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Title:
CARBON NANOTUBE COATING FOR USE AS ANCHORING SYSTEM FOR NANOSCALE AND MICROMETRIC SCALE DEVICES WITH THERAPEUTIC ACTIVITY
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2017/158213
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to a carbon nanotube coating for use as a system for anchoring micro-nanoscale devices with therapeutic activity to the cell membrane and for conveying these devices to the cytosol. Also disclosed is a composition comprising (a) a micro-nanoscale device with therapeutic activity, and (b) a carbon nanotube coating that covers the micro-nanoscale device. Finally, the use of this composition is disclosed for antineoplastic therapies and for therapies against nervous system disorders.

Inventors:
LÓPEZ FANARRAGA MÓNICA (ES)
CORREA DUARTE MIGUEL ÁNGEL (ES)
PÉREZ LORENZO MOISÉS (ES)
GONZÁLEZ DOMINGUEZ ELENA (ES)
Application Number:
ES2017/000031
Publication Date:
September 21, 2017
Filing Date:
March 15, 2017
Export Citation:
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Assignee:
UNIV CANTABRIA (ES)
UNIV VIGO (ES)
International Classes:
A61K9/54; A61K33/44; A61P25/00; A61P35/00
Domestic Patent References:
WO2006052538A22006-05-18
WO2015127332A12015-08-27
Foreign References:
ES2478793A12014-07-22
US20030180491A12003-09-25
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Claims:
REIVINDICACIONES

1 Cobertura de nanotubos de carbono para su empleo como sistema de anclaje a la membrana celular y de transporte hacia el citosol de dispositivos micro-nanométricos con actividad terapéutica.

2 Composición que comprende:

a) un dispositivo micro-nanométrico con actividad terapéutica, y

b) una cobertura de nanotubos de carbono que recubre al dispositivo micro- nanométrico.

3. Composición, según la reivindicación 2, donde los nanotubos de carbono están functonalizados con ligandos. 4 Composición según la reivindicación 3. donde los nanotubos de carbono están funcionalizados con proteínas, péptidos, ácidos nucleicos u oligosacáridos.

5. Composición según la reivindicación 4, donde las proteínas son proteínas de interacción de tipo microbiológico de patógenos o toxinas.

6 Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 2-5 donde la cobertura de nanotubos de carbono se une al dispositivo micro-nanométrico por medio de:

i) enlaces covalentes.

ii) polímeros biodegradables.

iii) enlaces sensibles a procesos de reducción en el lisosoma. o

iv) enlaces sensibles a la acción de enzimas de los lisosomas.

7. Composición, según la reivindicación 6, donde la cobertura de nanotubos se une al dispositivo micro-nanométrico por medio de enlaces covalentes (i).

8. Composición, según la reivindicación 7, donde los nanotubos a su vez pueden llevar anclados fármacos y/o ligandos a sus paredes mediante enlaces sensibles a procesos de reducción en el lisosoma o enlaces cuya ruptura sea catalizada por enzimas de los lisosomas.

9. Composición, según la reivindicación 6, donde los polímeros biodegradables se seleccionan de entre dextrano sulfato de sodio y clorhidrato de poli-L arginina

10. Composición según la reivindicación 6 donde los enlaces sensibles a procesos de reducción empleados son puentes disulfuro. 11. Composición según la reivindicación 6 donde los enlaces cuya ruptura sea catalizada por enzimas de los lisosomas son enlaces peptidicos o enlaces amida.

12 Composición, según las reivindicaciones 2-1 1. para su empleo en terapias antineoplásicas.

13. Composición, según las reivindicaciones 2-11 , para su empleo en terapias dirigidas a alteraciones de! sistema nervioso

Description:
DESCRIPCIÓN

Cobertura de nanotubos de carbono para su empleo como sistema de anclaje de dispositivos nano y micrométricos con actividad terapéutica. Objeto de la Invención

La presente invención tiene su campo de aplicación dentro del sector sanitario, en concreto, se refiere al empleo de coberturas de nanotubos de carbono como sistemas de anclaje a ia membrana celular y de transporte hacia ei citosol de dispositivos nano y micrométricos con actividad terapéutica. En particular se contempla su aplicación en terapias neoplásicas y en terapias dirigidas a alteraciones del sistema nervioso.

