RODRIGUES LEONARDO (BR)
CORREA JUNIOR ARY (BR)
LADEIRA LUIZ ORLANDO (BR)
RODRIGUES LEONARDO (BR)
CORREA JUNIOR ARY (BR)
WO1998004740A1 | 1998-02-05 |
US20080194031A1 | 2008-08-14 | |||
FR2724935A1 | 1996-03-29 | |||
US20060240554A1 | 2006-10-26 |
QIN W J; YUNG L Y L: "Nanoparticle carrying a single probe for target DNA detection and single nucleotide discrimination", BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, vol. 25, no. 2, 17 July 2009 (2009-07-17), pages 313 - 319, XP026600426
HILLAIREAU, H., ET AL.: "Encapsulation of mono- and oligo-nucleotides into aqueous-core nanocapsules in presence of various water-soluble polymers", INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICS, vol. 331, no. 2, 26 October 2007 (2007-10-26), pages 148 - 152, XP005745262
IKEDA A; ET AL: "Water-Solubilization of Nucleotides-Coated Single-Walled Carbon Nanotubes Using a High-Speed Vibration Milling Technique", ORGANIC LETTERS, vol. 8, no. 6, 18 February 2006 (2006-02-18), pages 1153 - 1156, XP003007326
REIVINDICAÇÕES 1- CONJUGADO DE NANOTUBOS DE CARBONO PARA INIBIR ESTRUTURAS DE INFECÇÃO DE PATÓGENOS EM VEGETAIS, caracterizada por compreender a conjugação de oligonucleotídeos com nano- tubos de carbono. 2- CONJUGADO DE NANOTUBOS DE CARBONO PARA INIBIR ESTRUTURAS DE INFECÇÃO DE PATÓGENOS EM VEGETAIS, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelos nanotubos serem selecio- nados do grupo compreendendo SWNTf ou MWNTf. 3- CONJUGADO DE NANOTUBOS DE CARBONO PARA INI¬ BIR ESTRUTURAS DE INFECÇÃO DE PATÓGENOS EM VEGETAIS, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizada pelos nanotubos apresentarem em sua superfície estruturas helicoidais dispostas ordenadamente ao logo de sua superfície longitudinal compatível com a adsorção dos oligonu- cleotídeos sobre a estrutura de carbono. 4- CONJUGADO DE NANOTUBOS DE CARBONO PARA INIBIR ESTRUTURAS DE INFECÇÃO DE PATÓGENOS EM VEGETAIS, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelos oligonucleotídeos serem selecionados do grupo compreendendo sequências senso e anti-senso do gene INF24. 5- CONJUGADO DE NANOTUBOS DE CARBONO PARA INIBIR ESTRUTURAS DE INFECÇÃO DE PATÓGENOS EM VEGETAIS, de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser capaz de penetrar no citoplasma da células de patógenos. 6- CONJUGADO DE NANOTUBOS DE CARBONO PARA INI¬ BIR ESTRUTURAS DE INFECÇÃO DE PATÓGENOS EM VEGETAIS, de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizada por interferir nos mecanismos de síntese protéica regulada pelo RNA mensageiro do patógeno. 7- CONJUGADO DE NANOTUBOS DE CARBONO PARA INIBIR ESTRUTURAS DE INFECÇÃO DE PATÓGENOS EM VEGETAIS caracterizado pelo seu uso no controle de doenças no campo. 8- CONJUGADO DE NANOTUBOS DE CARBONO PARA INIBIR ESTRUTURAS DE INFECÇÃO DE PATÓGENOS EM VEGETAIS, caracterizado pela inibição do desenvolvimento da doença causada pelo fungo U. appendiculatus inoculado em espécies vegetais susceptíveis. |
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção descreve a construção e uso de um siste- ma híbrido envolvendo a conjugação de nanotubos de carbono e oligonucle- otídeos. Em seu aspecto mais geral relata processo e metodologia para a inibição ou controle de pragas e infecções de patógenos em vegetais, em especial, em culturas de importante interesse comercial tais como: feijão, soja, café e eucalipto. O conjugado oligonucleotídeo-nanotubos de carbono é utilizado como agente de internalização celular carreando uma seqiiência específica de ácido nucléico, também denominado de oligonucleotídeo, de fora para dentro do citoplasma da célula do microrganismo. O objetivo desta internalização é permitir que o oligonucleotídeo passe para o citoplasma do microrganismo e interfira nos mecanismos de síntese protéica regulada pelo RNA mensageiro do microrganismo que como resultado leva a inibição de estruturas de infecção, causando a morte do microrganismo ou diminuição dos efeitos nocivos do agressor ao hospedeiro.
