本发明属于医药技术领域， 具体而言， 涉及一类咖啡酰基取代的五环三萜衍生物及 其在制备预防和治疗脑缺血、缺糖、缺氧诱发 的脑损伤和 /或神经功能异常和 /或认知功能 障碍的药物或保健品中的用途。 背景技术

治疗脑缺血损伤药物的研究进展

急性缺血脑卒中属于一类突发性的脑血液循环 障碍性疾病， 通过广泛影响大脑内细 胞信号的转导， 继而诱发脑部的神经元大量死亡， 最后造成严重的神经功能损伤。 基于 该疾病的病理特点， 寻找具有神经保护作用的药物具有非常重要的 意义， 这类药物通过 抑制缺血所诱发的级联病变反应从而发挥保护 神经元的作用， 最终能够有效地改善神经 功能。 当前， 神经保护剂己成为研发急性缺血脑卒中治疗药 物的主要研究策略。

针对脑缺血诱发的级联反应中的不同环节， 曾出现了数以百计的不同作用机理的神 经保护剂， 遗憾的是， 临床上除了自由基清除剂依达拉奉以外再无其 他有效的神经保护 剂可用。 一方面， 相当大部分的神经保护剂在体外起效或者动物 实验有效， 进入到临床 实验时却没有显示预期效果或效果很差； 另一方面， 部分神经保护剂的临床药效结果并 不强， 而且兼具较大毒副作用从而限制了临床应用。 因此， 通过新的途径寻找新型神经 保护剂己成为匿前的研究重点。

己有统计数据表明，现代临床药物中约有 25%是直接或间接来源于天然产物【 \^^«} Y.， et al; Acta Pharmacol Sin, 2010 , 31(6): 649-664】。 因此， 近些年来， 新型药物的研 发越来越多地关注于中草药中提取分离出来新 型结构， 从这些新型结构来源的化合物具 有天然的优势： 作用靶点新颖、 起效途径复杂、 毒副作用少而轻， 如用于治疗心脑血管 疾病的灯盏细辛酚是来源于灯盏细辛【Liu Y.M.， et al; J Pharm Pharmacol , 2008 , 60(3): 349-355】、 治疗老年痴呆的石杉碱甲是来源于蛇足石杉 【王许杰等； 中国新药与临床杂 志， 2012， 31 (12)： 707-712】。 据此， 从天然产物中寻找到新型的神经保护剂具有巨 大的 可能性。

咖啡酸、 五环三萜和咖啡 ¾¾取代五环三萜衍生物的生物活性研究

咖啡酸是一种天然的双羟基苯丙烯酸， 广泛存在于多种植物中。 药理研究表明咖啡 酸能抑制 5-脂氧酶的活性、减少炎症介质白三烯的生成� �� 且自身具有较强的抗氧化作用。 咖啡酸能有效抑制局灶性脑缺血大鼠模型的脑 萎缩， 减少脑梗死面积， 保护缺血周边区 神经元的损伤 【Tsai S.K., et al; Life Sciences, 2006, 78(23): 2758-2762】。 匿前很多含有咖 啡酸片段的天然产物， 如丹酚酸 A【杜冠华等； 药学学报， 1995， 30(3): 184-188】、 丹酚 酸 B【王秋华等；北京中医药大学学报， 2006, 29(12): 820-822, 825】、咖啡酸苯乙酯【Khan M., et al; Journal of Neurochemistry, 102 (2): 365 -377】等化合物被报道具有较强的神经保 护活性。 一系列具有神经保护活性咖啡酸衍生物也被合 成报道 【Lm J.Y., et al; WO2012/068038 A2 [P]】。

五环三萜类化合物是一类重要的天然产物， 广泛存在于中草药、食物及其它植物中。 这类化合物数匿庞大， 结构复杂， 多以游离或者苷类形式存在。 大量研究表明含有五环 三萜母核的化合物具有广泛生物活性， 尤其在抗炎、 护肝、 抗肿瘤以及集体免疫调节等 方面己经显现令人关注的药理特性。 近年药理研究表明常见的几种五环三萜类化合 物， 如桦木醇【Lu Q. et al; Nitric Oxide, 2011 , 24(3): 132-138】、 齐墩果酸 [ Rong Z.T., et al; Pharmaceutical Biology, 49( 1), 78-85】和熊果酸【李俐涛； 河北医科大学， 博士论文， 导 师： 张祥建】 也具有潜在的神经保护作用。 五环三萜衍生物内皮素受体拮抗剂 S-0139 (SB-737004)曾作为治疗出血性、 缺血性中风的药物进行临床研究。

多种咖啡酰基取代的五环三萜类化合物在植物 中被发现或者被化学合成， 并表现出 抗肿瘤和护肝等生物活性。 卫矛科南蛇藤属植物南蛇藤 [Ce/iMfr orbiculatus Thunb. ( C articulates T unb ]， 又名过山风、 黄藤、 降龙草等， 其始载于清代 《植物名实图考》， 其藤茎、 根、 叶、 果实及种子均可入药， 在临床上可用于治疗神经衰弱， 具有镇静安神 的作用。 发明内容

本发明的发明人对南蛇藤进行化学成分研究， 得到咖啡酰基取代的五环三萜类化合 物， 生物活性筛选显示该类化合物对氧糖剥夺 （OGD ) 诱导损伤的细胞具有保护作用。 本发明的发明人进而合成了一系列具有不同骨 架和取代基团的咖啡酰基取代的五环三萜 类化合物，在 OGD诱导损伤的细胞模型上确定其具有保护作用 ，而咖啡酸和不连接咖啡 酰基的三萜类化合物不具备这种保护作用。 本发明所提供的咖啡酰基取代的五环三萜类 化合物 （式 I)具有神经保护作用， 可减轻缺氧、 缺血所诱发的神经功能损伤， 经深入研 究有望开发出治疗缺氧、 缺血所致脑损伤的药物。 本发明的一个匿的是提供一种式 I所示咖啡酰基取代的五环三萜类化合物、 其药学 可接受的盐、 前药、 水合物或异构体：

其中，

咖啡酰基可通过基团 B连接在五环三萜 C-2、 C-3、 C-6、 C-16、 C-23、 C-27、 C-28 或 C-30位；

R R ² 、 R ⁵ 、 R ⁶ 、 R ⁷ 、 R ⁸ 、 R ⁹ 可各自独立地为 H、 -CH ₃ 、 -CH ₂ OH、 -CH ₂ NH ₂ 、 -CH ₂ NHR ^a 、 -COR ^a 、 -CONHR ^a 、 -COOR ^a 或 -CH ₂ OCOR ^a ;

R ³ 、 R ⁴ 、 R ^1Q 各自独立地为 H或 OR ^a ;

R ^u -R ¹³ 可各自独立地为 H、 -OR ^a 或 -OC(0)R ^a ;

A 选自 -CH ₂ -、 >C=0、 >CH(OR ^a ) -、 >CH(OCOR ^a )、 -COO-, >C=NOH、 >CH(NHR ^a ) 禾口 >C(NHCOR ^a );

B选自 0、 NH、 S、 >NR ^a 、 -NHR ^C NH -、 -OR ^c O-、 -NHR ^c O-、 -OR ^c NH-和 -OR ^c S-;

X 选 自 -CH ₂ -C(CH ₃ ) ₂ - 、 -CH(CH ₃ )-C(CH ₃ ) ₂ - 、 -CH(CH ₃ )-C(CH ₃ )(OR ^a )- 、 -CH(B-CH ₃ )-C(a-CH ₃ )(B-OH)-、 -CH(B-CH ₃ )-CH(a-CH ₃ )-、 -CH ₂ -C(a-CH ₃ )(B-CH ₂ OR ^a )-、 -CH ₂ -C(a-CH ₃ )(B-COOR ^a )-、 -CH ₂ -C(a-CH ₃ )(B-COOR ^a )-、 -CH ₂ -C(a-CH ₃ )(B-CH ₂ NHR ^a )-、 -CH ₂ -C(a-CH ₃ )(B-CONHR ^a ) Q>CH(R ^a );

丫为>( 、 >0¾01-01¾或>€=0，

R ^a 选自 H、 C1-C6烧基、 C2—C6 ¾基、 C6—Cl0芳 δ Cl-C6烧基、 C6—Cl0芳基 C2—C6 ¾基、

5-10元杂芳基 d-Cs垸基和 5-10元杂芳基 C ₂ -C ₆ 烯基， 其中， 所述杂芳基含有选自 0、 N 和 S中的 1至 3个，

R ^b 选自 H、 d-Cs垸基、 C ₂ -C ₆ 烯基、 -R ^e COOR ^a 、 -COR ^a 和 -OC(0)R ^a ，

R ^e 选自 CrC ₈ 亚垸基和 C ₂ -C ₈ 亚烯基。

优选地， 咖啡酰基可通过基团 B连接在五环三萜 C-3、 C-23、 C-27、 C-28和 C-30位；

R R ² 、 R ⁵ 、 R ⁶ 、 R ⁷ 、 R ⁸ 、 R9可各自独立地为11、 -CH ₃ 、 -CH ₂ OH或 -COOH;