Antecedentes de la Invención

El Cáncer es una enfermedad altamente heterogénea donde algunas células que se dividen rápidamente escapan a todos los mecanismos de control genético, resultando en innumerables mutaciones aleatorias (Navin et al. "Tumor evoiution inferred by single cell sequencing" Nature 2011, 472, 90-94). Algunos de estas mutaciones son incompatibles con la supervivencia celular, pero otras proporcionan ventajas genéticas sustancíales que inevitablemente conducen a una resistencia a diferentes fármacos. Como resultado, las terapias dirigidas a genes o proteínas son sólo efectivas de forma transitoria hasta que surgen nuevas adaptaciones o mutaciones celulares que eluden el efecto del fármaco. Por esta razón, la resistencia genética a la quimioterapia es uno de los problemas a los que se enfrenta la farmacología a medio plazo.

Como resultado de la resistencia, cada vez hay que emplear mayores dosis de fármacos para garantizar la eliminación de las células más resistentes del tumor. Estas dosis altas muchas veces son inviables debido a su toxicidad.

Por ejemplo, el pactitaxel (taxol®) favorece ia estabilización de los microtúbulos y provoca la muerte de las células que se dividen activamente como las células del cáncer. Pero, a pesar de ser uno de los agentes antitumorales más empleados en las últimas décadas, el paclitaxel tiene numerosas desventajas, como su insolubilidad en disolventes salinos. A nivel sistémico todos estos fármacos tienen además innumerables inconvenientes pues son inhibidores de la proliferación de todas las células del organismo, lo cual tiene importantes efectos secundarios en el paciente que es tratado.

En la aplicación dirigida de terapias, el empleo de nano-dispensadores dirigidos permitiría que, por ejemplo, fármacos que no son solubles en disolventes fisiológicos debido a su hidrofobicidac, llegasen intactos a su zona de aplicación. En este sentido, la nanotecnologia proporciona alternativas completamente novedosas

En otras áreas terapéuticas, como las enfermedades neurodegenerativas, el fracaso clínico de muchos candidatos farmacológicos es a menudo atribuible a los métodos de entrega (delivery) que no atraviesan, por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BHE). En el caso del cerebro, se restringe la difusión pasiva de muchos fármacos, lo que constituye un obstáculo importante en e< tratamiento farmacológico del sistema nervioso central (SNC) Por tanto, los métodos que puedan mejorar la administración de fármacos al cerebro y al sistema nervioso son de gran interés farmacéutico. Existen varios sistemas de terapia que utilizan métodos no invasivos, incluyendo la manipulación de drogas que abarca la transformación en análogos lipófilos, los profármacos, la administración química de fármacos, la administración de fármacos mediada por vectores de entrega receptor o mediada por fármacos y administración de fármacos por via intranasal, que explota las vías neuronales olfativas y del trigémino para administrar drogas al cerebro.

Por otro lado, también se emplean métodos invasivos como la administración de fármacos intracraneal directa por intra-cerebro-ventricular, intracerebral o administración intratecal después de crear aberturas reversibles en !a cabeza. Todos estos métodos conllevan un riesgo biológico importante de modo que, actualmente, se contemplan otro tipo de tratamientos, como las terapias dirigidas, para conseguir que dichas terapias puedan acceder a nivel transcraneal al cerebro, o a las células del sistema nervioso periférico Algunos de estos mecanismos se basan en la endocitosis mediada por receptores.

