СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА.

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к новым карбамоилфенильным производным, предназначенным для остановки, предотвращения и профилактики кровотечений или усиления системы гемостаза. Данное изобретение так же относится к новому классу веществ, их фармацевтически приемлемым солям, их фармацевтически приемлемым композициям, которые могут использоваться для остановки, предотвращения и профилактики кровотечений у человека и других млекопитающих которые могут быть следствием гипокоагуляционного состояния системы свертывания крови, нарушения свертываемости крови, гематологических расстройств, геморрагических расстройств, гемофилий, дефицита фактора VII, медикаментозного лечения, травмы, заболевания, нарушений, связанных с кровоточивостью, хирургического вмешательства, гипотермии, менструации и беременности и ряда других болезней у человека и млекопитающих, связанных со свертываемостью крови. Данное изобретение так же относится к использованию заявленных соединений в фармацевтических композициях и способах лечения болезней связанных с нарушением свертываемости крови у человека и других млекопитающих .

Предшествующий уровень техники

Свертывание крови - физиологический процесс образования гемостатического сгустка для предотвращения значительных потерь крови и для сохранения целостности кровеносного русла в случае поранения, повреждения тканей или травмы. В результате повреждения возникает кровотечение, при котором кровь контактирует с разрушенными тканями, и инициация свертывания плазмы крови осуществляется тканевым фактором (TF) - мембранным белком, присутствующим на поверхности всех клеток организма, за исключением эндотелия, выстилающего внутреннюю поверхность кровеносного сосуда. В плазме крови растворены неактивные предшественники белков-факторов свертывания, которые в ходе инициации свертывания активируются путем протеолиза по специальным сайтам. Фактор свертывания VII (FVII) и его активная форма FVIIa образуют комплекс с TF, который активирует факторы свертывания IX (FIX) и X (FX). Активированный фактор FIXa также активирует FX, a FXa протеолитически расщепляет протромбин, из которого образуется тромбин - главный фермент системы свертывания. Образующиеся на стадии инициации (в первые секунды-десятки секунд) следовые количества тромбина способны активировать факторы свертывания V (FV) и VIII (FVIII), которые являются кофакторами FXa и FDCa, соответственно, а также фактор свертьшания XI (FXI), который в активной форме способен активировать FIX. На стадии амплификации комплексы FXa и FVa, FIXa и FVIIIa собираются на отрицательно заряженных фосфолипидных везикулах или мембранах клеток; образующиеся комплексы обладают в тысячи-десятки тысяч большей каталитической активностью, чем одиночные FXa и FrXa. В результате происходит быстрый рост концентрации тромбина, вплоть до концентрации 1мкМ. В ходе протеолиза тромбином фибриногена, растворимого белка плазмы крови, образуется фибрин, который полимеризуется в гелеобразный фибриновый сгусток. (Mann K.G. et al. Blood 1990 76:1-16; Hoffman M. et al. Thromb Haemost, 2001: 85/6 pp.947-1124). На стадии распространения рост фибринового сгустка в просвете сосуда или раны происходит от поверхности, на которой произошла инициация свертьшания тканевым фактором. Скорость пространственного роста фибринового сгустка определяется диффузией активных факторов свертывания в направлении роста сгустка, таких как тромбин, FXa, FVa, FIXa, FVIIIa, FXIa, FXIIa. (Panteleev et al. Biophys J. 2006:90(5) pp. 1489 - 1500). Диффузия активных факторов свертьшания ограничивается ингибиторами протеаз плазмы крови, такими как антитромбин-Ш, α 1 -антитрипсин, <х2-макроглобулин, С 1 -ингибитор, а2- антиплазмин, α 1 -ингибитор протеиназ, αΐ-антихимотрипсин, которые необратимо инактивируют эти факторы.

При различных нарушениях системы свертьшания крови возникают патологические состояния, при которых рост фибринового сгустка отличается от нормального роста сгустка у здоровых субъектов. Так, субъекты с риском возникновения тромбозов имеют гиперкоагуляционное состояние системы свертьшания, характеризующееся повышенной скоростью роста сгустка и спонтанным тромбообразованием. Напротив, субъекты с повышенной тенденцией к кровотечениям имеют гипокоагуляционное состояние свертьшания, характеризующееся повышенной задержкой и пониженной скоростью роста сгустка.

Кровотечения представляют собой общеклиническую проблему. Они могут являться следствием как нарушения системы свертьшания крови, так и заболевания, травмы, хирургического вмешательства или медикаментозного лечения. При кровотечениях могут произойти избыточная кровопотеря и даже гибель субъекта, поэтому крайне важно остановить их. Механическая остановка кровотечения может оказаться невозможной из-за местоположения или большого количества поврежденных сосудов. Поэтому субъекту с кровотечением может потребоваться лечение агентами, поддерживающими гемостаз. В качестве таких агентов могут выступать цельная донорская кровь, свежезамороженная плазма, происходящие из плазмы криопреципитат или концентрат активированного протромбинового комплекса, очищенные и рекомбинантные факторы свертывания (Elliott J. Et al. Anesth Analg. May 2010 110:5 pp 1419-1427).

