ISOTOPIQUE STABLE

La présente invention concerne le domaine médical, et notamment le pronostic dans le domaine du cancer,

Plus précisément, l'invention est relative à un procédé de pronostic chez un patient atteint d'un cancer, qui est basé sur l'étude de la variation de deux isotopes stables d'un élément chimique, et en particulier d'un élément métallique choisi parmi le cuivre et le zinc.

Pour la prise en charge des patients atteints de cancer, il est très important de pouvoir déterminer un pronostic, de manière à pouvoir adapter au mieux le traitement et/ou le suivi de ces patients. Par exemple, une thérapie plus intensive ou modifiée peut être envisagée chez les patients qui sont atteints d'un cancer associé à un pronostic défavorable, notamment dans le bu de les traiter efficacement et préventivement avant l'apparition de métastases éventuelles. De même, une simple surveillance peut être considérée comme suffisante chez les patients qui sont atteints d'un cancer peu ou pas évolutif associé à un pronostic plutôt favorable.

Il existe à ce jour un certain nombre de critères cliniques, histologiques et biologiques qui permettent de déterminer le pronostic d'un cancer. Plus spécifiquement, il est possible d'utiliser des biomarqueurs de type antigène (PSA ou antigène prostatique spécifique, ACE ou antigène carcino-embryonnaire, CA15.3 ou Carbohydra e Antigen 153, CA19.9 ou Carbohydrate Antigen 19.9), génétique (HER2 ou Human Epidermai growth factor R œptor-2, K AS) ou cellulaire HCG ou hormone gonadotrophine chorionique, gastrine, AFP ou alpha foeto-protéine, CYFRA 21-1 ou CYtokeratin-21 -FRAgment

Il reste néanmoins difficile de prévoir comment un cancer va évoluer et il est donc difficile de prédire quels sont les patients qui ont un cancer à haut potentiel évolutif et qui doiven donc être traités de façon intensive, et quels sont les patients pour lesquels une simple surveillance serait suffisante. De plus, pour les patients sous traitement, les marqueurs connus sont souvent peu fiables, ce qui rend difficile l'estimation de l'efficacité de la thérapeutique mise en place, voire i'anticipation d'une récidive éventuelle.

Tout ceci limite donc de manière substantielle les possibilités d'ajustement des traitements actuellement disponibles.

Disposer de nouvelles approches pronostiques permettrait une meilleure segmentation de la population des patients atteints de cancer en sous-catégories et ainsi de pouvoir guider les cliniciens dans leurs démarches thérapeutiques et adapter au mieux les traitements aux patients. En particulier, un marqueur, et notamment un marqueur sérique, de pronostic ou d'évolutivité serait un outil très utile pour décider de la mise en place ou de la poursuite de traitements de fonds aux effets secondaires souvent importants, et de la fréquence à laquelle le suivi clinique doit être réalisé.

Dans ces conditions, il existe un réel besoin de disposer de nouveaux marqueurs pronostiques concernant le pronostic ou évoiutivité des cancers. De plus, il serait très avantageux de disposer d'un marqueur facilement détectable pour améliorer le confort du patient et diminuer les coûts de santé publique associés au suivi de ces cancers.

C'est dans ce contexte que les inventeurs ont découvert ce qui fait l'objet de la présente invention, qui est en particulier basée sur l'étude de la variation isotopique de deux isotopes stables d'un élément chimique, et en particulier d'un élément métallique, pour établir un pronostic chez les patients atteints de cancer.

Selon un premier aspect, la présente invention a donc pour objet un procédé de pronostic d'un cancer chez un sujet, comprenant les étapes suivantes, voire consistant en les étapes suivantes :

- mesurer le rapport isotopique entre deux isotopes stables du cuivre ou entre deux isotopes stables du zinc, dans un échantillon biologique à tester issu dudit sujet,

- comparer ce rapport isotopique à celui mesuré dans un échantillon de référence,

- conclure sur le pronostic, favorable ou défavorable, dudit cancer chez ledit sujet en fonction de la variation du rapport isotopique. Ainsi, les inventeurs ont montré que la variation du rapport isotopique entre deux isotopes stables du cuivre ou du zinc, est associée à une évolution du cancer, dans un sens positif ou négatif, ce qui en fait un marqueur de pronostic du cancer utiie pour le suivi des sujets diagnostiqués, en particulier chez l'homme. Autrement dit, les variations isotopiques qui sont observées chez les patients atteints d'un cancer sont en accord avec les variations de cette maladie, en termes d'évolution.

