On a décrit, dans l'art antérieur, différentes substances notamment peptidiques présentant des propriétés antimicrobiennes, plus particulièrement bactéricides ou fongicides. En santé humaine, on peut rappeler que l'incidence des infections microbiennes opportunistes est en constante progression depuis ces dernières années. Selon l'Organisation Mondiale de la Santé plus de 95% des souches bactériennes Staphylococcus aureus sont résistantes à la pénicilline et plus de 60% sont également devenues résistantes à son dérivé, la méthicilline (The new antibiotics, Holger Breithaupt, Nature Biotechnologie, Vol 17 December 1999). Les microorganismes opportunistes ont pour cibles premières les sujets immunodéprimés, chez lesquels ils peuvent conduire au développement de pathogènes, le plus souvent résistants. L'immunosuppression peut être le résultat d'une variété de causes telles que par exemple la corticothérapie, la chimiothérapie, la transplantation, l'infection par le VIH.

Il existe donc un réel besoin de caractériser de nouvelles classes de composés antimicrobiens pour suppléer au phénomène de résistance que les microorganismes développent envers les antimicrobiens classiques.

Des peptides dotés de propriétés antimicrobiennes sont produits par une grande variété d'espèces tant animales que végétales, chez lesquelles ils participent à des mécanismes non spécifiques de défense contre les infections (Host defence cationic peptides : what is their future clinical potential ?, Hancock, Drugs 1999,57 : 469-473). Ces peptides peuvent être subdivisés en 4 groupes en fonction de leur séquence en acides aminés et de leur structure secondaire : - les peptides comprenant 2 hélices a amphipatiques (cécropines et mélittines d'insectes, cécropines et cathélicidines de mammifères et magainines de la peau de batraciens ; Amphipatic a-helical Antimicrobial Peptides, Tossi A., Sandri L., Giangaspero A., Biopolymers (Peptide Science), Vol. 55,4-30,2000) - les peptides comprenant des ponts disulfures intramoléculaires (défensines d'insectes ou de mammifères, brévinines de la peau de batraciens, protégrines de mammifères, thanatine d'insectes WO 99/24594, tachyplésines de crustacés et androctonines de scorpions WO 97/300082 ; Cystéines-rich antimicrobial peptides in invertebrates, JL.

Dimarcq, P. Bulet, C. Hetru, J. Hoffmann, Biopolymers (Peptide Science), Vol. 47,465-477,1998),

- les peptides riches en proline (apidaecines, abaecines, drosocine et pyrrhocoricine produits par les insectes, bacténécines de mammifères), et - les peptides ou polypeptides riches en glycines (attacines, sarcotoxines, diptéricines d'insectes).

Depuis ces dernières années, l'industrie pharmaceutique est fortement focalisée sur le développement d'analogues de substances connues, comme par exemple le peptide cationique pexiganan dérivé de la magainine extraite de la peau de batraciens et qui ne présente pas d'activité accrue par rapport aux antibiotiques conventionnels (The new antibiotics, Holger Breithaupt, Nature Biotechnologie, Vol 17 December 1999). Il est également connu de l'homme de l'art que les peptides présentent, de par leur nature, des propriétés physico- chimiques non favorables aux applications pharmaceutiques, notamment en matière de biodisponibilité. Les peptides sont en effet facilement et rapidement dégradés par des enzymes protéolytiques, comme par exemple la chymotrypsine, la trypsine et l'élastase (Peptide metabolism by gastric, pancreatic and lysosomal proteinases, R. Krishnamoorthy, A.

K. Mitra, Peptide-Based Drug Design : Controlling Transport and Metabolism, 1995,47-68) ce qui se traduit in vivo par une demi-vie courte. D'autre part, les barrières biologiques telle notamment la muqueuse intestinale sont non seulement de par leur structure peu perméables aux peptides mais également riches en enzymes protéolytiques, limitant ainsi davantage l'absorption de la substance active par l'organisme (Peptide absorption,

Gastroenterology 71,1976,151-161 ; V. H. L. Lee, A.

Yamamoto, Penetration and enzymatic barriers to peptide and proteine absorption, Adv. Drug Deliv. Rev. 4,1990,171- 207 ; V. H. L. Lee, R. D. Traver, M. E. Taub, Enzymatic barriers to peptide and protein drug delivery, Peptide and Drug Delivery, Marcel Dekker, New York, 1991,303-357).

Par ailleurs, la mise en oeuvre de systèmes de production de peptides à haut débit est longue et coûteuse.

La présente invention vise précisément à caractériser des composés qui miment globalement la structure des peptides antimicrobiens de façon à s'affranchir de leurs désavantages précédemment exposés tout en améliorant leurs activités.

La demanderesse a isolé à partir de coccinelles de l'espèce Harmonia axyridis un composé présentant une activité antibactérienne (contre les germes à Gram+ et-). Ce composé est une diamine à longue chaîne hydrocarbonée faisant le lien entre les fonctions amines.

La chaîne intermédiaire comporte une double liaison en son centre. D'un côté le carbone a voisin de la fonction amine porte une fonction alkyle courte à savoir un groupement méthyle. De l'autre côté de la chaîne, la fonction amine primaire est portée par un carbone non substitué. La formule développée de la diamine a été identifiée comme suit :

Ce composé cis-1, 17-diaminooctadec-9-ène sera aussi désigné ci-après « harmonine ».

La demanderesse a synthétisé le composé harmonine par voie chimique. Les activités antibactériennes dudit composé et de celui isolé à partir de l'insecte sont identiques et sont rapportées dans le tableau 1 ci-après.

Tableau 1 Composé Micrococcus E. coli D363 Staphyllococcus luteus Activité aureus Activité spécifique Activité spécifique (ug/ml) spécifique (Ug/ml) Activité (Ug/ml) Activité molaire Activité molaire (µM) molaire (hum) (UM) cis-1,17- diaminooctadec 1,5 3 4 -9-ène 4,2 8,4 11,2 (harmonine) Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention ont donc consisté à synthétiser des composés polyfonctionalisés (Polyvalent interactions in biological systems : Implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors, Mathai Mammen, Seok-Ki Choi, and George M. Whitesides Angew. Chem. Int. Ed., 1998,37,2754-2794) de façon à améliorer les activités ce qui se traduit notamment par une potentialisation des activités molaires.

Les carbadendrimères ("dendron"signifiant "arbre"en grec) sont des composés qui comportent un squelette hydrocarboné ramifié, avec des groupements chargés aux extrémités des branches, chaque hétéroatome du

squelette étant substitué par un carbone. Chaque point d'embranchement comporte un carbone-CH<, ce qui permet de différencier les carbadendrimères de la présente invention d'autres composés dendrimèriques connus en tant qu'agents de transfection (transport artificiel d'ADN dans des cellules) comme les PAMAM ou le PEI qui comportent des fonctions amides ou amines tertiaires au niveau des points d'embranchement (Elimination of prions by branched polyamines and implications for pharmaceuticals, Surachai Supattapone, Hoang-Oanh B. Nguyen, Fred E. Cohen, Stanley B. Prusiner, and Michael R. Scott, PNAS, December 7,1999, vol. 96, No. 25,14529-14534).

La présente invention a donc pour objet un composé de formule (I) : Dans laquelle : - X est un groupe hydrocarboné en Co-Czo comprenant de 0 à 2 doubles liaisons ou éventuellement un groupement benzyle, - Y représente un groupe-COOH ou un groupe amine de formule-N (Z) z (H) 3zt où Z est un groupe alkyle en Ci-C. linéaire ou ramifié, un groupement arylméthyl, en particulier benzyle, éventuellement substitués par un ou plusieurs groupes hydroxyle, ou encore le groupe - N (Z) z (H) 3-z forme un radical pyridinium et z est un nombre entier compris entre 0 et 3,

- R représente un groupe-(CH2) m~ OÙ m est un nombre entier compris entre 4 et 16, - n est un nombre entier compris entre 1 et 6.

Des composés avantageux selon l'invention sont ceux dans lesquels les groupements Y sont identiques et/ou les groupements R sont identiques.