Гемофилия А представляет собой патологию, характеризующуюся повышенной тенденцией к кровоточивости; она является наиболее распространенным наследственным нарушением свертывания крови, с частотой встречаемости одно на 5000 мужчин. Гемофилия А вызывается дефицитом или структурными дефектами FVIII. Гемофилия В, которая встречается в 5 раз реже, чем гемофилия А, вызывается дефицитом или структурными дефектами FIX. FIXa наименее подвержен инактивированию ингибиторами протеаз плазмы крови, и его диффузия определяет скорость роста сгустка в плазме крови здорового субъекта. При отсутствии активности FIXa при таких патологиях скорость роста сгустка определяется диффузией других факторов, таких как FXa и тромбин. Такие факторы необратимо инактивируются ингибиторами протеаз плазмы крови намного быстрее, чем FIXa, поэтому рост сгустка в плазме субъекта с гемофилией А или гемофилией В происходит со скоростью, примерно в 2 раза меньшей скорости роста в плазме здорового субъекта (Berntorp Е. et al. Bull World Health Organ. 1995, v.73:5 pp 691-701).

До повсеместного применения концентратов FVIII и FIX для лечения гемофилии А и гемофилии В, соответственно, продолжительность жизни человека с тяжелой формой гемофилии составляла менее 20 лет. Использование концентратов факторов из плазмы крови значительно улучшило ситуацию для субъектов, страдающих гемофилией, при этом средняя продолжительность их жизни значительно увеличилась. Однако использование плазмы крови человека в качестве источника концентратов факторов имеет множество недостатков, в том числе вероятность контаминирования смертельно опасными вирусами, такими как ВИЧ, вирус гепатита В и многими другими, поэтому позже белковые факторы свертывания стали получать в виде рекомбинантных белков. Современное лечение гемофилии производится введением внутривенно рекомбинантных факторов свертывания человека FVIII (Kogenate®, Recombinate®, Refacto®) и FIX (BeneFix®), замещающих недостающие или нефункциональные факторы в плазме крови субъекта. Такой способ лечения имеет ряд серьезных недостатков.

FVIII имеет короткий период полувыведения (около 11 часов) из кровотока человека. (Tiede A. et al. J Thromb Haemost. 2013; 11: 670-678). Поэтому введение препарата субъектам назначается несколько раз в неделю в течение всей жизни. Необходимость частого внутривенного введения создает огромные барьеры в соблюдении больными режима и схемы лечения, а также сильно увеличивает стоимость лечения. Короткое время жизни факторов свертывания в плазме крови человека может быть несколько увеличено различными модификациями FVIII, например, ковалентным присоединением длинноцепочечных молекул полиэтиленгликоля (ПЭГ) к протеину. (Patapp. WO 2006/053299, Site-Directed Modification Of FVIII)

Серьезной медицинской проблемой является ингибиторная гемофилия, которая характеризуется образованием ауто-антител к заменяющим факторам. Примерно у 25- 30% субъектов с гемофилией А вырабатываются аутоантитела, которые ингибируют активность FVIII. (Saenko EX. et al. Haemophilia (2002), 8, 1-11). Выработка антител, блокирующих активность вводимого препарата, препятствует использованию FVIII при заместительной терапии. Лечение субъектов с ингибиторной гемофилией более дорого из-за использования высокодозированного рекомбинантного FVIII и иммуноустойчивой терапии. Выработка у субъекта антител к FIX менее распространена, но имеет более тяжелые последствия, потому что такие антитела менее восприимчивы к терапии, при которой индуцируется иммунная толерантность (DiMichele D.M. Br J Haematol. 2012, 159:2, p 123-134).

В настоящее время для лечения ингибиторной гемофилии используется шунтирующая терапия ("by-pass therapy"), которая проводится путем введения сверх- физиологических концентраций FVIIa, которых достаточно для образования гемостатического сгустка даже в отсутствие FVIIIa или FIXa (US 4382083 "Therapeutic method for treating blood-clotting defects with factor Vila"). FVIIa в высоких концентрациях способен активировать такие количества FX, которые достаточны для быстрой наработки тромбина и образования фибрина без участия положительных обратных связей активации тромбином факторов FVIII и FXI. Таким образом, применение FVIIa позволяет достичь образования гемостатического сгустка, минуя стадию амплификации. На основе рекомбинантного FVIIa человека (rhFVIIa) в 1988 году был создан фармацевтический продукт, который продается под торговой маркой NovoSeven®. (US 4784950 "Expression of factor VII activity in mammalian cells"). Однако использование рекомбинантного FVIIa имеет существенные недостатки, связанные с белковой природой препарата.

FVIIa имеет короткое время полу-жизни в плазме крови человека, около 2 часов, и это представляет собой серьезный недостаток для терапевтического применения FVIIa, потому что для достижения гемостаза необходимы многократные внутривенные инъекции или непрерьшное вливание препарата. Это сильно увеличивает стоимость лечения и создает неудобства для субъекта. Существует несколько способов увеличения времени полужизни фактора, включающие производство FVII в виде слитного белка с альбумином или в виде белка, модифицированного ПЭГ, но эти способы не решают данную проблему полностью. (ЕР1816201 А1 "Modified coagulation factor Vila with extended half-life").

Также недостатком использования препаратов rhFVIIa является низкая активность препарата при терапевтическом применении, которая вызвана отсутствием определенных модификаций молекул белка, которые необходимы для проявления функциональной активности белка в крови человека. Белки системы свертывания синтезируются в клетках печени и подвергаются множеству ко- и посттрансляционных модификаций, например, аспарагинсвязанное (Ν-связанное) гликозилирование; О- связанное гликозилирование и γ-карбоксилирование остатков Glu. Расположение модифицированных аминокислотных остатков в молекуле белка, который получен путем экспрессии в гетерологичных клетках-хозяевах, может сильно различаться по сравнению с молекулой функционально активного природного белка. Так, производство белка в различных гетерологичных клетках часто приводит к получению различных вариантов гликозилирования одного полипептида. Такие варианты гликоформ rhFVIIa различаются по конфигурации олигосахаридов, а, следовательно, по активности, иммуногенности и по клиренсу in vivo (WO2004111242А1, Factor VII or Vila gla domain variants; US6903069 B2, Factor VII glycoforms).