R ³ 、 R ⁴ 、 R ^1Q 各自独立地为 H或 OH;

R ^u -R ¹³ 可各自独立地为 H、 -OR ^a 或 -OC(0)R ^a ;

A选自 -CH ₂ -、 >C=0和 -CH(OR ^a )-；

B选自 0、 NH、 -NH(CH ₂ ) ₂ NH -、 -0(CH ₂ ) ₂ 0-和 -NH(CH ₂ ) ₂ 0-;

X 为 -CH ₂ -C(CH ₃ ) ₂ - 、 -CH(CH ₃ )-C(CH ₃ ) ₂ - 、 -CH(CH ₃ )-C(CH ₃ )(OR ^a )- 、 -CH(B-CH ₃ )-C(a-CH ₃ )(B-OH)-、 -CH(B-CH ₃ )-CH(a-CH ₃ )-、 -CH ₂ -C(a-CH ₃ )(B-COOH)-、 -CH ₂ -C(a-CH ₃ )(B-CH ₂ OH) -、 -0¾-( (0 _[ -( ¾)(6-( ^«¾)-或>0¾1^)；

Y为 -CH ₂ -、 -0¾01-01¾-或>€=0，

R ^a 选自 H和 C _r C ₃ 垸基，

R ^b 选自 H和 C ₂ -C ₃ 烯基，

在一个实施方案中，

其中，

咖啡酰基可通过基团 B连接在羽扇豆垸型三萜的 C-3、 C-23、 C-28和 C-30位; 取代基 R ¹ R ³ 、 R ⁹ 、 A和 B如上所定义；

R ¹⁴ 选自 -C(CH ₃ )=CH ₂ 、 -C(CH ₂ OR ^a )=CH ₂ 和 -C(CH ₃ )CHO；

R ^a 如上所定义。

优选地， 式 la的化合物为式 Ia-1的化合物：

其中， 咖啡酰基以酯键连接在羽扇豆垸型三萜的 C-3位; 取代基 R\ R\ R ⁹ 和 R ¹⁴ 如上所定义。

优选地， 式 la的化合物为式 Ia-2的化合物:

其中， 咖啡酰基以酯键连接在羽扇豆垸型三萜的 C-28位; 取代基 R R ³ 、 R ¹⁴ 和 A如上所定义

优选地， 式 la的化合物为式 Ia-3的化合物：

其中， 咖啡酰基以酯键连接在羽扇豆垸型三萜的 C-23位; 取代基 R ³ 、 R ⁹ 、 R ¹⁴ 和 A如上所定义。

优选地， 式 la的化合物为式 Ia-4的化合物：

Ia-4

其中， 咖啡酰基以酯键连接在羽扇豆垸型三萜的 C-30位; 取代基 R R\ R ⁹ 和 A如上所定义。

优选地， 式 la的化合物为式 Ia-5的化合物： 其中， 咖啡酰基以酰胺键连接在羽扇豆垸型

取代基 R R ³ 、 R ¹⁴ 和 A如上所定义。

优选地， 式 la的化合物为式 Ia-6的化合物：

其中， 咖啡酰基通过基团 B连接在羽扇豆垸型三萜的 C-28位；

取代基 R R ³ 、 R ¹⁴ 和 A如上所定义;

B选自 -NH(CH ₂ ) ₂ NH -、 -NH(CH ₂ ) ₂ 0-、 -0(CH ₂ ) ₂ 0-和 -0(CH ₂ ) ₂ NH -。

在一个实施方案中， 式 I的化合物为式 lb的化合物：

其中， 咖啡酰基通过基团 B连接在齐墩果垸型三萜的 C-2、 C-3、 C-23、 C-27、 C-28 或 C-30位；

取代基 R\ R ³ 、 R ⁸ 、 R ⁹ 、 R ^1Q 、 A、 B和 Y如上所定义；

R ¹⁵ 选自 H、 CH ₃ 、 -COOR ^a 、 -C(0)R ^a 、 -CONHR ^a 、 -CH ₂ NHR ^a 和 -CH ₂ OC(0)R ^a ; 其中， R ^a 如上所定义。

优选地， 式 lb的化合物为式 Ib-1的化合物：

lb-1

其中， 咖啡酰基通过酯键连接在齐墩果垸型三萜的 C-3位; 取代基 R ¹ R ³ 、 R ⁸ 、 R ⁹ 、 R ^1Q 和 R ¹⁵ 如上所定义。

优选地， 式 lb的化合物为式 Ib-2的化合物：

其中， 咖啡酰基通过酯键连接在齐墩果垸型三萜的 C-28位; 取代基 R ¹ R ³ 、 R ⁸ 、 R ^1Q 、 R ¹⁵ 和 A如上所定义。

优选地， 式 lb的化合物为 Ib-3的化合物：

其中， 咖啡酰基通过酯键连接在齐墩果垸型三萜的 C-23位; 取代基 R ³ 、 R ⁸ 、 R ⁹ 、 R ^1Q 、 R ¹⁵ 和 A如上所定义。

优选地， 式 lb的化合物为式 Ib-4的化合物：

其中， 咖啡酰基通过酯键连接在齐墩果垸型三萜的 C-27位; 取代基 R ¹ R ³ 、 R ⁹ 、 R ¹⁰ 、 R ¹⁵ 和 A如上所定义。

优选地， 式 lb的化合物 Ib-5的化合物：

其中， 咖啡酰基通过酯键连接在齐墩果垸型

取代基 R\ R ⁸ 、 R ⁹ 、 A和 Y如上所定义。

优选地， 式 lb的化合物为式 Ib-6的化合物:

其中， 咖啡酰基通过酰胺键连接在齐墩果垸型

取代基 R ¹ 和 A如上所定义。

优选地， 式 lb的化合物为式 Ib-7的化合物：

其中， 咖啡酰基通过基团 B连接在齐墩果垸型

取代基 R ¹ R ⁸ 、 A和 B如上所定义。

优选地， 式 lb的化合物为式 Ib-8的化合物：

其中， 咖啡酰基通过酰胺键连接在齐墩果垸型三萜的 C-30位； 取代基 A和 Y如上 所定义。

优选地， 式 lb的化合物为式 -9的化合物：

其中， 咖啡酰基通过基团 B连接在齐墩果垸型三萜的 C-30位;

取代基 A、 Y和 B如上所定义。

在一个实施方案中，

其中， 咖啡酰基通过基团 B连接在熊果垸型三萜的 C-2、 C-3、 C-23或 C-28位; 取代基 R\ R ³ 、 R ⁴ 、 R ⁹ 、 A和 B如上所定义；

R ¹⁶ 选自 H、 OR ^a 或 OC(0)R ^a ， 其中， R ^a 如上所定义。

优选地， 式 I的化合物为式 Ic-1的化合物：

其中， 咖啡酰基通过酯键连接在熊果垸型三萜的 C-3位; 取代基 R ¹ R ³ 、 R ⁴ 、 R ⁹ 和 R ¹⁶ 如上所定义。

优选地， 式 I的化合物为式 Ic-2的化合物：

其中， 咖啡酰基通过酯键连接在熊果垸型三萜的 C-28位; 取代基 R R\ R ⁴ 和 A如上所定义。

优选地， 式 I的化合物为式 Ic-3的化合物：

其中， 咖啡酰基通过酯键连接在熊果垸型三萜的 C-23位; 取代基 R ³ 、 R ⁴ 、 R ⁹ 和 A如上所定义。

优选地， 式 I的化合物为式 Ic-4的化合物：

其中， 咖啡酰基通过酰胺键连接在熊果垸型

取代基 R R ³ 、 R ⁴ 和 A如上所定义。

优选地， 式 I的化合物为式 Ic

其中， 咖啡酰基通过基团 B连接在熊果垸型三萜的 C-28

取代基 R ¹ R ³ 、 R ⁴ 、 A和 B如上所定义。

在一个实施方案中，

其中， 咖啡酰基通过基团 B连接在木栓烧型三萜的 C-28或 C-29位; 取代基 R ⁹ 、 A和 B如上所定义；

R ¹⁷ 选自 -CH ₃ 、 -CH ₂ OR ^a 、 -COOR ^a 和 -CH ₂ NHR ^a ， R ^a 如上所定义。 优选地， 式 I的化合物为式 Id-1的化合物：



其中， 示例性化合物包括从天然植物南蛇藤中分离得 到的咖啡酸五环三萜酯类化合 物 (化合物 001-005)以及合成的衍生物 （006-021 )。

本发明的另一个匿的是提供一种预防或治疗脑 缺血、 缺糖、 缺氧诱发的脑损伤和 /或 神经功能异常和 /或认知功能障碍的方法， 所述方法包括向患者施用治疗有效量的本发明 化合物。

本发明的另一个匿的是提供式 I所示咖啡酰基取代的五环三萜类化合物、 其药学可 接受的盐、 前药、 水合物或异构体用于制备预防或治疗脑缺血、 缺糖、 缺氧诱发的脑损 伤和 /或神经功能异常和 /或认知功能障碍的药物或保健品中的用途。