ESTADO DA TÉCNICA
Nanotubos de Carbono são estruturas quase unidimensionais formadas por ligações carbono-carbono em hibridização sp 2 na forma de tubos cujo diâmetro pode variar de 1 nm (10 "9 m) a 100 nm e comprimento típico da ordem de 10 4 vezes seu diâmetro (HERBST, M.H.; MACEDO, M.I.F. & ROCCO, A.M. Tecnologia dos Nanotubos de carbono: tendências e perspectivas de uma área multidisciplinar. Quím.Nova. 27 (6): 986-992. 2004; IIJIMA, S & ICHIHASHI, T. Single-shell carbon nanotubes of 1-nm di- ameter. Nature. 363: 603-605. 1993; IIJIMA, S. Helical microtubules of gra- phitic carbon. Nature. 354: 56-58. 1991). Os nanotubos de carbono podem ser produzidos com uma única parede de carbono sendo denominados de nanotubos de carbono de parede única (SWNT) ou com múltiplas paredes de carbono concêntricas denominados de nanotubos de carbono de múltiplas paredes (MWNT) (SINHA, N. & YEOW, J.T.W. Carbon Nanotubes for biomedical applications. IEEE Transactions on Nanobioscience. 4(2): 180- 195. 2005). Os nanotubos de carbono possuem alta rigidez estrutural, alta biocompatibilidade, baixa citotoxicidade e com seu diâmetro na faixa de alguns nanômetros são pequenos o suficiente para atravessar passivamente a parede celular e membrana citoplasmática de células, carreando assim bio- moléculas ligadas a sua superfície do meio extracelular para o intracelular (KOSTARELOS, K.; LACERDA, L; PASTORIN, G.; WU, W.; WIECKOWSKI, S.; LUANGSIVILAY, J.; GODEFROY, S.; PANTAROTTO, D.; BRIAND, J.; MULLER.S.; PRATO, M. & BIANCO, A. Cellular uptake of functionalized car- bon nanotubes is independent of functional group and cell type. Nature. 2: 108-113. 2007; ZHANG, Z.; YANG, X.; ZHANG, Y.; ZENG, B.; WANG, S.; ZHU, T.; RODEN, R.B.S.; CHEN, Y. & YANG, R. Delivery of telomerase re- verse transcriptase small interfering RNA in complex with positively charged single-walled carbon nanotubes suppresses tumor growth. Clin. Câncer Res. 12 (16): 4933-4939. 2006; KAM, N.W.S. & DAI, H. Carbon nanotubes as intracellular protein transporters: generality and biological functionality. J.Am.Chem.Soc. 127: 6021-6026. 2005; KAM, N.W.S.; JESSOP, T.C.; WENDER, P.A. & DAI, H. Nanotube molecular transporters: Internalization of carbon nanotube-protein conjugates into mammalian cells. J.Am.Chem.Soc. 126: 6850-6851. 2004). A ligação ou imobilização de biomoléculas a parede externa de nanotubos de carbono pode ser feita através de dois processos:
- Imobilização covalente - neste caso uma molécula ponte tem uma de suas extremidades ligada covalentemente à parede do nanotubo de carbono e a biomolécula ligada covalentemente à outra extremidade da molécula ponte (CHEN, S.; SHEN, W.; WU, G.; CHEN, D. & JIANG, M. A new approach to the functionalization of single-walled carbon nanotubes with both alkyl and carboxyl groups. Chem.Phys.Letters. 402: 312-317. 2005; HE, P. & URBAN, M.W. Controlled phospholipids functionalization of single-walled carbon nanotubes. Biomacromolecules. 6: 2455-2457. 2005; WANG, Y.; IQBAL, Z. & MALHOTRA, S.V. Functionalization of carbon nanotubes with amines and enzymes. Chem.Phys.Letters. 402: 96-101. 2005; PANTAROTTO, D.; PARTIDOS, C.D.; GRAFF, R.;HOEBEKE, J.; BRIAND, J.; PRATO, M. & BIANCO, A. Synthesis, structural characterization, and immunological properties of carbon nanotubes functionalized with peptides. J.Am. Chem. Soe. 125 (20): 6160-6164. 2003; POMPEO, F. & RESASCO, D.E. Water solubilization of single-walled carbon nanotubes by functionalization with glucosamine. Nano- letters. 2 (4): 369-373. 2002).