Известны попытки использовать FVIIa в качестве универсального гемостатического средства для остановки кровотечения при различных патологиях, например, при кровоизлияниях в органах, внутренних кровотечениях, травмах. (Erhardtsen Е. Pathophysiol Haemost Thromb 2002;32(suppl l):47-52). Однако в таких случаях NovoSeven® проявляет низкую активность, и для предотвращения неконтролируемых кровотечений у субъектов с травмами требуются относительно высокие дозы препарата. С другой стороны, при использовании NovoSeven® были выявлены случаи артериальных и венозных тромбозов и случаи образования ингибирующих антител у субъектов с дефицитом FVII. Также недостатком NovoSeven® является невозможность его использования при патологических состояниях, при которых повышено высвобождение тканевого фактора (такие состояния, как атеросклероз, септицемия, размозженные раны, ДВС-синдром), из-за высокого риска возникновения тромботических осложнений. Такие состояния характеризуются одновременно риском тромботических осложнений и повышенной кровоточивостью. (Lin Y. et al. Transfusion medicine, 2012, v.22:6, pp 383-394; Logan A.C. et al, Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2010; 2010:153-9.).

Кроме врожденных или приобретенных дефицитов гемостаза, таких как гемофилия, также причиной кровотечений может стать хирургическая операция, в т.ч. на сердце, печени (например, резекция или трансплантация печени), или травма. Известно много методов остановки кровотечений применением гемостатических агентов местного действия (topical use). В качестве местных гемостатиков используется коллагеновый гель, на котором формируется тромбоцитарный агрегат; раствор, содержащий ионы металлов, которые образуют нерастворимый комплекс с альбумином плазмы крови; полимерные губки хитозана; растворы, аэрозоли, пленки или гели, содержащие активированные факторы свертывания. (ЕР 1718147 В1 "Hemostatic agent for topical and internal use"; WO 2001082896 Al "Hemostatic agent, method and carrier for applying a blood clotting agent"; US 7094428 B2 "Hemostatic compositions, devices and methods").

Однако все методы остановки кровотечений обладают общими недостатками: невозможно применить такие средства в случаях, когда область кровотечения точно не локализована (например, при внутренних кровотечениях), или не доступна для прямого применения гемостатиков (например, при внутричерепном кровоизлиянии). Также недостатком таких методов является риск эмболизации образующихся сгустков и риск возникновения тромбозов (особенно при применении препаратов, содержащих активированные факторы свертывания). (Georgiou С et al. Am Surg; 2013 Feb;79(2):180- 7).

Также причиной возникновения гипокоагуляционного состояния системы свертывания крови и повышенного риска кровотечений является лечение антикоагулянтными препаратами. Наиболее распространенным непрямым антикоагулянтом является гепарин и его производные (низкомолекулярный гепарин, фрагмин, фондапаринукс, идрапаринукс, эноксапарин), он используется в случаях возникновения тромбозов. Гепарин и его производные опосредуют связывание антитромбина-Ш с тромбином и FXa, таким образом, увеличивая скорость необратимого инактивирования активных факторов свертывания. (Becattini С. et al. Thromb Res. 129 (2012) 392-400). Однако применение гепарина примерно в 10% случаев способствует развитию гепарин-индуцированной тромбоцитопении - состояния, при котором система гемостаза субъекта подавлена, а при высоких концентрациях препарата может вызвать неконтролируемое кровотечение. (Bakchoul Т. et al. Ther Adv Hematol. (2012) 3(4) 237- 251). Известен антидот гепарина - протамин, конкурирующий с ним за связывание с антитромбином-Ш. Однако применение протамина осложняется узким терапевтическим окном для этого препарата - при передозировке препарат оказывает антикоагулянтное действие. (Fazavana J. et al. J Thromb Haemost. 2013 Jun;l l(6):l 128-36). Также известно применение тромболитических и фибринолитических препаратов в случаях, связанных с тромботическими событиями и гиперкоагуляционным состоянием системы свертывания, однако при их применении также часто возникает риск кровотечений и гипокоагуляции. В частности, известны случаи кровоизлияния в мозг, связанные с применением тромболитических препаратов. (Matosevic В. et al. Neurology. March 26, 2013 80:1216- 1224).

Также для предотвращения рецидива тромбоза используется варфарин, блокирующий витамин К-зависимое γ-карбоксилирование факторов свертывания в клетках печени. Однако варфарин вызывает понижение концентрации факторов свертывания в крови и способствует возникновению коагулопатии, а также спонтанного кровоизлияния в мозг субъекта (Cervera A. et al. J Neurol. 2012, v.259(2) pp 212-224).

В случаях избыточного кровотечения после антикоагулянтной терапии известно применение антифибринолитических средств. Например, транексамовая кислота ингибирует образование из плазминогена основного белка фибринолиза плазмина, который протеолитически расщепляет фибриновый сгусток. Однако антифибринолитические средства могут способствовать рецидиву тромбоза, в частности, они способствуют развитию генерализованного тромбоза при ДВС-синдроме (диссеминированном вну рисосудистом свертывании) - клиническом состоянии, которое характеризуется массивным кровоизлиянием. (Gando S. et al. Ann Surg. July 2011 254(1): 10- 19).