Algunos patógenos, como virus y ciertas bacterias, entran en el sistema nervioso central logrando el paso físico directo a través de células endoteliales o neuronales para infectar el cerebro empleando receptores. También existen toxinas que preferentemente interactúan con tipos específicos de células para ejercer una amplia gama de efectos biológicos en las neuronas periféricas y centrales. Los mecanismos de interacción de estos microorganismos o de las toxinas con las células del sistema nervioso se pueden utilizar para diseñar terapias que puedan entrar en el sistema nervioso a modo de ligandos, generando innumerables diseños de nanovehiculos.

Los nanofilamentos en general, y ios nanotubos de carbono (NTCs) en particular, son muy estables químicamente. Como todos los nanomateriales disponen de una relación superficie/peso extraordinaria (aproximadamente 1000-2000 m 2 por gramo de material) Los NTCs representan una clase de materiales altamente versátiles que muestran propiedades mecánicas, térmicas y electrónicas muy interesantes. Los NTCs son capaces de atravesar tejidos y penetrar en el interior de las células por diferentes mecanismos, fundamentalmente por endocitosis (Shi et al. "Cell entry of one dimensional nanomaterials occurs by tip recognition and rotation", Nature Nanotechnology 2011, 6. 714-719: Lacerda et al. "Translocation mechanisms of chemicalty functionalised carbón nanotubes across plasma membranes"* Biomaterials 2012, 33, 3334-3343). La entrada de los NTCs en la célula depende de las moléculas que lleven adheridas a su superficie (funcionalizarión).

Los NTCs al entrar en contacto con sistemas biológicos se recubren (es decir, se funcionalizan) con los componentes de éstos, constituyendo la llamada "biocorona" (Saptarshi et al. "Interaction of nanopatlicles with proteins: relation to bio-reactivity of the nanoparticle", Journal of Nanobtotechnology 2013, 11. 26). Esta biocorona proporciona a los NTCs propiedades biomtméticas y hace que las células los capturen activamente hacia su interior via receptores de membrana (Kostarelos et al. "Cellular uptake of functionalized carbón nanotubes is independent of functtonal group and cell type", Nature Nanotechnology 2007, 2 108-113) Existen muchos trabajos que muestran como la cubierta proteica puede modificarse para dirigir los NTCs a dianas especificas y asi conseguir redireccionar estos nanomateriales hacia células diana, por ejempio que exhiban ligandos que interaccionen con las células del cáncer Esta invención aprovecha estas propiedades de los NTCs para el diseño de nuevos nano-dispositivos de terapia dirigida y acción intracelular.

La funcionalización de los nanofilamentos con proteínas permite modificar las propiedades físicas de la superficie de estos nanomateriales. como son la solubilidad y dispersabilidad. fundamentales para que puedan ejercer sus propiedades biológicas, permitiéndoles tener una mejor interacción con los receptores (moléculas biológicas) de las membranas de las células del cáncer (ES2478793B2)

Ante la necesidad existente de terapias dirigidas alternativas, los autores de la presente invención, tras un importante trabajo de experimentación, han desarrollado una nueva composición de NTCs a modo de recubrimiento: una cobertura de NTCs en forma de corona para facilitar la entrada de micro y nanodispositivos al interior de las células.

Dentro de esta aplicación, en el estado de la técnica existe además gran interés por los sistemas de liberación de fármacos encapsulados en nanopartículas que protejan los fármacos de la degradación y que, combinados con métodos fisicos, incrementen de forma significativa la penetración del fármaco en las células diana (por ejemplo, en el tumor), actuando como vehículos del mismo (Stephánia Fleury Taveira and Renata Fonseca Vianna López (2011) Topical Administration of Anticancer. Drugs for Skin Cáncer Treatment, Skin Cancers - Risk Factors. Prevention and Therapy, Prof. Catarina La Porta (Ed ), ISBN: 978- 953-307-722-2. InTech, Available from: http:/ANVM.intechapen.com/books/sk¡ncancersrrisk- factors-pmvention-and-therapyAopical-administmtion-of-antica ncer-d^

cancertreatment).