Dans l'art antérieur, les variations dlsotopes stables de certains éléments ont été étudiées, et éventuellement proposées pour une utilisation future sous la forme d'un diagnostic de maladies liées à ces éléments, comme le cuivre pour la maladie de Wiison {Aramendia M. et al., 2013, 28, 675-681). Une étude des variations isotopiques du fer a également été menée chez des patients atteints d'hémochromatose héréditaire par rapport à des individus sains (Krayenbuehl, P-A. et al., 2005, Blood, 105 (10), 3812- 3816).

S'agissant du cancer, le seul lien mis en évidence jusqu'à maintenant d'un point de vue diagnostic entre les éléments chimiques et le cancer a été étudié sous l'angle des concentrations totales d'éléments métalliques tels que le cuivre, mais jamais sous l'angle de llsotopie stable (Hrgovcic M. et ai, 1973, 31, 1337-1345; Fisher G. L et ai, 1976, 37, 356-363).

Dans le cadre d la présente demande, les termes « cancer » et « tumeur » sont utilisés indifféremment pour désigner un cancer, c'est-à-dire qu'ici le terme « tumeur » s'entend désigner une tumeur maligne c'est-à-dire cancéreuse.

Au sens de la présente invention, l'expression « mesurer le rapport isotopique» s'entend désigner la mesure in vitro ou ex vivo dudit rapport isotopique.

Dans le cadre du procédé selon l'invention, l'établissement du « pronostic » consiste à déterminer l'évolution, favorable ou défavorable, du cancer, et notamment i'agressivité et/ou l'extension tumorale. Le « pronostic » peut égalemen couvrir l'évaluation de la réponse, que ce soit dans un sens positif ou négatif, à un traitement mis en place chez un sujet pour qui le diagnostic du cancer a déjà été posé, comme par exemple une chirurgie, une radiothérapie, une chimiothérapie, etc.

Les éléments chimiques, et en particulier ies éléments métalliques, peuvent exister dans la nature sous plusieurs formes, les isotopes, qui ne diffèrent que par leur nombre de neutrons et donc par leur masse atomique.

Les isotopes dits stables sont pourvus d'un noyau de structure stable, qui ne subit aucune modification au cours du temps en l'absence d'apport d'énergie extérieure, contrairement aux isotopes dits radioactifs qui possèdent un noyau instable qui se transforme spontanément en un autre par émission d'un rayonnement ou d'une particule.

La présente invention est, en particulier, mise en œuvre sans aucun ajout d'un traceur radioactif, de queique sorte que ce soit.

Les éléments chimiques qui peuvent exister sous forme d'isotopes peuvent avoir deux isotopes différents ou plus. Ainsi, selon le procédé de l'invention, le rapport isotopique de deux isotopes stables, qui est mesuré, peut notamment être le rapport entre un isotope 1 et un isotope 2 pour lequel ia masse de l'isotope 1 est supérieure à celle de l'isotope 2, et ce, quel que soit l'élément chimique concerné qui possède des isotopes stables.

En revanche, il est également possible de mesurer le rapport isotopique selon l'invention entre l'isotope 2 et l'isotope 1 tels que définis ci- dessus.