本发明的另一个匿的是提供一种组合物， 该组合物包含治疗有效量的式 I所示咖啡 酰基取代的五环三萜类化合物、 其药学可接受的盐、 前药、 水合物或异构体。

根据本发明的另一个方面， 提供了一种预防或治疗脑缺血、 缺糖、 缺氧诱发的脑损 伤和 /或神经功能异常和 /或认知功能障碍的方法，所述方法包括向患� �施用包含治疗有效 量的本发明化合物的组合物。

优选地， 所述脑缺血、 缺糖、 缺氧诱发的脑损伤和 /或神经功能异常和 /或认知功能障 碍包括脑卒中、 脑梗塞、 脑缺血、 脑外伤、 缺血性神经退行性疾病及高山缺氧导致的不 适。

根据本发明， 可以将治疗有效量的本发明化合物和药学上允 许的任意一种或多种辅 料制成药物组合物。 其制剂可以是药学上的任意一种剂型， 包括但不限于， 片剂、 胶囊 剂、 丸剂、 注射剂等。

为实施本发明的方法， 所述化合物可通过口服、 肠胃外、 皮下、 静脉注射、 吸入式 喷雾或通过植入式贮存器等给药。

本发明中匿标化合物及其衍生物对 OGD诱导的细胞损伤有较强的保护作用，而且在 动物实验上， 匿标化合物能够降低大脑缺血损伤区域并修复 缺血所诱发的神经功能损伤。

本发明公开了所述化合物在治疗脑血管损伤诱 发的神经功能异常的药物中的用途。 通过动物实验手段首次证明， 所述化合物能显著减少脑缺血诱发的大脑损伤 ， 同时能明 显改善动物的神经行为学功能。 经实验证实， 本发明的化合物对脑缺血诱发的神经功能 损伤具有显著改善作用， 有望开发为改善脑缺血等引发的脑卒中疾病并 能改善相应的神 经行为学功能。 附图说明

图 1 : MTT测定的 SH-SY5Y细胞存活率的统计图， 在化合物 001 -012 ( ΙΟμΜ) 存 在或不存在下， 经过氧糖剥夺后， 24小时继续培养后， 将细胞存活计算为相对 DMSO溶 剂对照的百分比， *;? < 0.05， **p < 0.01， ** < 0.001 , 相比于溶剂对照组； ^### < 0.001， 相比于正常对照组。

图 2 : MTT测定的神经元活性统计图， 结果表明氧糖剥夺条件下神经元的活性显著 下降， 而给予匿标化合物 006后， 神经元活性得到明显恢复。 *p < 0.05， ***p < 0.001， 相比于溶剂对照组； 漏 p < 0.001， 相比于正常对照组。

图 3 : TTC测定的大鼠脑部的损伤情况及神经功能的表 现， 结果表明缺血能造成大 鼠的脑部出现明显的大区域死亡， 同时神经功能损伤严重， 而给予匿标化合物 006后， 脑部死亡区域显著减少， 相应的神经功能得到显著修复。 0.05, **;? < 0.01， ***p < 0.001， 相比于溶剂对照组； ^ < 0.001 , 相比于假手术组， 每组 10-15只动物。 具体实施方式

如下实施例所述， 存在多种合成途径， 通过它们， 本领域的技术人员能制备本发明 的化合物和中间体。

方案 1-3 提供某些合成途径， 依据这些途径可以获得本发明的某些咖啡酰基 五环三 萜类衍生物。

方案 1 : 显示了以桦木醇化合物为原料合成本发明中的 部分化合物：

 2： 显示了以齐墩果酸和甘草次酸为原料合成本发 明的部分化合物:

方案 3: 显示了以熊果酸、 积雪草酸和羟基积雪草酸为原料合成本发明中 的部分化 合

^^H feL产物 CH3 H H

H !¾^产物 CH ₂ OAc OAc H

^反^产物 CH ₂ OAc OAc OAc

实施例

下面的具体实施例可使本专业技术人员能够全 面地理解本发明， 但不以任何方式限 制本发明。

下述缩写在实施和本发明的整个说明书中使用 ： TBSC1/TBDMSC1: 叔丁基二甲基硅 垸； NMDA: N-甲基 -D-天冬氨酸； LAH:氢化铝锂； PDC: 二氯铬酸吡啶鎗盐 （pyridinium dichlorochromate) ; DMAP: 4-二甲基氨基吡啶； Ac : 乙酰基； DMSO : 二甲基亚砜。

使用本领域技术人员己知的各种反应， 可以如下所述合成本发明范围内的化合物。 本领域的技术人员还承认可以使用备选方法来 合成本发明的匿标化合物， 且本文主体中 描述的方法不是穷尽的， 但的确提供了匿标化合物的广泛适用和实用途 径。

用于合成本文关键化合物的实验过程的详细描 述得到这样的分子， 所述分子用鉴定 它们的物理数据以及与它们相关的结构说明来 描述。

实施例 1 : 化合物 001 - 005的制备

阴干、 粉碎的南蛇藤 (C. orbiculatus , 2009年 4月采自湖南怀化)根皮 (20 Kg)室温下 用 95%乙醇渗漉提取 (30 L x 3)， 提取液减压浓缩得乙醇浸膏。 将乙醇浸膏悬溶于 10%甲 醇 (1.5 L) , 经乙酸乙酯萃取三次 (1.5 L x 3)， 得乙酸乙酯部位浸膏 (400 g)。 乙酸乙酯浸膏 经正相分离， 石油醚-乙酸乙酯 (10: 1, 6: 1, 4: 1, 2: 1, 1 : 1)梯度洗脱， 得 4个组分 (Fr. 1-4)。 其 中 Fr.2经反相、 正相、 LH-20 HW-40反复柱层析得化合物 002和化合物 004 ; Fr.3经反 相、 正相、 LH-20 HW-40反复柱层析得化合物 001 003和化合物 005

化合物 001为白色无定形粉末： [a] _D ²² : -23 (c 0.088, 丙酮)； UV (甲醇） (log ε) 329 (4.51), 244 (4.29), 2.18 (4.44) nm; IR (KBr) v 3369, 2935, 2872, 1701, 1678, 1630, 1599, 1518, 1261 , 754 cm" ¹ ; NMR (300 MHz, 氘代丙酮)： 0.72 (s, 3H), 0.86 (s, 3H), 0.88 (d, J = 7.8 Hz, 3H), 1.02 (s, 3H), 1.04 (s, 3H), 1.10 (s, 3H), 1.22 (s, 3H), 3.86 (s, 2H), 6.33 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 7.17 (s, 1H), 6.88 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 7.04 (d, J= 8.8 Hz, 1H); ¹³ C NMR (100 MHz, 氘代丙酮）： 6.8, 14.5, 18.0, 18.5, 18.6, 20.8, 22.4, 26.5, 28.5, 30.3, 30.7, 31.0, 32.2, 32.3, 32.9, 35.9, 36.3, 37.8, 38.7, 39.6, 40.3, 41.4, 41.4, 42.2, 42.4, 53.5, 57.9, 59.4, 74.7, 114.9, 115.5, 116.0, 122.2, 127.3, 145.2, 167.3, 146.0, 148.4, 211.3 ; HREIMS: ra/z 604.4131 [M]+ (C ₃₉ H ₅₆ 0 ₅ , 计算值： 604.4128)。

化合物 002为白色无定形粉末： [a] _D ²² : -8 (c 0.055, 氯仿); UV (甲醇） λ (log ε) 328 nm; IR (KBr) Vmax 3539, 3381, 2970, 1707, 1676, 1631, 1514, 1444, 1379, 1275, 1186, 1111, 978, 812 cm" ¹ ; ^l H NMR (300 MHz, 氘代氯仿）： 0.80 (m, 6H), 0.91 (m, 6H), 0.94 (s, 3H) , 0.99 (s, 3H) , 1.01 (s, 3H) , 1.08 (s, 3H) , 4.62 (t, J = 7.5 Ηζ,ΙΗ) , 5.13 (m, 1H), 6.25 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.98 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 7.12 (s, 1H), 7.56 (d, J = 15.6 Hz, 1H); ¹³ C NMR (100 MHz, 氘代氯仿）： 15.7, 16.9, 16.8, 17.5, 18.2, 21.4, 23.2, 23.3, 23.6, 26.6, 28.1, 28.1, 28.7, 31.2, 32.9, 33.7, 36.8, 37.9, 38.4, 39.6, 39.6, 40.0, 41.5, 42.0, 47.6, 55.2, 59.0, 81.5, 114.3, 115.3, 115.7, 122.4, 124.2, 127.1, 139.6, 144.0, 145.1, 146.7, 168.2; HREIMS: m/z 588.4177 [M]+ (C ₃₉ H ₅₆ 0 ₄ , 计算值： 588.4179)。