La composición de la presente invención, supone un importante avance en el estado de la técnica, ya que, a diferencia de lo divulgado hasta el momento, los NTCs actúan por sus propiedades como anclaje de micro y nanocápsulas en la superficie celular, favoreciendo posteriormente la salida de estos dispositivos desde ei endo-lisosoma y/o fago-lisosoma al interior celular, donde se produciría ia liberación progresiva de diferentes terapias como fármacos o ácidos nucleicos, por ejemplo de ARN de interferencia

La composición de la invención presenta por tanto importantes aplicaciones clínicas, pudiéndose emplear en el tratamiento adyuvante o neo-adyuvante de muchos tipos de cánceres o tumores, a través de diferentes vías de aplicación, asi como en terapias dirigidas a otras patologías, como las de! sistema nervioso.

Descripción de las figuras

Figura 1.- Diagrama de mecanismo de entrada y liberación intracelular de los dispositivos modelo rodeados de la cobertura de NTCs.

Figura 2.- Imagen del nanodispositivo modelo recubierto de la cobertura de NTCs con microscopía electrónica de transmisión (izda.) y de barrido (dcha.)

Figura 3.- Imagen de microscopía electrónica de barrido que muestra la interacción de la cobertura de NTCs con la superficie celular.

Figura 4.- Imagen del nanodispositivo liberado a nivel citosólico Izquierda: Imágenes de microscopía confocal tomada en un plano Z de las células donde se muestra cómo ios nanodispositivos están localizados en el citoplasma celular a la altura del núcleo Derecha: medida de! diámetro de los nanodispositivos intracelularmente

Figura 5.- Imagen del nanodispositivo liberado a nivel citosólico fuera de las vesículas endolisosomales a) localización de los lisosomas de las células mediante tinción específica (acridina naranja), b) localización de los nanodispositivos en el citoplasma.

Figura 6.- Imagen de células HeLa tratadas con nanodispositivos que liberan la terapia (colorante) tras su sometimiento a las condiciones reductor as de los endo-lisosomas. Descripción de la Invención

En base a las necesidades de la técnica en relación con la búsqueda de terapias dirigidas alternativas, los autores de la presente invención han desarrollado una composición formada por un dispositivo micro-nanométrico con actividad terapéutica, rodeado por una cobertura de nanotubos de carbono que lo recubre.

En esta composición, la cobertura de nanotubos de carbono actúa como sistema de anclaje a la membrana celular y de transporte hacia el cítosol del dispositivo con actividad terapéutica.

De esta forma, estos sistemas de terapia están dirigidos por los NTCs que, funcionalizados con ligandos determinados, son capaces de introducir las terapias en determinadas células de forma selectiva, y asi lograr altas concentraciones de fármacos, agentes de contraste de imagen, bioterapias u otros a nivel intracelular. proporcionando una mejora del rendimiento terapéutico a nivel local y disminuyendo los efectos secundarios no deseados.

Los nanotubos de carbono que forman la cobertura pueden ser tanto multipared como de una sola pared, y pueden tener un diámetro desde 1 a 100 nm y una longitud desde cientos de nanómetros a mieras.

La funcionalización de los NTCs puede llevarse a cabo con ligandos, en particular proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, oligosacárídos o pequeñas moléculas, que se unen a receptores celulares de cualquier naturaleza, permitiendo direccionar los micro-nanodispositivos a las células diana. En realizaciones preferidas de la composición de la presente invención, los NTCs se funcionalizan con proteínas. En particular, la funcionalización se puede llevar a cabo con suero, lo que permite modificar las propiedades físicas de la superficie de estos nanomateriales. como son la solubilidad y dispersabiüdad. que son fundamentales para que puedan ejercer sus propiedades biológicas, permitiéndoles tener una mejor interacción con los receptores (moléculas biológicas) de las membranas de las células del cáncer.

Estas proteínas hacen que las células reconozcan específicamente a los nanotubos de la cobertura de la micro-nanoestructura como algo propio, endocitándolos activamente, de forma que, una vez en el citosol celular, puedan actuar de numerosas formas. Si los nanotubos se encuentran libres (no unidos al dispositivo terapéutico) interfirieren con los procesos dinámicos de los microtúbulos formando haces. Cuando esto ocurre, las células en división que precisan de una dinámica microtubular muy activa se quedan bloqueadas en metafase y terminan por morir.