Un premier groupe préféré de composés de formule (I) selon la présente invention est celui dans lequel Y représente un groupe-COOH, et dans lequel les groupements Y sont identiques et/ou les groupements R sont identiques.

Un second groupe préféré de composés de formule (I) selon la présente invention est celui dans lequel Y représente un groupe amine de formule-N (Z) z (H) 3 zt et dans lequel les groupements Y sont identiques et/ou les groupements R sont identiques. Une première classe de ces composés comprend de préférence 3 groupes amines de formule -N(Z)z(H)3-z, et dans la formule (I) m est un nombre entier compris entre 6 et 16. Une seconde classe de ces composés comprend de 4 à 6 groupes amines de formule -N(Z)z (H) 3 z et dans la formule (I) m est un nombre entier compris 4 et 14.

Les composés de l'invention présentent de préférence l'une et/ou l'autre des caractéristiques suivantes : - ils comprennent au moins une chaîne hydrocarbonée linéaire-R-CH-X-R-en C13-C34,

- ils comprennent un groupement hydrocarboné (CHX)-(R) n+2 constituée de 18 à 144 atomes de carbone.

L'invention envisage tout particulièrement les composés ci-dessous.

- la triamine 8 : 17 répondant à la formule (II) suivante :

- la tétramine 7 : 18 répondant à la formule (III) suivante : - la 9,9-diméthyl tétramine 7 : 17 répondant à la formule (IV) suivante :

- l'hexamine 6 : 19 répondant à la formule (V) suivante :

Les composés synthétisés par la demanderesse ont ensuite été testés in vitro pour leur activité antibactérienne (anti-Gram positifs et anti-Gram négatifs) ainsi que pour leur activité anti-fongique. Les résultats des tests d'activité sont rapportés dans le tableau 2 ci-dessous.

Tableau 2 triamine tétramine hexamine 8 : 17 7 : 18 6 : 19 Activité Activité Activité spécifique spécifique spécifique (Hg/ml) (Ug/ml) (Ug/ml) Activité Activité Activité molaire molaire molaire (uM) (uM) (uM) E. coli 0,7 0,8 1,4 1,4 1,2 1,5 Staphylococcus 1,0 1, 5 1,4 aureus 2,0 2,2 1,5 Micrococcus 0, 7 0,8 1, 0 luteus 1,4 1,2 1,0 Neurospora 2,5 5,0 5, 5 crassa 4,9 7,6 5,7

Ce tableau montre que l'ensemble des polyamines (composés triamine, tétramines et hexamines) présentent une activité à largue spectre, à la fois antibactérienne (Gram négatifs et Gram positifs) et antifongique

(champignons filamenteux). Les polyamines présentent toutefois une activité antibactérienne supérieure à l'activité antifongique.

La présente invention concerne donc également une composition antimicrobienne, plus particulièrement antibactérienne ou antifongique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre d'agent actif au moins un composé tel que défini précédemment.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un composé pour la préparation d'une composition pour la prévention ou le traitement des infections microbiennes chez l'homme, l'animal ou les plantes.

Les carbadendrimères de la présente invention sont donc des composés mimant les peptides antimicrobiens, avec un côté hydrophobe et une surface portant des groupements chargés. Leur structure non peptidique leur confère l'avantage d'être résistant aux protéases qui dégradent communément et rapidement les peptides. Par ailleurs, les groupements terminaux chargés favorisant les contacts avec les têtes polaires des lipides des membranes des microorganismes ainsi que la taille réduite des composés (inférieure à 1 kDa) permettent une facilité de passage desdits carbadendrimères à travers les barrières biologiques telle notamment la muqueuse intestinale.

L'ensemble des propriétés physico-chimiques exposées concourt ainsi à favoriser la biodisponibilité des composés.

La simplicité structurale des carbadendriméres présente également l'avantage de pouvoir synthétiser ces composés de façon aisée et sans surcoût.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant la synthèse de composés selon l'invention et leurs activités anti-microbiennes et dans lesquels il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels : - la figure 1 représente un schéma général de synthèse des carbadendrimères alpha polyfontionnalisés, - la figure 2 représente le schéma de synthèse de la triamine 8 : 17, - la figure 3 représente le schéma de synthèse de la tétramine 7 : 18, - la figure 4 représente le schéma de synthèse de l'hexamine 6 : 19.

Les composés de l'invention peuvent être préparés selon le schéma général de synthèse des carbadendrimères alpha polyfontionnalisés donné à la figure 1 des dessins en annexe. Un squelette hydrocarboné saturé ou non et comportant des fonctions carboxyles est tout d'abord estérifié. Les fonctions esters peuvent réagir avec- des organomagnésiens qui sont @-fonctionnalises. Ce groupement chimique est présent sous forme de précurseur (benzyloxy), facilement convertible en d'autres groupements chimiques par déprotection (débenzylation) et activation de la fonction alcool résultante (mésylation). Par ce moyen une grande diversité de fonctionnalisations est accessible.

Nous pouvons citer la conversion facile des fonctions alcools (mésyles) en nitriles, puis l'hydrolyse en acide, ce qui fournit des carbadendrimères polycarboxyliques (cf. schéma précédent). L'étape la plus délicate est la conversion des polyols en polyamines qui est décrite de façon détaillée dans les exemples. Les amines peuvent alors être substituées par des méthodes classiques décrites dans la littérature scientifique, comme la peralkylation par des bromures d'alkyles pour former des ammoniums sur un squelette de carbadendrimères (cf. schéma précédent). La réaction des organomagnésiens avec les esters va créer des alcools tertiaires qui peuvent être déshydratés pour former des alcènes trisubstituées. Les doubles liaisons sont hydrogénées par catalyse au palladium (5% sur charbon) en présence de dihydrogène sous pression d'une atmosphère.

Lors de l'hydrogénation les fonctions alcools terminales sont déprotégées. Les polyols résultants sont activés par formation de groupes méthanesulfoniques au niveau des alcools. Cette activation permet d'obtenir par substitution nucléophile SN2 des polyazides. Les polyazides sont réduits en présence de triphénylphosphine en présence de quelques équivalents molaires d'eau. La réaction présente une grande inertie du fait de la taille du squelette hydrocarboné et elle ne se fait pas dans des conditions classiques..

L'utilisation d'une quantité minimale de tétrahydrofurane (THF) comme solvant (la masse du solvant ne dépasse pas la masse des réactifs) et d'un temps de réaction d'une semaine à température ambiante permet une conversion totale en polyamine sur un squelette de carbadendrimère, qui, après

précipitation au HCl gaz, n'a pas besoin d'être purifiée davantage.

Exemple 1 : Synthèse de la triamine 8 : 17.

La demanderesse a synthétisé la triamine 8 : 17 selon les 5 étapes qui suivent rapportées à la figure 2 des dessins en annexe.

Etape 1 : Formation de l'alcool tertiaire T1.

Intermédiaire T1, C46H7004 PM = 687,06 121 mg de tournures de magnésium (Mg ; 5 mmoles ; PM=24, 31) sont introduits dans un ballon bicol de 25 ml (séché à l'étuve) surmonté d'un réfrigérant. 1496mg de 8- bromo-1-benzoxyoctane (5 mmoles ; PM=299,26) sont pesés dans un ballon piriforme (séché à l'étuve) et dissous dans 4 ml de diéthyléther (distillé sur du sodium-benzophénone) sous argon. Le bromure est additionné sur le magnésium par seringue à travers d'un sérum cap par portions de 0,5 ml.

La réaction est initiée par chauffage par un sèche cheveux et elle démarre sans problème. Le reflux est entretenu par rajout successif du bromure. A la fin du rajout, le milieu réactionnel est mis sous léger reflux pendant 1 heure.

157,5 mg de diéthylcarbonate dissous dans 4 ml de diéthyléther est rajouté pendant un quart. d'heure. La réaction est laissée à température ambiante pendant 24 heures. Le milieu réactionnel est versé sur une solution saturée en NH4C1 et extraite avec de l'éther. La phase éthérée est séchée par du sulfate de magnésium et filtrée sur célite. Le brut réactionnel obtenu après évaporation des solvants est purifié par chromatographie sur silice (3

x 20 cm ; 30% éther dans l'hexane). L'alcool tertiaire élue très vite avec une bonne séparation. 454 mg de T1 sont obtenus, ce qui correspond à 0,66 mmoles et à un rendement de 50% par rapport au diéthylcarbonate.