化合物 003为白色无定形粉末： [a] _D ²² : +35 (c 0.060, 氯仿)； UV (甲醇） (log ε) 327 nm; IR (KBr) Vmax 3539, 3390, 2949, 1707, 1678, 1633, 1605, 1516, 1446, 1365, 1273, 1180, 1115, 978, 812 cm" ¹ ; ^l H NMR (300 MHz, 氘代氯仿）： 0.83 (s, 3H), 0.88 (s, 3H), 0.89 (s, 3H), 0.91 (s, 3H), 0.95 (s, 3H), 1.01 (s, 3H), 1.21 (s, 3H), 4.02 (dd, J= 2.4, 9.0 Hz, 1H), 4.64 (t, J = 7.5 Ηζ, ΙΗ), 5.31 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.22 (d, J = 15.6 Hz, 1H) , 6.90 (m, 2H), 7.10 (s, 1H) 7.56 (d, J= 15.6 Hz, 1H); ¹³ C NMR (100 MHz, 氘代氯仿）： 16.8, 16.9, 18.1, 18.2, 23.6, 23.8, 25.0, 26.2, 26.7, 28.2, 28.4, 31.0, 32.3, 33.2, 34.6, 36.9, 38.0, 38.1, 39.1, 41.7, 43.2, 46.4, 47.0, 50.5, 55.3, 76.2, 80.8, 114.0, 115.2, 115.6, 121.2, 122.4, 127.1 , 144.3, 145.1, 146.9, 150.5, 167.8; HREIMS: ra/z 604.4105 [M]+ (C ₃₉ H ₅₆ 0 ₅ , 计算值： 604.4128)。

化合物 004为白色无定形粉末： [a] _D ²² : +38 (c 0.050,氯仿); UV (甲醇) λ (log ε) 330 nm; IR (KBr) v _max 3411, 2949, 2875, 1681, 1631, 1604, 1516, 1446, 1275, 1178, 978 cm" ¹ ; ^l H NMR (300 MHz,氘代吡啶）： 0.86 (s, 6H), 0.93 (s, 3H), 1.01 (s, 3H), 1.06 (s, 3H), 1.09 (s, 3H), 1.19 (s, 3H), 1.34 (s, 3H), 4.64 (dd, J = 3.6, 8.7 Ηζ, ΙΗ), 4.98 (dd, J= 5.1, 10.8 Hz), 5.54 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.70 (d, J= 15.9 Hz, 1H) , 7.24 (s, 2H), 7.66 (s, 1H) 8.03 (d, J = 15.9 Hz, 1H); ¹³ C NMR (100 MHz,氘代吡啶）： 17.0, 17.2, 18.4, 18.7, 23.7, 24.5, 25.9, 26.5, 27.0, 28.3, 28.6, 31.1, 32.6, 33.3, 33.6, 34.8, 37.3, 38.5, 40.9, 42.0, 43.6, 46.4, 47.8, 55.8, 56.0, 66.8, 80.5, 115.7, 115.8, 116.7, 122.0, 127.0, 127.9, 145.5, 146.4, 147.7, 150.4, 167.3; HREIMS : m/z 586.3976 [M-H ₂ 0]+ (C ₃₉ H ₅₄ 0 ₄ ,计算值： 586.4022

化合物 005为白色无定形粉末： [a] _D ²² : +31 (c 0.065, 氯仿 /甲醇)； UV (甲醇） λ (log ε) 330, 244, 217 nm; IR (KBr) Vmax 3535, 343 1, 2935, 1685, 1633, 1603, 1529, 1446, 1386, 1275, 1192, 978, 758 cm" ¹ ; ^l H NMR (300 MHz,氘代吡啶）： 0.84 (s, 3H), 0.96 (s, 3H), 0.97 (s, 6H), 0.98 (s, 3H), 1.02 (s, 3H), 1.32 (s, 3H), 1.38 (d, J = 6.8 Hz , 3H), 4.86 (dd, J = 4.8, 11.3 Hz), 6.70 (d, J= 15.8 Hz, 1H) , 7.23 (s, 2H), 7.67 (s, 1H) 8.04 (d, J = 15.8 Hz, 1H); ¹³ C NMR (100 MHz, 氘代吡啶）： 14.9, 16.1, 16.2, 16.9, 18.0, 18.5, 18.6, 21.4, 21.8, 24.2, 26.9, 28.1, 28.7, 34.5, 35.9, 37.0, 38.2, 38.5, 38.7, 38.4, 39.0, 40.7, 41.4, 42.4, 43.2, 48.1, 49.5, 55.4, 74.0, 80.4, 115.6, 115.8, 116.7, 122.0, 127.0, 145.6, 147.7, 150.5, 167.4; HREIMS: m/z 606.4292岡+ (C ₃₉ H ₅₆ 0 ₅ , 计算值： 606.4284 实施例

冰浴条件下， 向桦木醇 (200 mg, 452.5 mmol)的 DCM (CH ₂ C1 ₂ )溶液 (20 mL)中加入新 制的咖啡酰氯 （ 179.2 mg, 905.0 mmol) , 室温搅拌。 经 TLC检测所述反应完成后， 加入 饱和 NaHC0 ₃ 溶液 (50 mL)淬灭。 用 DCM (50 mL x 3) 萃取， 并用饱和食盐水洗涤， 无水 N¾S0 ₄ 干燥。 蒸干 DCM后的残留物用正相硅胶柱纯化， 石油醚：乙酸乙酯（5 : 1 ) 洗脱， 得白色粉末状固体， 即化合物 006， 164 mg, 产率 60%。 NMR (500 MHz, 氘 代氯仿）： δ 0.77 (s, 3Η), 0,82 (s,3H), 0.97 (s, 3H), 0.98 (s， 3H), 1.04 (s, 3H), 1 .69 (s, 3H), 0.68-2.00 (m, 25H), 2.46 (dt， J :: 10.8, 5.7 Hz, 1H), 2.68 (m, 1H), 3.21 (dd， J :: 11.3, 4.6 Hz, Πί), 3 ,97 (d, J = 1 1.0 Hz, Ι ίΓ), 4.37 (d, J = 11.0 Hz, 1 H), 4.60 (s, l iT), 4.70 (s, 6.28 (d， J ：:: 16.0 Hz, 1H), 6.45 (br s, 1H), 6.87 (d, J == 8.0 Hz, 1H), 6.98 (dd, J == 8.0, 1.6 Hz, 1H), 7.10 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.57 (d, ./= 16.0 Hz) ; ESI MS: m/z 603 [M- HJ―。

实施例 3： 3β-咖啡酰氧基 -20(29)-烯 -28-醇-羽扇豆垸 (007)的合成。

步骤 1 : 冰浴搅拌条件下， 向新制备的 3,4-二乙酰氧基咖啡酰氯的干燥 DCM(5ml)溶 液中，加入 3β-羟基 -20(29)-烯 -28-乙酰氧基-羽扇豆垸 (218 mg， 0.45 mmol)、吡啶 (113 mg， 1.35) , 室温搅拌反应 4h。 反应液浓缩后直接用正相柱层析分离， 石油醚： 乙酸乙酯 (10: 1) 洗脱， 得化合物 3β-(3,4-二乙酰氧基-咖啡酰氧基) -20(29)-烯 -28-乙酰氧基-羽扇豆垸 (230 mg, 0.32, 产率 71%)。

步骤 2: 向反应产物 3β-(3,4-二乙酰氧基-咖啡酰氧基) -20(29)-烯 -28-乙酰氧基-羽扇豆 垸 (200 mg, 0.27 mmol)的甲醇 (3 mL)溶液中加入催化量的金属钠， 室温搅拌反应 30 mm, TLC检测无原科点， 加入盐酸溶液 (1M, 10 mL), 室温搅拌 30 mm后， 用乙酸乙酯 (10 mL x 3)萃取， 萃取液减压除去溶剂后， 用 HPLC纯化， 90%- 95%乙猜梯度洗脱， 即得化合物 007(108 mg, 0.18 mmol, 产率 67%)„ 'H NMR (300 MHz, 氘代氯仿)： δ 0.87 (s, 3H), 0.88 (s,3H), 0.99 (s， 3H), 1.03 (s， 3H), 1.69 (s， 311), 1 .00-2.00 (m, 24H), 2.39 (dt, J = 10,0, 4.5 Hz, 1H), 3.35 (d, J ::: 11.0 Hz, 1H), 4.37 (d， J--- 11.0 Hz, IH), 4.59 (m, 2H), 4.68 (s, 1H), 6.26 (d， J = 16.0 Hz, III), 6.87 (d, J = 8.0 Hz,】H), 7,00 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz,】H), 7.10 (d, J = 1.6 Hz, IH), 7.56 (d, J == 16.0 Hz) ; ESI MS: m/z 603 [M-Hf„ 实施例 4： 3β-咖啡酰氧基 -20(29)-烯 -28-羧酸-羽扇豆垸 (008)的合成。

冰浴搅拌条件下， 向新制备的 3，4-二乙酷氧基咖啡酰氯的干燥 DCM(5ml)溶液中， 加 入 3β-羟基 -20(29)-烯 -28-羧酸-羽扇豆垸 (205 mg， 0.45 mmol)、 吡啶（113 mg， 1.35 mmol) , 室温搅拌反应 4h。 反应液浓缩后直接用正相柱层析分离， 石油醚： 乙酸乙酯 (8: 1)洗脱， 得化合物 3β-(3,4-二乙酰氧基-咖啡酰氧基) -20(29)-烯 -28-羧酸-羽扇豆垸 (225 mg, 0.32, 产 率 71%)。