- Imobilização não-covalente - neste caso a biomolécula adsor- ve à parede do nanotubo de carbono de modo não-covalente ficando fracamente aderida a sua parede por forças de Van der Walls (BECKER, M.L.; FAGAN, J.A.; GALLANT, N.D.; BAUER, B.J.; BAJPAI, V.; HOBBIE, E.K.; LACERDA, S.H.; MIGLER, K.B. & JAKUPCIAK, J.P. Length-dependent upta- ke of DNA-wrapped single-walled carbon nanotubes. Adv.Mater. 19: 939- 945. 2007; GIGLIOTTI, B.; SAKIZZIE, B.; BETHUNE, D.S.; SHELBY, R.M. & CHA, J.N. Sequence-independent helical wrapping of single-walled carbon nanotubes by long genomic DNA. Nanoletters. 6 (2): 159-164. 2006; ZHANG, Z.; YANG, X.; ZHANG, Y.; ZENG, B.; WANG, S.; ZHU, T.; RODEN, R.B.S.; CHEN, Y. & YANG, R. Delivery of telomerase reverse transcriptase small interfering RNA in complex with positively charged single-walled carbon nanotubes suppresses tumor growth. Clin. Câncer Res. 12 (16): 4933-4939. 2006; KAM, N.W.S. & DAI, H. Carbon nanotubes as intracellular protein transporters: generality and biological functionality. J.Am. Chem. Soe. 127: 6021-6026. 2005; SIRDESHMUKH, R.; TEKER, K. & PANCHAPAKESAN, B. Biological functionalization of carbon nanotubes. Mat. Res. Soe. Symp. Proc. 823: W4.1-.1-W4.1.6. 2004; CHEN, R.J.; BANGSARUNTIP, S.; DROUVALA- KIS, K.A.; KAM, N.W.S.; SHIM, M.; LI, Y.; KIM.W.; UTZ, P.J. & DAI, H. Non- covalent functionalization of carbon nanotubes for highiy specific electronic biosensors. PNAS. 100 (9): 4984-4989. 2003).
O feijoeiro é cultivado em todas as unidades da federação, sendo o quarto produto agrícola em área plantada e o sexto em valor da produção de grãos do país (IBGE - Fundação Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Levantamento sistemático da produção agrícola: pesquisa men- sal de previsão e acompanhamento das safras agrícolas no ano civil. Rio de Janeiro, v.21 , n.1 , 79p, 2009; ZIMMERMANN, MJ. DE; ROCHA, M.; YAMA- DA, T. Cultura do feijoeiro. Piracicaba: Associação Brasileira para a Pesqui- sa da Potassa e do Fosfato (POTAFOS), 689p. 1988). Entretanto, os Estados do Paraná, Minas Gerais, Bahia e São Paulo são, em ordem decrescente, os principais produtores do país (IBGE - Fundação Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Levantamento sistemático da produção agrícola: pesquisa mensal de previsão e acompanhamento das safras agrícolas no ano civil. Rio de Janeiro, v.21 , n.1, 79p, 2009).
Dentre os fatores responsáveis por baixar a produtividade do feijoeiro estão as doenças, das quais a ferrugem [Uromyces appendiculatus (Pers.) Unger] é considerada como de grande importância, causando danos da ordem de 45% podendo chegar a 100%, o que vai estar diretamente relacionado à severidade precoce da infecção (SANNAZZARO, A.M.; OLIVEIRA, S.H.F.; WUTKE, E.B.; CASTRO, J.L; GALLO, P.B.; MARTINS, A.L.M.; BORTOLETO, N.; SABINO, J.C.; SILVEIRA, L.C.P.; SAKAI.M.; SAES, L.A.; PAULO, E.M.; KASAI, F.S.; DORNELLES, C.R.F. & BACCHI, G.S. Severi- dade de ferrugem em cultivares de feijoeiro no Estado de São Paulo. Arq.Inst.Biol. 70 (3): 323-329. 2003; COELHO, R.R.; VALE F.X.R.; JESUS JÚNIOR, W.C.; PAUL, P.A.; ZAMBOLIM, L. & BARRETO, R.W. Determinação das condições climáticas que favorecem o desenvolvimento da ferrugem e da mancha angular do feijoeiro. Fitopatol.Bras. 28 (5): 508-514. 2003; JE- SUS JÚNIOR, W.C.; VALE, F.X.R.; COELHO, R.R.; HAU, B.; ZOMBOLIM, L; COSTA, L.C. & BERGAMIN FILHO, A. Effects of angular leaf spot and rust on yield loss of Phaseolus vulgaris. Phytopathology. 91 (11): 1045-1053. 2001 ; FALEIRO, F.G.; RAGAGNIN, V.A.; VINHADELLI, W.S.; MOREIRA, M.A.; STAVELY, J.R. & BARROS, E.G. Resistência de linhagens de feijoeiro a quatro raças de Uromyces appendiculatus isoladas em Minas Gerais, Brasil. Fitopatol.Bras. 26 (1): 77-80. 2001 ; RODRIGUES, F.A.; FERNANDES, J.J. & MARTINS, M. Influência de semeaduras sucessivas de feijoeiro na severidade da mancha-angular e ferrugem e perdas na produção. Pesq. Agropec. Bras. 34 (8): 1373-1378. 1999; HALL, R. Compendium of bean dis- ease. St. Paul: The American Phytopathological Society, 73p. 1991).