Idéalement, le rapport isotopique qui est mesuré est rapporté à la valeur d'un standard ou étalon isotopique de l'élément chimique choisi (le cuivre ou le zinc). Le choix du standard ou étalon utilisé est donc fonction de l'élément chimique duquel on souhaite mesurer le rapport isotopique. Ceci permet avantageusement de pouvoir mesurer séparément dans le temps le rapport isotopique dans l'échantillon à tester et le rapport isotopique dans l'échantillon de référence, e ainsi d'éviter de devoir mesurer ces deux rapports isotopiques en même temps. Parmi les standards ou étalons qui peuvent être utilisés, on peut notamment citer le standard international STD NÎST SRM 976 (copper isotopic standard) pour le cuivre et le standard Alfa Aesar Lot 02040110 {Zn standard) pour le zinc. Dans le cas particulier où l'élément chimique dont on souhaite mesurer le rapport isotopique possède plus de deux Isotopes stables et que l'on souhaite comparer les valeurs de rapports isotopiques différents d'un même élément chimique entre l'échantiHon à tester et l'échantillon de référence, le rapport isotopique qui est mesuré dans te procédé selon l'invention peut être rapporté à l'écart de masse entre les deux isotopes ou tout du moins tenir compte de cet écart de masse pour la comparaison.

Globalement, quelle que soit Sa manière de mesurer le rapport isotopique dans le cadre du procédé de l'invention, les conclusions quant au pronostic seront les mêmes dans la mesure où celles-ci sont basées su la variation de ce rapport isotopique.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré du procédé de l'invention, le rapport isotopique est mesuré à l'aide de la formule I suivante :

dans laquelle :

EL représente le cuivre ou ie zinc pour lequel on souhaite mesurer le rapport isotopique,

ECH représente l'échantillon biologique à tester,

EF représente l'échantillon de référence,

STD représente le standard ou étalon isotopique de l'élément chimique EL choisi.

La méthode de mesure du rapport isotopique des deux isotopes stables selon l'invention peut être n'importe quelle méthode connue par l'homme du métier dans ie domaine. En particulier, on peut citer ia spectrométrie de masse, et notamment la spectrométrie de masse à source plasma et à multi-coliection ou MGICP-MS, mais également les techniques nucléaires ou laser. Selon un autre mode de réalisation selon la présente invention, le procédé comprend, préalablement à la mesure du rapport isotopique entre deux isotopes stables de l'élément chimique choisi, une étape de mesure de ia concentration totale dudit élément dans l'échantillon biologique à tester. Cette étape préalable peut également être réalisée par toute méthode connue par l'homme du métier du domaine de l'invention, et notamment par spectrométrie de masse, comme par exemple I1CP-MS à quadripôle avec cellule de collision ou à haute résolution, par absorption atomique avec ou sans four graphite, ou bien encore par spectrométrie d'émission optique comme la technique ICP-AES {Inductivety Coupled Piasma-Atomic Emission Specro etry).

Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, c'est le rapport isotopique du cuivre qui est mesuré dans le cadre de l'invention.

S'agissant du rapport isotopique lui-même, si l'élément chimique choisi est le cuivre, on peut mesurer le rapport isotopique Cu65/Cu63 ou l'inverse : Cu63/Cu65, car le cuivre ne possède que deux isotopes stables. Pour le zinc, qui possède plus de deux isotopes stables, n'importe quel rapport isotopique peut être mesuré dans le cadre de la présente invention, Par exemple, si ie rapport isotopique mesuré concerne le zinc, on peut mesurer n'importe quel rapport de deux isotopes stables différents choisis parmi Zn64, Ζηδδ, Zn67, Zn68, Zn70, et notamment le rapport Zn66/Zn64 ou l'inverse, Zn66/ Zn68 ou l'inverse, Zn66/ Zn70 ou l'inverse, Zn66/ Zn67 ou l'inverse, Zn64/ Zn67 et l'inverse, etc.

Dans le cadre de l'invention, le sujet chez qui on souhaite établir le pronostic selon la présente invention peut être atteint de n'importe quel type de cancer, notamment d'un cancer du côlon, du sein, du foie, de l'estomac, des poumons, de la thyroïde, de la prostate, de la paroi antérieure de la vessie, du rectum, des ovaires, d'un cancer colorectal, d'une leucémie ou d'un lymphome. De préférence, le procédé de pronostic selon la présente invention est mis en œuvre chez un sujet atteint d'un cancer du côlon ou d'un cancer du sein. De préférence, le sujet n'est atteint que d'un seul type de cancer pour lequel on souhaite établir le pronostic, et de préférence, est exempt de toute autre maladie, telle qu'une maladie Inflammatoire chronique.

