【발명의 명칭】

통합형 3차원 세포 프린팅 기술을 이용한 세포 배양체 및 이의 제조방법

【기술분야】

본 발명은 3차원 세포 프린팅 기술로 제조된 배양 지지체， 및 세포층을 포함하는 세포 배양체와， 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 【배경기술】

인공피부는 창상 치유뿐만 아니라 신약 /화장품 개발 및 피부 기초 연구에 개발되고 있다. 특히， 화장품 개발을 위한 동물실험이 완전히 금지됨에 따라 인공피부 개발은 더욱더 절실해지고 있다. 그러나 현재 사용되는 동물 대체용 인공피부모델은 , 비자동 (manual ) 3차원 세포배양만으로 제작되기 때문에 다음과 같은 한계점을 가지고 있다.

첫째， 반복 생산 및 대량생산에 어려움이 있다. 둘째， 이로 인해 성공적으로 제작된 인공피부의 경우 핑장히 고가로 판매되고 있다. 셋째 실제 피부의 다양한 요소들 (색소， 혈관， 노화 등)을 고려한 피부 모델을 개발하기에는 한계점을 가지고 있다. 따라서, 더 인간의 피부와 유사한 인공피부를 개발하기 위해서는 새로운 기술의 도입이 반드시 필요하다. 본 연구내용은 인간의 피부의 구조적 /생리학적 특징을 고려하여 통합형 세포 프린팅 기술 개발하고 인공피부 개발에 활용하고자 한다.

인공피부모델 개발을 위해 기존에 수행되는 연구에서는 고가의 트렌스웰 사용이 필수적이다. 하지만， 상용화된 트렌스웰 (transwel l )은 크기가 규격화 되어있기 때문에 다양한 크기의 인공피부 모델을 제작하기 힘들다. 또한， 고가의 제품 사용 및 모든 제작 과정이 사람에 의해 수행되기 때문에 이에 따라 인공피부도 상당히 고가로 판매되고 있다.

최근에， 다양한 세포를 원하는 위치에 정밀하게 위치시킬 수 있는 삼차원 세포 프린팅 기술이 각광받음에 따라 기존의 한계점을 극복하고， 실제 피부와 같은 삼차원 프린팅 된 인공피부 모델 ,제작 가능성이 대두되고 있다. 그럼에도 불구하고， 인쇄된 인공피부는 결국 상용화된 트렌스웰 위로 옮겨져야 하는 문제가 있고， 이러한 문제는 비교적 기계적 물성이 약한 인쇄된 인공 피부에 손상을 줄 수 있다. 또한, 삼차원 프린팅 된 인공피부는 다양한 모양과 크기로 제작 가능함에도 불구하고 규격화된 트렌스웰 위로 옮겨져야 하는 단점이 있기 때문에 삼차원 세포 프린팅 기술의 장점을 상쇄시킨다.

이외에， 인공피부 모델 개발의 가장 큰 이슈 중 하나는 배양 기간 동안의 수축이다. 이러한 수축은 세포가 세포 외 기질에 붙을 때， 기계적 물성이 약한 하이드로젤의 특성 때문에 발생하기 한다. 수축은 생체 내 환경에서 상처를 발생시키고， 생체 외에서 오랜 시간 동안 인공 피부를 배양하는데 한계를 가지고 있다. 기존의 제작 공정에서는 이러한 문제점을 극복하기 위해， 세포를 봉입하지 않은 하이드로젤 (hydrogel )을 세포를 봉입한 하이드로젤 위에 제작하기 전에 위치시킴으로써 수축을 억제 시킨다. 하지만, 이것은 고가의 하이드로젤을 소모시키고， 이러한 여분의 제작 공정은 인공피부 개발의 반복성 및 비용적인 측면에서 한계점을 가지고 있다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