Rf = 0,13 ; éluant : 30 % éther dans l'hexane ; révélation à la vanilline (noir) 1H-RMN (CDC13) : 7,25-7,45 ppm ; multiplet ; 15 H ; 3 phényles 4,551 ppm ; singulet ; 6 H ; 3 OCH2Ph 3,514 ppm triplet J 6, 6 Hz ; 6 H ; 3 CH20bn 1,57-1,78 ppm ; multiplet ; pics maj. : 1,704 ppm, 1,666 ppm, 1,633 ppm ; 6 H ; 3 CH2CH20Bn 1,21-1,54 ppm ; multiplet ; pic maj. : 1,349 ppm ; 36 H ; 18 CH2 intrachaîne 13C-RMN (CDC13) : 138,81 ppm (CO) ; 128,40 ppm (CH) ; 127,67 ppm (CH) ; 127, 51 ppm (CH) ; 74,47 ppm (CO) ; 72,91 ppm (CH2) ; 70,58 ppm (CH2) ; 39,36 ppm (CH2) ; 30,31 ppm (CH2) ; 29,83 ppm (CH2) ; 29,65 ppm (CH2) ; 29,54 ppm (CH2) ; 26,26 ppm (CH2) ; 23,54 ppm (CH2) Etape 2 : Obtention de l'alcène trisubstitué par déshydratation de l'alcool tertiaire T1.

Intermédiaire T2, C46H6803.

PM = 669,04 231,5 mg de l'alcool tertiaire est dissous dans 50 ml de toluène dans un ballon de 100 ml surmonté d'un piège d'eau de type Dean-Stark. Le milieu réactionnel est chauffé à reflux en présence de 13,5 mg d'acide paratoluènesulfonique (0,07 mmoles ; PM=190,22). Arrêt du

chauffage après 2 heures (l'analyse par chrommatographie en couche mince ne montre plus d'évolution) et évaporation du toluène par un évaporateur rotatif. Le brut est chromatographié sur colonne de silice (3 x 17 cm ; 10% éther dans l'hexane). 215,3 mg d'alcène sont obtenus, ce qui correspond à 0,322 mmoles et à un rendement de 96%.

Rf = 0, 27 ; éluant : 10 % éther/hexane ; vanilline 1H-RMN (CDC13) : 7,26-7,45 ppm ; multiplet ; pic maj. : 7,383 ppm ; 15 H ; 3 phényles 4,553 ppm ; singulet ; 6 H ; 3 OCH2Ph 5,133 ppm ; triplet ; J = 7,0 Hz ; 1 H ; proton vinylique 3,516 ppm ; triplet ; J = 6, 6 Hz ; 6 H ; 3 CH20Bn 1,92-2,09 ppm ; multiplet pics maj. 2,025 ppm, 2,000 ppm ; 6H ; 3 CH2 allyliques 1,56-1,75 ppm ; multiplet ; pics maj. 1,668 ppm, 1,635 ppm ; 6 H ; 3 CH2CH20Bn 1,23-1,50 ppm ; multiplet ; pic maj. 1,354 ppm ; 28 H ; 14 CH2 intrachaîne 13C-RMN (CDC13) : 139,61 ppm (CO) ; 138,79 ppm (CO) ; 128, 35 ppm (CH) ; 127,62 ppm (CH) ; 127,48 ppm (CH) ; 124,69 ppm (CH) ; 72,89 ppm (CH2) ; 70,58 ppm (CH2) ; 36,97 ppm (CH2) ; 30,18 ppm (CH2) ; 29,83 ppm (CH2) ; 29,55 ppm (CH2) ; 28,57 ppm (CH2) ; 27,74 ppm (CH2) ; 26,25 ppm (CH2) Etape 3 : Hydrogénation de l'alcène T2 pour former le triol T3.

Intermédiaire T3, C25H5203 PM = 400,68 Le produit tribenzylé est insoluble dans l'éthanol, solvant classique pour les hydrogénations au palladium. 215 mg de l'alcène (0,321 mmoles, PM=669,04) sont dissous dans 8 ml d'acétate d'éthyle et placés dans un ballon bicol de 25 ml. 20 mg de Pd/C (5%) sont introduits sous argon, puis l'argon est remplacé par du dihydrogène (cycles de vide-H2). L'hydrogénation se fait pendant 2 heures. Puis le milieu réactionnel a été filtré sur du papier filtre et le filtre lavé avec un mélange de méthanol-dichlorométhane (50 : 50). Les solvants sont ensuite évaporés. Une analyse par chrommatographie en couche mince montre que la débenzylation est complète. La purification par chromatographie sur colonne de silice (3 x 17 cm ; éluant : 65 % AE/hexane) donne 145 mg de produit dont l'analyse RMN (résonance magnétique nucléaire) révèle que la double liaison trisubstituée n'est que partiellement hydrogénée. Ce triol est repris dans de l'éthanol et remis à hydrogéner dans de l'éthanol pendant 4 heures en présence de 20 mg de Pd/C 5%. Une purification comme celle décrite permet d'isoler 102 mg de triol, ce qui correspond à 0,25 mmoles et à un rendement de 79%.

Rf = 0, 15 ; 50 % acétate d'éthyle dans- l'hexane ; révélation à la vanilline 1H-RMN (CDC13) : 3,590 ppm triplet J 6, 6 Hz ; 6 H ; 3 CH20H 2,228 ppm ; singulet ; 3H ; 3 OH ; déplacement dépend de la concentration

1,43-1,62 ppm ; multiplet (forme de quintruplet) ; pics maj. : 1,566 ppm, 1,534 ppm, 1,501 ppm, 1,470 ppm ; 6 H ; 3 CH2CH20H 1,00-1,43 ppm ; multiplet ; pics maj. : 1,273 ppm, 1,196 ppm, ; 37 H ; 18 CH2 intrachaîne et H central 13C-RMN (CDC13) : 62,94 ppm (CH2) ; 37,34 ppm (CH) ; 33,67 ppm (CH2) ; 32,81 ppm (CH2) ; 30,03 ppm (CH2) ; 29,64 ppm (CH2) ; 29, 47 ppm (CH2) ; 26,65 ppm (CH2) ; 25,82 ppm (CH2) Etape 4 : Activation du triol T3 par permésylation et conversion en triazide T4.

Intermédiaire T4, C25H49N9 PM = 475,72 Activation du triol T3 par permésylation : 168,8 mg de triol T4 (0,421 mmoles, 1 éq., PM = 400, 68) sont dissous dans 15 ml de CH2C12. 253 mg de chlorure de mésyle, dissous dans 2 ml de dichlorométhane, sont rajoutés. 255 mg de triéthylamine, dissous dans 2 ml de dichlorométhane sont additionnés goutte à goutte à température ambiante. La réaction est laissée sous agitation pendant une heure. Une analyse par chromatographie en couche mince révèle qu'il reste du produit de départ. 125 mg de MsCl et 125 mg de Et3N sont rajoutés. Après une demi-heure le milieu réactionnel est devenu jaune et une analyse par chromatographie en couche mince montre que la réaction est finie. Les solvants sont évaporés sous évaporateur rotatif et le résidu est repris dans du dichlorométhane (100 ml). La phase organique est lavée avec une solution saturée aqueuse de NaHC03. La phase aqueuse est extraite au dichlorométhane, et les phases

organiques réunies sont séchées par du sulfate de magnésium. La phase organique est filtrée sur célite et séchée sous vide. On récupère un brut jaune.