Asimismo, es posible funcionalizar los NTCs recubriéndolos con otro tipo de proteínas o péptidos. por ejemplo las proteínas de interacción de tipo microbiológico que emplean algunos patógenos, como virus y ciertas bacterias, que facilitan la entrada al sistema nervioso central, o ciertas toxinas que preferentemente ínteractúan con tipos específicos de células para ejercer una amplia gama de efectos biológicos en las neuronas periféricas y centrales. Los mecanismos de interacción de estos microorganismos o de las toxinas con las células del sistema nervioso se pueden utilizar para diseñar terapias que puedan entrar en el sistema nervioso a modo de ligandos. permitiendo el diseño de nanovehfculos "a la carta"

Los dispositivos con actividad terapéutica empleadas en la composición de la invención presentan dimensiones, que van desde el rango de los nanómetros hasta incluso el de las mieras, siendo útiles en la administración de composiciones para el tratamiento de tumores y otras patologías

Los micro y nanodispositivos pueden estar compuestos por micro-nanoparticulas huecas o sólidas recubiertas, total o parcialmente, por los nanotubos de carbono. Las huecas pueden incluir en su interior diferentes terapias, como fármacos o ácidos nucleicos tipo DNA, o RNA, para su posterior liberación. Las sólidas podrían ser de diversas naturalezas con potencial terapéutico, por ejemplo nanoparticulas que se calienten por efectos de radiaciones infrarrojas, campos magnéticos, nanoparticulas con efectos biocidas, etc.

La cobertura de nanotubos de carbono (NTCs) se puede unir al dispositivo micro- nanométrico por medio de:

i) enlaces covalentes,

ii) polímeros biodegradables.

iii) enlaces sensibles a procesos de reducción en el lisosoma, o

iv) enlaces sensibies a la acción de las enzimas del lisosoma, las llamadas hidrolasas acidas. Estas enzimas sóio están activadas en e! lisosoma y en los compartimentos membranosos de las rutas degradativas intracelulares

En aquellas realizaciones en las que la cobertura de nanotubos se une al dispositivo micro- nanométrico por medio de enlaces covalentes (i), los nanotubos a su vez pueden llevar anclados fármacos y/o ligandos a sus paredes mediante enlaces sensibles a procesos de reducción (S-S, puentes disulfuro) o enlaces cuya ruptura sea catalizada por enzimas del lisosoma (enlaces amida o enlaces peptidicos) La ruptura de los enlaces sensibles a los procesos de reducción (S-S) ocurre en los caminos de entrada de la célula (endosomas- endolisosomas).

En base a la cobertura de nanotubos, y a su empleo como anclaje del dispositivo micro- nanométrico a la membrana celular, los autores de la invención han desarrollado composiciones con aplicaciones diferentes:

Cobertura de NTCs para el anclaje v entrada de dispositivos micro-nanométricos con actividad terapéutica en células diana

En esta realización particular de la composición de la invención, la cobertura de nanotubos está establemente fijada a la superficie del dispositivo micro o nanométrico mediante enlaces covalentes. Dichos enlaces covalentes se llevan a cabo a través de una aminación (por ejemplo mediante el uso de aminopropil trimetoxisilano, APS) de la superficie de los dispositivos micro-nanométricos combinada con una reacción de Steglich o método carbodiimida. De esta forma, la unión se realiza mediante el enlace entre e! grupo NH 2 del nanodispensador y el grupo COOH de los NTCs

Alternativamente, también se pueden utilizar métodos de click chemistry para el anclaje de los NTCs a los dispositivos micro-nanométricos (en particular la cicloadición catalizada por cobre entre azidas y alquinos, CuAAC). La click chemistry se define como una herramienta química para generar sustancias de forma rápida y fiable al unir pequeñas unidades entre si. y que inspirada en la naturaleza no responde a una reacción especifica.