U. appendiculatus é um fungo parasita obrigatório que se caracteriza por apresentar alta variabilidade patogênica. No mundo inteiro, mais de 250 raças já foram identificadas (HALEY, S.D.; MIKLAS, P.N.; AFANA- DOR, L; KELLY, J.D. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) marker variability between and within gene pools of common bean. Journal of the American Society for Horticultural Science, 119: 122-125, 1994). No Brasil várias raças fisiológicas diferentes já foram encontradas, confirmando sua variabilidade nas populações deste fungo presentes em nosso país (SAN- NAZZARO, A.M.; OLIVEIRA, S.H.F.; WUTKE, E.B.; CASTRO, J.L; GALLO, P.B.; MARTINS, A.LM.; BORTOLETO, N.; SABINO, J.C.; SILVEIRA, L.C.P.; SAKAI.M.; SAES, LA; PAULO, E.M.; KASAI, F.S.; DORNELLES, C.R.F. & BACCHI, G.S. Severidade de ferrugem em cultivares de feijoeiro no Estado de São Paulo. Arq.lnst.Biol. 70 (3): 323-329. 2003; FALEI RO, F.G.; RA- GAGNIN, V.A.; VINHADELLI, W.S.; MOREIRA, M.A.; STAVELY, J.R. & BARROS, E.G. Resistência de linhagens de feijoeiro a quatro raças de U- romyces appendiculatus isoladas em Minas Gerais, Brasil. Fitopatol.Bras. 26 (1): 77-80. 2001 ; RIOS, G.P.; ANDRADE, E.M. & COSTA, J.LS. Avaliação da resistência de cultivares e linhagens do feijoeiro comum a diferentes populações de Uromyces appendiculatus. Fitopatol.Bras. 26 (2): 128-133. 2001 ; RODRIGUES, F.A.; FERNANDES, J.J. & MARTINS, M. Influência de semeaduras sucessivas de feijoeiro na severidade da mancha-angular e fer- rugem e perdas na produção. Pesq. Agropec. Bras. 34 (8): 1373-1378. 1999).
O processo de infecção da ferrugem-do-feijão é complexo e depende do reconhecimento por parte do patógeno de estruturas particulares da superfície do hospedeiro. Um apressório deve ser produzido após o con- tato da ponta do tubo germinativo com o lábio do estômato que é a estrutura apropriada à penetração (CORRÊA JR., A. & HOCH, H.C. Identification of thigmoresponsive loci for cell differentiation in Uromyces germlings. Protop- lasma. 186: 34-40. 1995; TERHUNE, B.T.; BOJKO, RJ. & HOCH, H.C. De- formation of stomatal guard cell lips and microfabricated artificial topogra- phies during appressorium formation by Uromyces. Experimental Mycology. 17: 70-78. 1993; WYNN, E.K. Appressorium formation over stomates by the bean rust fungus: Response to a surface contact stimulus. Phytopathol. 66:136-146. 1976). O apressório é então o produto do reconhecimento do sítio de infecção e o seu correto posicionamento no hospedeiro é um estágio crucial para o sucesso da infecção e consequentemente o estabelecimento da doença (ALLEN, E. A., HAZEN, B. E., HOCH, H. C, KWON, Y., LEINHOS, G. M. E., STAPLES, R. C, STUMPF, M. A. & TERHUNE, B. T. Apressorium for- matium in response to topographical signals by 27 rust species. Phytopathol. 81 :323-331. 1991 ; HOCH, H. C. & STAPLES, R. C. Structural and chemical changes among the rust fungi during appressorium formation. Annual Review of Phytopathology. 25:231-247. 1987; STAPLES, R. C, MACKO, V., WYNN, W. K. & HOCH, H. C. Terminology to describe the differentiation response by germlings of fungai spores. Phytopathol. 73: 380. 1983). Desta forma, qualquer interrupção no processo de reconhecimento do sítio de infecção ou desenvolvimento do apressório afeta o estabelecimento da doença.
Durante o desenvolvimento de um apressório em ferrugens, vários genes são transcritos (KULKARNI, R.D. & DEAN, R.A. Identification of proteins that interact with two regulators of appressorium development, ade- nylate cyclase and cAMP-dependent protein kinase A, in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Mol. Gen. Genomics. 270: 497-508. 2004; KWON, Y.H.; HOCH, H.C. & AIST, J.R. Initiation of appressorium formation in Uro- myces appendiculatus: organization of the apex, and the responses involving microtubules and apical vesicles. Can. J. Bot. 69: 2560-2573. 1991). Em U. appendiculatus (Pers.:Pers.) Ungler diversos estudos foram realizados, tentando investigar moléculas envolvidas no processo de diferenciação do tubo germinativo em apressório (YANIV, Z. & STAPLES, R. C. The purification and properties of the aminoacyltRNA from bean rust urediniospores. Biochem. Biophys. Acta. 232:717-725. 1971 ; RAMAKRISHNAN, L. & STAPLES, R. C. Evidence for a template RNA in resting urediniospores of the bean rust fun- gus. Contrib. B. Thompson Instit. 24:1197-1202. 1970). Uma família de genes expressos entre o período coincidente com a formação do apressório foi caracterizada (XUEI, X.; BHAIRI, S.; STAPLES, R.C. & YODER, O.C. Cha- racterization of INF56, a gene expressed during infection structure development of Uromyces appendiculatus. Gene. 110: 49-55. 1992; BHAIRI, S.M.; STAPLES, R.C.; FREVE, P. & YODER, O.C. Characterization of an infection structure-specific gene from the rust fungus, Uromyces appendiculatus. Gene. 81 : 237-243. 1989). Entretanto, estudos de função e identificação desses genes são de difícil execução, uma vez que o isolamento tradicional de transform antes para características de infecção gera obrigatoriamente células incapazes de infectar, o que no caso de parasitas obrigatórios resulta em letalidade, pois estes fungos se multiplicam apenas nos tecidos vivos do hospedeiro.