Conversion en triazide T4 : Le trimésylate brut est dissous dans 10 ml de diméthylformamide (DMF) dans un ballon de 25 ml et 410,54 mg d'azidure de sodium sont rajoutés. Le milieu réactionnel est chauffé par un bain d'huile à 65-70° C pendant 18 heures. Après refroidissement du milieu, on rajoute 25 ml d'eau. Le milieu est extrait avec de l'éther (3 x 100ml) et les phases organiques réunies sont relavées avec 50 ml d'eau, puis séchées par du sulfate de magnésium (filtration sur célite, évaporation). Le brut est chromatographié sur colonne de silice (3 x 17 cm, éluant : 300 ml de 1% d'éther dans l'hexane, puis 2,5% éther dans l'hexane). Le composé sort très vite avec le deuxième éluant, mais migre très peu sur colonne avec 1% éther dans l'hexane. 183 mg de triazide sont récupérés, ce qui correspond à 0,3847 mmoles et à un rendement de 91 %.

Rf = 0, 61 éluant 2,5 % éther dans l'hexane ; révélation à la vanilline donne une couleur brun-rose faible 1H-RMN (CDC13) : 3,280 ppm ; triplet ; J = 6, 9 Hz ; 6 H ; 3 CH2N3 1,52-1,72 ppm ; multiplet pics maj. : 1,625 ppm, 1,599 ppm, ; 6 H ; 3 CH2CH2N3 1, 12-1,50 ppm ; multiplet pics maj. : 1,335 ppm, 1,246 ppm ; 37 H ; 18 CH2 intrachaîne et 1 H central 13C-RMN (CDC13) :

51,52 ppm (CH2) ; 37,43 ppm (CH) ; 33,69 ppm (CH2) ; 30,03 ppm (CH2) ; 29,54 ppm (CH2) ; 29,19 ppm (CH2) ; 28, 86 ppm (CH2) ; 26,69 ppm (CH2) Etape finale : Réduction du triazide T4 et formation du trichlorhydrate de la triamine.

Produit final, triamine 8 : 17, C25H58C13N3 PM = 507,11 158 mg de triazide (0,332 mmoles, PM = 475,72) sont introduits dans un pilulier de 5 ml et dissous dans 800 gl de tétrahydrofurane (THF) et 80 1 d'eau. 522,5 mg de triphénylphosphine sont rajoutés spatule par spatule, en attendant que la réaction se calme après chaque rajout.

La réaction du PPh3 est accompagnée d'un fort dégagement gazeux, mais la réaction reste contrôlée. Après une semaine sous agitation, le milieu réactionnel reste homogène sans formation de précipité.

Pour arrêter la réaction le milieu réactionnel est dilué dans 100 ml de CH2C12, et filtré sur papier filtre pour enlever des traces d'eau résiduelles. La triamine est précipitée par HCl gazeux (sec, cf. synthèse hexamine 6 : 19). Le précipité dense qui se forme initialement change d'aspect lorsqu'un excès de HCl bulle à travers la solution et semble prendre un aspect vitrifié et il se dépose sur les parois du ballon. Filtration de la solution sur papier filtre. L'essentiel du précipité reste au fond du ballon et il est lavé plusieurs fois avec du solvant neuf. En total, 118 mg du chlorhydrate de la triamine sont récupérés, ce qui correspond à 0.233 mmoles et à un rendement de 70 %.

Rf = 0, 09 ppm ; éluant : méthanol-CH2C12- ammoniaque 10/10/1 ; révélation faible à la vanilline ; couleur brune 1H-RMN (méthanol d) : 4,861 ppm ; singulet (large) ; 9H ; 3 NH3+ 2,875 ppm ; triplet ; J = 7, 6 Hz ; 6 H ; 3 CH2NH2 1,50-1,72 ppm ; multiplet ; pics maj. : 1,657 ppm, 1,623 ppm, 1,585 ppm ; 6 H ; 3 CH2CH2NH2 1,10-1,46 ppm ; multiplet ; pics maj. : 1,311 ppm, 1,218 ppm ; 37 H ; 18 CH2 intrachaîne et 1 H central 13C-RMN (méthanol d) : 40,88 ppm (CH2) 38, 76 ppm (CH) ; 34, 91 ppm (CH2) ; 31, 20 ppm (CH2) ; 30, 64 ppm (CH2) ; 30, 35 ppm (CH2) ; 28, 65 ppm (CH2) ; 27,89 ppm (CH2) ; 27,56 ppm (CH2) Exemple 2 : Synthèse de la tétramine 7 : 18.

La demanderesse a synthétisé la tétramine 7 : 18 selon les étapes qui suivent rapportées à la figure 3 des dessins en annexe.

Etape 1 : Formation du tétrabenzoxydiol Q1.

Intermédiaire Q1, C60H9006 PM = 907,35 Un ballon bicol de 50 ml est surmonté d'un réfrigérant (verrerie séchée à l'étuve à 120° C puis laissée à refroidir sous vide). 267,41 mg de tournures de magnésium (Mg, 11 mmoles, PM=24,31) sont introduits et placés sous argon, le montage étant fermé par des sérums

caps. 2,852 g de 7-bromo-1-benzyloxyheptane (10 mmoles, PM=285,23) est pesé dans un ballon piriforme (séché dans l'étuve), placé sous argon et dissous dans 8 ml d'éther (distillé sur du sodium-benzophénone). Cette solution est rajoutée par portions de 0,5 ml sur le magnésium à l'aide d'une seringue. La réaction démarre après le troisième rajout et chauffage par sèche-cheveux. L'addition complète se fait pendant un intervalle de 10 minutes, puis le milieu réactionnel est placé 10 minutes à reflux.

217,75 mg de diéthylsuccinate (1,25 mmoles, 1/8 éq. ; PM=174,2) est dissous dans 25 ml de tétrahydrofurane (THF) (distillé sur du sodium-benzophénone) et rajouté goutte à goutte sur l'organomagnésien, par une ampoule à addition, pendant une demi-heure. La réaction est laissée à 23°C pendant 20 heures. Pour arrêter la réaction le milieu réactionnel est versé dans de l'eau et la phase aqueuse est neutralisée par rajout de HC1 concentré. La phase aqueuse est saturée en NaCl et extraite avec de l'éther. La phase organique est séchée sur MgS04, puis évaporée à sec. Le brut est chromatographié sur colonne de silice (3 x 17 cm, éluant : 50 % puis 70 % éther dans l'hexane). Le produit avec la plus forte polarité est ciblé. Lorsqu'il commence à sortir, les premières fractions sont accompagnés d'un contaminant révélant à la vanilline. et de polarité légèrement plus faible. Ces fractions mixtes sont repurifiées lors d'une deuxième colonne. En total 538,4 mg de diol Q1 sont récupérés, ce qui correspond à 0,593 mmoles et à un rendement de 47,5 %.

RF = 0,41, éluant : 70 % éther dans l'hexane ; révélation à la vanilline : couleur noir

1H-RMN (méthanol d) : 7,18-7,33 ppm ; multiplet ; 20 H ; 4 Phényles 4,85 ppm ; singulet ; 2 H ; 2 OH 4,438 ppm ; singulet ; 8 H ; 4 OCH2Ph 3,429 ppm ; triplet ; J = 6,4 Hz ; 8 H ; CH20Bn 1,46-1,65 ppm ; multiplet ; 8 H ; CH2CH20Bn 1,18-1,45 ppm ; multiplet ; 44 H ; 20 CH2 intrachalne et 2 CH2 du milieu 13C-RMN (méthanol d) : 139,95 ppm (CO) ; 129,42 ppm (CH) ; 128,83 ppm (CH) ; 128,66 ppm (CH) ; 75,11 ppm (CO) ; 73,89 ppm (CH2) ; 71,49 ppm (CH2) ; 40,15 ppm (CH2) ; 33,36 ppm (CH2) ; 31,44 ppm (CH2) ; 30,83 ppm (CH2) ; 30,62 ppm (CH2) ; 27,31 ppm (CH2) ; 24,49 ppm (CH2) Etape 2 : Déshydratation du diol Q1.