向反应产物 3β-(3,4-二乙酰氧基-咖啡酰氧基) -28-乙酰氧基-桦木醇 (200 mg, 0.28 mmol)的甲醇 (3 mL)溶液中加入催化量的金属钠， 室温搅拌反应 30 mm, TLC检测无原料 点， 加入盐酸溶液 (Ι Μ, ΙΟ ηΛ), 室温撹拌 30 min后， 用乙酸乙酯 (10 mL x 3)萃取， 萃取 液减压除去溶剂后，用 HPLC纯化， 90%- 95%乙腈梯度洗脱，即得化合物 008(127 mg， 0.20 mmol, 产率 73%) ^! H NMR (300 MHz,氘代氯仿)： δ 0.87 (s, 3H), 0.88 (s,3H), 0.99 (s, 3H), 1.03 (s， 3H), 1.69 (s， 3H), 2.39 (dt， J : 10.0, 4.5 Hz, 1H), 3.35 (d, J - 11.0 Hz, 1H), 4.37 (d, J = 11.0 Hz, 1H), 4.59 (m, 2H), 4.68 (s, 1H), 6.26 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.87 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.00 (dd, ./ = 8.0, 1.6 Hz, 1H), 7.10 (d, J= 1.6 Hz, 1H), 7.56 (d, J= 16.0 Hz); ESI MS: m/z 603 [M-H]"„

-羟基 -12-烯 -28-咖啡酰氧基-齐墩果垸 (009)的合成。

冰浴搅拌条件下， 向 LAH(458 mg, 12.38 mmol)的无水 THF(5 mL)溶液中， 加入齐墩 果酸 (1.0 g, 2.19 mmol)的无水 THF(10 mL)溶液。随后加热回流反应 8h， TLC检测无原料。 反应液冷却至室温， 冰浴条件下， 向反应液中依次加入水 (460 μL),NaOH溶液(15%,460 μί), 水 (1.38 mL)。 搅拌 30 min后， 向反应液中加入饱和酒石酸钠 (30 mL)溶液后， 用乙 酸乙酯萃取 (30mLx3)。萃取液合并， 减压除去有机溶剂， 即得 3β,28-二羟基 -12-烯 -齐墩 果垸 (940 mg, 2.13 mmol, 产率 97%)。

与化合物 007的合成类似，化合物 009由化合物 3β,28-二羟基 -12-錄 -齐墩果垸和 3,4- 二乙酰氧基咖啡酰氯反应后经碱水解制得， 产率为 70%。 iHNMR OOMHz, 氘代氯仿): δ 0.80 (s, 3Η), 0.90 (s,6H), 0.92 (s, 3H), 0.99 (s, 3H), 1.00 (s, 3H), 1.71 (s, 3H), 2.11 (dd, J = 13.0, 4.0 Hz, IH), 3,25 (d, J= 10,7 Hz, IH), 3,85 (d, J= 11,0 Hz, IH), 4.16 (d, J = 11.0 Hz, IH), 6.22 (t, J= 3.2 Hz, IH), 6,27 (d, J = 16.0 Hz, IH), 6.87 (d, J= 8,0 Hz, IH), 7.01 (dd, J = 8.0, 1.6 Hz, ΙίΓ), 7.10(d,J= 1.6 liz, ΙίΓ), 7.67 (d, J= 16.0 Hz); ^!3 C NMR (126 MHz,氘代氯 仿)： δ 168.27, 146.79, 145.13, 144.22, 143.69, 127.40, 123.06, 122.51, 115.57, 115.46, 114.26, 79.55, 71.07, 55.27, 47.69, 46.39, 42.63, 41.77, 39.87, 38.90, 38.70, 37.02, 36.18, 34.13, 33.31, 32.63, 31.64, 31.07, 28.23, 27.21, 26.14, 25.75, 23.73, 22.50, 18.46, 16.81, 15.76: 15.64； ESI MS: m/z 6Q3 [M~H]"„

实施例 6:

向 3,4,5-三甲氧基-苯丙酸 (129 mg, 0.54 mmol)和 DCC(336 mg, 1.63 mmol)的无水 DCM溶液 (5 mL)中加入催化量的 DMAP，室温搅拌 30 mm后，向反应液中加入桦木醇 (200 mg,0.45mmol)的无水 DCM溶液 (5 mL), 室温搅拌 2d。 TLC检测， 大部分原料己反应， 反应液过滤， DCM(10mLx3)洗涤。 滤液合并， 减压除去有机溶剂后， 通过正相分离纯 化， 石油醚-乙酸乙酯 (15:1 - 8:1)梯度洗脱得化合物 010(229 mg, 0.35 mmol, 产率 64%)。 ^! H NMR (400 MHz,氘代氯仿）： NMR (400 MHz,氘代氯仿)： δ 0.76 (s ,3Η), 0.83 (s, 3Η) _: 0.96 (s, 3Η), 0.99 (s, 3H) , 1.05 (s, 3H), 1.69 (s, 3H) , 2.50 (dt, J= 10.0, 4.5 Hz, IH), 3.18 (dd, J = 11.2, 5.0 Hz, IH), 3.88 (s, 3H) , 3.89(s, 6H), 3.99 (d, J=11.2 Ηζ,ΙΗ), 4.41 (d, J=11.2 Ηζ,ΙΗ), 4.61 (s, IH), 4.71 (s, IH), 6.36 (d, J=15.9 Hz, IH) , 6.76 (s, 2H), 7.58 (d, J=15.9 Hz, 1H); ESI MS : m/z 66 \ [M-H]" ₍ ,

实施例 1:

与化合物 010的合成方法相同， 化合物 011 由化合物 3-羰基 -20(29)-錄 -28-醇-羽扇豆 垸和 3,4,5-三羟基-苯丙酸经 DCC缩合制得。 ^! H NMR (400 MHZ,氘代氯仿)： δ 0.94 (s ,3H), 1.00 (s ,3H), 1.02(s ,3H), 1.07(s ,3H), 1.09(s ,3H), 1.70(s ,3H), 3.88 (s ,3H), 3.89(s ,6H), 3.99 (d, J=11.2 Hz, 1H) , 4.41 (d, J=11.2 Hz, 1H), 4.61 (s, 1H), 4.71 (s, 1H), 6.36 (d, J=15.9 Hz, 1H) , 6.76 (s, 2H) ,7.58 (d, J=15.9 Hz, 1H) ; ESI MS : m/z 659 [M- H] -。

实施例 8： 3β-羟基 -20(29)-烯 -28-咖啡酰胺基羽扇豆垸 (012)的合成。

向 3β-羟基 -20(29)-烯 -28-醛基-羽扇豆垸 (500 mg, 1.14 mmol)的无水乙醇 (20 mL)溶液 中依次加入盐酸羟胺 (127 mg, 1.84 mmol)、 乙醇钠 (600 mg, 8.82 mmol) , 室温搅拌反应。 TLC检测反应完成后， 减压除去反应液中的有机溶剂， 通过正相分离纯化， 石油醚：乙酸 乙酯 (20: 1 - 15 : 1)梯度洗脱， 得 3β-羟基 -20(29)-烯 -28-肟-羽扇豆垸 (467 mg， 1.03 mmol) , 产率 90%。 NMR (400 MHz, 氘代氯仿）： δ 0.77 (s, 3H), 0.82 (s, 3H), 0.96 (s, 3H), 0.98 (s, 3H), 1.42 (s, 3H), 1.69 (s, 3H), 2.50 (dt J = 11.2 Hz, 5.1 Hz, 1H), 3. 19 (dd, J = 11.2 Hz, 5.1 Hz, 1H),4.60 (s, 1H), 4.71 (s, 1H), 7.55 (s, 1H) ; ESI MS : m/z 5b [M÷H] ⁺ ; 向 3β-羟基 -20(29)-烯 -28-肟-羽扇豆垸 (300 mg, 0.66 mmol)的无水乙醇溶液 (50 15 ml), 加入金属钠 (1.2 g, 52.17 mmol), 室温搅拌至反应液中金属钠全部反应， 向反应液中加入 盐酸溶液 （2M,26.0mL)， 将反应液调至中性后， 用乙酸乙酯萃取 (50 mL x 3)。 萃取液浓 缩后经正相分离纯化， 石油醚：乙酸乙酯 (10:1 - 0:1)梯度洗脱， 得 3β-羟基 -20(29)-烯 -28- 氨基-羽扇豆垸 (232 mg, 0.53 mmol), 产率 80%。 ^NMRWOO MHz, DMSO- 氘代二甲基 亚砜)： δ 0.65 (s, 3Η), 0.76 (s, 3H), 0.87 (s, 3H), 0.92 (s, 3H), 0.97 (s, 3H), 1.63 (s, 3H), 2.22 (d _: J= 13.2 Hz, IH), 2,37 (m, 1H), 2.69 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 2.96 (m, 1H), 4.54 (s, 1H), 4.67 (s, 1H),; ESI MS: m/z 442 [M+HJ ^÷ „