Таким образом, существующие методы лечения нарушений свертываемости крови с применением препаратов факторов свертывания имеют следующие недостатки:

- Активные компоненты существующих лекарственных средств имеют белковую природу. В результате время полу-жизни в плазме субъекта очень короткое, порядка часа или нескольких часов, что требует многократного введения препарата. - Применение белковых препаратов осуществляется путем внутривенных инъекций, что препятствует многократному и частому использованию препаратов.

- Белковая природа активных компонентов, которые производятся из культур рекомбинантных клеток млекопитающих, является причиной высокой дороговизны существующих препаратов.

- В случае активных компонентов, получаемых из плазмы крови человека, существует риск заражения смертельно опасными вирусными инфекциями, такими как ВИЧ, гепатит В, гепатит С и другими.

- При использовании препаратов факторов свертывания FVIII и FIX в лечении гемофилии А и В у части субъектов появляются ингибирующие антитела («ингибиторная гемофилия»), которые блокируют терапевтический эффект препарата и делают лечение неэффективным. Среди субъектов, страдающих гемофилией, около 30% имеют ингибирующие антитела, и их доля постоянно растет.

- При использовании препарата фактора свертывания FVIIa и концентрата протромбинового комплекса в лечении ингибиторной гемофилии и других нарушений свертываемости крови существует серьезный риск тромботических осложнений.

Лечение нарушений свертывания крови, которые возникают как следствие антикоагулянтной, антитромбоцитарной и фибринолитической терапии при тромботических событиях, а также остановка кровотечений препаратами факторов свертывания имеют серьезный недостаток, заключающийся в риске рецидива тромбоза.

Перечисленные недостатки указывают на необходимость создания альтернативного подхода в лечении нарушений свертывания крови с применением, желательно, единственного прокоагулянтного соединения, лишенного вышеупомянутых недостатков и обладающего широким диапазоном применения.

Краткое описание рисунков

На рис.1, рис. 2 и рис. 3 для веществ из числа, приведенных в примерах (Прим.1, Прим.2, Прим.З), а так же для известного лекарства против гемофилии А « оэйт-ДВИ» (Bayer, США) (Копылов и др. Проблемы гематологии; 2003/2:5-11) приведены зависимости стационарной скорости роста сгустка Vst от концентрации активного вещества в плазме крови человека с дефицитом фактора VIII (гемофилия А) (рис. 1), с дефицитом фактора ГХ (гемофилия В) (рис. 2) и в плазме крови здорового человека, в которую добавлен нефракционированный гепарин, в условиях in vitro. Концентрация рассчитывалась в мкг/мл. Рис. 1. Зависимость , стационарной скорости роста сгустка Vst от концентрации . активного вещества в плазме крови человека с дефицитом фактора УШ (гемофилия А).

Рис. 2. Зависимость стационарной скорости роста сгустка Vst от концентрации

С выбран из

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ

Z], Z ₂ , Z3, Z ₄ , Z5, Z ₆ , Z ₇ и Zg каждый независимо выбран из Н, -CI, -F, -Вг, -ОН, - Me, -ОМе;

YiBbi6paH из СН ₂ , S, О, и NH;

Ri, R ₂ , R3 и R4 каждый независимо выбран из Н, -CI, -F, -Вг, -ОН, -Me, -ОМе;

R5 выбран из Н или СгС _б алкила, который также может содержать гидроксильные, карбоксильные или сложноэфирные группы;

Хь Х ₂ и Хз каждый независимо выбран из Н или -Ce алкила, который также может содержать гидроксильные, карбоксильные или сложноэфирные группы

или их фармацевтически приемлемый изомер, соль, гидрат, сольват и пролекарственное производное.

Особенно предпочтительными соединениями являются соединения, выбранные из

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ

О

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ

Следующим аспектом изобретения является фармацевтическая композиция для остановки, предотвращения и профилактики кровотечений или усиления системы, гемостаза у субъекта путем введения субъекту терапевтически эффективного количества соединения. Кровотечения у субъекта могут быть следствием гипокоагуляционного состояния системы свертывания крови, нарушения, свертываемости крови, гематологических расстройств, геморрагических расстройств, гемофилии, дефицита фактора VII, медикаментозного лечения, травмы, заболевания, нарушений, связанных с кровоточивостью, хирургического вмешательства, гипотермии, менструации и беременности.

Фармацевтическая композиция помимо активного ингредиента, которым является соединение общей формулы (I), содержит фармацевтически приемлемый носитель растворитель или разбавитель.

Также заявляемые соединения могут быть использованы для изготовления фармацевтической композиции для ее применения в качестве лекарственного средства в случаях, когда требуется остановка, профилактика кровотечения или нормализация системы гемостаза у субъекта, причем такая композиция содержит терапевтически или профилактически эффективное количество указанного соединения и, не обязательно, фармацевтически приемлемый носитель, растворитель или экципиент.

Также заявляемые соединения могут быть использованы сами по себе или в составе композиции для блокирования действия непрямых антикоагулянтов после введения их субъекту, путем введения субъекту терапевтически эффективного количества соединения.

Так соединения по изобретению могут быть использованы в случаях, в которых гемофилия представляет собой гемофилию А или гемофилию В, когда гемофилия является врожденной или приобретенной, в том числе когда у субъекта вьграбатываются

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ аутоантитела к FVIII или FIX (ингибиторная гемофилия). В частности, когда кровотечения вызваны хирургическим вмешательством у субъекта с гемофилией.

Соединения по изобретению могут быть использованы в случаях, в которых кровотечения у субъекта вызваны дефицитом гемостаза, который развился как последствие лечения лекарственными средствами, такими как лекарственные средства против тромбоцитов или антикоагулянты. В частности, где антикоагулянт выбран из группы, состоящей из гепарина, фрагмина, низкомолекулярного гепарина, производного кумарина, такого как варфарин и дикумарол, ингибиторов FXa, таких как фондапаринукс, идрапаринукс и эноксапарин.