A técnica de oligonucleotídeo anti-senso é usada extensivamen- te como ferramenta para inibir a expressão de mRNA alvos e permitir a elucidação da função de genes, ambos in vitro e in vivo (OEKELEN, D.V.; LUY- TEN, W.H.M.L. AND LEYSEN, J.E. Ten years of antisense inhibition of brain G-protein-coupled receptor function. Brain Res. Rev. 42: 123-142. 2003). Foi demonstrado previamente, por um membro da equipe que apresenta este pedido de patente, que a microinjeção de sequências em anti-senso do gene INF24 resulta na inibição da formação de apressórios de U. appendiculatus in vitro (BARJA, F.; CORRÊA JR., A.; STAPLES, R.C. AND HOCH, H.C. Mi- croinjected antisense Inf 24 oligonucleotides inhibit appressorium develop- ment in Uromyces. Mycol.Res. 102 (12): 1513-1518. 1998). No entanto, a técnica de microinjeção é de difícil execução e com baixa rentabilidade, o que inviabiliza a sua utilização em protocolos de controle de doença.
É conhecida a propriedade de nanotubos de carbono de parede única (SWNT) ou de múltiplas paredes (MWNT) em penetrar no interior de células de mamíferos, plantas, bactérias e fungos (LIU, Q.; CHEN, B.; WANG, Q.; SHI, X.; XIAO, Z.; LIN, J. & FANG, X. Carbon Nanotubes as Molecular Transporters for Walled Plant Celis. Nano Lett. 9 (3): 1007-1010. 2009; KOSTARELOS, K.; LACERDA, L; PASTORIN, G.; WU, W.; WIECK- OWSKI, S.; LUANGSIVILAY, J.; GODEFROY, S.; PANTAROTTO, D.; BRIAND, J.; MULLER, S.; PRATO, M. & BIANCO, A. Cellular uptake of func- tionalized carbon nanotubes is independent of functional group and cell type. Nature. 2: 108-113. 2007; KAM, N.W.S.; LIU, Z. & DAÍ, H. Functionalization of carbon nanotubes via cleavable disulfide bonds for efficient intracellular delivery of siRNA and potent gene silencing. J.Am.Chem.Soc. 127: 12492- 12493. 2005; KAM, N.W.S.; JESSOP, T.C.; WENDER, RA. & DAI, H. Nano- tube molecular transporters: Internalization of carbon nanotube-protein con- jugates into mammalian cells. J.Am.Chem.Soc. 126: 6850-6851. 2004). Essa propriedade permite a utilização dessa ferramenta como promissores carre- adores de biomoléculas para o interior de células vivas e o estudo de sua função.
Moléculas biológicas, tais como proteína e ácidos nucléicos, interagem com facilidade à superfície de NTC e têm sido usadas como surfac- tantes dessas nanoestruturas com sucesso (ZHAO, X. & JOHNSON, J.K. Simulation of adsorption of DNA on carbon nanotubes. J.Am.Chem.Soc. 129: 10438-10445. 2007; MALIK, S.; VOGEL, S; RÕSNER, H.; ARNOLD, K.; HENNRICH, R; KOHLER, A.; RICHERT, C. & KAPPES, M.M. Physical Chemical characterization of DNA-SWNT suspensions and associated composites. Composites Science and Technology. 67: 916-921. 2007; GIGLIOTTI, B.; SAKIZZIE, B.; BETHUNE, D.S.; SHELBY, R.M. & CHA, J.N. Sequence- independent helical wrapping of single-walled carbon nanotubes by long ge- nomic DNA. Nanoletters. 6 (2): 159-164. 2006; KAM, N.W.S.; LIU, Z. & DAÍ, H. Functionalization of carbon nanotubes via cleavable disulfide bonds for efficient intracellular delivery of siRNA and potent gene silencing. J.Am.Chem.Soc. 127: 12492-12493. 2005; KAM, N.W.S. & DAI, H. Carbon nanotubes as intracellular protein transporters: generality and biological func- tionality. J.Am.Chem.Soc. 127: 6021-6026. 2005; KAM, N.W.S.; JESSOP, T.C.; WENDER, RA. & DAI, H. Nanotube molecular transporters: Internaliza- tion of carbon nanotube-protein conjugates into mammalian cells. J.Am.Chem.Soc. 126: 6850-6851. 2004; CHEN, R.J.; BANGSARUNTIP, S.; DROUVALAKIS, KA; KAM, N.W.S.; SHIM, M.; LI, Y; KIM,W.; UTZ, PJ. & DAI, H. Noncovalent functionalization of carbon nanotubes for highly specific electronic biosensors. PNAS. 100 (9): 4984-4989. 2003).