본 발명의 일 예는 열가소성 수지를 이용한 배양 지지체와 세포와 겔화 고분자를 포함하는 세포층을 3차원 인쇄법으로 일체로 인쇄하여 제조된 세포 배양체， 예를 들면 진피 유사 구조체 또는 인공 피부를 제조할 수 있는, 세포 배양체， 예를 들면 진피 유사 구조체 또는 인공 피부의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 일예는， 삼차원 인쇄법으로 지지체와 세포를 포함하는 세포층을 일체로 제조할 수 있어， 종래 기술에서 세포를 포함하는 인쇄된 진피층 또는 인공피부를 트렌스웰 위로 이동시켜야 배양해야 하고， 이 경우 비교적 기계적 물성이 약한 인쇄된 진피층 또는 인공피부에 손상을 초래하는 문제점 및 삼차원 인쇄법으로 제조된 다양한 모양과 크기의 인공피부를 규격화된 트렌스웰에 적용해야 하는 한계점을 해소한 세포 배양체， 예를 들면 진피 유사 구조체 또는 인공 피부의 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 일예는 삼차원 인쇄법으로 지지체와 세포를 포함하는 세포층을 일괄 제조된 세포 배양체， 예를 들면 진피층 유사 구조체 또는 인공피부를 제공하는 것이다. 【기술적 해결방법】

본 발명은 피부의 구조적 /생리학적 특성 및 인공피부 개발의 필요조건을 고려하여， 합성 생체재료를 이용한 토출형 모듈 (module)의 삼차원 인쇄방법으로 지지체 및 세포층의 외곽 격벽부를 제조하고, 상기 지지체의 상부 및 외곽 격벽부의 내부에 겔화 고분자 용액과 세포를 포함하는 바이오 잉크를 3차원 인쇄법으로 인쇄하여 세포 배양체， 예를 들면 진피 유사 구조체 또는 인공 피부를 제조할 수 있다.

상기 바이오 잉크를 삼차원 인쇄법으로 인쇄하는 구체적인 방법은， 고농도의 용액을 분사시킬 수 있는 토출형 모들 (module)과 저농도의 용액을 소량으로 분사 가능한 분사형 모들을 모두사용하여 수행할 수 있다.

본 발명에 따라， 3차원 인쇄방법으로 지지체 및 진피층을 포함하는

2층 구조의 진피층 유사 구조체 또는 지지체， 진피층 및 표피층을 포함하는 3층 구조의 인공피부를 삼차원 인쇄법으로 일괄 제조할 수 있에 종래 기술에서 세포를 포함하는 인쇄된 진피층 또는 인공피부를 트렌스웰 위로 이동시켜야 배양해야 하고, 이 경우 비교적 기계적 물성이 약한 인쇄된 진피층 또는 인공피부에 손상을 초래하는 문제점 및 삼차원 인쇄법으로 제조된 다양한 모양과 크기의 인공피부를 규격화된 트렌스웰에 적용해야 하는 한계점을 해소할수 있다.

본 발명은 통합형 세포 프린팅 기술에 관한 것으로， 종래의 방법으로 제조되는 진피 섬유아세포 (dermal f ibroblast )를 봉입한 하이드로젤은 배양기간 또는 보관기간 동안 수축이 일어나기 때문에， 삼차원 인쇄법을 이용한 지지체를 포함하는 진피층 유사 구조체를 개발함으로써， 하이드로젤의 수축을 억제할 수 있다. 이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 예는 열가소성 수지로 제작된 하부 지지부와 상기 하부 지지부의 상부 외곽을 따라 위치하는 외곽 격벽부를 포함하는 배양 지지체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 배양 지지체 자체는 세포를 인쇄하지 않으며， 그 상부에 위치하는 세포층의 배양을 위한 지지체로서 기능을 수행하며, 원활한 배양액의 통과를 위한 공극을 포함하는 다공성 구조를 가진다.

