DOMAINE TECHNIQUE

La présente invention concerne le traitement de maladies affectant le muscle strié (muscles squelettiques et/ou muscle cardiaque), et en particulier de la dystrophie musculaire tibiale (TMD pour Tibial Muscular Dystrophy). Elle préconise l'identification et l'utilisation d'inhibiteurs de la calpaïne 3 comme médicaments pour le traitement de ces maladies.

ETAT ANTERIEUR DE LA TECHNIQUE Les maladies neuro musculaires regroupent des pathologies diverses qui sont généralement associées à une perte de force musculaire transitoire ou permanente. Cette perte de force s'accompagne le plus souvent d'une fonte musculaire, également appelée amyotrophie. Parmi ces maladies musculaires, les myopathies constituent un groupe important correspondant à des atteintes de la fibre musculaire à proprement parler. Parmi elles, les dystrophies musculaires progressives se caractérisent par une diminution de la force musculaire avec généralement une atrophie des muscles, ainsi que par des anomalies visibles sur biopsie musculaire, révélant une modification du tissu. Appartiennent notamment à ce groupe la dystrophie musculaire de Duchenne (ou DMD), la dystrophie musculaire de Becker (ou DMB), les dystrophies musculaires proximales dite des ceintures ou distales dont la dystrophie musculaire tibiale (ou TMD). La dystrophie musculaire tibiale (TMD, Tibial Muscular Dystrophy) a été mise en évidence pour la première fois dans des familles finlandaises consanguines (Udd et al, 1993).

La dystrophie musculaire tibiale est caractérisée par une atrophie et une faiblesse musculaire en général confinée au niveau du compartiment antérieur des membres inférieurs, principalement le Tibialis Antérieur {TA). Le mollet des patients montre une proéminence dans sa partie ventrale. Les premiers symptômes se déclarent souvent de façon asymétrique et tendent avec le temps à devenir bilatéraux (Udd et al, 1998). Les premiers symptômes cliniques apparaissent vers l'âge de 35 ans {Udd et al., 1993). La maladie progresse lentement et chez la majorité des patients la marche est préservée avec toutefois l'impossibilité de poser le talon pendant la marche et dans les cas les plus sévères la nécessité d'une aide à la marche. Aucune atteinte cardiaque ni d'atteinte faciale n'a été observée. Le taux de CPK reste normal ou modérément élevé (Udd et al, 1998). Néanmoins, une grande hétérogénéité a été mise en évidence chez un panel de patient TMD (constituant près de 9% des TMD totales), avec des atteintes plus ou moins variables pouvant toucher d'autres muscles tels que le Quadriceps et le Soléaire, mais aussi quelquefois des atteintes distales et proximales pouvant même impliquer les muscles des bras (Udd et al, 2005). L'Imagerie à Résonnance Magnétique (IRM) réalisée sur différents patients montre un remplacement du muscle par du tissu conjonctif et adipeux dans le TA et selon l'atteinte, dans le Quadriceps et le Soléaire.

Les biopsies musculaires des patients montrent des changements myopathiques- dystrophiques de sévérité variable incluant une modification de la taille des fibres musculaires (souvent la présence de fibres plus grosses), des noyaux internalisés et quelques fibres positives aux basophiles ou nécrosées (Udd et al, 1992); (Partanen et al, 1994). De plus, des noyaux en apoptose ont pu être mis en évidence sur les biopsies de Tibialis des patients TMD (Haravuori et al, 2001). Les biopsies visualisées en microscopie électronique montrent, de façon variable selon les patients, la présence de quelques vacuoles contenant des débris cellulaires alors que la structure du sarcomère est préservée (Udd et al, 1993).

En 2002, les équipes d'Isabelle Richard et Bjarne Udd mettent en évidence la mutation la plus fréquente en Finlande dans le gène codant pour la plus grande protéine du vivant : la titine (Hackman et al, 2002). La titine (OMIM#18840, appelée également connectine) est une protéine géante codée par un gène d'une taille approximative de 294 kb situé sur le chromosome 2, région 2q31 et composé de 363 exons codant pour 381 388 acides aminés. La masse moléculaire de la titine est de 3 000 à 3 700 kDa (Bang et al, 2001). La titine s'étend du disque Z à la ligne M du sarcomère (Furst et al, 1988; Wang et al, 1979) ce qui correspond à un demi- sarcomère. Protéine essentielle pour l'organisation et l'intégrité des sarcomères, elle constitue le troisième réseau de filaments le plus abondant dans le muscle strié, représentant quelque 10% de la masse myofïbrillaire après ceux de l'actine et de la myosine et représente le seul système continu sur toute la longueur des sarcomères. Les parties N-terminales de deux molécules de titine appartenant à deux sarcomères adjacents sont ancrées dans la strie Z où elles se chevauchent de manière antiparallèle (Gregorio et al, 1998). La région C-terminale participe à la structure de la ligne M du sarcomère, où deux molécules de titine de sarcomères adjacents se superposent (Obermann et al, 1997); (Furst et al., 1999). Enfin, la partie centrale de la titine (la bande I) forme la partie élastique de la molécule. De par sa taille et ses nombreuses interactions protéiques, la titine joue un rôle important dans l'assemblage des sarcomères, le maintien des éléments contractiles pendant la contraction, l'intégration des filaments épais dans le sarcomère, contrôle l'intégrité et assure la stabilité mécanique du sarcomère. De plus, lors du travail musculaire, le déploiement de la titine génère une force capable de s'opposer à la tension d'étirement du sarcomère : pendant la contraction d'un muscle strié, la tension active provient de l'action des filaments minces d'actine sur les filaments épais de myosine et la tension passive résulte de l'extension de la titine. Enfin, elle a un rôle important dans les voies de signalisation (Trinick, 1994) (Labeit and Kolmerer, 1995) (Gregorio et al, 1999) (Machado and Andrew; 2000) (Squire, 1997) (Clark et al, 2002) (Lange et al, 2005), notamment car elle a de très nombreux partenaires tout au long du sarcomère.