Антикоагулянт может быть выбран из группы, состоящей из ингибиторов FXa, включая прямые ингибиторы FXa, такие как DX-9065a, ривароксабан, апиксабан, разаксабан (DPC906), YM-60828, YM-150, бетриксабан, PD-348292, отамиксабан, DU- 176b, LY517717, GSK913893, ингибиторов тромбина, включая гирудин, бивалирудин, аргатробан, ксимелагатран и прямые ингибиторы тромбина, такие как дабигатран.

Антикоагулянт также может быть выбран из группы, состоящей из ингибитора пути тканевого фактора (TFPI), антитромбина-Ш, волчаночного антикоагулянта, антикоагулянтного пептида нематод, фактора FVIIa с заблокированным активным центром (FVIIai), ингибиторов FIXa, ингибиторов факторов Va и Villa, включая активированный протеин С (аРС) и растворимый тромбомодулин, и ингибирующих антител, которые связываются с фактором свертывания.

Соединения по изобретению могут быть использованы в случаях, в которых кровотечения связаны с нарушением функции печени, приводящим к нарушениям свертываемости крови; с нарушением функции почек; с дефицитами гемостаза, которые развились во время инфекций или во время болезней, такими как дефицит витамина К или тяжелое заболевание печени; с дефицитами гемостаза, которые развились в результате укусов змеи. А также в случаях, когда кровотечения связаны с дефицитом или нарушением факторов свертывания, отличных от FVIII и FIX; с дефицитом FV; с дефицитом FVII; с дефицитом FX; с дефицитом FXIII; с дефицитом а2-антиплазмина; с дефицитом или нарушением фибриногена, включая афибриногенемию, гипофибриногенемию и дисфибриногенемию.

Кроме того, заявляемые соединения могут быть использованы в случаях, в которых кровотечения являются последствием массивного переливания крови, плазмы, кровезамещающих или плазмозамещающих агентов (дилюционная коагулопатия).

Они также могут быть использованы в случаях, в которых кровотечение является осложнением после хирургии или травмы. Например, когда кровотечение является следствием хирургии, такой как хирургии на сердце, ангиопластики, легочной хирургии, абдоминальной хирургии, хирургии позвоночника, сосудистой хирургии, стоматологической хирургии, трансплантации или резекции органов. В частности, когда трансплантация является трансплантацией костного мозга, сердца, . легких, поджелудочной железы и печени.

Кровотечение может происходить из варикозно расширенных вен или проявляется как острый гемартроз, хроническая гемофильная арторопатия, гематомы, гематурия, кровотечения в центральной нервной системе, желудочно-кишечные кровотечения, кровоизлияние в мозг, острое, рецидивирующее или хроническое трахеальное, бронхиальное или альвеолярное кровотечения или кровохарканья у субъекта.

Кровотечения могут быть вызваны тромболитической или фибринолитической терапией. В частности, когда тромболитическая или фибринолитическая терапия проводилась с использованием активатора плазминогена.

Причиной кровотечения могут быть состояния субъекта, связанные с болезнью фон Виллебранда (VWD), гемолитико-уремическим синдромом (HUS). А также когда причиной кровотечения могут быть состояния субъекта, связанные с врожденными или приобретенными тромбоцитарными болезнями и нарушениями, подобные тромбоцитопении, гепарин-индуцированной тромбоцитопении, идиопатической тромбоцитопенической пурпуре (ITP), тромботической тромбоцитопенической пурпуре (ТТР), тромбастении Гланцмана, синдрому Бернара-Сулье, синдрому Германски- Пудлака, HELLP-синдрому, синдрому Чедиака-Хигаси, пурпуре Геноха-Шенлейна.

Соединения по изобретению могут быть использован в случаях, в которых заболевание или состояние субъекта поддается лечению введением про-коагулянта.

Подробное описание изобретения

Соединения, описываемые общей формулой (I), могут быть синтезированы

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ любым подходящим методом, например, присоединением соответствующего амина (II) к производному соответствующей карбоновой кислоты (III)

Ш I

в присутствии подходящих агентов сочетания, таких как 1, - карбонилдиимидазол (CDI), дициклогексилкарбодиимид (DCC), N-(3- диметиламинооприл)--¥-этилкарбод иимид гидрохлорид (EDCI) или иных подобных реагентов. Формирование амидной связи может быть так же обеспечено взаимодействием хлорангидридов (IV) с аминами (II). Хлорангидриды (IV) могут быть получены из соответствующих карбоновых кислот (III) обработкой подходящим реагентом, таким как SOCl ₂ или РОС1 ₃ .

IV

Хлорангидрид (IV), соответствующей карбоновой кислоты легко реагирует с аминами (II) давая на выходе целевое соединение (I).

Амины (II) могут быть получены восстановлением соответствующих нитросоединений (V) при подходящих условиях. В качестве восстанавливающих агентов можно использовать, например SnCl ₂ или гидрирование в присутствии никеля Ренея.

V И

Нитросоединения (V) могут быть синтезированы из соответствующих аминов (VI) и нитрозамещенных карбоновых кислот (VII)

VI VII VIII

Карбоновые кислоты (VII) преобразуются в соответствующие хлорангидриды (VIII) обработкой подходящим реагентом, таким как SOCl ₂ или РОС1 ₃ . Хлорангидриды^!!!) затем гладко реагируют с аминами (VI) образуя нитросоединения

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ

Пример 1.