구체적으로는， 토출 방식의 삼차원 인쇄법으로， 일정한 간격으로 위치하는 적어도 2개 이상의 인쇄 라인을 함유하는 인쇄층을 2층 이상 포함하며， 상기 다른 인쇄층의 인쇄 라인은 일정 교차각을 갖도록 인쇄되어 형성된 공극을 포함하는 다공성 하부 지지부와， 상기 하부 지지부의 상부 외곽을 따라 형성된 외곽 격벽부를 포함하는 배양 지지체에 관한 것이다. 본 발명의 다른 일예는， 열가소성 수지로 제작된 하부 지지부와 상기 하부 지지부의 상부 외곽을 따라 위치하는 외곽 격벽부를 포함하는 배양 지지체; 및 상기 배양 지지체의 하부 지지부 상부 및 외곽 격벽부의 내부에 삼차원 인쇄법으로 제조된 세포층을 포함하는 일체형 세포 배양체에 관한 것으로서， 상기 세포층은 진피층을 포함하는 2층 구조， 또는 진피층과 표피층을 포함하는 3층 구조일 수 있다.

본 발명의 추가 일예는， 상기 배양 지지체와 세포층을 포하맣는 일체형 배양체에서 분리된 세포층에 관한 것으로서， 진피층을 포함하는 1층 구조， 또는 진피층과 표피층을 포함하는 1층 구조일 수 있다.

본 발명의 다른 일예는, 열가소성 수지로 제작된 하부 지지부와 상기 하부 지지부의 상부 외곽을 따라 위치하는 외곽 격벽부를 포함하는 배양 지지체; 및 상기 ^' 하부 지지체의 상부에 적층되며， 겔화 고분자와 섬유아세포를 포함하는 유사 진피층；을 포함하는 진피층 유사 구조체에 관한 것이다.

또한， 본 발명의 일예는， 상기 진피층 유사 구조체의 상부에 적층되며， 겔화 고분자와 표피세포를 포함하는 유사 표피층을 포함하는 인공 피부에 관한 것이다. ^' 상기 하부 지지부는 공극을 갖는 다공성 구조로 되어 있으며， 하부 지지부의상부 및 외곽 격벽부의 내부에 진피층 및 표피층이 위치하며， 하부 지지부와 세포층을 모두 일련의 삼차원 인쇄법으로 제조하므로， 원하는 세포층에 맞도록 하부 지지부의 모양， 크기 및 공극을 적절히 조절할 수 있다. 하부 지지부 내부의 공극으로 인해 세포 배양 시에 배양액의 이동이 원활하며， 진피층 및 /또는 표피층을 물리적으로 지지할 수 있으며, 다공성 구조의. 크기를 제어할 수 있어 진피층의 수축 등의 변형을 막을 수 있고， 하부지지부의 다공성 구조의 크기를 제어하여 진피층의 첫 층을 하부 지지부와 잘융합되도록 도와줄 수 있다.

상기 배양 지지체의 공극은 2이상의 인쇄 라인 (내부 격벽， 섬유)을 포함하는 게 1인쇄층과， 상기 제 1인쇄층에 포함된 인쇄라안과 일정 교차각을 형성하도록 교차된 2이상의 인쇄라인을 포함하는 게 2인쇄층을 인쇄할 때 형성된 내부 공간을 의미한다. 교차각은 다양한 각도로 제조될 수 있으며， 교차각이 ₉₀ °인 경우 격자무늬가 형성되며， 상기 인쇄층은 2층 이상 제조할 수 있다. 구체적인 일예에서， 제 1 방향을 따라 연장되고， 상기 제 1 방향과 교차하는 제 2 방향을 따라 소정의 간격으로 배치되는 복수의 제 1 인쇄라인 ; 및 상기 복수의 제 1 인쇄라인 상에서 상기 제 2 방향을 따라 연장되고， 상기 거 U 방향을 따라 소정의 간격으로 배치되는 복수의 제 2 인쇄 라인;를 포함하고， 상기 복수의 게 1 인쇄라인 및 상기 복수의 제 2 인쇄라인은 각각 열가소성 수지를 포함하는， 배양 지지체일 수 있다. 본 발명에 따른 배양 지지체는 하부 지지부와 상기 하부 지지부의 상부 외곽을 따라 위치하는 외곽 격벽부를 포함하며， 상기 하부 지지부는 일정한 간격으로 위치하는 적어도 2개 이상의 인쇄 라인을 함유하는 인쇄층을 2층 이상 포함하며 , 상기 인접하는 인쇄층의 인쇄 라인은 일정 교차각을 갖도록 인쇄되어 형성된 공극을 포함할 수 있으며， 원하는 높이의 지지체를 제조하기 위해 다수의 층으로 적층할 수 있다. 본 발명의 일예에서， 하부 지지부와 외곽 격벽부를 모두 구비한 배양 지지체는 외곽 격벽부만을 포함하거나 내부 인쇄라인만 포함하는 지지체에 비해 그 상부에 형성된 진피층의 수축이 현저히 감소한 효과가 있다. 이러한 수축 방지 효과에 따라, 더 안정적으로 오랜 시간 동안 생체 외에서 진피층 및 표피층을 배양할 수 있을 뿐만 아니라 창상 치유를 위해 생체 내에 적용되었을 때 흉터를 억제할 수 있는 효과를 가짐을 의미한다.