Foram encontradas algumas patentes relacionadas à invenção:
O pedido de patente WO2005104179 descreve o uso de nano- tubos de carbono para análises de amostras químicas e biológicas, porém não relata o uso de nanotubos para introduzir substâncias no interior do citoplasma de células.
O pedido de patente WO2006078640 relata a introdução de substâncias em células causando alteração gênica, entretanto, não são utili- zados nanotubos de carbono.
Todavia, não foi descrito no estado da técnica a inibição de fito- patógenos utilizando oligonucleotídeos conjugados com nanotubos de carbono.
PROBLEMAS DO ESTADO DA TÉCNICA
O controle da ferrugem é realizado através da utilização de cultivares resistentes à doença, práticas culturais e/ou a aplicação de defensivos agrícolas. A existência de uma grande variabilidade de raças de U. appendi- culatus circulante dificulta o controle da ferrugem. Esse fato, associado à utilização de defensivos agrícolas que levam a seleção de microrganismos fitopatogênicos resistentes aos compostos disponíveis mostra a necessidade de se buscar alternativas mais eficazes e menos poluentes para o controle da ferrugem em vegetais.
VANTAGENS DA TECNOLOGIA
A compreensão dos mecanismos de patogênese e sua manipu- lação abrem caminho para a obtenção de estratégias que permitem uma solução mais específica e menos impactante para o meio ambiente.
A internalização de oligonucleotídeos anti-senso, através da utilização do conjugado nanotubo-oligonucleotídeo, representa uma alternativa eficiente para análise funcional de genes em fungos filamentosos, especial- mente daqueles que apresentam limitações com as técnicas convencionais, bem como uma ferramenta para o desenvolvimento de novas estratégias de controle da doença no campo.
BREVE DECRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1 - Ultramicrografias de Microscopia de Força Atómica de (a) INF24 anti-senso adsorvidos em nanotubos de carbono e (b) oligonucleotídeos INF24 senso adsorvidos a nanotubos de carbono.
Figura 2 - Folhas de feijoeiro inoculadas com o fungo Uromyces appendiculatus após tratamento com (a) nanotubo de carbono, (b) água, (c) oligonucieotídeos INF24 anti-senso adsorvidos em nanotubos de carbono e (d) oligonucieotídeos INF24 senso adsorvidos a nanotubos de carbono.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA
A presente invenção relata um processo de imobilização não covalente de uma sequência especifica de genes a nanotubos de carbono (NTC) produzindo assim um sistema híbrido oligonucleotídeos-nanotubo de carbono para ser utilizado como agente de internalização gênica no combate de fitopatógenos. O objetivo desta internalização é permitir que o oligonu- cleotídeo passe para o citoplasma do patôgeno e interfira nos mecanismos de síntese protéica regulada pelo RNA mensageiro do patógeno que como resultado leva a inibição de estruturas de infecção, causando a morte do patôgeno ou diminuição dos efeitos nocivos do agressor ao hospedeiro.
Este sistema híbrido conjugado possui alta bioatividade, alta bio- seletividade e especificidade uma vez que é construído pela imobilização de um oligonucleotídeo específico ao nanotubo de carbono.
Como modelo biológico para comprovar e aferir a eficácia da invenção utilizou-se o fungo fitopatogênico Uromyces appendiculatus (Pers.: Pers.) Ungler que é um fungo parasita obrigatório, causador da ferrugem-do- feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.).
A presente invenção pode ser mais bem entendida através dos seguintes exemplos, não limitantes de tecnologia:
Exemplo 1 : Preparação dos conjugados oligonucleotídeo-NTC
Os conjugados oligonucleotídeo e NTC foram obtidos a partir de uma solução de oligonucleotídeo INF24 e NTC funcionalizados (SWNTf ou MWNTf) que foi sonicada em ultra-som de banho por trinta minutos à temperatura ambiente e armazenada à -20 °C até a utilização nos experimentos. Exemplo 2: Análise de Microscopia de Força Atómica dos conjugados
As análises das ultramicrografias de Microscopia de Força Atô- mica (Figura 1) demonstraram que SWNTf conjugados com oligonucleotídeo INF24 apresentaram em sua superfície estruturas helicoidais dispostas ordenadamente ao logo de sua superfície longitudinal compatível com a ad- sorção dos oligonucleotídeos sobre a estrutura de carbono. Estas estruturas não são observadas em nanotubos não conjugados com os oligonucleotídeos.