Une mutation détectée sur des patients finlandais, FINmaj (majeure en Finlande), a été identifiée dans le dernier exon de la titine (Hackman et al, 2002). Cette mutation à l'état hétérozygote entraine la TMD. La mutation FINmaj est la conséquence d'une délétion/insertion de 11 pb (AAGTAACATGG -> TGAAAGAAAAA) entraînant la modification de 4 acides aminés acides en 4 acides aminés basiques E33359_W33362delinsVKEK (EVTW -> VKEK) dans une zone hydrophobe très conservée du domaine mlO de la titine (Hackman et al, 2002). Cette mutation semble être le fruit d'une recombinaison de l'ADN avec une même séquence présente dans un intron situé dans la bande A de la titine entre les exons 246 (Fn3) et 247 (Ig) du gène sain 87 204 pb en amont du dernier exon, Mex6. Dans cette mutation, le tryptophane est muté en une lysine charge. Or ce résidu tryptophane est généralement très conservé dans toutes les répétitions Ig de la titine et est connu pour être d'une importance cruciale dans la stabilisation du noyau hydrophobe de la structure tridimensionnelle du domaine Immunoglobuline-like (Improta et al, 1998). Cette mutation FINmaj a été mise en évidence chez un grand nombre de patients finlandais et la prévalence serait supérieure à 10 cas pour 100 000 en Finlande (Hackman et al., 2002). Six autres mutations faux-sens ou non-sens ont été mises en évidence dans les deux derniers exons de la titine chez des patients belges, français, italiens et espagnols (Hackman et al., 2008; Hackman et al., 2002; Pollazzon et al., 2009; Van den Bergh et al., 2003) entraînant les mêmes phénotypes que la mutation FINmaj.

De façon intéressante, il y aurait une corrélation génotype-phénotype visible notamment suite à la mise en évidence d'une atteinte beaucoup plus sévère chez les patients ayant une mutation entraînant la production d'une protéine tronquée suite à une mutation faux-sens ou un décalage du cadre de lecture introduisant un stop prématuré (Hackman et al., 2008). II a été mis en évidence par révélation d'épitopes que la partie C-terminale de la titine est absente à 50% (Hackman et al., 2008).

Parmi les nombreux partenaires de la titine, il a été montré que la calpaïne 3 se liait à la région unique codée par l'avant dernier exon de la titine appelé Mex5 (codant pour le domaine is7) de la titine (Kinbara et al., 1997).

Les calpaïnes sont une famille de protéases à cystéine non lysosomales activables par le calcium. Cette famille comprend à l'heure actuelle 11 membres, dont 2 protéines ubiquitaires (calpaïnes 1 et 2). Les fonctions physiologiques des calpaïnes restent encore largement inconnues. En tant que protéases de type régulatrices, elles régulent vraisemblablement des fonctions cellulaires importantes.

La calpaïne 3 (également appelée p94) appartient à la famille des calpaïnes qui sont toutes des protéases à cystéines (Dear et al., 1999). La calpaïne 3 est codée par un gène constitué de 24 exons répartis sur une région de 35 kb du chromosome 15. La protéine de 94 kDa comporte 821 acides aminés et est composée de quatre domaines retrouvés chez les membres de la famille des calpaïnes. Les premières caractérisations biochimiques de la calpaïne 3 ont montré que cette enzyme s'autolysait sous la forme de deux fragments principaux (Sorimachi et al., 1993). Cette autolyse, qui a lieu dans le domaine IS1, constitue le mécanisme d'activation de la protéase et est décrite comme séquentielle (Taveau et al., 2003). Ainsi trois sites d'autolyse (SI, S2 et S3) ont été mis en évidence dans ISl, conduisant à la formation d'un fragment court de 34 kDa et de fragments plus longs compris entre 55 et 60 kDa (Kinbara et al., 1998).

Lorsque la protéine est entière, une hélice a codée par la séquence ISl, ferme le sillon catalytique, empêchant les substrats et les inhibiteurs d'y pénétrer (Diaz et al., 2004). Lorsque celle-ci s'autolyse, elle libère le fragment ISl (coupure intramoléculaire) qui libère alors le sillon catalytique. La protéine devenue active peut alors cliver ses substrats mais également d'autres molécules de calpaïne 3 (coupure intermoléculaire). Dans le muscle, la calpaïne 3 est majoritairement présente sous forme non-autolysée de 94kDa (Kinbara et al., 1998; Sorimachi et al., 1990), suggérant qu'elle s'y trouve principalement sous une forme inactive et qu'un signal d'activation permettant de l'activer est nécessaire.

La fonction précise de la calpaïne 3 dans le muscle squelettique n'est pas connue, mais sa déficience est responsable de la LGMD2A. Des mutations récessives dans le gène de la calpaïne 3, sont à l'origine de la LGMD2A (Limb Girdle Muscular Dystrophy 2A) (Richard et al., 1995) qui est la forme la plus répandue des dystrophies des ceintures (elle représente 30 à 40 % de celles-ci). II apparaît qu'il existe un besoin persistant de développer de nouveaux médicaments permettant de traiter le vaste spectre des pathologies affectant le muscle strié, notamment les dystrophies musculaires.

Ainsi et à ce jour, aucun traitement spécifique n'est connu pour la prise en charge de la TMD. La plupart des patients nécessitent une kinésithérapie pour prévenir l'aggravation des contractures. Une piste évidente est l'apport d'un gène codant la protéine normale mais cette stratégie n'est pas applicable dans le cas de la titine, du fait de la grande taille du gène qui dépasse les capacités des vecteurs de transfert utilisés actuellement. EXPOSE DE L'INVENTION

La présente invention propose de nouvelles pistes thérapeutiques pour traiter certaines formes de dystrophies musculaires - notamment la TMD - ou de cardiomyopathies, et offre la possibilité d'identifier de nouveaux médicaments destinés à ces pathologies.