상기 인쇄라인의 두께 또는 폭은 0. 1 내지 0.5隱， 0. 1 내지 0.4隱， 0. 1 내지 0.3隱， 또는 0. 1 내지 0.2醒인 것일 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 인쇄라인의 인쇄 높이는 0. 1 내지 1.0 mm, 0. 1 내지 0.9 讓， 0.1 내지 0.8 mm, 0.1 내지 0.7 匪， 0.1 내지 0.6 隱， 0.1 내지 0.5 mm, 0.1 내지 0.4 mm, 또는 0.1 내지 0.3 隱， 예를 들어， 0.2 mm인 것일 수 있다. 상기 하부 지지부에 형성된 공극의 크기는 100 내지 1000 um, 100 내지 900 um, 100 내지 800 丽, 100 내지 700 um, 100 내지 600 um, .100 내지 500 um, 100 내지 400 um, 100 내지 300 um, 예를 들어， 200 um인 것일 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 배양 지지체는 삼차원 인쇄법으로 제작되므로, 공극은 동일 인쇄층에 있는 인접하는 인쇄 라인간의 거리 또는 간격에 해당된다. 상기 동일 인쇄층에 있는 인접하는 인쇄 라인간의 거리 100 내지 1000 um을 포함하는 것일 수 있다.

상기 배양 지지체의 하부 지지부는 공극을 가질 수 있으며, 상기 공극 크기，즉， 동일 인쇄층에 있는 인접하는 인쇄 라인간의 거리가 같거나 상이할 수 있다. 상기 동일 인쇄층에 있는 인접하는 인쇄 라인간와 거리가 상이한 경우， 상부 동일 인쇄층의 인접하는 인쇄 라인간의 간격이 300 내지 1,000 마이크로미터이고, 하부 동일 인쇄층의 인접하는 인쇄 라인간의 간격이 인쇄 간격이 100 내지 500마이크로미터일 수 있다. 하부 지지부의 공극 크기를 다양화하여 하층부는 원활한 배양액 공급이 가능한 상대적으로 큰 크기의 공극 (200μπι~1000μιη)으로 구성되고， 하부 지지부의 상층부는 진피층이 프린팅되는 곳으로 상대적으로 작은 크기의 공극을 배치하여 진피층의 수축 방지 기능을 수행할 수 있다.

상기 외곽 격벽부는， 세포를 포함하는 세포층의 높이와 동일하거나 더 높을 수 있으며， 예를 들면 세포층의 두께 (길이-마이크로미터 기준)를 1로 기준할 때， 외곽 격벽부의 높이는 1 내지 5 일 수 있다. 상기 외곽 격벽부는 하부 지지부의 상부에 형성된 세포층의 수축을 방지하는 효과가 , 있으며， 따라서 안정적으로 오랜 시간 동안 생체 외에서 세포층을 배양할 수 있을 뿐만 아니라 창상 치유를 위해 생체 내에 적용되었을 때 흉터를 억제할 수 있는효과를 가짐을 의미한다.