Au sens de la présente invention, on entend par « échantillon biologique à tester issu du sujet» ou « échantillon biologique issu du sujet à tester », tout échantillon biologique susceptible de contenir l'élément chimique duquel on souhaite mesurer le rapport isotopique entre deux isotopes stables, et provenant du sujet chez qui on souhaite déterminer le pronostic du cancer.

L'échantillon biologique à tester utilisé dans le cadre du procédé selon l'invention peut être de différente nature. L'homme du métier saura adapter la nature de l'échantillon biologique à tester en fonction du type de cancer dont est atteint le sujet.

Quel que soit le type de cancer, l'échantillon biologique à tester peut être choisi parmi les tissus ou les cellules isolées à partir de ces tissus mais aussi les fluides et sécrétions biologiques tels que l'urine, le sang total, le plasma, le sérum, et les cellules isolées à partir de ces fluides ou sécrétions.

D'une manière générale, l'échantillon biologique à tester est de préférence du sérum.

L'échantillon biologique à tester peut contenir l'élément chimique à la fois à l'état libre mais également associé ou lié à des protéines ou enzymes contenues dans l'échantillon biologique.

Selon un mode de réalisation particulier du procédé selon la présente invention, l'échantillon biologique à tester est préalablement débarrassé de l'élément chimique qui est présent à l'état libre et la mesure du rapport isotopique est faite uniquement sur la fraction de l'élément chimique qui est associée à des protéines contenues dans l'échantillon biologique. Dans ce cadre, l'échantillon biologique à tester peut donc être constitué d'une ou de plusieurs protéines à laquelle l'élément chimique choisi (EL) est associé, c'est-à-dire une ou plusieurs protéines qui contient un ou plusieurs ions dudit élément chimique comme groupe(s) prosthétique(s) ou une ou plusieurs enzymes qui utilisent ledit élément chimique comme co-facteur catalytique, et notamment une ou plusieurs protéine(s) ou enzyme(s) telle(s) que les métallothionéines ou la cérutoplasmine.

Les échantillons biologiques a comparer, à savoir l'échantillon à tester et l'échantillon de référence, sont de préférence de même nature (fluides ou sécrétions biologiques, tissus, cellules Issues de ceux-ci, etc) ou tout du moins d'une nature compatible pour constituer une référence quant à la mesure du rapport des deux isotopes stables.

Dans le cadre de {invention, l'échantillon de référence est un échantillon biologique issu du même dit sujet à tester, obtenu lors d'un prélèvement antérieur, c'est-à-dire un échantillon biologique qui a été obtenu antérieurement dans le temps par rapport à l'échantillon biologique à tester. De préférence, l'échantillon de référence est constitué d'un échantillon biologique directement antérieur par rapport à l'échantillon à tester, c'est-à- dire celui qui précède l'é hantillon à tester dans l'ordre des prélèvements effectués chez le sujet.

La fréquence des prélèvements dans le temps est adaptée à celle des suivis qui sont habituellement pratiqués en fonction du type cancer et du stade de celui-ci. Le protocole de suivi est adapté à chaque sujet et à sa prise en charge initiale.

Par exemple, l'échantillon antérieur issu du même sujet que le sujet chez qui on cherche à établir le pronostic peut être, par exemple, l'échantillon antérieur obtenu au moment du diagnostic du cancer chez le sujet à tester, ou bien un échantilion obtenu avant le traitement du sujet pour être comparé à un échantillon à tester obtenu après traitement, ou encore un échantillon antérieur obtenu au cours du traitement dudtt sujet. Par « traitement », on entend tout traitement chirurgical, greffe, chimique ou radiologique.

Ainsi, les indications, qui sont mentionnées ci-dessus pour l'échantillon biologique à tester, s'appliquent également et intégralement à l'échantillon de référence, aussi bien en termes général que préférentiel.

Selon l'invention, le rapport des isotopes stables qui est mesuré à partir de l'échantillon à tester est comparé à celui mesuré à partir d'un échantillon de référence, et la m se en évidence d'une variation de ce rapport permet de conclure sur le pronostic du cancer chez le sujet testé.