En effet, la présente invention repose sur la mise en évidence par le Demandeur qu'une inhibition partielle de la calpaïne 3 permet d'améliorer certaines formes de dystrophies musculaires, notamment la TMD.

Ainsi et selon un premier aspect, l'invention a trait à une composition comprenant un inhibiteur de la calpaïne 3 pour le traitement de maladies affectant le muscle strié, en particulier les dystrophies musculaires et les cardiomyopathies, et encore plus précisément celles associées à une surexpression ou une suractivation de la calpaïne 3.

En d'autres termes, il s'agit d'utiliser une composition comprenant un inhibiteur de la calpaïne 3 pour préparer un médicament destiné au traitement de dystrophies musculaires et de cardiomyopathies. Ladite composition peut en outre contenir tout composé ou excipient acceptable, notamment pharmaceutiquement. Elle peut en outre comprendre d'autres principes actifs destinés à traiter la même pathologie ou une autre pathologie. Selon un mode de réalisation particulier, le ou les inhibiteur(s) de la calpaïne 3 sont les seuls principes actifs de la composition.

Il peut également être envisagé d'associer, dans la même composition, au moins deux inhibiteurs de la calpaïne 3 de nature distincte, pour une administration simultanée ou décalée dans le temps. La voie d'administration peut aussi bien être intramusculaire qu'intraveineuse, voire sous-cutanée, intrapéritonéale ou orale.

Le fondement de la présente invention repose donc sur la mise en évidence de l'intérêt thérapeutique des inhibiteurs de la calpaïne 3 dans le contexte de l'invention. On entend par « inhibiteur de la calpaïne 3 », toute molécule apte à diminuer ou réduire l'activité de la calpaïne 3. Dans la mesure où la calpaïne 3 a potentiellement de nombreuses implications biologiques in vivo, une suppression uniquement partielle est privilégiée.

De même, un inhibiteur spécifique de la calpaïne 3 est avantageusement mis en œuvre dans le cadre de l'invention. On entend par « spécifique », le fait qu'il inhibe exclusivement ou majoritairement la calpaïne 3 mais pas d'autres protéines bio logiquement actives in vivo. En particulier, il apparaît comme très important de vérifier la spécificité de l'inhibiteur vis-à-vis de protéines proches de la calpaïne 3, à savoir les autres calpaïnes et notamment les calpaïnes ubiquitaires 1 et 2. L'intérêt d'un inhibiteur spécifique est qu'il offre généralement une plus grande sélectivité et efficacité. Cliniquement, ceci se traduit par des effets secondaires potentiels moindres. La réduction ou inhibition de l'activité de la calpaïne 3 peut résulter de 2 modes d'action distincts des molécules inhibitrices :

Selon un premier mode de réalisation, la molécule a pour effet de diminuer l'expression et/ou la quantité de calpaïne 3 produite, en agissant notamment au niveau de la transcription/traduction du gène de la calpaïne 3. C'est par exemple le mode d'action des oligonucléotides antisens, des AR si, des ARNsh et des ribozymes qui constituent des inhibiteurs privilégiés au sens de l'invention.

De telles molécules peuvent être aisément identifiées par l'homme du métier, sur la base notamment de la séquence du gène de la calpaïne 3. Une séquence particulièrement pertinente en vue de la thérapie chez l'homme est celle du gène humain de la calpaïne 3, de séquence SEQ ID NO : 1.

Dans la mesure où les expérimentations sont réalisées au préalable chez la souris, la séquence du gène murin de la calpaïne 3 est également d'intérêt et est illustrée à la séquence SEQ ID NO : 2.

Des séquences antisens susceptibles d'induire du saut d'exons, afin d'éliminer un exon critique pour l'activité protéolytique ou d'induire une rupture du cadre de lecture en début de séquence, sont des candidats privilégiés. Les exons ciblés sont avantageusement les exons 2, 3, 4, 5, 7, 8 et 10. Au niveau des séquences correspondantes, les séquences importantes pour l'épissage (point de branchement ou BP, sites donneur et accepteur d'épissage, sites ESE (Exonic Séquence Enhancer) de liaisons de facteurs d'épissage (protéines SR)) sont privilégiées. Elles peuvent être aisément déterminées par l'homme du métier et sont illustrées, en rapport avec le gène humain de séquence SEQ ID NO : 1, à la figure 7.

Il peut par exemple s'agir des séquences antisens suivantes :

Alternativement, un ARN interfèrent, de type si (« small interférence ») constitue également un inhibiteur privilégié au sens de l'invention. A titre d'exemple pour illustrer l'invention, les oligonucléotides suivants, dont la position est repérée sur la figure 8, sont susceptibles d'exercer cette fonction, à la fois chez la souris et l'homme :

TGGAAGAAGACCTCCGGAAA (SEQ ID NO : 3)

CCCATGATCAAAGTTTCAT (SEQ ID NO : 4)

AACCTCTCCTTCTGGTCTGAACA (SEQ ID NO : 5)

CCAAAGAGATGCACGGGAA (SEQ ID NO : 6)

GCAACAAGGAGCTGGGTGT (SEQ ID NO : 7)

ACAAGGACCTGAAGACACA (SEQ ID NO : 8).

L'homme du métier peut aisément vérifier si la molécule testée en tant qu'inhibiteur de la calpaïne 3 affecte le niveau d'expression et/ou de production de la calpaïne 3, notamment à l'aide des techniques bien connues suivantes :

niveau d'expression du transcrit par Northern blot ou PCR ;

- niveau de production de la protéine par détection à l'aide d'anticorps (Western blot ou ELI SA). Selon un second mode de réalisation, la calpaïne 3 est « normalement » produite mais c'est son activité qui est affectée par l'inhibiteur en question. Dans ce cas de figure, l'inhibiteur est typiquement un anticorps de la calpaïne 3, une molécule chimique, une protéine ou un peptide ayant l'activité inhibitrice recherchée.