상기 배양 지지체는 열가소성 수지를 재질로 사용할 수 있으며， 예를 들면 폴리카프로락톤 (Polycaprolactone; PCL), 폴리락테이트—코- 글라이콜레이트 (poly(lactate-co-glycolate), PLGA), 폴리유산 (Poly Lactic Acid, PLA), 폴리우레탄 (polyurethane, PU), 폴리락테이트-코- 카프로락톤 (poly( lact ide—co—caprolactone)， PLCL) , 폴리다이옥사논 (polydioxanone , PD0) , 폴리스티렌 (polystyrene , PS)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며， 바람직하게는 폴리카프로락톤 (Polycaprol actone ; PCL)일 수 있다. 폴리카프로락톤의 경우 비교적 낮은 온도에서 분사되기 때문에 세포와 함께 인쇄되었을 때 높은 세포 생존율을 가지는 장점이 있다.

상기 배양 지지체는 온도 민감성 겔화 고분자를 희생층으로 이용하여， 상기 인쇄 라인으로 형성된 공극에 겔화 고분자를 층진하여 제조될 수 있으며， 배양 지지체로부터 희생층을 제거할 수 있다.

본 발명에 따른 진피 유사 구조체는， 상기 하부 지지체와 상기 하부 지지부의 상부 외곽을 따라 위치하는 외곽 격벽부를 포함하는 배양 지지체와 상기 하부 지지부의 상부 및 외곽 격벽부의 내부에， 토출식 삼차원 인쇄법으로 인쇄하여 제조되는， 섬유 아세포와 겔화 고분자를 포함하는 바이오잉크를 포함하는 진피층을 포함한다.

상기 배양 지지체와 진피층을 삼차원 인쇄법을 적용한 일괄 공정으로 상기 진피층 유사 구조체를 제조하여, 하부 지지부의 상부 층에 바이오 잉크가 적층되어 지지체와 유사 진피층의 결착력이 강하다. 상기 적층 상태에서 바이오 잉크에 포함된 겔화 고분자의 가교 결합을 수행하기 때문에， 종래의 방법에 따라 배양 지지체 없이 별도로 세포층 인쇄 및 가교결합을 수행하여 얻어진 진피층을 별도 배양 지지체， 예컨대 트랜스웰에 부착하는 경우에 비해서, 진피층의 수축이 현저하게 낮아지는 효과가 있다.

또한， 본 발명에 따른 진피 유사 구조체에서 진피층은 ( i )전체 세포층에 섬유아세포를 함유하거나， ( i i )하부 지지부에 인접하는 하부 진피층에는 세포를 포함하지 않고 상부 진피층에만 세포를 포함하여 수직방향으로 세포 포함 영역과 불포항 영역을 형성하거나， ( i i i ) 배양 지지체의 외곽 격벽부와 일정 간격， 예를 들면 50 마이크로미터 이상， 예를 들면 50 내지 5000 마이크로미터 거리 또는 100 내지 1000 마이크로미터 거리로 이격하여 그 내부에 세포를 포함하여 수평방향으로 세포 포함 영역과 불포함 영역을 형성하거나， ( iv) 수직방향과 수평 방향 모두에서 세포 포함 영역과 불포항 영역을 형성하는 것일 수 있다. 상기 세포 포함 영역은 세포를 함유하는 바이오잉크를 사용하여 삼차원 인쇄를 수행하고， 상기 세포 불포함 영역은 세포 불포함 바이오잉크를 사용하여 삼차원 인쇄를 수행하여 진피층을 제조할 수 있다. 상기 외곽 격벽부와 세포층의 이격 거리를 세포층의 수축 방지에 적절한 거리를 하한치로 설정하고， 세포층의 전체 크기를 고려하여 적절히 상한치를 설정할 수 있다.

따라서， 상기 진피층 유사 구조체에 포함된 유사 진피층은 세포배양 후에도 최초 진피층 단면적 100을 기준으로 단면적 감소율이 25% 이하, 24% 이하， 23% 이하， 22% 이하， 21% 이하， 20% 이하, 19% 이하， 18% 이하， 17% 이하， 16% 이하， 15% 이하， 14% 이하, 13% 이하 12% 이하 또는 11% 이하인 것일 수 있다. 이는 더 안정적으로 오랜 시간 동안 생체 외에서 배양을 가능하게 할 뿐만 아니라 창상 치유를 위해 생체 내에 적용 되었을 때 흉터를 억제할 수 있는 효과를 가짐을 의미한다.