Dans le cadre de la présente invention, le pronostic consiste notamment à déterminer l'évolution du cancer et/ou l'efficacité d'un traitement dans le cadre du suivi de l'état du patient, que ce soit dans un sens positif ou négatif.

En particulier, si le rapport isotopique mesuré est un rapport entre un isotope 1 et un isotope 2 pour lequel la masse de l'isotope 1 est supérieure à celle de l'isotope 2, le pronostic dud ^' rt cancer chez ledit sujet est défavorable, lorsqu'une diminution de ce rapport isotopique est mise en évidence par rapport à celui mesuré dans l'échantillon de référence, et est favorable lorsqu'une augmentation de ce rapport isotopique est mise en évidence par rapport à celui mesuré dans l'échantillon de référence, étant entendu que l'échantillon à tester, et de préférence également l'échantillon de référence, est un fluide ou une sécrétion biologique, et en particulier du sérum.

A l'inverse, si le rapport isotopique mesuré est un rapport entre un isotope 2 et un isotope 1 pour lequel la masse de l'isotope i est supérieure à celle de l'isotope 2, le pronostic dudit cancer chez ledit sujet est défavorable lorsqu'une augmentation de ce rapport isotopique est mise en évidence par rapport à celui mesuré dans l'échantillon de référence, et favorable lorsqu'une diminution de ce rapport isotopique est mise en évidence par rappor à celui mesuré dans l'échantillon de référence, étant entendu que échantiilon à tester, et de préférence également l'échantillon de référence, est un fluide ou une sécrétion biologique, et en particulier du sérum.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré du procédé de l'invention, les variations du rapport isotopique telles que décrites ci-dessus aux deux paragraphes précédents sont avantageusement des variations du rapport isotopique du cuivre,

De manière préférée, lorsque le rapport isotopique est mesuré à l'aide de la formule X décrite précédemment par spectrométrie de masse à source plasma et à multi-coîlection ou MC-ICP-MS, une variation de ce rapport, qu'elle soit positive ou négative, d'au moins 0,10 permet de conclure sur le pronostic du cancer dont est atteint te sujet

Selon un deuxième aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation de la mesure/de l'étude des variations isotopiques d'isotopes stables du cuivre ou des variations isotopiques dlsotopes stables du zinc comme marqueur pronostic d'un cancer.

Par « marqueur pronostic », on entend désigner un marqueur d'évolution ou de progression du cancer ou un marqueur d'extension tumoral.

Dans le cadre de ce deuxième aspect de l'invention, la mesure des variations isotopiques consiste de préférence à mesurer la variation du rapport isotopique entre deux isotopes stables du cuivre ou du zinc, mesuré dans un échantillon biologique issu d'un sujet atteint d'un cancer pour lequel on souhaite établir un pronostic par rapport au même rapport isotopique mesuré dans un échantillon de référence.

Tous les modes de réalisation préférés et leurs combinaisons qui sont mentionnés ci -dessus concernant le procédé constituent également des modes de réalisation préférés s'agissant de l'utilisation.

Diverses autres caractéristiques ressortent de la description faite ci- dessous en référence aux figures annexées qui montrent, à titre d'exemples non limitatifs, des formes de réalisation de l'objet de l'invention, et dans lesquelles :

- les Figures 1A et 1B représentent les profils d'évolution au cours du temps du dosage de l'AŒ (Antigène Carcino-Embryonnaire)(A) et du marqueur CA19.9 {Carbohydrate Antigen 19.9)(B) au regard du rapport isotopique du cuivre Cu65/Cu63 chez un patient atteint d'un cancer du côlon (patient i-côion).

- les Figures 2A et 2B représentent les profils d'évolution au cours du temps du dosage de l'AŒ (Antigène Carcino-Embryonnaire)(A) et du marqueur CA19.9 {Carbohydrate Antigen 19.9)(B) au regard du rapport isotopique du cuivre Cu65/Cu63 chez un patient atteint d'un cancer du côlon (patient 2-côion). - la Figure 3 représente le profil d'évolution au cours du temps du marqueur CA19.9 {Carbohydrate An igen 19,9) au regard du rapport isotopique du cuivre Cu65/Cu63 chez un patient atteint d'un cancer du côion (patient 3-côlon).