L'activité de la calpaïne 3 peut être mesurée grâce à différents tests, notamment ceux décrits dans les documents WO 2003/002730, WO2007/039699 et Milic et al. (2007).

Concernant l'utilisation d'anticorps spécifiques de la calpaïne 3, certains sont disponibles et peuvent être mis en œuvre dans le cadre de la présente invention. Il s'agit par exemple de l'anticorps décrit dans le document Baghdiguian et al. (1999).

Concernant les protéines ou peptides d'intérêt, ceux-ci sont avantageusement choisis parmi ceux ayant une activité inhibitrice de la calpaïne 3 in vivo. Ainsi, l'équipe d'Isabelle Richard a récemment montré que la protéine myospryne (CMYA5, cardiomyopathy-associated 5) de séquence SEQ ID NO : 9 (humaine) ou SEQ ID NO : 10 (murine), était apte à assurer cette fonction. Un fragment actif de celle-ci, par exemple de séquence SEQ ID NO : 11 (humaine) ou SEQ ID NO : 12 (murine), peut également être mis en œuvre dans le cadre de l'invention. L'apport exogène des ces protéines ou de peptides actifs dérivés a donc pour conséquence de réduire in vivo l'activité de la calpaïne 3 et ainsi d'améliorer les états pathologiques visés par la présente invention.

Enfin, les tests d'activité décrits ci-dessous permettent une approche pharmaco logique classique, à savoir l'identification de molécules chimiques ayant l'activité inhibitrice recherchée. A cette fin, des banques de molécules disponibles peuvent être utilisées.

Plus généralement et selon un second aspect, la présente invention concerne un procédé d'identification ou de criblage de médicaments pour le traitement de dystrophies musculaires, avantageusement de la TMD, ou de cardiomyopathies.

Il s'agit alors d'évaluer le potentiel inhibiteur du composé testé sur la calpaïne 3.

Ce procédé est avantageusement mis en œuvre in vitro. Là-encore, le potentiel inhibiteur peut être évalué soit en mesurant l'expression ou la production de calpaïne 3, soit en mesurant son activité, à l'aide des techniques mentionnées précédemment. Ces mesures sont réalisées parallèlement en présence et en absence du composé testé, puis comparées.

Dans le cas où une diminution de la calpaïne 3 est observée en présence du composé testé, celui-ci constitue un médicament candidat pour le traitement des pathologies visées.

Concernant les pathologies visées, il s'agit donc de celles associées à une surexpression ou à une suractivation de la calpaïne 3. Avantageusement, la présente invention trouve des applications dans le traitement de dystrophies musculaires, affectant les muscles squelettiques. Plus généralement sont visées les pathologies visant le muscle strié, et donc également celles affectant le muscle cardiaque appelées cardiomyopathies.

De manière très claire et pour la première fois, la présente invention met en évidence la possibilité de traiter la dystrophie musculaire tibiale (TMD pour Tibial Muscular Dystrophy) à l'aide de cette stratégie.

Plus généralement, la présente invention révèle, pour la première fois, la corrélation entre dystrophies musculaires et une possible suractivation de la calpaïne 3. Il est rappelé qu'à ce jour, ne sont identifiées, en rapport avec la calpaïne 3, que les dystrophies des ceintures liées à une calpaïne 3 déficiente. La présente invention met en lumière l'existence de dystrophies musculaires possiblement dues à une surexpression ou suractivation de la calpaïne 3, qui peuvent être appelées « calpainopathies dominantes » et être traitées à l'aide de la stratégie proposée.

De même, la présente invention vise le traitement de cardiomyopathies possiblement dues à une surexpression ou suractivation de la calpaïne 3, ou à un apport exogène de calpaïne 3. En effet, la calpaïne 3 est exprimée dans le cœur, quoique bien plus faiblement que dans le muscle squelettique (Taveau et al., 2002) et l'équipe d'Isabelle Richard a montré qu'au delà d'un seuil, la calpaïne 3 pouvait entraîner des effets délétères sur le muscle cardiaque. L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants, à l'appui des figures annexées. Ceux-ci n'ont toutefois aucune portée limitative.

L'invention est illustrée plus avant en rapport avec la TMD chez la souris.

Figure 1 : AI Histologie des muscles des souris hétérozygotes pour la mutation FINmaj et WT. (TA=Tibialis Antérieur, QUA= Quadriceps, BF=Biceps Femoris, SOL : Soleus, GLU: Glutens, PLA : Plantaire, PSO : Psoas, DEL: Deltoïde, GA: Gastrocnemius). Atteinte du TA, QUAD et BF dans les souris hétérozygotes pour la mutation FINmaj à 9 mois. B/ Quantification de la centronucléation des fibres des muscles TA, QUA et BF des souris HE et WT.

Figure 2 : Western Blot réalisé sur broyats de muscles de souris WT et HE et hybridé avec les anticorps contre la calpaïne 3 et l'actine. Quantification de la quantité de calpaïne 3 dans les muscles, rapportée à l'actine utilisée comme normalisateur en unités arbitraires (UA) (n=4).

Figure 3 : Marquage des bandes de dégradation de la titine grâce à un anticorps dirigé contre la partie terminale de la titine (codée par le dernier exon) après fractionnement subcellulaire des Psoas des souris WT et HE pou la mutation FINmaj.

Figure 4 : AI Histologie des muscles hétérozygotes pour la mutation FINmaj et WT après injection IM de l'AAV codant pour la calpaïne 3 humaine. B/ quantification de la centronucléation des fibres des TA injectés et non injectés avec l'AAV C3 des souris WT et HE.