Exemplo 3: Teste in vitro de inibição de apressórios
A suspensão do conjugado oligonucleotídeo INF24 e NTC
(SWNTf ou MWNTf) foi vertida sobre urediniosporos depositados em membranas plásticas contendo topografia indutiva ou discos de folhas de feijoeiro. Os substratos inoculados foram incubados por 4 h a 18 °C, fixados e o número de apressórios formados foi determinado em 100 tubos germinati- vos. No caso dos discos de folhas de feijoeiro o número de apressórios foi determinado em tubos germinativos escolhidos aleatoriamente e destes, os tubos germinativos que cresceram sobre estômatos.
Exemplo 4 - Nanotubo puro (SWNTf)
Urediniosporos de U. appendiculatus tratados com dispersões de SWNT com modificações químicas (SWNTf) germinaram e desenvolve- ram-se adequadamente sobre substrato plástico, mostrando eficiente formação de apressórios de 53,00 % ± 6,56 % e 46,67 % ± 3,05 %, não apresentando diferença estatística significante entre si e o controle (48,67 % ± 3,79 %). Além disso, não foi observado efeito deletério sobre a germinação e vi- abilidade dos tubos germinativos tratados com os diferentes SWNTf. A taxa de germinação, comprimento do tubo germinativo e sua morfologia não diferiram do controle.
Exemplo 5 - Nanotubo puro (MWNTf)
Urediniosporos de U. appendiculatus tratados com MWNTf germinaram e cresceram sobre substrato plástico contendo ranhuras e iniciaram a formação de apressórios após contato com a topografia indutiva como relatado previamente e de maneira similar ao observado para tratamentos com SWNTf. O percentual médio de formação de apressórios em U. appendiculatus incubados no controle (água destilada) e no tratamento de MWNTf foi de 27,33 % ± 9,35 % e 23,33 % ± 7,71 % respectivamente. Nenhuma interferência foi observada nos eventos que se processam durante a formação de apressórios após tratamento com MWNTf. Exemplo 6 - Oligonucleotídeos puros
Urediniosporos de U. appendiculatus tratados somente com oligonucleotídeos INF24 senso e anti-senso emitiram tubo germinativo, cresceram sobre substrato plástico e desenvolveram apressórios, 42,67 % ± 7,02 %, e 49,67 % ± 3,79 % respectivamente. Ambos não diferiram estatisticamente do controle e do tratado com SWNTf. Esses resultados estão em a- cordo com relatos na literatura, uma vez que, oligonucleotídeo anti-senso adicionado diretamente no meio de cultura não apresenta atividade biológica (BENNET & COWSERT, 1999).
Exemplo 7 - MWNTf conjugados com oligonucleotídeo INF24 anti-senso
Urediniosporos de U. appendiculatus tratados com MWNTf conjugados com oligonucleotídeo INF24 senso apresentaram valores médios de formação de apressórios de 29,17 % ± 8,06 %; 32,33 % ± 17,98 %; 26,33 % ± 9,62 % e 26,50 % ± 8,04 %, nas proporções de 1 :0,5; 1 :1 ; 1 :2 e 1 :3 res- pectivamente. Contudo, estes valores não diferiram estatisticamente entre si, do controle e do MWNT.
Os urediniosporos tratados com MWNTf conjugados com oligonucleotídeo INF24 anti-senso tiveram a formação de apressório inibida. Nas proporções utilizadas, de 1 :0,5; 1 :1 ; 1 :2 e 1 :3 (MWNTf: I F24), os valores médios de formação de apressórios observados foram de 28,33 % ± 11 ,27 %; 13,50 % ± 7,20 %; 10,83 % ± 4,71 % e 2,17 % ± 2,04 %, respectivamente. O tratamento de 1 :1 apresentou diferença significativa (P<0,05) quando comparado com os tratamentos controle, MWNTf e 1 :0,5. No tratamento de 1 :2, observou-se diferença estatística significante quando comparado com o controle e 1 :0,5 (P<0,01) e MWNTf (P<0, 05).
O tratamento na proporção de 1 :3 apresentou o menor percentual de formação de apressórios e diferiu do controle, MWNTf e 1 :0,5 (P<0,001). A proporção 1 :0,5 não diferiu significativamente dos tratamentos controle e MWNTf. Os dados mostram que a proporção entre NTC e oligo- nucleotídeos influencia a eficiência da inibição da formação de estruturas de infecção. Não se observou em nenhum dos tratamentos sinal de morbidade celular (Granulação citoplasmática, vacuolização etc). Exemplo 8 - MWNTf conjugados com oligonucleotídeo INF24 anti-senso sobre discos de folha
Urediniosporos de U. appendiculatus tratados com MWNTf conjugado com INF24 senso apresentaram valores médios de formação de a- pressórios de 21 ,3 % ± 3,05 %. Já para aqueles que apresentaram contato com os estômatos os valores percentuais médios de formação de apressó- rios foi de 69,7 % ± 2,76 %. Estes valores não diferiram estatisticamente do controle (água destilada), INF24S, INF24RC e do MWNTf.