- les Figures 4A et 4B représentent Se profil d'évolution au cours du temps du marqueur CA15J {Carbohydrate Antigen 15.3){k) et du marqueur ACE (Antigène Carcino-Embryonnaire)(B) au regard du rapport isotopique du cuivre Cu65/Cu63 chez un patient atteint d'un cancer du sein (patient l-sein).

- la Figure S représente le profil d'évolution au cours du temps du dosage de i'ACE (Antigène Carcino-Embryonnaire) au regard du rapport isotopique du cuivre Cu65/Cu63 chez un patient atteint d'un cancer du sein (patient 2-sein).

-ies Figures 6 à 9 présentent les rapports isotopiques du cuivre Cu65/Cu63, dCu (%o) correspondant à la formule I, en comparaison d'autres marqueurs, pour des patients dans ie cadre du suivi de différents cancers.

EXEMPLES

Echantillons biologiques

Les échantillons ont été obtenus au Centre Léon Bérard (Lyon) qui dispose d'un centre de ressources biologiques prévu pour la conservation des prélèvements. Les échantillons de sérums ont été prélevés sur tes patients lors de leurs visites à l'hôpital et avec leur consentement écrit à des fins de recherche et ensuite maintenus à -160°C sous formes de paillettes de 200μΙ. Préparation des échantillons biologiques

Les sérums ont été récupérés à partir des paillettes de 200μΙ fournies par ie Centre de ressources biologique du Centre Léon Bérard et il a été ajouté 1 mi d'acide nitrique ultra-pur et 0,2 ml d'eau oxygéné ultra-pure et chauffée à 80°C pendant 12 heures dans des récipients en PFA pour procéder à la mise en solution ou minéralisation, Ensuite a eu lieu l'étape de séparation chimique sur colonne échangeuse d'ions (type AG- P 1} pour obtenir l'élément à mesurer purifié comme expliqué ci-dessous. Mesure du rapport Isotopique

La mesure d'un rapport isotopique dans un échantillon par spectrométrie de masse à source plasma et à muiticollection (MC-îCP-MS) nécessite des étapes préalables de minéralisation, d'extraction et de purification des éléments d'intérêt, faute que quoi de nombreuses interférences et effets de matrice rendraient i 'analyse impossible.

Pour cela, une première étape de préparation chimique a été réalisée dans une salie blanche par chromatographîe sur résine échangeuse d'ion à la suite d'une minéralisation. Les protocoles de séparation ont été réalisés dans une salle en légère surpression et sous atmosphère filtrée afin d'éviter la contamination des échantillons par les poussières du milieu extérieur. Pour préparer les échantillons de sérum, le protocole de séparation des éléments a été réalisé comme décrit par Maréchal et ah, 1999, Chemical Geology, 156, 251-273.

Les rapports isotopiques ont été calculés dans les échantillons (à tester et de référence) à l'aide de la formule ï décrite ci-dessus.

Mesure des marqueurs AŒ, CA19.9, CAÎ5.3

Ces marqueurs ont été mesurés en dosage immunologique selon la technique LOCI sur un appareil Siemens VISTA, en suivant les prescriptions du constructeur.

Analyse des données

Les données ont été reportées sur les figures avec une barre d'erreur correspondant à deux écarts-types sur le standard analysé pendant toute une session de mesure. Celui-ci est analysé avant et après chaque échantillon à comparer pour faire le calcul, c'est-à-dire avant et après l'échantillon à tester et avant et après l'échantillon de référence.

RESULTATS

Exemple 1 ; étude de la mesure isotopique du cuivre chez des patients atteints d'un cancer du côlon

Trois patients atteints d'un cancer du côlon ont été suivis pendant leur prise en charge et le rapport isotopique du cuivre Cu65/Cu63 a été mesuré sur les échantillons disponibles comme indiqué ci-dessus. D'autres marqueurs (ACE et CA19.9) utilisés habituellement pour le suivi des patients atteints de ce type de cancer ont également été mesurés.

tes résultats des mesures réalisées au cours du suivi de ces trois patients sont regroupés dans les Figures 1 à 3 :

Patient 1 -côlon

Un cancer du côlon (adénocarcinome de type Lieberkuhnien) a été détecté en janvier 2008 et suivi d'une coiectomie droite avec anastomose laparoscopique puis d'une chimiothérapie de type FOLFOX 4.