Figure 5 : Histologie des muscles des souris HE et WT, capn3+/- et HE/ capn3+/- à 9 mois et quantification de la centronucléation. Al TA B/ QUAD C/ BF. Barre =50 um. Figure 6 : Histologie des muscles des souris HE et WT, capn3+/- et HE/ capn3+/- à 12 mois et quantification de la centronucléation. AI TA B/ QUAD CI BF. Barre = 50μιη.

Figure 7 : Localisation de cibles potentielles pour les séquences antisens, situées dans les introns (minuscules)/exons (majuscules) 2, 3, 4, 5, 7, 8 et 10, au niveau :

(A) des sites de branchement (en foncé, avec prédiction UMD score) et des sites d'épissage donneur et accepteur (en clair) ;

(B) des sites ESE prédits selon « rescue ESE » ;

- (C) des sites ESE prédits selon « ESE fïnder ».

Figure 8 : Position des oligonucléotides 1 à 6 (SEQ ID NOS : 3 à 8) susceptibles de diminuer l'expression du messager de la calpaïne 3 par ARN interférence. Figure 9 : RT-PCR sur la calpaïne 3 murine entre les exons 2 et 6 après transfection 24h du minigène C3 et des AONs en cellule HER911. L'ARN entier transcrit et épissé à partir du minigène donne une bande à 645 pb. L'utilisation des AONs exon3-ESE2 et exon4-ESEl montre la présence d'une bande plus importante d'ARN épissé par saut d'exon. Les flèches indiquent les isoformes principaux après saut d'exon.

Figure 10 : Test des AONs combinés sur l'exon 3, 4 ou 5 sur les cellules 911 préalablement transfectées avec le minigène calpaïne 3.

Figure 11 : Saut des exons 3, 4 ou 5 par les AONs seuls ou combinés sur la calpaïne 3 endogène dans les cellules HER911.

Figure 12 : RT-PCR de l'exon 2 à 5 (495pb) réalisées sur les ARNs extraits des TAG injectés avec les AONs ciblant l'exon 3 ; Les TAD sont les contrôles latéraux de l'expérience. Dans la plupart des TAG la quantité de calpaïne 3 visible est nettement diminuée (flèche).

Figure 13 : RT-PCR en temps réel de la calpaïne 3 réalisées sur les ARNs extraits des TAG injectés avec les AONs ciblant l'exon 3 ; les TAD sont les contrôles latéraux de l'expérience. Ici dans un souci de clarté seules les souris injectées avec ΓΑΟΝ EX3- ESE1 sont présentées. Dans tous les TAG la courbe d'amplification de la calpaïne 3 est décalée vers la droite. Chaque échantillon est présenté en duplicata.

Figure 14 : Représentation du nombre de cycles au bout duquel la valeur arbitrairement choisie de 0,2 est atteinte par RT-PCR en temps réel.

I) MATERIEL ET METHODES

1. GENERATION DES SOURIS ET GENOTYPAGE

La construction du vecteur de ciblage utilisé pour la génération de la souris knock-in FINmaj a été réalisée à l'Institut « Clinique de la souris » (ICS, France). Un fragment de 2,2 kb englobant les exons Mex2 à Mex6 de la titine a été amplifié par PCR sur de l'ADN génomique de souris 129S2/SvPas avec des amorces modifiées afin d'introduire la mutation GAAATAACATGG -> GTGAAAGAAAAA dans l'exon 6. Le fragment muté a été sous-cloné dans un vecteur contenant une cassette de résistance lox-néomycine. Deux fragments de 2,8 kb et 3,6 kb (correspondant aux bras d'homologie 5 'et 3', respectivement) ont été amplifiés par PCR sur de l'ADN génomique de souris 129S2/SvPas et sous-clonés directement en amont et en aval de la construction du plasmide précédent afin de générer la construction finale. La séquence des plasmides a été vérifiée par restriction et tous les exons et les jonctions exon-intron ont été séquencées. La construction linéarisée a été électroporée dans des cellules souches embryonnaires (ES) de souris 129S2/SvPas et les colonies G418 -résistantes ont été isolées et amplifiées. La séquence des clones obtenus a été validée après amplification PCR en utilisant des amorces externes, confirmée par Southern blot avec des sondes externes 5' et 3' et a permis d'identifier un clone avec un allèle correctement ciblé. Après caryogramme, le clone transgénique ES a été injecté dans des blastocystes C57BL/6J qui ont été réimplantés dans des mères porteuses pour générer des souris chimères. La transmission à la lignée germinale a été obtenue après croisement des chimères mâles avec des femelles transgéniques CMV-CRE exprimant la CRE recombinase sous le promoteur CMV, permettant l'excision de la cassette néo. Le transgène Cre a été éliminé par un premier croisement sur fond C57BL/6; les souris hétérozygotes résultantes ont ensuite été rétrocroisées sur 3 générations sur fond C57BL/6, puis croisées ente elles. Toutes les souris ont été traitées conformément à la directive du Conseil de la Communauté européenne du 24 Novembre 1986 (86/609/CEE).

L'introduction de la mutation dans le génome murin a été vérifiée par séquençage de fragments de PCR obtenus par amplification de l'ADN de queue, isolé en utilisant le kit REDExtract-N-PCR AmpTM tissus (Sigma), à l'aide des amorces TTN 1180 située autour du site loxP (SEQ ID NO : 13 = GCTATCTGCACCTC AAAATCTGTGGGTTG) et TTN 1183 (SEQ ID NO : 14 = GAACCCTGACCC TCTGGAAGAACATC). Les allèles résultant de type sauvage et mutant correspondent à des fragments de PCR de 414 et 502 pb, respectivement.