Intermédiaire Q2 (mélange d'isomères de position), C60H8604 PM = 871,32 538 mg du diol Q1 (0,445 mmoles, 1 éq. ; PM=907,37) sont dissous dans 30 ml de toluène dans un monocol de 50 ml et le ballon est surmonté d'un piège Dean- Stark couplé à un réfrigérant. 22,5 mg d'acide paratoluènesulfonique (0,12 mmoles, 0,2 éq. PM=190,2.2) sont rajoutés et le milieu réactionnel est chauffé à reflux pendant 2 heures. Pour arrêter la réaction le toluène est évaporé sous évaporateur rotatif. Par chromatographie sur couche mince, on voit que le produit recherché est accompagné d'un produit secondaire de plus forte polarité et de même intensité. Le brut réactionnel est purifié par

chromatographie sur silice (17 x 3 cm) avec comme éluant un mélange de 10 % éther dans l'hexane. 290,3 mg de Q2 sont obtenus, ce qui correspond à 0,333 mmoles et à un rendement de 56,4 %.

Rf = 0, 43 ; éluant : 20 % éther dans l'hexane, révélation faible en UV, forte avec de l'iode 1H-RMN (CDC13) : 5,06-5,19 ppm ; multiplet centré sur 5,124 ppm ; 2 H ; 2 protons vinyliques 7,24-7,43 ppm ; 20 H ; 4 phényles 4,526 ppm ; singulet ; 8 H ; 4 OCH2Ph 3,489 ppm triplet 6, 6 Hz ; 8 H ; 4 CH20bn 1,93-2,20 ppm ; multiplet ; pics maj. : 2,142 ppm, 2,100 ppm, 2,052 ppm, 2,027 ppm ; 8 H ; 4 CH2 allyliques 1,54-1,75 ppm ; multiplet ; 8 H ; 4 CH2CH20Bn 1,21-1,52 ppm ; multiplet (singulet) ; pic maj.

: 1, 348 ppm ; 32 H ; 16 CH2 intrachaîne plusieurs petits massifs correspondant aux protons vinyliques et allyliques d'isomères peu abondants 13C-RMN (CDCl3) : 140,98 ppm (CO) ; 139,51 ppm (CO) ; 138,82 ppm (CO) ; 128,40 ppm (CH) ; 127, 66 ppm (CH) ; 127, 51 ppm (CH) ; 124,82 ppm (CH), 120,60 ppm (CH) ; 72,92 ppm (CH2) ; 70,60 ppm (CH2) ; 37,83 ppm (CH2) ; 37,07 ppm (CH2) ; 30,51 ppm (CH2) ; 30,20 ppm (CH2) ; 29,86 ppm (CH2) ; 29, 52 ppm (CH2) ; 28, 77 ppm (CH2) ; 28,48 ppm (CH2) ; 28, 32 ppm (CH2) ; 27, 83 ppm (CH2) ; 26,28 ppm (CH2)

Etape 3 : Hydrogénation et débenzylation de Q2 pour former Q3.

Intermédiaire Q3, C32H6604 PM =514,86 290,3 mg du diène Q2 (0,333 mmoles, PM=871,34) sont dissous dans 25 ml d'acétate d'éthyle et introduits dans un ballon bicol de 50 ml. L'air est remplacé contre de l'argon, par cycles successifs de vide et d'argon. 30 mg de Pd/C (5 %) sont introduits. Le milieu est placé sous argon, puis l'argon est remplacé par du dihydrogène sous une pression d'une atmosphère. L'hydrogénation catalytique se fait pendant 1 jour. Dilution du milieu réactionnel avec un mélange de CH2C12-méthanol (50 : 50), filtration sur papier filtre et lavage du filtre avec CH2Cl2-méthanol et évaporation des solvants. Le résidu est repris dans 25 ml d'éthanol et remis à hydrogéner en présence de 30 mg de Pd/C (5 %) pendant 5 jours. Arrêt en enlevant le palladium par filtration sur papier filtre et lavage du filtre par CH2C12-méthanol. Après évaporation des solvants, le tétrol solide (le brut réactionnel est très peu contaminé d'après analyse par chromatographie en couche mince) est purifié par chromatographie sur silice (3 x 18 cm, équilibrée avec de l'acétate d'éthyle). Le hexol étant peu soluble dans l'acétate d'éthyle est dissous dans 2 ml d'acétate d'éthyle contenant 10 % de méthanol et déposé sur colonne. On élue avec 100 ml d'acétate d'éthyle 100%, puis un gradient 1 à 10 % de méthanol dans 1'acétate d'éthyle (100 ml pour chaque n %). Le produit majeur sort avec 6 à 8 % de méthanol. Les fractions pures réunies fournissent 137,8 mg

du tétrol Q3, ce qui correspond à 0,268 mmoles et à un rendement de 80,4 %.

Rf = 0,31 ; éluant : 10% méthanol dans CH2C12 1H-RMN (méthanol d) : 4,836 ppm ; singulet ; 4 H ; 4 OH 3,494 ppm ; triplet ; J = 6, 5 Hz ; 8 H ; 4 CH20H 1,40-1,58 ppm ; multiplet pics maj. : 1,520 ppm, 1,488 ppm, 1,457 ppm ; 8 H ; 4 CH2CH20H 1,10-1,40 ppm ; multiplet ; pics maj. : 1,276 ppm, 1,232 ppm ; 46 H ; 22 CH2 intrachaîne et 2 H des embranchements 13C-RMN (méthanol d) : 63,10 ppm (CH2) ; 38,90 ppm (CH) ; 34,94 ppm (CH2) ; 34,94 ppm (CH2) ; 33,80 ppm (CH2) ; 31,30 ppm (CH2) ; 30, 78 ppm (CH2) ; 27,93 ppm (CH2) ; 27,08 ppm (CH2) Etape 4 : Activation de la molécule par formation du tétramésylate et conversion en tétraazide Q4.

Intermédiaire Q4, C32H62N12 PM = 614,92 Activation de la molécule par formation du tétramésylate : 137,8 mg du tétrol Q3 (0,268 mmoles, 1 éq., PM=514, 88) est dissous-dans 15 ml de CH2Cl2 dans un ballon de 50 ml. 215 mg de chlorure de mésyle (1,876 mmoles, 7 éq.

, PM=114, 55), dissous dans 2 ml de CH2C12 sont rajoutés.

218 mg de triéthylamine (2,14 mmoles, 8 éq., PM=101,12), dilués dans 2 ml de CH2C12, sont additionnés goutte à goutte. Le milieu réactionnel est agité pendant une demi- heure, et le tétrol, insoluble au début, est passé

entièrement en solution. La réaction est lente, et pour l'accélerer 100 mg de Et3N (0, 98 mmoles) et 100 mg de MsCl (0,87 mmoles) sont rajoutés. Le milieu réactionnel vire lentement au jaune pâle puis au jaune orange pendant une demi-heure. Les solvants sont évaporés. Le solide résultant est repris dans du dichlorométhane (50 ml), puis lavé avec une solution aqueuse saturée en NaHC03 (30 ml) : La phase aqueuse est relavée avec du dichlorométhane (50 ml). Les phases organiques réunies sont relavées avec 50 ml d'eau, puis séchées avec du sulfate de magnésium, filtrées sur célite et évaporés sous vide.

Rf = 0, 87 ; éluant : acétate d'ethyle ; révélation à la vanilline est faible et montre que le produit se dégrade sur silice (tache sur le start).

Conversion en tétraazide Q4 : Le solide récupéré de la réaction précédente est repris dans 8 ml de DMF et placé dans un ballon monocol de 25 ml, surmonté d'un réfrigérant vigreux. 348,4 mg d'azidure de sodium (5,36 mmoles ; 20 éq. ; PM=65,01) sont rajoutés, et le milieu réactionnel est chauffé à 70° C pendant 16 heures. Après refroidissement du milieu, 10 ml d'eau sont rajoutés au milieu et extrait avec de l'éther (3 x 100 ml). Les phases organiques réunies sont lavées avec de l'eau.,. puis séchées avec du MgS04.. Filtration sur célite et évaporation des solvants fournit un brut qui est purifié par chromatographie sur silice (colonne : 3 x 18 cm, éluant : 2,5 % éther dans l'hexane). 112,6 mg du produit purifié sont récupérés, ce qui correspond à 0,183 mmoles et à un rendement de 68,3 %.