La naturaleza de estos enlaces covalentes permite que los NTCs no se desprendan a la entrada en el citosol celular En esta realización de la composición de la invención, la cobertura de NTCs rodea por completo ai dispositivo micro-nanométrico actuando asf como sistema de anclaje a la membrana celular, y facilitando a su vez la liberación de la droga en el citosol de las células diana.

Cobertura de NTCs para el anclaje, entrada v liberación intravesicular/citoplásmica de terapias en células diana en base a condiciones reductoras.

En esta realización particular de la composición de la invención, los NTCs de la cobertura, además de estar fijados a la superficie de los dispositivos micro-nanométricos mediante enlaces covalentes. llevan unidos, mediante enlaces sensibles a ios procesos de reducción en el lisosoma o enlaces cuya ruptura sea catalizada por enzimas del lisosoma, terapias (fármacos y/o ligandos) que se liberarán a nivel intracelular.

Las terapias y/o ligandos se anclan a las paredes de los NTCs mediante estos enlaces sensibles a procesos de reducción intracelular, como son los puentes disulfuro (S-S). p.ej. mediante el uso de cistamina, creando asi este enlace sobre la cobertura de NTCs. aunque también se contemplan otras estrategias basadas en la química orgánica, o mediante enlaces cuya ruptura sea catalizada por enzimas del lisosoma, facilitando su liberación.

Cobertura de NTCs para el anclaje, entrada y liberación intracelular de NTCs para terapia citotóxica

En esta realización particular de la composición de la invención, los dispositivos micro- nanométricos puedes estar anclados a los NTCs mediante.

a) polímeros biodegradables. o

b) enlaces que son sensibles a procesos de reducción en el lisosoma o enlaces cuya ruptura sea catalizada por enzimas del lisosoma.

En la opción a), los NTCs se fijan al dispositivo micro-nanométrico mediante el empleo de polímeros biodegradables. como son los polielectrolitos cargados biodegradables, que liberan los nanotubos de forma dirigida y controlada al degradarse (por ejemplo, dextrano sulfato de sodio o clorhidrato de poli-L-arginina). A su vez, la cobertura de NTCs recubre, total o parcialmente, al dispositivo como sistema de anclaje a la membrana celular, facilitando además la liberación de la droga contenida en el dispositivo en el citosol.

En la opción b) los NTCs se fijan al dispositivo micro-nanométrico mediante enlaces que se rompen en medio reductor, como puedan ser los puentes disutfuro (ej. cistamina), o enlaces cuya ruptura sea catalizada por enzimas del lisosoma, provocando la liberación de los NTCs. Igualmente, la cobertura de NTCs sirve como sistema de anclaje a la membrana celular y permite la liberación de la terapia en el citosol. En este caso, los dispositivos, que llevan unido a su superficie la cobertura de NTCs, por acción de los enzimas y el pH intraceiuiar, liberarán su recubrimiento de NTCs entre 48-72 h aproximadamente desde la llegada a nivel intraceiuiar, para que los NTCs efectúen su acción antiproliferativa

En ambos casos, la acción terapéutica derivaría de la combinación del efecto antiproliferativo de los NTCs y de los agentes neoplásicos contenidos en los nanodispensadores, al ser ambos liberados.

La composición de la invención presenta importantes aplicaciones clínicas, pudiéndose emplear en terapias antineoplásicas, en el tratamiento adyuvante o neo-adyuvante de muchos tipos de cánceres o tumores, a través de diferentes vías de aplicación, asi como en terapias dirigidas a otras patologías, como las del sistema nervioso, las del sistema respiratorio, las de! sistema digestivo y. en general, a cualquier tejido u órgano

EJEMPLOS

Ejemplo 1 Obtención de partículas de Si02@dve@NTCs:

Síntesis de los dispositivos nanométricos: Partículas de S1O2

(i) Esferas de sílice: siguiendo el método Stober, una solución de TEOS:EtOH:H 2 0: NH4OH (1.7: 18.2:3,1 :1 ,97 ml_) se agitó vigorosamente durante 2 h para obtener una suspensión turbia blanca. Las esferas monodispersas (~ 500 nm) se lavaron con etanol mediante 3 ciclos de redispersión/centrifugación (9000 rprrv 10 min). y finalmente se volvieron a dispersar en 25 mL de agua. La concentración final fue de 0,0174 g/mL

(ii) Mareaje con colorante de las partículas de sílice: las partículas de sílice se recubrieron con APS medíante la dilución de 87 mg de S1O2 en 10 mL de EtOH y la adición de 0.5 mL de APS. Después de agitar 3 h, el exceso se eliminó mediante 3 ciclos de redispersion/centrifugación (7000 rpm, 20 min). Después de esto, las partículas de S1O2 funcionalizadas con APS se diluyeron en 10 mL de EtOH y se añadieron a 10 mL de una disolución de isotiocianato de rodamina B (0,32 mg/mL). Después de agitar 3 h, el exceso se eliminó mediante 3 ciclos de redispersion/centrifugación (7000 rpm, 20 min) La concentración final fue de 8,7 mg/mL.

(iii) Recubrimiento de las partículas de SiO? 10 mL de esferas de SiOs preparadas previamente (8.7 mg/mL), se diluyeron con agua hasta 20 mL y se añadieron a 60 mL de una disolución de cloruro de poiidialildimetilamina (PDDA) (1 mg/mL, que contenía NaCI 0,5 M) bajo sonicación débil. La reacción transcurrió durante 1 h para permitir la adsorción del PDDA y, a continuación, su exceso se eliminó con 3 ciclos de redispersion/centrifugación (8000 rpm, 20 min). El sulfonato de poliestireno (PSS) (1 mg/mL que contiene NaCI 0,5 M) fue depositado sobre las esferas de SiO? recubiertas de una manera similar y usando las mismas condiciones. La concentración final fue de 8,7 mg/mL.

Revestimiento de las esferas de sílice con NTCs

Los NTCs se pre-trataron con acetona y etanol para eliminar los materiales orgánicos, congelados con N 3 y se liofilizaron. Después de esto, los nanotubos de carbono se oxidaron mediante el siguiente procedimiento: 100 mg de NTCs se sometieron a ultrasonidos en 100 mL de una mezcla de H2SO4/HNO3 (3 1) con un sonicador de punta durante 15 min y con un baño de ultrasonidos durante 4 h. Después, la muestra se lavó con una disolución acuosa de NaOH diluido con 3 ciclos de redispersion/centrifugación (9000 rpm, 10 min) Cuando el pH se estabilizó en 10, la muestra se sometió a ultrasonidos con el sonicador de punta durante 2 h. Finalmente, los NTCs se dispersaron en agua, obteniéndose una dispersión estable de NTCs oxidados presentando fundamentalmente grupos carboxílicos e hidroxilicos en las paredes, los cuales les aportan una carga superficial negativa. La concentración final fue de 0,8 mg/mL.

Se diluyeron 10 mL de esferas de S\0¿ funcionalizadas previamente con PSS/PDDA (8,7 mg/mL) con 100 mL de agua milliQ Posteriormente, se añadieron 2 mL de una disolución 0.5 M NaCI y 5 mL de una dispersión de NTCs (0,8 mg/mL). Tras un periodo de adsorción de 15 h se eliminó el exceso de NTCs mediante 3 ciclos de centrifugación/redispersión (7000 rpm, 20 min) La concentración final fue de 3.8 mg/mL. En la Figura 1 se puede observar la cobertura de NTCs alrededor de las partículas escogidas como modelos de nanodispensador, asi como la trayectoria de entrada de los dispositivos con actividad terapéutica hasta liberar su terapia

Funcionalización de la cobertura de NTCs

La funcionalización se llevó a cabo con proteínas séricas diluidas en una solución salina, como por ejemplo el medio de cultivo celular, a una concentración de 20-30 mg/mL mediante sonicación moderada en baño con punta durante 2 min.