冰浴搅拌条件下， 向新制备的 3,4-二乙酰氧基咖啡酰氯的干燥 DCM(5ml)溶液中， 加 入 3β-羟基 -20(29)-烯 -28-氨基-羽扇豆垸 (200 mg， 0.45 mmol)、 吡啶（113 mg， 1.35), 室温 搅拌反应 4h。 反应液浓缩后直接用正相柱层析分离， 石油醚：乙酸乙酯 (3:1)洗脱， 得化合 物 012，该混合物进一步通过反相柱色谱分离， 95%乙腈洗脱，分别得化合物 012(124 mg, 0.18, 产率 40%)。化合物 012的 NMR (400 MHz, 氘代氯仿）： δ 0.76 (s, 3H), 0.83 (s, 3H) _; 0.96 (s, 3H), 0.97 (s， 3H), 1.08 (s, 3H), 1.69 (s, 3H), 2.30 (s, 6H), 2.51(dt J== 11.2 Hz, 5.1 Hz, IH), 3.13 (dd, J= 13.6 Hz, 5.1 Hz, IH), 3.19 (dd, J= 11.3 Hz, 5.1 Hz, IH), 3.65 (dd, J= 13.6 Hz, 5.1 Hz, IH), 4.60 (s, IH), 4.71 (s， 1H),5.54 (m s， IH), 6.35 (d， J:- 15 Hz, IH), 7.19 (d, J:- 8.5 Hz, IH), 7.34 (d, J= 1.7 Hz, IH), 7.36 (dd, J = 8.5 Hz, 1.7 Hz, IH), 7.60 (d, J= 15 Hz, IH); ESI MS: m/z 688 [M+H] ⁺ o

实旛例 9: 3β-羟基 -12-烯 -28-(3，4-二乙酰基)咖啡酷基-齐墩果烷 (013)和 3β-羟基 -12-烯 -28-咖啡雌-齐墩果烷 (014)的合成。

向甘草次酸 (5.0 g, 10.64 mmol)的二氧六环 (30 mL)溶液中加入锌粉 (2.0 g, 30.77 mmol), 随后向反应液中缓慢滴加浓盐酸至锌粉全部反 应， 室温搅拌过夜。 减压除去有机 相后， 经正相柱层析， 石油醚：丙酮 (8: 1 - 4: 1)梯度洗脱， 得 3β,30-二羟基 -20(29)-烯 -齐墩 果垸 (4.2 g, 9.21 mmol, 产率 87%)。 冰浴条件下， 向干燥的三口瓶中依次加入 LAH(324.7 mg, 8.77 mmol), 无水 THF(10 mL)， 3β,30-二羟基 -20(29)-烯-齐墩果垸 (1.0 g, 2.19 mmol) 和无水 THF(20 mL)。 随后反应加热回流 8h， TLC检测无原料。 反应液冷却至室温， 冰 浴条件下， 向反应液中依次加入水 (330 L), NaOH溶液 (15%, 330 μ¾ 水 (9.9 mL)。 搅拌 30 min后， 向反应液中加入饱和酒石酸钠 (30 mL)溶液后， 用乙酸乙酯萃取 (30 mL x 3)。 萃取液合并， 减压除去有机溶剂， 即得 3β,30-二羟基 -12- -齐墩果垸 (871 mg, 1.97 mmol, 产率 90%)。

与化合物 007的合成步骤 1类似， 化合物 013由化合物 3β,30-二羟基 -12-烯-齐墩果 垸和 3,4-二乙酰氧基咖啡酰氯反应后制得，产率为 73%。化合物 013的 iH NMR WOO MHz, 氘代氯仿)： S 0.85 (s, 3H), 0.86 (s, 3H), 0.88 (s, 6H), 0.93 (s, 3H), 0.95 (s, 3H), 0.97 (s, 3H), 2.30 (s, 3H), 2,3—1 (s, 3H), 3.22 (dd, J = 10.7, 4.3 Hz, 1H), 4.13 (s, 2H), 5 , 18 (t, J = 3.51 Hz, 1H), 6.41 (d, J= 16.0 Hz, 1H), 7.22 (d, J = 8.3 Hz, IH), 7,38 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.42 (dd, J = 8.3, 2.0 Hz, 1H), 7.62 (d, J= 16.0 Hz, 1H); ESI MS : m/z 687 [M-H]"„

与化合物 007的合成步骤 2类似， 化合物 013迸一步碱 (MeONa/MeOH)水解得化合 物 014(产率： 87%)。 化合物 014的 ^ NMR (400 MHz, 氘代氯仿)： δ 0.82 (s, 3H), 0.86 (s， 3H), 0,96 (s, 3H), 0,98 (s, 3H), 0.99 (s, 311), 1.02 (s, 3H), 1.17 (s, 3H), 3.26 (dd, J= 10.8, 4.3 Hz, 1H), 4.14 (s, 2H), 5.20 (t, J= 3.6 Hz, 1H)， 6.31 (d, J= 15 Hz, 1H), 6,90 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 7.04 (d, J::: 1.7 Hz, 1H), 7.13 (dd， J::: 8.5 Hz, 1.7 Hz, 1H), 7.60 (d, J::: 15 Hz, 1H) _; ESI MS: m/z 603 [M-H]―。 实施例 10： 化合物 3β-羟基 -12-烯 -28-0-(3，4-二乙雌)咖啡 m¾-熊果烷 (015)和化 合物 -羟基 -12-烯 -28-0-咖啡難-熊果垸 (016)的合成。

同化合物 009的合成类似， 以熊果酸为原料经 LAH原后得 3,28-二羟基 -12- -熊 果垸 (产率： 93%),然后将 3,28-二羟基 -12- -熊果垸与新制备的 3,4-二乙酰氧基咖啡酰 氯反应得化合物 015(产率： 72%)。

化合物 015进一步碱水解得化合物 016(产率： 85%)。

化合物 015的 iHNMR (400 MHz, 氘代氯仿)： S 0,79 (s, 3H), 0.82 (d, J = 5.8 Hz, 3H), 0.94 (s, 6H), 0,99 (s, 3H), 1.01 (s, 3H), 1.11 (s, 3H), 2,30 (s, 3H), 2.31 (s, 3H), 3,22 (dd, J = 10.9, 5.0 Hz,】H), 3.75 (d, J= 11,0 Hz, HI), 4.21 (d,J= 11 ,0 Hz, 1H), 5,16 (t， J= 3.4 Hz, 1H), 6.38 (d, J == 16.0 Hz, I ), 7.21 (d, J== 8.3 Hz, 1H), 7.37 (d, J== 2.2 Hz, 1H), 7.40 (dd, J - 8.3, 2.2 Hz, IH), 7.59 (d, J== 16.0 Hz, IH); ESI MS- m/z 687 [M-HJO

化合物 016的 NMR (400 MHz, 氘代氯仿)： δ 0.80 (s， 3H), 0.82 (d， J 5.8 Hz, 3H), 0.94 (m, 6H),1.00 (s, 6H), 1.11 (s, 3H), 3.27 (m, IH), 3.74 (d, J= 11.0 Hz, IH), 4.20 (d, J= 11.0 Hz, IH), 5.15 (t, J= 3.4 Hz, IH), 6.27 (d, J= 16.0 Hz, IH), 6.87 (d, J= 8.3 Hz, IH), 7,00 (d, J= 2,2 Hz, IH), 7,10 (dd, J= 8.3, 2,2 Hz, IH), 7,56 (d, J= 16,0 Hz, IH); ESI MS: m/z 603 [M-H]"; tffiESI MS : w/z 603.4058 [M-H]" (€ ₃ 9¾ ₅ 0 ₅ , 计算值： 603.4050) ( 实施锊 H 化合物 3β，28-0-二 (3,4-二乙酰基)咖啡酰基 -12-烯-熊果烷 (017)和

3β，28-0-二咖啡難 -12-烯-熊果烷 (018)的合成。

冰浴搅拌条件下， 向新制备的 3,4-二乙酰基咖啡酰氯 (169 mg, 0.60 mmol)的干燥 DCM(5 mL)溶液中， 加入化合物 015(344 mg, 0.50 mmol)、 吡啶 (200 mg, 2.53 mmol)。 室 温反应 4h后， 反应液浓缩后直接用正相柱层析分离， 石油醚：丙酮 (7:1 - 4:1)梯度洗脱， 得化合物 017(280 mg, 0.30 mmol, 产率： 60%)。 化合物 017的 ¹ HNMR (400 MHz, 氘代 氯仿）： δ 0.84 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 0.91 (s, 3H), 0.93 (s, 3H), 0.95 (s, 3H), LOO (s, 3H), 1 ,03 (s, 3H), 3.75 (d, J = 11. 1 Hz, 1H), 4.22 (d, J = 11.1 Hz, 1H), 4.63 (t, J = 8 ,2 Hz, 1 H), 5.17 (t, J = 3.0 Hz, 1 H), 6.39 (d, J= 16.0 Hz, 2H), 7,21 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.37 (m, 2H), 7.41 (dd, J = 8.5, 1 ,8 Hz, 2H), 7,59 (d, ,/ = 1 6.0 Hz, 2H); ESI MS : m/z 933 [M-H]"; HRESI MS： m/z 957.4774〖M+Na] (C ₅₆ H ₇₀ O ₁₂ Na, i†算值： 95.7.4765)。