Rf = 0,35 ; éluant : 5 % éther dans l'hexane ; révélation faible à la vanilline (couleur brun rose) et révélation faible à l'iode.

1H-RMN (CDC13) : 3,293 ppm ; triplet ; J = 6, 8 Hz ; 8 H ; 4 CH2N3 1,54-1,73 ppm ; multiplet pics maj. : 1,671 ppm, 1,637 ppm, 1,602 ppm ; 8 H ; 4 CH2CH2N3 1,12-1,48 ppm ; multiplet ; pics maj. : 1,354 ppm, 1,259 ppm, 1,209 ppm ; 46 H ; 22 CH2 intrachaîne et 2 H des embranchements 13C-RMN (CDC13) : 51,54 ppm (CH2) ; 37,80 ppm (CH) ; 33,67 ppm (CH2) ; 30,44 ppm (CH2) ; 30,02 ppm (CH2) ; 29,26 ppm (CH2) ; 28, 90 ppm (CH2) ; 26,80 ppm (CH2) ; 26, 69 ppm (CH2) Etape finale : Réduction de l'azide en tétraamine Q4 et formation du tétrachlorhydrate.

Produit final, C32H74C14N4 PM = 656,77 99 mg du tétraazide Q4 (0,16 mmoles ; 1 éq. ; PM=614,92) sont introduits dans un pilulier de 5 ml. 500 1 de tétrahydrofurane (THF) et 50 Rl d'eau (2,77 mmoles ; 17,4 eq.) sont rajoutés. 336 mg de triphénylphosphine (1,28 mmoles ; 8 éq. ; PM=262,3) sont additionnés, spatule par spatule. Au début la réaction démarre lentement, mais après 5 min et rajout total du PPh3 le dégagement gazeux est fort et la réaction est exothermique. Le pilulier est fermé d'un bouchon transpercé par l'aiguille d'une

seringue, le milieu réactionnel étant agité par un barreau aimanté de 2 mm pendant 6 jours. Après 1 jour de réaction un précipité s'est formé ; il est amorphe dans la solution et cristallin sur les parois de verre du récipient. Après 6 jours de réaction totale, le milieu réactionnel est repris dans 100 ml de CH2C12 et filtré sur papier filtre, pour piéger les traces d'eau excédentaire. L'amine est alors précipitée par de l'HCl gazeux (préparé par action de H2S04 sur un mélange de HCl concentré et de NH4C1, et lavage du gaz par passage à travers de H2SO4 concentré) dans un ballon bicol. Par filtration on récupère 83,3 mg de la tétraamine. Le filtre et le bicol sont lavés avec du méthanol, ce qui permet de récupérer 10,6 mg de produit supplémentaire. Le produit pèse donc en total 93,9 mg, ce qui correspond à 0, 143 mmoles et à un rendement de 89 %.

Rf = 0,015 ; éluant : méthanol-dichlorométhane- ammoniaque 10/10/1 ; révélation à la vanilline ; couleur brune 1H-RMN (méthanol d) : 4,866 ppm ; singulet ; 12 H ; NH3+ 2,911 ppm ; triplet ; J = 7, 6 Hz ; 8 H ; 4 CH2NH3+ 1,57-1,78 ppm ; multiplet pics maj. : 1,697 . ppm, 1,663 ppm, 1,625 ppm ; 8 H ; 4 CH2CH2NH3+.

1,18-1,45 ppm ; multiplet ; pics maj. : 1,347 ppm, 1,261 ppm, 1,214 ppm ; 46 H ; 22 CH2 intrachaîne et 2 H des embranchements 13C-RMN (méthanol d) : 40,87 ppm (CH2) ; 39,09 ppm (CH) ; 34,88 ppm (CH2) ; 31,49 ppm (CH2) ; 31,11 ppm

(CH2) ; 30,43 ppm (CH2) ; 28,66 ppm (CH2) ; 27,90 ppm (CH2) ; 27, 64 ppm (CH2) Exemple 3 : Synthèse de l'hexamine 6 : 19.

La demanderesse a synthétisé l'hexamine 6 : 19 selon les 7 étapes qui suivent rapportées à la figure 4 des dessins en annexe.

Etape 1 : Formation du triester méthylique H1 par estérification de l'acide 4- (2-carboxyéthyl)-4- nitropimélique.

Intermédiaire H1, C13H2108N PM = 319,31 11,09 g d'acide 4- (2-carboxyéthyl)-4- nitropimélique (40 mmoles, PM=277,24 ; Fluka), dissous dans 250 ml de méthanol, sont chauffés pendant 3 h à reflux en présence de 380,4 mg d'acide paratoluènesulfonique, puis laissés à température ambiante pendant 12 heures. Le méthanol est évaporé à l'évaporateur rotatif et le résidu est séché sous pompe à palettes.

Purification par chromatographie sur silice (dimensions : 20 x 6 cm ; éluant : 70 % éther dans l'hexane). Le produit réactionnel n'est que peu soluble dans l'éluant. On dépose le mélange constitué de 2 phases sur la colonne..

Le produit purifié est peu soluble dans l'éther et très visqueux. On récupère 12,1695 g, ce qui correspond à 38,1 mmoles et à un rendement de 95 %.

Caractérisation par chromatographie en couche mince :

Rf = 0, 38 pour 70 % éther dans l'hexane, révélation à la vanilline donne tâche orange Rf = 0, 38 pour 70 % éther dans l'hexane, révélation à la vanilline donne tache orange 1H-RMN : 3,683 ppm ; singulet ; 9 H ; 3 OMe des esters 2,18-2,38 ppm ; multiplet ; pics maj. : 2,279 ppm, 2,286 ppm ; 12 H ; 3 CH2 en alpha et 3 CH2 en beta de COOMe 13C-RMN : 172,16 ppm (CO) ; 91,88 ppm (CO) ; 52,08 ppm (CH3) ; 30,28 ppm (CH2) ; 28,50 ppm (CH2) Etape 2 : Réduction radicalaire du nitrotriester H1 par HSnBu3.

Intermédiaire H2, C13H2206 PM = 274, 32 5,821 g de H1 (10 mmoles, PM = 316, 31) est dissous dans 6 ml de toluène dans un ballon monocol surmonté d'un réfrigérant. 328mg d'azoisobutyronitrile AIBN (2 mmoles, PM = 164, 21) et 5,3 ml d'hydrure de tributylétain (5,821 g de Bu3SnH, 20 mmoles, PM = 291,05) sont rajoutés. Le milieu réactionnel est mis à chauffer sur un bain d'huile, où la température monte à 120° C pendant 20 minutes. Puis le milieu réactionnel est gardé à cette température pendant une heure. Après refroidissement du milieu réactionnel, une analyse par chromatographie en couche mince révèle qu'il reste du produit nitro de départ.

2 mmoles de AIBN sont rajoutés et le milieu réactionnel est remis à chauffer à 105° C pendant une heure. Après refroidissement du MR une analyse par chromatographie en

couche mince montre que tout produit de départ est consommé. Le toluène est évaporé et le brut réactionnel est séché sur pompe à palettes. Le produit est purifié par chromatographie sur colonne de silice (4.5 x 18 cm) avec comme éluant un mélange de 30 % d'éther dans l'hexane.

Récupération de 2,045 g de produit purifié, ce qui correspond à 7,453 mmoles et à un rendement de 74,5 %.

Rf = 0,44, éluant 60 % éther dans l'hexane Rf = 0,28, éluant 30 % éther dans l'hexane, ne révèle pas à la vanilline, révèle bien à l'iode 1H-RMN : 3,658 ppm ; singulet ; 9 H : 3 OMe 2,321 ppm ; triplet ; J = 7,8 Hz ; 6 H ; 3 CH2 en alpha de COOMe 1,595 ppm ; multiplet sous forme de quadruplet ; 7, 3 Hz ; 6 H ; 3 CH2 en béta de COOMe 0,900 ppm ; triplet ; 7,2 Hz ; 1 H ; CH du milieu du squelette 13C-RMN : 173, 99 ppm (CO) ; 51,59 ppm (CH3) ; 36,13 ppm (CH2), 31,13 ppm (CH2) ; 27,91 ppm (CH2) Etape 3 : Formation du hexabenzoxytriol H3 par couplage d'organomagnésien sur les 3 fonctions esters.