Реакция 1

1.6 г 2-нитробензойной кислоты кипятится в 50 мл SOCl ₂ с обратным холодильником с хлоркальциевой трубкой в течение 4-х часов, после чего полученный раствор охлаждается, упаривается на роторном испарителе, дважды переупаривается с

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ безводным ТГФ, остаток растворяется в 20 мл ТГФ, полученный раствор в течение 30 мин по каплям прибавляется к перемешиваемому раствору 1,3 г пара-хлоранилина и 1 мл пиридина в 30 мл ТГФ. Через 8 часов реакционная смесь упаривается, остаток растворяется в 30 мл хлороформа, промывается насыщенным водным раствором NaHCC"3, хлороформенный экстракт упаривается, остаток наносится на колонку 40x150 мм, наполненную 30-50 мкм силикагелем. Продукт элюируется хлороформом. Детектирование осуществляется с помощью УФ-ячейки, на длине волны 280 нм. Поглощающие УФ излучение фракции собираются, чистота продукта контролируется методом тонкослойной хроматографии в смеси хлороформ:этанол 20:1. Rf продукта составляет 0,6. Rf исходного п-хлоранилина составляет 0,7. Выход 1чГ-(4-хлорофенил)-2- нитробензамида составляет 2,0 г. Масс-спектр (МАЛДИ-ВП): М+Н 277, M+Na 299.

Реакция 2

1.8 г Ы-(4-хлорофенил)-2-нигробензамида растворяют в 30 мл этилацетата, добавляют раствор 4 г SnCl ₂ в 20 мл воды, подкисленной 0.2 мл концентрированной НС1. Реакционную смесь интенсивно перемешивают в течение 1 часа, после чего нагревают до кипения и кипятят еще 3 часа. Далее реакционную смесь фильтруют, водную фракцию экстрагируют СНС1з, после чего к водной фракции добавляют при перемешивании 30 мл 10% водного раствора аммиака и оставляют на ночь для формирования осадка. На следующий день осадок отфильтровывают, промывают водой, хлороформом. Водную фракцию экстрагируют хлороформом, органические экстракты объединяют и упаривают. Остаток после упаривания наносят на колонку 40x150, наполненную силикагелем 40-60 мкм. Продукт элюируется хлороформом, детектирование - УФ ячейка 280 нм, контроль чистоты продукта - ТСХ в хлороформе. Rf продукта составляет 0,6. Выход 2-амино- -(4-хлорофенил)-бензамида 1,3 г. Масс- спектр (МАЛДИ-ВП): М+Н 247, M+Na 269.

Реакция 3

500 мг 2-амино- -(4-хлорофенил)бензамида, 400 мг 4- (ацетилметиламино)бензойной кислоты и 420 мг EDCI перемешивают в 10 мл этилацетата в течение 3 суток. После этого раствор упаривают и наносят на колонку 30x150, заполненную силикагелем 40-60 мкм. Продукт элюируется смесью хлороформ:этанол 9:1. Rf=0,5. Выход 2-[(4-ацетилметил)амйнофенилкарбо� �ил)амино]- г> 4-хлорофенил)бензамида 650 мг. Масс-спектр (МАЛДИ-ВП): М+Н 422, M+Na 444.

фильтруют, водную фракцию экстрагируют СНС1 ₃ , после чего к водной фракции

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ

600 мг 5-хлортиофен-2-карбоновой кислоты кипятится в 15 мл SOCl ₂ с обратным холодильником с хлоркальциевой трубкой в течение 6-х часов, после чего полученный раствор охлаждается, упаривается на роторном испарителе, дважды переупаривается с безводным ТГФ, остаток растворяется в 10 мл ΊΤΦ, полученный раствор в течение 30 мин по каплям прибавляется к перемешиваемому раствору 280 мг β-аланина и 340 мг

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ

спектр (МАЛДИ-ВП) в отрицательных ионах: М-1 226.

Реакция 2

600 мг 3-((4-хлорфенил)-карбониламино)про� �ионовой кислоты, 380 мг Ν-(4-

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ

40x150, наполненную силикагелем 40-60 мкм. Продукт элюируется смесью хлористый метилен:этанол 20:1. Выход К-(3-(4-(ацетилметиламино)фенил)ами но)-3-оксопропил)-5- хлоропиридин-2-карбоксоамида 710 мг. Масс-спектр (МАЛДИ-ВП): М+Н 375, M+Na 397.

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ

5

Пример 6

Реакция 1

600 мг 5-хлортиофен-2-карбоновой кислоты кипятится в 20 мл SOCl ₂ с обратным холодильником с хлоркальциевой трубкой в течение б-х часов, после чего полученный раствор охлаждается, упаривается на роторном испарителе, дважды переупаривается с безводным ТГФ, остаток растворяется в 10 мл ТГФ, полученный раствор в течение 30 мин по каплям прибавляется к перемешиваемому раствору 610 мг гидрохлорида 2- амино-циклопентанкарбоновой кислоты и 350 мг гидроксида натрия в 10 мл 50% водного ТГФ. Через 8 часов реакционная смесь подкисляется до рН 4 0, НС1, и затем экстрагируется 3x20 мл этилацетата. Этилацетатные экстракты объединяют и упаривают. Продукт перекристаллизовывают из этанола. Выход 2-(5-хлортиофен-2-ил)- карбониламино)циклопенталкарбо� �овой кислоты 880 мг. Масс-спектр (МАЛДИ-ВП) в отрицательных ионах: М-1 272.