与化合物 007的合成歩骤 2类似， 化合物 017进一步经碱水解得化合物 018(产率： 69%)。化合物 018的 NMR (400 MHz, 氘代二甲基亚戰）： δ 0.84 (s, 3H), 0.91 (m, 15H), 1.09 (s, 3H), 2.29 (d, J = 1.7 Hz, 2H) , 3.17 (d, J = 4.6 Hz, 2H), 3.40 (s, 2H), 4.15 (m, 2H), 4.52 (m, 1H), 5.14 (s, 1H), 6.24 (d, ./ = 16 Hz, 2H), 6.76 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.99 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.05 (s, 2H), 7.46 (d, J = 16.0 Hz, 2H); ESI MS : m/z 765 [M- HJ— ; HRESI MS : m/z 765.4383 [M-HT (C ₄₈ H ₆₁ 0 ₈ , 计算值： 765.4366)。 实施例 12s化合物 3β-羟基 -12-烯 -28-0-(3，4-二乙酰基)咖啡酰基-齐墩果烷 (019)、28- 羟基-12-烯-3β-O-(3，4-二乙酰基)咖啡酰基-齐墩� ��烷(020)和 3p，28-7V-二 (3,4-二乙酰基)咖 啡¾¾-12-烯-齐墩果烷 (021)的合成。

向 3β-( -乙酰基-齐墩果酸 (500 mg, 1.00 mmol)的干燥 DCM(10 mL)溶液中， 缓慢滴 加 SOCl ₂ (2 mL)。 加热回流反应 4h后， 减压除去 DCM和 S0C1 ₂ 。 冰浴条件下， 向所得 产物的干燥 DCM(10 mL)溶液中快速滴加氨水 (1 mL)， 搅拌反应 lh后， TLC检测， 己 无原料点。 减压除去反应液中的有机相和水， 即得 3B-0-乙酰基 -12- -28-酰胺-齐墩果 烧 (490 mg, 0.99 mol, 产率： 99%)。

冰浴条件下， 向干燥的三口烧瓶中依次加入 LAH(134 mg, 3.61 mmol)、无水 THF(10 mL)、 化合物 3β-( -乙酰基 -12-錄 -28-酰胺-齐墩果垸 (450 mg, 0.91 mmol)、 无水 THF(20 mL)。 反应加热回流 8h后， TLC检测己无原料。 冰浴搅拌条件下， 向反应液中依次缓 慢滴加 H ₂ 0(134 L)、 15%的 NaOH溶液 (134 L)和 H ₂ O(402 L)。 搅拌 30min后， 向反 应液中加入饱和酒石酸钠 (30 mL)溶液， 用乙酸乙酯萃取 (30 mL x 3)。萃取液合并， 减压 除去有机溶剂， 即得 3β -羟基 -12-烯 -28-氨基-齐墩果垸 (415 mg, 0.94 mmol, 产率 95%)。

向 3β-羟基 -12-烯 -28-氨基-齐墩果垸 (350 mg, 0.79 mmol)的无水 DCM(10 mL)溶液中 缓慢滴加新制备的 3,4-二乙酰氧基咖啡酰氯 (354 mg, 1.26 mmol)的无水 DCM(5 mL)溶液 和吡啶 (1.5 mL)， 室温搅拌 4h后， 减压除去有机相， 经正相柱层析分离和 HPLC纯化得 化合物 019(53 mg, 0.08 mmol, 产率： 10%)、020(113 mg, 0.16 mmol，产率： 21%)和 021(221 mg, 0.24 mmol, 产率： 30%)。

化合物 019的 'Ή丽 R (400 MHz, 氘代氯仿）： δ 0.81(s, 3H), 0.90 (s, 3H), 0.91 (s, 3H) 0.96 (s, 3H), 1.02 (s, 3H), 1.07 (s, 3H), 1.44 (s, 3H), 2.31 (s, 3H), 2.32 (s, 3H), 2.91 (dd,J = 13.8, 5.5 Hz, 1H), 3.23 (m.1H), 3.68 (dd,J= 13.8, 5.5 Hz, 1H), 5.27 (t,J=3.5 Hz, 1H), 5.51 (t,J= 5.5 Hz, 1H), 6.36 (d, J= 16.0 Hz, 1H), 7.21 (d,J= 8.3 Ηζ,ΙΗ), 7.36 (m, 2H), 7.60 (d, J= 8.3 Hz, 1H); ESI MS: m/z 688 [M+H]"„

化合物 020的 NMR (400 MHz, 氘代氯仿）： δ 0.89(s, 3Η), 0.91 (s, 3H), 0.93 (s, 3H), 1.00 (s, 3H), 1.04 (s, 3H), 1.18 (s, 3H), 1.67 (s, 3H), 2.32 (s, 3H), 2.33 (s, 3H), 2.79 (dd,J = 13.8, 5.5 Hz, 1H), 3.53 (dd,J= 13.8, 5.5 Hz, 1H), 4.65 (t,J=7.2 Hz, 1H), 5.24 (t,J=3.5 Hz, 1H), 5.37 (t, J= 5.5 Hz, 1H), 6.40 (d, J= 16.0 Hz, 1H), 7.24 (d, J= 8.3 Ηζ,ΙΗ), 7.39 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.43 (dd, J = 8.3, 2.0Hz, 1H), 7.60 (d, J = 8.3 Hz, 1H); ESI MS: m/z 688 [M+H]"„

化合物 021的 NMR (400 MHz, 氘代氯仿）： δ 0.90 (s, 3Η), 0.92 (s, 3H), 0.93 (s, 3H), 0.96 (s, 3H), 1.01 (s, 3H), 1.08 (s, 3H), 1.20 (s, 3H), 2.33 (m, 12H), 2.90 (dd, J = 13.8, 5.2 Hz, 1H), 3.70 (dd,J= 13.6,7.5 Hz, 1H), 4.65 (t, J= 8.6 Hz, 1H), 5.27 (t, J = 3.0 Hz, 1H), 5.56 (t,J= 6.0 Hz, 1H), 6.36 (d, J= 16.0 Hz, 1H), 6.41 (d, J= 16.0 Hz, 1H), 7.21 (d, J= 8.3 Hz, 1H), 7.24 (d,J= 8.3 Hz, 1H), 7.36 (m, 2H), 7.39 (d, J= 2.0 Hz, 1H), 7.43 (dd, J = 8.3, 2.0 Hz, 1H), 7.60 (d,J= 16.0 Hz, 1H), 7.62 (d,J= 16.0 Hz, 1H); ESI MS: m/z9 [M+H] ⁺ „ 实施例 13: 化合物 001-012保护 SH-SY5Y细胞免受氧糖剥夺损伤

本测定按常规采用噻唑蓝 （MTT) 比色试验法， 即用人骨髓神经母细胞瘤细胞株 (SH-SY5Y细胞）， 以含 10%的胎牛血清的 MEM/F12培养基， 在 37°C、 5%C0 ₂ 培养箱 中培养。 每四天传一代细胞， 在倒置显微镜下观察传代细胞。 当细胞均匀贴壁生长， 生 长至 80 至 90%时， 用 0.125%的胰蛋白酶消化 1~2 分钟后， 用含 10%的胎牛血清的 MEM/F12培养基调整细胞浓度为 2.5*10 ⁵ /mL， 接种在 96孔培养板中， 每孔 100μί， 于 37°C、 5%C0 ₂ 培养箱中继续培养 24小时。 给药组的处理如下： 24小时后往细胞培养基 中分别加入化合物 001-012 (终浓度为 10μΜ)， 于 37°C、 5%C0 ₂ 培养箱孵育 2小时， 结 束后用 EBSS 溶液 （单位为 mM: 116 NaCl, 5.4 KC1, 1.8 CaCl ₂ ， 0.8 MgS0 ₄ ， 1.25 NaH ₂ P0 ₄ -2H ₂ 0, 26.2 NaHC0 ₃ , pH 7.2 -7.4, 0~4°C, 使用前通入 95% 0 ₂ /5% C0 ₂ ， 平衡 15分钟）润洗细胞一遍， 并将培养基换为不含葡萄糖的 DMEM培养基（Life technologies 公司， 货号为 1227494)， 同时加入相应化合物 001-012， 并放进厌氧箱， 在 5% CO ₂ /10%H ₂ /85%N ₂ 、 37°C的条件下培养 4小时， 结束后加入葡萄糖及胎牛血清使培养基 的条件恢复到原来水平， 并放回原来的培养环境继续培养； 模型组的处理与给药组相似， 但加入的是空白溶剂； 而正常对照组则进行 EBSS平衡溶液润洗一遍后换为了新的含葡 萄糖及胎牛血清的 DMEM培养基，继续培养。 24小时后，每孔加入 l(^L MTT( 5mg/mL)， 37°C孵育 3小时， 终止培养， 小心吸出培养板中的液体， 每孔加入 lOO L DMSO, 37°C 振荡 5分钟， 使紫蓝色甲瓒 （formazan) 结晶充分溶解， 在酶标仪上以 490nm波长测定 各孔 OD值， 根据下式计算给药后对氧糖剥夺诱发的神经元 存活率：