Intermédiaire H3, C88H13009 PM = 1331,99 Un ballon bicol de 50 ml est surmonté d'un réfrigérant (verrerie séchée à l'étuve à 120° C puis laissée refroidir sous vide). 121, 55 mg de tournures de magnésium (Mg, 5 mmoles, PM=24, 31) sont introduits et placés sous argon, le montage étant fermé par des sérums caps. 1,356 g de 6-bromo-1-benzyloxyhexane (5 mmoles,

PM=271,20) est pesé dans un ballon piriforme (séché dans l'étuve), placé sous argon et dissous dans 4 ml d'éther (distillé sur du sodium benzophénone). Cette solution est rajoutée par portions de 0,5 ml sur le magnésium à l'aide d'une seringue. La réaction démarre après le troisième rajout. L'addition complète se fait pendant un intervalle de 10 minutes, puis le milieu réactionnel est placé 10 minutes à reflux.

109,7 mg de triester H2 (0.4 mmoles, 1/12 éq.) est dissous dans 15 ml de tétrahydrofurane (THF) (distillé sur du sodium-benzophénone) et rajouté goutte à goutte sur l'organomagnésien, par une ampoule à addition, pendant une demi heure. La réaction est laissée à 23°C pendant 18 heures. Pour arrêter la réaction le milieu réactionnel est versé sur de la glace. Après fonte de la glace la phase aqueuse est neutralisée par rajout de HC1 concentré. La phase aqueuse est saturée en NaCl et extraite avec de l'éther. La phase organique est séchée sur MgS04, puis évaporée à sec. Le brut est chromatographié sur colonne de silice (3 x 17 cm, éluant : 70 % éther dans l'hexane). Le produit avec la plus forte polarité est ciblé. Lorsqu'il commence à sortir, les premières fractions sont accompagnées d'un contaminant révélant fortement à la vanilline et de polarité légèrement plus faible. Ces fractions mixtes sont repurifiées lors d'une deuxième colonne. En total 299.4 mg de triol sont récupérés, ce qui correspond à 2.24 mmoles et à un rendement de 56 %.

RF = 0, 31, éluant : 70 % éther dans l'hexane, révélation à la vanilline 1H-RMN (CDC13) :

7,23-7,42 ppm ; multiplet ; 30 H ; 6 phényles 4,527 ppm ; singulet ; 12 H ; 6 OCH2Ph 3,490 ppm ; triplet ; J = 6, 5 Hz ; 12 H ; 6 CH20Bn 1,54-1,73 ppm ; multiplet ; pic maj. : 1,562 ppm ; 12 H ; CH2CH20Bn.

1,20-1,52 ppm ; multiplet ; 61 H 30 CH2 intrachalne et 1 H central 13C-RMN (CDC13) : 138,75 ppm (CO) ; 128, 37 ppm (CH) ; 127, 62 ppm (CH) ; 127,48 ppm (CH) ; 74,38 ppm (CO) ; 72,90 ppm (CH2) ; 70,48 ppm (CH2) ; 39,23 ppm (CH2) ; 38,94 ppm (CH) ; 36,19 ppm (CH2) ; 26,26 ppm (CH2) ; 30,17 ppm (CH2) ; 29,82 ppm (CH2) ; 23,55 ppm (CH2) Etape 4 : Déshydratation du hexabenzoxytriol H3.

Intermédiaire H4 (isomères de position), C88H12406 PM = 1277,94 594 mg de triol H3 (0,445 mmoles, PM=1335, 04) sont dissous dans 25 ml de toluène dans un monocol de 50 ml et le ballon est surmonté d'un piège Dean-Stark couplé à un réfrigérant. 17,1 mg d'acide paratoluènesulfonique (0,09 mmoles, 0,2 éq. PM=190.22) sont rajoutés et le milieu réactionnel est chauffé. à reflux pendant-. 2. heures. Pour arrêter la réaction le toluène est évaporé sous évaporateur rotatif. Le produit réactionnel est purifié par chromatographie sur silice (17 x 3 cm) avec comme éluant un mélange de 20 % éther dans l'hexane. Le triène H4 sort très vite de la colonne. 528 mg de H4 sont obtenus, ce qui correspond à 0,412 mmoles et à un rendement de 92,5 g

Rf = 0, 26 ; éluant : 20 % éther dans l'hexane, révélation faible en UV, forte avec de l'iode 1H-RMN (CDC13) : 7,22-7,40 ppm ; multiplet ; 30 H ; 6 phényles 5, 03-5,17 ppm ; multiplet centré sur 5,107 ppm ; 3 H ; 3 protons vinyliques 4, 505 ppm ; singulet ; 12 H ; 6 OCH2Ph 3, 468 ppm ; triplet ; J = 6, 5 Hz ; 12 H ; 6 CH20Bn 1, 88-2,08 ppm ; multiplet centré sur 1,973 ppm ; 18 H ; 6 CH2 allyliques 1, 54-1,71 ppm ; multiplet centré sur 1,626 ppm ; 12 H ; CH2CH20Bn 1,20-1,46 ppm ; multiplet centré sur 1,331 ppm ; 37 H ; 18 CH2 intrachalne et CH central 13C-RMN (CDCl3) : (mélange d'isomères) 140, 3 ppm (CO) ; 138, 82 ppm (CO) ; 128, 39 ppm (CH) ; 127, 64 ppm (CH) ; 127,51 ppm (CH) ; 124, 47 ppm (CH) ; 123, 2 ppm (CH) ; 72,91 ppm (CH2) ; 70,59 ppm (CH2) ; 31,77 ppm (CH2) ; 37,10 ppm (CH2) ; 32,30 ppm (CH2) ; 30,13 (CH2) ; 29, 47 ppm (CH2) ; 28,46 ppm (CH2) ; 27,79 ppm (CH2) ; 26, 25 ppm (CH2) Etape 5 : Réduction des doubles liaisons de H4 et débenzylation par hydrogénation catalysée au palladium.

Intermédiaire H5, C46H9406 PM : 743,24 396,5 mg du triène H4 (0,31 mmoles, PM=1277.94) sont dissous dans 25 ml d'acétate d'éthyle et introduits dans un ballon bicol de 50 ml. L'air est remplacé contre de l'argon, par cycles successifs de vide et d'argon. 39 mg de

Pd/C (5 %) sont introduits. Les traces d'air sont remplacées par de l'argon, puis l'argon est remplacé par du dihydrogène sous une pression d'une atmosphère.

L'hydrogénation catalytique se fait pendant 2 jours.

Dilution du milieu réactionnel avec un mélange de CH2Cl2- méthanol (50 : 50), filtration sur papier filtre et lavage du filtre avec CH2C12-méthanol et évaporation des solvants.

Le résidu est repris dans de l'éthanol et remis à hydrogéner en présence de 39 mg de Pd/C (5 %) pendant 2 jours. Arrêt en enlevant le palladium par filtration sur papier filtre et lavage du filtre par CH2C12-méthanol.

Après évaporation des solvants, le produit réactionnel est purifié par chromatographie sur silice (3 x 18 cm, coulée avec de l'acétate d'éthyle). Le hexol est peu soluble dans l'acétate d'éthyle. Il est dissous dans 10 ml d'acétate d'éthyle contenant 20 % de méthanol et déposé sur colonne.

On élue avec 100 ml d'acétate d'éthyle 100%, puis un gradient 1 à 10 % de méthanol dans l'acétate d'éthyle (100 ml pour chaque n %). Le produit majeur sort avec 9 à 10 % de méthanol. La colonne est alors lavée avec 20 % et 40 % de MeOH dans l'AcOEt, afin de vérifier qu'aucun produit ne reste accroché sur colonne.

148,2 mg du hexol H5 sont récupérés, ce qui correspond à 0,2 mmoles et à un rendement de 64,5 %.

65 mg d'un produit secondaire issu de l'hydrogénolyse sont récupérés.