Реакция 2

. 700 мг 2-(5-хлортиофен-2-ил)-карбо амино)циклопенталкарбоновой кислоты, 420 мг -(4-аминофенил)-К-метилацетамида и 580 мг EDCI перемешивают в 50 мл этилацетата в течение 8 часов. Затем реакционную смесь упаривают, остаток наносят на колонку 40x150, наполненную силикагелем 40-60 мкм. Продукт элюируется смесью хлористый метилен:этанол 20:1. Выход Ы-(2-(4-(щетилметиламино)фенил)- карбамоил)циклопентил)-5-хлортио� �ен-2-карбоксиамида 850 мг. Масс-спектр (ТУ ТДИ- ВП): М+Н 420, M+Na 442.

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ

6

Пример 7

Реакция 1

625 мг 4-хлорбензойной кислоты кипятится в 20 мл SOCl ₂ с обратным холодильником с хлоркальциевой трубкой в течение 6-х часов, после чего полученный раствор охлаждается, упаривается на роторном испарителе, дважды переупаривается с безводным ТГФ, остаток растворяется в 15 мл ТГФ, полученный раствор в течение 30 мин по каплям прибавляется к перемешиваемому раствору 660 мг гидрохлорида 2- амино-циклопентанкарбоновой кислоты и 400 мг гидроксида натрия в 10 мл 50% водного ТГФ. Через 8 часов реакционная смесь подкисляется до рН 4 0,1N НС1, и затем экстрагируется 3x20 мл этилацетата. Этилацетатные экстракты объединяют и упаривают. Продукт перекристаллизовывают из этанола. Выход 2-(4-хлорфенил)- карбониламино)циклопенталкарбо� �овой кислоты 910 мг. Масс-спектр (МАЛДИ-ВП) в отрицательных ионах: М-1 266.

Реакция 2

650 мг 2-(4-хлорфенил)карбониламино)цикл� �пенталкарбоновой кислоты, 390 мг К-(4-аминофенил)->1-метилацетамид а и 550 мг EDCI перемешивают в 50 мл этилацетата в течение 8 часов. Затем реакционную смесь упаривают, остаток наносят на колонку 40x150, наполненную силикагелем 40-60 мкм. Продукт элюируется смесью хлористый метилен: этанол 20:1. Выход N-(2-(4-

(ацетилметиламино)фенил)карбам оил)циклопентил)-5-хлоробензамид� � 820 мг. Масс- спектр (МАЛДИ-ВП): М+Н 400, M+Na 422.

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ

7

Пример 8

Реакция 1

730 мг 4.7 ммоль 5-хлорпиридин-2-карбоновой кислоты кипятится в 20 мл SOCl ₂ с обратным холодильником с хлоркальциевой трубкой в течение 6-х часов, после чего полученный раствор охлаждается, упаривается на роторном испарителе, дважды переупаривается с безводным ТГФ, остаток растворяется в 15 мл ТГФ, полученный раствор в течение 30 мин по каплям прибавляется к перемешиваемому раствору 780 мг гидрохлорида 2-амино-циклопентанкарбоновой кислоты и 450 мг гидроксида натрия в 20 мл 50% водного ТГФ. Через 8 часов реакционная смесь подкисляется до рН 4 Ο,ΙΝ НС1, и затем экстрагируется 3x20 мл этилацетата. Этилацетатные экстракты объединяют и упаривают. Продукт перекристаллизовывают из изопропилового спирта. Выход 2-(5- хлорпиридин-2-ил)-карбониламино)ц иклопенталкарбоновой кислоты 950 мг. Масс- спектр (МАЛДИ-ВП) в отрицательных ионах: М-1 266.

Реакция 2

535 мг 2-(5-хлорпиридин-2-ил)-карбониламин о)циклопенталкарбоновой кислоты, 490 мг Т^-(4-аминофенил)-1 -метилацетамида и 330 мг EDCI перемешивают в 50 мл этилацетата в течение 8 часов. Затем реакционную смесь упаривают, остаток наносят на колонку 40x150, наполненную силикагелем 40-60 мкм. Продукт элюируется смесью хлористый метилен:этанол 20:1. Выход Ν-(2-(4-

(ацетилметиламино)фенил)карбам оилциклопентил-5-хлорпиридина-2-к арбоксамида 670 мг. Масс-спектр (МАЛДИ-ВП): М+Н 415, M+Na 437.

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ ,

8

Пример 9

Реакция 1

К раствору 1 г 4-метиламинобензойной кислоты в 50 мл этилацетата и 10 мл пиридина при охлаждении по каплям прибавляют с 3 мл пропионилхлорида. Через 6 часов реакционная смесь упаривается и дважды переупаривается с этилацетатом. Остаток растворяется в 30 мл этилового спирта, подкисляется 10% НС1 и оставляется при ОС на 24 часа для кристаллизации. Кристаллы отфильтровываются и промываются 20 мл охлажденного до 5°С этилового спирта. Выход 4- метил(пропаноил)аминобензойной кислоты 730 мг. Rf 0,2-0,4. Масс спектр (МАЛДИ- ВП) в отрицательных ионах: М-1 206.

Реакция 2

350 мг 2-амино- -(4-хлорфенил)бензамида, 270 мг 4- метил(пропаноил)аминобензой-ной кислоты и 320 мг EDCI в 5 мл этилацетата перемешивают 8 часов. Затем экстрагируют хлороформом. Органический экстракт упаривают и производят очистку на колонке 30x150 мм, заполненной силикагелем 40-60 мкм. Продукт элюируется системой хлористый метилен:этанол 20:1. Выход N-(4- хлорфенил)-2-(4-(метил(пропаноил)-а� �ино)фенилкарбонил-амино)бензами да 420 мг. Масс-спектр (МАЛДИ-ВП): М+Н 436, M+Na 458.