存活率 = ( OD -OD I ( OD -OD X 100%。

实验结果： 统计结果显示， 氧糖剥夺条件下神经元的活性显著下降， 而给予匿标化 合物后，神经元活性得到明显恢复；而匿标化 合物不影响正常组神经元的活性。 < 0.05 ***p < 0.001， 相比于溶剂对照组； ^### p < 0.001， 相比于正常对照组； 每组 6孔， 独立重 复实验 3次。 结果如图 1所示。

实施例 14： 化合物 006 W胎鼠皮层神 ^免受氧糖剥夺损伤

目的和原理：

本实验采用噻唑蓝 （MTT) 比色试验法， 噻唑蓝分析法以活细胞代谢物还原剂噻唑 蓝为基础。 MTT为黄色化合物， 是一种接受氢离子的染料， 可作用于活细胞线粒体中的 呼吸链， 在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C的作用下， 生成蓝色的 formazan结晶， formazan 结晶的生成量仅与活细胞数匿成正比（死细胞 中琥珀酸脱氢酶消失， 不能将 MTT还原）。

实验材料：

MTT: Amresco公司 （进口分装）， 货号： 14041-03。

二甲基亚砜（DMSO): 国药集团化学试剂有限公司， 批号： 20120331。

Neurobasal培养液： Life Technologies公司， 货号： 21103049。

B27: Life Technologies公司， 货号： 17504044。

17天 SD孕鼠（ SPF级）： 由中国科学院上海药物研究所 AAALAC动物实验室提供， 动物生产许可证： SCXK [沪] 2004-0002。

5% CO ₂ /10%H ₂ /85% N ₂ 气体： 由中国科学院上海有机化学研究所提供。

实验施

从怀孕 17~18天的孕鼠腹中取出胎鼠， 分离得到胎鼠大脑皮层， 将皮层组织消化， 进行细胞计数后以每孔 3.0 X 10 ⁴ 个细胞接种在 96孔板中， 以含 2%B27 (v/v)、 0.5mM的 Neurobasal培养基， 在 37 C、 5%C0 ₂ 培养箱中培养， 直至第 9天使用。 培养板分为两块 板， 一块是： 正常组， 正常组 + ( Ι μΜ, 10μΜ) 药物组； 另一块是氧糖剥夺的板， 分别 是： 溶剂对照组， 三个给药组（Ο.Ι μΜ, 1μΜ， 10μΜ) _; 每组重复 6孔。 在损伤前两个小 时加药， 预孵育 2小时后， 用 EBSS溶液 （单位为 mM: 116 NaCl， 5.4 KC1, 1.8 CaCl ₂ ， 0.8 MgS0 ₄ ， 1.25 NaH ₂ P0 ₄ -2H ₂ 0, 26.2 NaHC0 ₃ , pH 7.2 - 7.4， 0~4°C,使用前通入 95% 0 ₂ / 5% C0 ₂ ， 平衡 15分钟） 润洗一遍神经元， 然后每孔加入 90μί EBSS溶液及 ΙΟμί相应 的药物， 并放进厌氧箱， 在 5% CO ₂ /10%H ₂ /85% N ₂ 、 37°C的条件下培养 4小时。 结束后 加入葡萄糖使培养基的条件恢复到原来水平， 并放回原来的培养环境继续培养。

实验结果： 统计结果显示， 氧糖剥夺条件下神经元的活性显著下降， 而给予匿标化 合物后，神经元活性得到明显恢复；而匿标化 合物不影响正常组神经元的活性。 < 0.05， ***p < 0.001， 相比于溶剂对照组； 醒 _P < Q.QQ l， 相比于正常对照组； 每组 6孔， 独立重 复实验 3次。

实施例 15: 化合物 006对急性脑缺血诱发神经损伤的保护作用

目的和原理： 以手术方式将栓线插入， 从颈外动脉切口入线， 经颈内动脉进入到大 脑中动脉， 在阻塞大脑中动脉缺血往大脑供血， 造成左侧大脑局部缺血， 以模拟缺血型 中风患者。 缺血结束后给药， 最终评价候选化合物对缺血诱发的大脑损伤程 度以及短期 的神经行为学变化。

实验材料：

受试品为化合物 006， 淡黄色固体粉末， 易溶于 DMSO。 使用前将受试品充分溶解 于溶媒（1%DMS0， 5%Cremophor EL, 94%生理盐水）中， 配置成所需要浓度（ 10mg/kg、 30mg/kg)„

水合氯醛： 国药集团化学试剂有限公司， 批号： 20120309。

DMSO: 国药集团化学试剂有限公司， 批号： 20120331。

生理盐水： 安徽双鹤药业有限责任公司， 批号： 1108045C。

Cremophor EL: Sigma-Aldrich公司， 批号： BCBF7085V。

磷酸盐 （PBS ) 缓冲液： 迪申生物技术有限公司， 批号： 20100818001。

2 , 3， 5-三苯基氯化四氮唑 （TTC ): 沃凯公司， 批号： 30187785。

尼龙鱼线： 北京沙东生物技术有限公司， 产品货号： 2636-100 (AAAA)。

实验动物：雄性 SD大鼠， 体重 250-300g， 中国科学院上海药物研究所 AAALAC动 物实验室提供， 动物生产许可证： SCXK [沪] 2004-0002。

实验施

( 1 )动物分组： 该实验采用栓塞型大鼠大脑缺血手术模型评价 动物的认知功能。 实 验分为三组： 假手术组 （不进行缺血手术）、 溶剂对照组 （进行缺血手术）、 化合物 006 给药组（进行缺血手术）， 缺血后三小时腹腔注射给药， 分别给予空白溶剂和化合物 006。

(2 )中脑动脉栓塞所致局灶性脑缺血（MCAO )模型： 大鼠用水合氯醛（350mg/kg， ι.ρ. ) 麻醉， 仰卧位固定， 颈部正中切口， 分离左侧颈总及颈内、 外动脉， 颈总动脉上打 活结， 结扎颈外动脉远心端结扎， 近心端上打活结， 用动脉夹夹闭颈内动脉。 在颈外动 脉近分叉处剪一小口， 将鱼线插入， 松开动脉夹， 将鱼线推进颈内动脉， 遇轻微阻力时 即停止， 插入浓度约 20mm。 结扎颈外动脉插线处， 固定鱼线。 缝合伤口， 动物放回笼 统中饲养， 2小时后将鱼线小心拔出。 以上实验操作均在 25 -28°C环境中进行。 给药组于 拔线后 1小时经腹腔注射给药， 溶剂对照组给予等容量的空白溶剂。

( 3 ) 神经行为评分及脑缺血面积测定： 术后 24小时进行神经行为评分。 改进的神 经行为评分包括一系列的神经功能障碍测试， 具体的评分标准如下：

A.运动功能测试：

1 ) 提尾测试一提尾后通过比较对侧肢体瘫痪程度 评价： 前肢不能伸展一 1分； 后 肢不能伸展一 1分； 30秒内头部侧弯与垂直轴角度超过 10度一 1分。 2)动物置于地上， 不能直线行走一 1分； 朝对侧旋转运动一 2分； 对侧偏瘫一 3分。

B.感觉功能测试：

1)视觉和触觉测试障碍一 1分；

2)肢体本体感受功能测试障碍一 1分。

C. 平衡木评分测试：

抓住平衡木时间超过 60秒一 1分； 单肢脱离抱住平衡木一 2分； 两肢脱离抱住平衡 木一 3分； 40秒后从平衡木上掉下一 4分； 20秒后从平衡木上掉下一 5分； 20秒内从平 衡木上掉下一 6分。

D.反射和异常运动测试：

耳廓反射障碍一 1分； 角膜反射障碍一 1分; 惊吓反射障碍一 1分; 肌阵挛或肌张力 障碍一 1分。

上述的评价指标综合反映了运动、 感觉、 平衡以及反射功能， 分数范围为 0— 18， 分数越大表明神经行为损伤越明显 【 CHEN J， et al; Stroke , 2001 , 32(11): 2682-2688 ]„ 神经行为评分结束后， 将动物断头取脑， 去掉嗅球、 小脑、 脑干和低位脑干， 然后 冠状切 5刀共 6片。 脑片组织用 TTC ( 1%, w/v) 染色， 正常组织为红色， 梗死部位为 白色， 求算梗死体积及比值。 同法操作， 记录各组梗死体积及比值， 进行 AN0VA统计 分析。

实验结果：

( 1 )与假手术组大鼠相比， 模型组大鼠表现出明显的神经行为障碍； 缺血 3小时后 注射给予化合物 006， 动物的神经行为症状得到明显改善， 经统计学分析， 给药组动物 的行为评分与溶剂对照组动物相比都有显著性 差异 （分别是 < 0.01， *p < 0.001 )。

( 2 ) TTC染色显示， 大鼠脑缺血 24小时后， 脑组织出现明显缺血区。 给予化合物 006 治疗后， 脑缺血区明显小于溶剂对照组， 经统计学分析， 给药组动物的脑缺血损伤 区域与溶剂对照组动物相比都有显著性差异 （ ** < 0.001 )。