Le 20 février 2011, le rapport dCu a chuté mais le dosage ACE reste faible donc négatif alors que l'état du patient s'est fortement dégradé avec une évolution méta-hépatique nécessitant la mise en place d'une chimiothérapie de type FOLFÎRI-AVASTIN.

Les valeurs du dosage ACE sont restées négatives (< 10 ng/mi) alors que le rapport isotopique dCu a varié en suivant l'état du patient. Le marqueur dCu a donc permis de mesurer une évolution de l'état du patient alors qu'un marqueur habituellement utilisé comme ACE est resté négatif (Figure 1A). Le marqueur CA19.9 est resté négatif (dans la gamme entre 0 et 12 U/ml) et n'a donc rien révélé des évolutions de la maladie du patient, alors que Se rapport isotopique dCu a parfaitement suivi ces évolutions (Figure 18).

Patient 2 -côlon

Un adénocarcinome de type Lieberkuhnien a été détecté en juin 2008 avec des métastases hépatiques, puis une chimiothérapie a été mise en place en Juillet 2008. En octobre 2008, une coiectomie gauche a du être pratiquée et en décembre 2008 une hépatectomie droite. En octobre 2010, le patient a eu une récidive hépatique nécessitant une chimiothérapie de type FOLFIRÏ-AVASTIN, puis une rechute en 2011.

Le dosage ACE est bien corrélé à l'état du patient en octobre 2011 mais pas du tout avant où ce marqueur est resté proche de zéro (Figure 2A). De même pour ce patient, ie marqueur CA19.9 n'a donc rien révélé en restant négatif tout ie temps. En revanche, le rapport isotopique dCu a parfaitement fonctionné et a montré les améliorations de conditions du patient ainsi que ia rechute (Figure 2B).

Patient 3-côlon

Un adénocarcinome de type Lieberkuhnien a été détecté en juin 2010 suivi d'une chimiothérapie de type FOLFIRI-AVASTÎN. La maladie a évoluée en janvier 2011 puis est restée stable jusqu'en décembre. La maladie a évoiué en décembre 2011 et la personne est décédée en novembre 2012. Pour ce patient, seul le marqueur CA19.9 a pu être suivi (Figure 3).

Le marqueur CA19.9 montre que le patient était malade en juillet 2010. Depuis août 2010, ie marqueur CA19.9 laissait penser que le patient allait bien car la valeur était passée en dessous de 30 U/ml en se maintenant, alors que l'état du patient évoluait. Le rapport dCu a d'abord montré une évolution positive de la maladie entre juillet 2010 et septembre 2010, puis une stabilisation et une rechute en janvier 2011 confirmant l'évolution clinique du patient» Une remontée du rapport dCu entre janvier et mars 2011, puis une rechute en mai 2011 ont été observées sur ce marqueur, laissant penser que ie traitement n'était plus efficace.

Exempte 2 : étude de la mesure isotopique du cuivre chez des patients atteints d'un cancer du sein

Deux patientes atteintes d'un cancer du sein ont été suivies pendant leur prise en charge et le rapport isotopique du cuivre Cu65/Cu63 a été mesuré sur les échantillons disponibles comme indiqué ci-dessus. D'autres marqueurs (ACE et CA15.3) utilisés habituellement pour le suivi des patients atteints de ce type de cancer ont également été mesurés.

Les résultats des mesures réalisées au cours du suivi de ces trois patients sont regroupés dans les Figures 4 à 5 :

Patient 1-sein

Un adénocarcinome canalaire infiltrant a été détecté chez cette patiente en 2001 suivi d'une mastectomie et d'un traitement par chimiothérapie de type Adriblatine-Endoxan. Une évolution métastatique osseuse s'est fait jour en 2004 suivi d'une tumorectomie du sein gauche en mai 2005. Pour cette patiente, seul le marqueur CA15.3 (Figure 4A) a montré une évolution alors que le marqueur ACE est resté négatif (< 45 ng/mi) tout au long de la maladie (Figure 48).