No tratamento com MWNTf conjugado com INF24 anti-senso foi observado o menor percentual de formação de apressórios, com valores de 4,0 % ± 4,58 % e de 14,6 % ± 16,28 %, para o número de apressórios formados para o total de tubos germinativos e para os apressórios formados após o contato do tubo germinativo com o lábio do estômato respectivamente. Nas duas situações foi observado um efeito inibitório na formação de apressório de maneira similar ao descrito previamente (BARJA et al., 1998) e os valores de formação de apressórios diferiu dos observados nos tratamentos controle, INF24RC e MWNTf conjugado com INF24 senso (P<0,05) e do MWNTf (P<0,01) e dos tratamentos controle, INF24RC, MWNTf e MWNTf conjuagados com INF24 senso (P<0,001), respectivamente para as conta- gens aleatórias e aquelas que apresentaram contato com estômatos.
Exemplo 9 - SWNTf conjugados com oligonucleotídeo INF24 senso
Urediniosporos de U. appendiculatus tratados com SWNTf conjugados com oligonucleotídeo INF24 senso apresentaram valores médios de formação de apressórios de 51 ,44 % ± 9,00 %; 56,00 % ± 5,78 %; 51 ,78 % ± 4,55 % e 49,11 % ± 4,00 %, nas doses de 50; 25; 12,5 e 6,25 % (v/v) respectivamente. Contudo, estes valores não diferiram estatisticamente entre si, do controle e do SWNTf.
Exemplo 10 - SWNTf conjugados com oligonucleotídeo INF24 anti-senso
Entretanto quando tratamos urediniosporos com SWNTf conju- gados com oligonucleotídeo INF24 anti-senso em diferentes concentrações tiveram a formação de apressório inibida. Também se observou um efeito dose dependente nas concentrações usadas. Os tratamentos de 50 e 12,5 % (v/v) apresentaram valores médios de formação de apressórios de 36,00 % ± 4,98 % e 37,89 % ± 8,38 %, respectivamente. Estes tratamentos apresentaram diferença significativa (P<0,05) quando comparados com os tratamentos controle, SWNTf e 6,25 % (v/v).
No tratamento de 25 % (v/v), observou-se o menor valor médio de formação de apressório, 31 ,44 % ± 1 ,83 %, que apresentou diferença estatisticamente significativa quando comparado com o controle, SWNTf e 6,25 % (P<0,01). A dose de 6,25 % (v/v) apresentou valor médio de apressórios formados de 52,67 % ± 3,46 % e não diferiu significativamente do controle e SWNTf. Os dados mostraram que conjugados SWNTÍ-INF24RC foram eficazes na inibição da formação de apressórios em U. appendiculatus.
Exemplo 11 : Teste de inibição de U. appendiculatus
In vivo, urediniosporos de U. appendiculatus infectam as plantas de feijão e desenvolvem lesões na superfície das folhas 7 dias após a inoculação. Pontos amarelados, característicos da fase inicial do desenvolvimento da doença são observados nesse período. Esses pontos evoluem para lesões pulverulentas, de coloração marrom, coalescentes e com liberação dos urediniosporos de U. appendiculatus em plantas suceptíveis e sem tra- tamento de controle.
A inibição da ferrugem causada por U. appendiculatus foi realizada vertendo suspensão do conjugado oligonucleotídeo INF24 e NTC sobre a face adaxial de folhas primárias de plantas de feijão 24 h antes da inoculação de urediniosporos. As plantas inoculadas foram incubadas sob molha- mento foliar por 18 h a temperatura ambiente, após o aparecimento dos sintomas características da doença o número de lesões foi determinado. Esses pontos evoluem para lesões pulverulentas, de coloração marrom, coalescentes e com liberação dos urediniosporos de U. appendiculatus em plantas suceptíveis e sem tratamento de controle. Esses sintomas também são ob- servados em plantas tratadas com MWNTf e MWNTf conjugado com INF24 senso e inoculadas com urediniosporos de U. appendiculatus, mostrando que esses tratamentos não interferem no processo de desenvolvimento da infecção das plantas.
Na avaliação visual (Figura 2) das folhas de feijoeiro, as plantas tratadas com MWNTf (a), controle (b) e MWNTf conjugadas com INF24 senso (d) apresentaram quantidade de pústulas/folha de 356,7 ± 367,54; 261 ,0 ± 212,87 e 131 ,8 ± 61 ,97, respectivamente. No entanto, observamos uma diminuição significativa da quantidade da doença nas plantas tratadas com MWNTf conjugada com INF24 anti-senso (Figura 2c), com valor médio de 31 ,5 ± 36,47, que apesar de menor, quando comparados com as folhas tratadas com MWNTf e MWNTf conjugada com INF24 senso ou Controle, não diferiu estatisticamente desses tratamentos. Adicionalmente nenhum efeito tóxico foi observado nas plantas tratadas com MWNTf e os seus conjugados com INF24. As plantas não apresentaram manchas cloróticas, lesões na lâmina foliar ou senescência das folhas tratadas até 8 dias após o tratamento.