Le modèle de souris portant à la fois la mutation FINmaj et l'allèle mutant de la calpaïne 3 a été obtenu par croisement de souris femelles avec des souris mâles déficients en calpaine 3 (Richard et al, 2000). Le génotypage pour les mutations FINmaj et calpaïne 3 a été réalisé sur l'ADN de queue, respectivement comme décrit ci-dessus et en utilisant des amorces pour la calpaïne 3 (amorces avant: GW255 (SEQ ID NO : 15 = AGTCTTCCTTCCAAAGTTGCCTGC) et GW 257 (SEQ ID NO : 16 = GTGCTACTTCCATTTGTCACGTCC) et amorce inverse GW 259 (SEQ ID NO : 17 = ACTTCTCTGAAGC AAACTCC AGCC) . Les allèles résultant de type sauvage et mutant correspondent à des fragments de PCR de 380 et de 480bp, respectivement.

2. HISTOLOGIE, IMMUNOHISTOCHIMIE ET MORPHOMETRIE

Des cryosections (8 ou 10 mm d'épaisseur) ont été préparées à partir de muscles squelettiques et cardiaques congelés. Les sections transversales ont été traitées pour la coloration histologique hématoxyline phloxine safran (HPS).

Colorimétrique et immunomarquage avec la laminine ont été réalisées selon le protocole ARK kit peroxydase (Dako) pour évaluer le nombre et le diamètre minimal de fibres. Les anticorps utilisés pour ces détections sont respectivement: un anticorps anti-laminine polyclonal (Progen, P-4417, la dilution 1 : 1000). Les images numériques des coupes colorées ont été acquises avec une caméra CCD (Sony) et d'une platine motorisée d'un microscope Nikon Eclipse E60. Les images ont été analysées avec le logiciel Ellix (Microvision, France).

3. WESTERN BLOT ET DÉ TERMINATION DE L 'ACTIVITÉ DE LA CALPAINE 3

Le tissu musculaire a été pesé et homogénéisé l'aide d'un Ultra-Turrax T8 (IKA, Allemagne). Un test in vitro mesurant l'activité calpaïne 3 a ensuite été effectué sur ces extraits comme décrit précédemment (Milic et al, 2007). Pour le western blot détectant la titine, les protéines ont été extraites avec le Kit Subcellular ProteoExtract Proteome (Spek, Calbiochem, Allemagne). Dans ces conditions expérimentales, le western blot de la fraction du cytosquelette à l'aide de l'anticorps M 10 révèle des bandes titine spécifiques. Les Western blot ont été réalisés comme décrit à l'aide de 50 μg de protéines (Milic et al, 2007).

L'analyse de l'activité protéolytique de la calpaïne 3 a été réalisée à l'aide d'un anticorps polyclonal de lapin anti-calpaïne 3 (Baghdiguian et al., 1999; dilution 1 : 150) et un anticorps monoclonal de souris anti-alpha-actine (A4700, Sigma; dilution au 1 : 500). Les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires anti-souris et anti-lapin (1 : 10,000) couplés à IRDye ® pour la révélation par le scanner infrarouge Odyssey (LI-COR Biosciences, Nebraska, USA). La quantification des bandes a été réalisée avec le logiciel Odyssey 2,1 (LI-COR Biosciences). La détection des bandes de titine a été effectuée en utilisant l'anticorps M 10. Les membranes ont été incubées avec des anticorps anti-souris ou de lapin anti-secondaire (1 : 10,000) couplé à la peroxydase (HRP; Amersham Biosciences, NJ, USA). La révélation a été réalisée avec le substrat HRP chimio luminescent Super Signal West kit Pico (Pierce, IL, USA).

4. TRANSFERT IN vivo MEDIE PAR L 'AA VDE L 'ADNC DE LA CALPAÏNE 3

Les préparations virales d'adénovirus AAV2/1 ont été générées en incorporant les génomes viraux recombinants de type AAV2-ITR dans des capsides AAV1 en utilisant un protocole de tri-transfection plasmidique comme décrit (Bartoli, 2006). Brièvement, des cellules 293 HEK (confluentes à 60%) ont été co-transfectées avec pAAV-calpain3, le plasmide RepCap (pLT-RC02), et le plasmide helper adenoviral (pXX6) à un ratio de 1 : 1 :2. Le lysat viral brut est récolté 60 heures après la transfection. Pour faciliter le relargage des particules virales, le lysat brut est séquentiellement traité par quatre cycles de congélation-décongélation, digéré par la benzonase (15' à 37°C) et précipité au sulfate d'ammonium. Finalement, le lysat viral est purifié par deux cycles d'ultracentrifugation en CsCl, puis suivi par des dialyses afin d'éliminer le CsCl. La détermination du titre viral est obtenue par PCR en temps réel, comme décrit dans Fougerousse et al (2007).

Les souris ont reçu par injection intramusculaire dans le muscle Tibialis Anterior (TA) gauche 30 μΐ d'AAVr2/l-calpaine3 (1.10 ^e12 vg). Un mois après l'injection, les souris sont sacrifiées et les muscles sont prélevés puis rapidement congelés dans de l'azote liquide refroidi en isopentane. II) RESULTATS

I. Caractérisation du modèle murin reproduisant la mutation FINmaj à l'état hétérozygote 1) Le modèle murin portant la mutation FINmaj (knock-in) présente une atteinte musculaire tardive et localisée

Afin d'étudier la pathologie TMD, un Knock-in murin de la mutation FINmaj (souris Kl TTN FINmaj) a été créée à la Clinique de la Souris par recombinaison homologue. Les souris hétérozygotes (HE) pour la mutation ont été caractérisées à différents âges en parallèle de souris saines (WT). Bien qu'elles ne montrent aucune atteinte globale, certains muscles montrent un profil de centronucléation tardivement, à partir de l'âge de 9 mois, comme le TA, le QUAD (Quadriceps) et le BF (Biceps Femoris). L'histologie des muscles a été réalisée sur des souris de 3, 6, 9 et 12 mois et les muscles ont été examinés par coloration à l'hématoxyline/éosine et comparés à ceux de souris WT (Figure 1A). Enfin, le calcul des fibres centronucléées a été réalisé sur ces mêmes muscles comparativement aux souris WT (Figure 1B). 2) Les conséquences au niveau moléculaire de la mutation FINmaj chez les souris hétérozygotes