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ Реакция 1

500 мг 3-(5-хлортиофен-2-ил)-карбониламино )пропионовой кислоты, 340 мг N- 4-

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ

Оценивалась способность исследуемых соединений из примеров, приведенных

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ выше, увеличивать стационарную скорость роста фибринового сгустка в плазме крови человека с дефицитом фактора VIII (гемофилия А), с дефицитом фактора IX (гемофилия В), а также плазме крови, в которую был добавлен гепарин в условиях in vitro.

Определение активности соединений

Приготовление плазмы крови человека с дефицитом фактора VIII (гемофилия А) и с дефицитом фактора IX (гемофилия В) и гепаринизированной плазмы крови здорового человека.

В экспериментах по изучению активности веществ использовались плазма субстратная дефицитная по фактору VIII и плазма субстратная дефицитная по фактору IX (ООО «Ренам», Москва, Россия), подготовленная согласно процедуре, рекомендованной производителем При подготовке гепаринизированной плазмы крови здоровых доноров руководствовались стандартными правилами забора крови для коагулологических тестов (Collection, Transport, and Processing of Blood Speciments for Testing Plasma-Based Coagulation Assays and Molecular Hemostasis Assays; Approved Guideline Fifth Edition by Clinical and Laboratory Standards Institute (CLCI) H21-A5 Vol.28 No.5). Непосредственно перед проведением исследования в свободную от тромбоцитов плазму, полученную от здоровых доноров, добавлялся гепарин в концентрации 0,1 ME на 1 мл плазмы, где ME - международная единица активности.

За 30 минут до проведения исследования плазма смешивалась со стоковым раствором исследуемого соединения в воде и инкубировалась при 37°С. Для приготовления стоковых растворов некоторых соединений нерастворимых в воде, применялось предварительное растворение в DMSO или изопропаноле. Конечная концентрация в плазме не превышала: изопропанола - 0,5%, DMSO - 0,2%. В этих случаях в качестве контрольных использовались образцы плазмы с соответствующим содержанием изопропанола или DMSO.

Исследование влияния соединений на рост фибринового сгустка в плазме крови человека.

Исследование влияния веществ на рост фибринового сгустка в плазме крови человека с дефицитом фактора VIII (гемофилия А), фактора ЕХ (гемофилия В) и в гепаринизированной плазме крови здорового человека проводилось с использованием лабораторной диагностической системы «Регистратор тромбо динамики Т-2» и «Диагностического набора для исследования тромбодинамики в плазме крови» (ООО «Гемакор», Москва, Россия). Для проведения исследования при помощи «Регистратора тромбодинамики Т-2» [USPTO Pat. арр. No. 20100261211) образцы плазмы крови помещались в каналы измерительной кюветы [Dashkevich et al. Biophys J. 2012; 103(10):2233-2240]. Исследования с использованием «Регистратора тромбодинамики Т- 2» проводилась в соответствии с руководством к «Диагностическому набору для исследования тромбодинамики в плазме крови» (ООО «Гемакор», Москва, Россия) (Balandina et al. Biophys J. 2011; ν.101(8):1816-1824). Расчет результатов исследования выполнялся автоматически программным обеспечением (руководство пользователя «Программное обеспечение системы диагностической лабораторной «Регистратор тромбодинамики Т-2», ООО «Гемакор», Москва, Россия).

Оценка антигипокоагуляционных свойств

Одной из наиболее важных характеристик коагуляции является динамика образования фибринового сгустка. Для исследования динамики определялась зависимость размера сгустка от времени. Из данной зависимости вычислялась стационарная скорость роста сгустка (V st, мкм/мин) - средняя скорость роста сгустка в диапазоне 15-25 минут после начала свертывания. При гипокоагуляционньк состояниях различной природы, в т.ч. при гемофилии А, В и С, при дефицитах факторов V, VII, X и тромбина, при терапии антикоагулянтами, ингибиторами фактора Ха, тромбина, антагонистами витамина К стационарная скорость роста сгустка уменьшена. (Parunov L.A. et al. J Thromb Haemost. 2011, v.9: 1825-1834).

Из рис. 1 и 2 видно, что соединения (пример 1, пример 2, примерЗ) в плазме крови человека с дефицитом фактора VIII (гемофилия А) и в плазме крови человека с дефицитом фактора IX (гемофилия В) при определенной концентрации приводят к существенному увеличению скорости роста сгустка, причем концентрация этих соединений в в мкг/мл сопоставима с концентрацией известного лекарства против гемофилии А "Коэйт-ДВИ", при которой наблюдаются аналогичные эффекты.

Эффективность соединений в качестве средства, нормализирующего систему свертываемости крови, определялась концентрацией С ₁₂ 5%, при которой скорость роста сгустка увеличивается на 25% по сравнению со скоростью роста сгустка в плазме крови человека

- с дефицитом фактора VIII (гемофилия А) или

- с дефицитом фактора IX (гемофилия В) или,

- в плазме крови человека, в которую добавлен нефракционированный гепарин. Таблица 1. Концентрации Ci _25% в мкг/мл для соединений из примеров 1-16, а так же для известного лекарства против гемофилии А Коэйт-ДВИ для плазмы крови человека с дефицитом фактора VIII (гемофилия А), с дефицитом фактора IX (гемофилия для плазмы крови человека, в которую добавлен нефракционированный гепарин.

Из таблицы 1 видно, что заявленные соединения способны при низких концентрациях нормализовать систему свертывания крови в случае болезни гемофилии А, гемофилии В и при других случаях нарушения системы свертьшания крови (когда в плазме крови человека добавлен гепарин).