En septembre 2005, au bout d'un mois de traitement chîmiothérapeutique (Taxotère), la valeur dCu était bien pire que celle mesurée en août, alors que la valeur de CA15.3 avait baissée laissant penser à un effet positif du traitement. La valeur très négative de dCu n'était pas un bon présage. Suite à l'aggravation de l'état du patient, le traitement chîmiothérapeutique a été modifié en décembre 2005,

Ces résultats montrent une très bonne corrélation entre le dCu et l'état du patient et le suivi de ce marqueur aurait montré très tôt que la première chimiothérapie ne fonctionnait pas du tout comme la deuxième chimiothérapie laissant le marqueur dCu très bas mais cette fois bien corrélé avec le marqueur CA15.3 en 2006. Une évolution défavorable est d'ailleurs intervenue en juillet 2006, pour conduire au décès du patient en 2008.

Patient 2-sein

Un adénocarcinome canaiaire infiltrant a été détecté chez cette patiente en 2004, qui a été mise sous traitement chîmiothérapeutique (Myocet) en mars 2004, pour subir ensuite une ovariectomie bilatérale en 2005.

Pour cette patiente, seul le marqueur ACE a été suivi. Les valeurs du dosage ACE sont restées négatives (en dessous de 10 ng/ml), alors que l'on distingue très nettement une évolution du rapport isotopique dCu qui montre en août 2007 que le traitement chimio-thérapeutique mis en place (Myocet) n'est pas efficace (Figure 5). Pendant toute cette période, le marqueu ACE ne révèle pourtant aucune évolution défavorable et reste négatif.

Le suivi du rapport isotopique dCu a donc révélé l'inefficacité du traitement des mois avant que les signes cliniques ne le montrent et ne suscite un changement de traitement en juin 2008 (Tamoxifen). L'efficacité de ce nouveau traitement n'a malheureusement pas été suivie et le décès du patient est ensuite intervenu en septembre 2008.

L'ensemble de ces résultats démontre que la mesure du rapport isotopique de deux isotopes stables d'un élément chimique peut être utilisée en tant que marqueur pronostic d'un cancer, alors même que des marqueurs utilisés habituellement ne révèlent aucune évolution de l'état du patient.

Exemple 3 ; étude sur différents types de cancer

1) Cancer du foie dans le cas d'un patient atteint du virus de l'hépatite C. Sur une personne, née le 13 février 1944, atteint de la forme HCV1 dû virus de l'hépatite C, des scores de fibrose (fibroscan) et le rapport dCu ont été examinés fors de deux prélèvements.

Les résultats présentés sur la Figure 6 montrent que le score de fibrose (fibroscan) s'est dégradé entre les deux prélèvements et que ces résultats peuvent être corréiés avec les valeurs du rapport dCu obtenu : plus la valeur de fibroscan est élevée, plus fa valeur de dCu est faible et moins le patient es en bonne condition de santé.

2) Cancer des ovaires.

Une patiente atteint d'un cancer des ovaires a été suivie en utilisant le marqueur CA125 et le rapport dCu, lors de deux prélèvements.

Les résultats sont présentés Figure 7 et montrent que le marqueur CA125 diminue alors que l'on a une valeur de dCu qui remonte vers des valeurs plus proches de 0.

3) Cas du cancer de la thyroïde.

Un patient atteint d'un cancer de la thyroïde a été suivi grâce au marqueur TG : (thyro-giobuline) et au rapport dCu. Les résultats obtenus à partir de deux prélèvements effectués, sont présentés Figure 8.

Il apparaît que quand la valeur de TG augmente, ce qui est en relation avec un état dégradé du patient, la valeur du rapport dCu diminue.

4) Cas du cancer de la prostate.

Un patient atteint du cancer de la prostate a été suivi grâce au marqueur PSA et au rapport dCu lors de deux prélèvements. Les résultats sont présentés Figure 9 et montrent que la valeur du marqueur PSA augmente fortement, alors qu'une diminution du rapport dCu est constatée.