Rf = 0, 30 ; éluant : 15 % methanol dans du CH2C12 ; révélation à la vanilline : bleu-noir 1H-RMN (méthanol) :

4,779 ppm ; singulet ; 6 H ; protons des alcools 3,495 ppm triplet ; J = 6, 5 Hz ; 12 H ; 6 CH20H 1,42-1,62 ppm ; multiplet centré sur 1,491 ppm ; 12 H ; 6 CH2CH20H 1,08-1,40 ppm ; multiplet ; pics maj. : 1,24 ppm, 1,19 ppm ; 61 H : 30 CH2 et 1 H central 13C-RMN (méthanol) : 63,11 ppm (CH2) ; 39,36 ppm (CH) ; 38,97 ppm (CH) ; 34,95 ppm (CH2) ; 33,79 ppm (CH2) ; 31,47 ppm (CH2) ; 31, 17 ppm (CH2) ; 27,99 ppm (CH2) ; 27,11 ppm (CH2) Etape 6 Activation de la molécule par formation du hexamésylate et conversion en hexaazide.

Intermédiaire H6, C46H88N18 PM = 893,32 Activation de la molécule par formation du hexamésylate : 145 mg du hexol H5 (0,2 mmoles, 1 éq., PM=743,25) est dissous dans 15 ml de CH2C12 dans un ballon de 50 ml. 240 mg de chlorure de mésyle (2,1 mmoles, 10,5 éq., PM=114,55), dissous dans 2 ml de CH2C12 sont rajoutés. 242.7 mg de triéthylamine (2,4 mmoles, 12 éq., PM=101, 12), dilués dans 2 ml de CH2C12, sont additionnés goutte à goutte, et la formation d'une fumée blanche est observée. Le milieu réactionnel, mis sous agitation à température ambiante pendant 1 heure, vire lentement au jaune pâle puis au jaune orange. Les solvants sont évaporés. Le solide résultant est repris dans du dichlorométhane (50 ml), puis lavé avec une solution

aqueuse saturée en NaHC03 (30 ml) : La phase aqueuse est relavée avec du dichlorométhane (50 ml). Les phases organiques réunies sont séchées avec du sulfate de magnésium, filtrées sur célite et le CH2C12 est évaporé sous vide.

Rf = 0, 37 ; éluant 75 % acétate d'éthyle dans l'hexane ; décomposition sur silice Conversion en hexaazide : Le solide récupéré de la réaction précédente est repris dans 10 ml de DMF et placé dans un ballon monocol de 25 ml, surmonté d'un réfrigérant vigreux. 390 mg d'azidure de sodium sont rajoutés, et le milieu réactionnel est chauffé à 65° C pendant 16 heures. Après refroidissement du-milieu, 25 ml d'eau sont rajoutés au milieu et extrait avec de l'éther (3 x 100 ml). Les phases organiques réunies sont lavées avec de l'eau, puis séchées avec du MgS04. Filtration sur célite et évaporation des solvants fournit un brut qui est purifié par chromatographie sur silice (colonne : 3 x 18 cm, éluant : 2,5 % éther dans l'hexane, puis gradient vers 10 %). 109 mg du produit purifié sont récupérés, ce qui correspond à 0,122 mmoles et à un rendement de 61 %.

Rf 0,032 éluant : 5 % éther dans l'hexane, révélation très faible à. la vanilline, révélation. faible à l'iode.

1H-RMN (CDC1 3) : 3,270 ppm ; triplet ; J 6, 8 Hz ; 12 H ; 6 CH2N3 1,50-1,70 ppm ; multiplet pics maj. : 1,613 ppm, 1,578 ppm ; 12 H ; 6 CH2CH2N3

1, 10-1, 50 ppm ; multiplet ; pics maj. : 1,325 ppm, 1,253 ppm, 1,191 ppm ; 64 H ; 30 CH2 intrachaîne et 4 H sur embranchements 13C-RMN : 51,50 ppm (CH2) ; 38,45 ppm (CH) ; 37,77 ppm (CH) ; 33,59 ppm (CH2) ; 30,42 ppm (CH2) ; 29,67 ppm (CH2) ; 28, 91 ppm (CH2) ; 26,81 ppm (CH2) ; 26,64 ppm (CH2) Etape finale : Réduction et conversion en chlorhydrate de hexaamine.

Produit final, hexamine 6 : 19, C46H106C16N6 PM = 956,09 109 mg de l'hexaazide sont introduits dans un pilulier de 5 ml. 800 ul de tétrahydrofurane (THF) et 80 Rl d'eau sont rajoutés. 384 mg de triphénylphosphine sont additionnés, spatule par spatule. La réaction est douce, avec un dégagement gazeux faible. Le pilulier est fermé d'un bouchon transpercé par l'aiguille d'une seringue, le milieu réactionnel étant agité par un barreau aimanté de 2 mm. Après 3 jours de réaction, 192 mg de triphénylphosphine (PPh3) sont rajoutés (peu soluble cette fois-ci, et pas de dégagement gazeux supplémentaire). Après une semaine de réaction totale, le milieu réactionnel est repris dans 100 ml de CH2C12 et filtré sur papier filtre, pour piéger les traces d'eau excédentaire. L'aminé est alors précipitée par de l'HCl gazeux (préparé par action de H2S04 sur un mélange de HCl concentré et de NH4C1, et lavage du gaz par H2SO4 concentré). Par filtration on récupère 85,6 mg de l'hexamine, qui forme un précipité amorphe, piégeant les solvants. Ce précipité durcit sous vide d'une pompe à palettes et devient floconneux. Le filtre est lavé avec du

méthanol, ce qui permet de'récupérer 17,. 1 mg de produit supplémentaire. Le produit pèse donc en total 102,7 mg, ce qui correspond à 0,107 mmoles et à un rendement de 88 %.

Rf = 0, 0 ; éluants méthanol-CH2Cl2-ammoniaque 10/10/1 ou 10/0/1 ou 10/0/2 1H-RMN (méthanol) :- 4,828 ; singulet ; 18 H ; 6 NH3+ 2,887 ppm ; triplet ; J = 7, 6 Hz ; 12 H ; 6 CH2NH3+ 1,54-1,72 ppm ; multiplet ; pics maj. : 1,676 ppm, 1,643 ppm, 1,606 ppm ; 12 H ; 6 CH2NH3+ 1,11-1,47 ppm ; multiplet ; pics maj. : 1,313 ppm, 1,255 ppm, 1,183 ppm ; 64 H ; 30 CH2 intrachaîne et 4 H sur embranchements 13C-RMN (méthanol).

40,87 ppm (CH2) ; 39,73 ppm (CH) ; 39,11 ppm (CH) ; 34,82 ppm (CH2) ; 31,65 ppm (CH2) ; 30,84 ppm (CH2) ; 28, 69 ppm (CH2) ; 27,83 ppm (CH2) ; 27,68 ppm (CH2) Exemple 4 : Tests antimicrobiens in vitro.

Les tests in vitro ont été réalisés suivant les conditions décrites dans"Strategies for the Isolation and Characterisation of Antimicrobial Peptides of Invertebrates, C. Hetru, P. Bulet, Methods in Molecular Biology, Vol. 78 : Antibacterial Peptide Protocols, Edited by Shafer, Humana Press Inc., Totowa, NJ". Pour déterminer les Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) des cascades de dilutions des chlorhydrates des polyamines ont été réalisées dans de l'eau stérile suivant un mode de dilution deux à deux, en commençant à 1 mg/ml. Pour les

tests 10p1 de chaque dilution sont mis ensemble avec 90 pl d'une suspension de bactéries ou de spores de champignons dans des plaques multipuits à 96 puits. La CMI pour les bactéries représente la concentration la plus faible où aucune pousse de bactéries ne peut être constatée après 24 heures de culture à 29°C. La densité de bactéries est mesurée par lecture de la turbidité dans les puits de culture exprimée par l'absorbance à 600 nm (densité optique, DO). La CMI pour les champignons est déterminée après 48 heures de culture à 29°C par analyse microscopique des ifs formés et correspond à la concentration minimale où aucune germination n'est visible. Les résultats des tests d'activité sont rapportés dans le tableau 2.