Il a été mis en évidence une tendance à la diminution de la quantité de protéine calpaïne 3 (non significative) chez les souris hétérozygotes pour la mutation FINmaj, après réalisation d'un Western Blot sur protéines extraites des TA (Figure 2). Enfin, un marquage de la ligne M de la titine sur un western blot, permettant de voir les bandes de dégradation de celle-ci suite à un fractionnement subcellulaire des cellules musculaires, a été réalisé. Comme indiqué dans la publication de (Hackman et al., 2008), il a été mis en évidence la perte de 50% du marquage de la titine en utilisant un anticorps ciblant la partie C-terminale de la titine (Figure 3).

II. Modulation de l'expression de la calpaïne 3 dans le modèle murin reproduisant la mutation FINmaj à l'état hétérozygote 1) L'injection de calpaïne 3 aggrave l'atteinte histologique des souris TMD

Des souris saines et hétérozygotes pour la mutation FINmaj ont reçu une injection en intramusculaire, grâce à un AAV codant pour la calpaïne 3 humaine, à l'âge de 9 mois dans l'un des TA afin de regarder quel effet la surexpression de calpaïne 3 pouvait avoir sur le profil histologique du TA.

Cette surexpression n'a aucun effet sur un muscle sain. Par contre, les muscles des souris hétérozygotes pour la mutation FINmaj injecté avec l'AAV C3 montrent un taux de centronucléation nettement plus élevé que le TA contrôle non injecté (Figure 4 A et B).

2) La diminution de la quantité de calpaïne 3 améliore le phénotype musculaire des souris hétérozygotes pour la mutation FINmaj La surexpression de la calpaïne 3 dans les muscles de souris hétérozygotes pour la mutation FINmaj tendant à aggraver le phénotype musculaire des souris Knock-in pour la mutation finlandaise, les conséquences de la diminution de la quantité de calpaïne 3 dans les muscles de ces souris ont été testées en croisant les souris hétérozygotes pour la mutation avec des souris déficientes en calpaïne 3 (KO calpaïne 3) (Richard et al., 2000) afin d'obtenir des souris hétérozygotes FINmaj exprimant 50% de la calpaïne 3 (capn3+/-). Les muscles des souris WT, HE, capn3+/- et HE/capn3+/- ont été analysés en histologie à l'âge de 9 et 12 mois. Il est à noter que les souris capn3+/- ne montrent aucune atteinte histologique à ces âges. A 9 mois, l'histologie des muscles TA, QUA et BF (figure 5 A, B et C) atteints chez les HE montre un profil avec très peu de fibres centronucléées. La quantification des fibres centronucléées montre une nette diminution de celles-ci et une restauration proche de ce qui est constaté chez des souris WT (n=3). La même chose a pu être observée chez les souris HE FINmaj ;capn+/-. En effet, ces souris montrent une réelle amélioration de l'état des muscles TA, QUA et BF (figure 6 A, B et C). 3) Conclusion

En conclusion, il a été montré que la diminution de l'expression de la calpaïne 3 dans les muscles atteintes des souris hétérozygotes pour la mutation FINmaj (majoritaire en Finlande) et entraînant chez l'Homme une dystrophie musculaire tibiale (TMD), permet de rétablir et de diminuer l'atteinte dystrophique des muscles atteints habituellement chez ces souris à l'âge de 9 mois (notamment la quantité de fibres centronucléées).

III. Identification d'inhibiteurs de la calpaïne 3

L'inhibiteur recherché est destiné à réaliser du saut d'exons de la calpaïne 3 pour bloquer en partie la traduction de cette protéine, et ainsi diminuer la quantité de calpaïne 3 dans le muscle des souris hétérozygotes pour la mutation FINmaj. Les séquences antisens susceptibles d'induire du saut d'exons, afin d'éliminer un exon critique pour l'activité protéolytique ou d'induire une rupture du cadre de lecture en début de séquence, sont des candidats privilégiés. Les exons ciblés sont avantageusement les exons 2, 3, 4, 5, 7, 8 et 10. Au niveau des séquences correspondantes, les séquences importantes pour l'épissage (point de branchement ou BP, sites donneur et accepteur d'épissage, sites ESE (Exonic Séquence Enhancer) de liaisons de facteurs d'épissage (protéines SR) sont privilégiées. Elles sont illustrées par rapport au gène humain de séquence SEQ ID NO : 1, à la figure 7.

Dans la mesure où les expérimentations sont réalisées au préalable chez la souris, les expériences suivantes ont été réalisées sur la séquence du gène murin de la calpaïne 3. Les séquences murines sur les exons 3 , 4 et 5 choisies sont présentées à la Table 1 : Table 1 : Oligonucléotides 2'omethyl spécifiques de la calpaïne 3 testé pour le saut d'exon chez la souris.

L'efficacité de la molécule testée en tant qu'inhibiteur de la calpaïne 3 peut être vérifiée par le niveau d'expression et/ou de production de la calpaïne 3, notamment à l'aide des techniques bien connues suivantes :

- niveau d'expression du transcrit par RT- PCR ;

- niveau de production de la protéine par détection à l'aide d'anticorps (Western blot ou ELI SA).

1) Preuve de principe du saut d'exon de la calpaïne 3 sur un minigène

Des tests préliminaires visant à évaluer la possibilité de réaliser le saut d' exons sur l'ARN de la calpaïne 3 (exon 3, 4 ou 5) ont été réalisés in vitro sur un minigène murin constitué des exons et introns 2 à 6.