Eiemplo 2. Cobertura de NTCs para el anclaje y entrada de nanodispensadores de terapias en células diana

Se prepararon los nanodispensadores con un contenido terapéutico en base a cualquiera de las soluciones técnicas que existen en patentes o en la literatura. Se recubrieron con los NTCs tal y como se indica en el ejemplo anterior, uniendo los nanotubos bien mediante fuerzas electrostáticas (usando polielectroiitos cargados) o mediante enlaces covalentes (e.g . entre el grupo carboxilico de los nanotubos oxidados y el grupo amino con el que se funcionalizó el nanodispensador). Se funcionalizaron con proteínas séricas o con ligandos destinados a su unión con dianas moleculares de la superficie de las células cancerosas (Scott et al. "Antibody therapy of cáncer", N ature Reviews Cáncer 2012, 12, 278-287).

Se empleó la linea celular HeLa como objeto del estudio y se sometió a una solución de 5 pg/mL de los nanodispensadores funcionaüzados con proteínas de suero como se indica en el ejemplo anterior. El tratamiento duró 96 h. Durante el tratamiento las células se observaron in vh/o y también se fijaron con paraformaldehido al 4%, se permeabilizaron con tritón X1C0 al 1% en PBS y se tiñeron con Hoechst 33342 para su observación mediante microscopía de alta resolución El resultado de este estudio mostró cómo el recubrimiento corona de NTCs en estas estructuras favorece la internalización (Figura 2 y 3) y liberación intraceluSar citosólica de estas nanoestructuras (Figura 4) en modelos celulares.

Ejemplo 3. Cobertura de NTCs para el anclaje, entrada y liberación intravesicular/citoplásmica de terapias en células diana en base a condiciones reductoras Se prepararon los nanodispensadores (en este caso sirve cualquier estructura nanométrica donde se puedan anclar NTCs) en base a cualquiera de las soluciones técnicas que existen en patentes o en la bibliografía. Se recubrieron y se funcionalizaron, tal y como se indica en el ejemplo 1. En este caso los NTCs fueron anclados de forma estable, bien mediante fuerzas electrostáticas (usando polielectroiitos cargados) o mediante enlaces covalentes (e g . entre el grupo carboxilico de los nanotubos oxidados y el grupo amino con el que se funcionalizó el nanodispensador) a las estructuras nanométricas A su vez, a la superficie externa de los NTCs se acopló una terapia mediante un enlace disulfuro, en este caso un colorante solamente detectable una vez liberado dei nanotubo Dicha terapia se liberó a nivel intracelular debido a !a ruptura de dicho enlace una vez los nanodispensadores pasaron por los lisosomas Los nanodispositivos eventualmente escapan del lisosoma al citosol (Figura 5). En la Figura 6 se muestra una prueba de concepto donde se observan células mostrando tinción con un colorante tras su liberación del anclaje a los nanotubos de carbono Ejemplo 4. Cobertura de NTCs para ei anclaje, entrada y liberación intracelular de NTCs para terapia citotóxica

Se prepararon los nanodispensadores (en este caso sirve cualquier estructura nanométrica donde se puedan anclar los NTCs) en base a cualquiera de las soluciones técnicas que existen en patentes o en la bibliografía. Éstos se recubrieron, tal y como se indica en el ejemplo 1 , con polielectrolitos bio-degradables (dextrano sulfato de sodio como polielectrolito cargado positivamente y poli-L hidrocloruro de arginina como polielectrolito cargado negativamente) y posteriormente se recubrieron con ios NTCs Los NTCs que se emplearon en ei recubrimiento tenían una longitud de 500-5000 nm y tras 48-72 h se liberaron por la degradación de los polímeros que actúan como anclaje a la nanoestructura. Su liberación les permitió interaccionar con los componentes celulares de forma biomimética y producir un efecto antiproliferativo, citotóxico.