Pour sauter les exons 3, 4 ou 5, des oligonucléotides de chimie 2'omethyl (AONs) ont été synthétisés chez la société Eurogentec selon une purification PAGE. 3 AONs ont été sélectionnés par exon (voir table 1 ci-dessus).

Après 24h de transfection du minigène dans des cellules de rétinoblastes humains (HER911), par le Fugène HD (Roche), les AONs ont été ajoutés aux cellules pendant 24h par le même type de transfection. Les cellules ont été ensuite récupérées et une extraction d'ARN a été réalisée suivie d'une reverse transcription. Une PCR entre les exons 2 et 6 a alors été réalisée afin de déterminer si les exons ont été sautés sur le minigène. La taille attendue du minigène après épissage avec la PCR exon 2 à 6 est de 645pb. D'autres bandes sont visibles dans le cas de la présence du minigène seul qui est la conséquence de saut d'exon interne sans présence des AONs.

Tailles possibles prédites :

ex2+ ex3 + ex4 + ex5 + ex6= 645 pb

ex2 + ex4 + ex5 + ex6 = 526 pb

ex2 + ex3+ ex5 + ex6= 511 pb

ex 2 + ex 3 + ex4 + ex 6= 476 pb

ex2 + ex 5 + ex 6 = 392 pb

ex2 + ex 3 + ex6= 342 pb

ex2 + ex6 = 223 pb

Sur le minigène, l'utilisation de l'oligonucléotide exon3-ESE2 entraîne un saut d'exon plus important de l'exon 3 (bande visible à 526 pb). L'AON exon4-ESEl permet également d'obtenir un saut de l'exon 4 plus important (Figure 9).

Ces mêmes AONs ont été testés combinés sur le minigène de la calpaïne 3 afin d'améliorer l'approche citée. Les 3 AONs ciblant l'exon 3 ainsi que ceux ciblant l'exon 4 et 5 ont été combinés et transfectés avec le minigène comme précédemment. Le trio exon 3 et exon 4 entraînent tous les deux un saut d'exon important du minigène de la calpaïne 3 (figure 10).

Enfin, le saut de ces exons a été testé sur l'ARN endogène de la calpaïne 3 dans des cellules HER911 qui contiennent une petite quantité d'ARNm calpaïne 3 mais pas la protéine correspondante. De nouveau, les AONs ont été testés seuls ou combinés. La PCR a été réalisée entre les exons 2 et 5 : taille attendue : 495 pb pour l'ARN entier.

Tailles possibles prédites :

Taille entière : ex2+ ex3 + ex4 + ex5 = 495 pb

ex2 + ex4 + ex5 = 376 pb

ex2 + ex3+ ex5 = 361 pb

ex2 + ex 5 = 242 pb

Comme il apparaît à la figure 11, ΓΑΟΝ exon4-ESE2 entraîne le saut des exons 3 et 4 entraînant une bande à 242 pb, le trio exon 3 entraîne le saut de l'exon 3 visible par la bande à 376 pb et le trio exon 4 entraîne le saut de l'exon 4 avec une bande visible à 376 pb. 2) Preuve de principe du saut d'exon de la calpaïne 3 in vivo sur les souris Kl TTN FINmaj HE.

L'approche in vivo a été réalisée en utilisant les AONs ciblant l'exon 3 seulement, cités précédemment (ex3-BP, ex3-ESEl-ex3-ESE2). 3mM de chaque AON a été associé au PEI et injectés en IM dans le TA gauche (TAG) 2 jours consécutifs chez des souris WT (« wild-type ») et hétérozygotes pour la mutation FINmaj.

Après 10 jours, les muscles ont été prélevés avec leurs témoins latéraux (TAD) et broyés pour récupérer les ARN messagers et les protéines.

Une RT-PCR réalisées entre les exons 2 à 5 de la calpaïne 3 permet de mettre en évidence dans les TAG une nette diminution de la quantité de calpaïne 3 suggérant que le saut d'exon a fonctionné et à entraîné un saut d'exon important (Figure 12).

Une RT-PCR en temps réel a ensuite été réalisée au moyen d'une sonde Taqman pour quantifier la diminution de calpaïne 3 dans les muscles TAG par rapport à leurs témoins latéraux TAD. Les courbes d'amplification PCR montrent clairement un retard d'amplification dans le cas des TAG, ainsi qu'on le voit pour exemple dans le cas des souris injectées avec ΓΑΟΝ EX3-ESE1 (Figure 13).

A partir de cette RT-PCR en temps réel, il est possible d'extraire le nombre de cycles de PCR au bout duquel la valeur (arbitraire) de 0,2 est atteinte (Figure 13 : au-niveau de la flèche). Ces valeurs ont été moyennées groupes par groupes et sont présentées à la figure 14. Ce nombre de cycles représente la quantité de matrice de départ : plus le nombre de cycles est grand, moins la calpaïne 3 est présente dans le muscle.

Un Western Blot (WB) a été réalisé sur les extraits cellulaires de cette expérience in vivo. La calpaïne 3 est mise en évidence grâce à un anticorps (12A2). Le WB montre la présence de la calpaïne 3 aux tailles de 94 et 55KD, ainsi que l'apparition d'une bande de 30 kD dans tous les TAG injectés avec les AONs. Ceci indique qu'une protéine plus petite est issue du saut d'exon, protéine qui ne comprend pas le domaine codé par l'exon 3 et qui correspond au domaine catalytique de la calpaïne 3. Cette protéine est donc non- fonctionnelle. En conclusion, ces données montrent que l'utilisation d'inhibiteurs génétiques de la calpaïne 3 peut permettre de diminuer in vitro et in vivo la quantité de calpaïne 3. La preuve de principe in vivo a été réalisée sur des souris WWT et HE pour la mutation FINmaj. Cette approche est donc possible pour traiter notamment les mutations hétérozygotes TMD.

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