상기 유사 진피층은 높이가 0. 1 내지 3.5 匪， 0. 1 내지 3.0 匪， 0. 1 내지 2.5 醒， 0. 1 내지 2.0 隱， 0. 1 내지 1.5 mm, 0.5 내지 3.5 mm, 0.5 내지 3.0 隱, 0.5 내지 2.5 匪， 0.5 내지 2.0 睡， 또는 0.5 내지 1.5 睡， 예를 들어， 1.0画가 되도록 분사하는 것일 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일예는 진피층 유사 구조체의 상부에 적층되며， 겔화 고분자와 상피세포를 포함하는 유사 표피층을 포함하는 인공 피부를 제공한다. 상기 상피세포는 피부 각질세포를 포함하는 인공피부를 배양하고 분화하여 제조된 것일 수 있다. '

상기 세포와 세포 사이의 접합 ( junct ion)을 가지고 있어야 하고, 분화하기 전에 진피층 위에 빽빽한 단일층 (conf luent mono- 1 ayer )으로 위치되어 있어야 한다. 이러한 진피층 위에 위치된 상피세포는 공기 중에 노출되어 분화를 시작하여 표피 (epidermis)를 형성하게 된다. 따라서 인공피부를 제작하기 위해서는， 진피층에 존재하는 세포는 3차원 세포외 기질에 둘러싸여 있어야 하며, 세포를 봉입한 진피층은 배양기간 동안 수축이 최소화되어야 하며， 상피세포는 정상적인 세포생존율과 단백질을 발현하고 빽빽한 단일층을 이루어야 하며, 제작되는 인공피부는 submerge 상태와 ai r-l iquid interface condi t ion를 모두 형성함으로써 성숙한 피부로 성장 가능하여야 한다.

종래의 삼차원 인쇄법으로 제작된 인공피부는, 진피층 및 표피층을 별도로 제작하고 배양 지지체， 예를 들면 트렌스웰로 이동해야 때문에 , 다양한 크기 및 모양으로 제작 가능한 세포 프린팅 기술의 장점을 감쇄시키고， 인쇄 직후 약한 기계적 물성의 진피층 및 표피층을 트렌스웰로 옮기는 과정 중에 파손될 가능성도 있다. 본 발명에 따라 배양 지지체와 진피층 또는 진피층과 표피층을 삼차원 인쇄법으로 일괄 제조하는 통합형 세포 프린팅 시스템은 상기 피부의 구조적 /생리학적 특성을 충족할 수 있으며， 이에 기존의 문제점인 반복성， 대량생산성， 다양한 모양 및 크기 복잡한 제작 공정 및 고가의 비용을 모두 해결할 수 있고， 더 나아가 실제 피부와 같은 인공피부를 제작 가능하게 하였다.

이에， 일괄 삼차원 인쇄법으로 배양 지지체， 진피층 및 표피층을 모두 제조할 수 있다. 구체적으로， 토출형 모들을 통해 열가소성 수지를 사용하여 하부 지지브와 외곽 격벽부로 구성된 다공성 배양 지지체를 제조하고， 하부 지지부 위에 섬유아세포와 겔화 고분자를 포함하는 바이오잉크를, 토출형 방식의 삼차원 인쇄법으로 인쇄하여 유사 진피층을 제조하고， 겔화 고분자를 가교결합을 수행하여 진피층 유사 구조체를 제조한다. 다음으로， 삼차원 인쇄법으로 유사 진피층 위에， 상피세포와 겔화 고분자를 포함하는 바이오잉크로 표피층을 제조한다. 이에， 본 발명에 따라 제작된 인공피부는 고가의 규격화된 트렌스웰 사용 및 추가적인 작업 없이 한 번에 (one step) ai r-1 iquid interface condi t ion¾- 포함한 인공피부를 제작할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 인공피부에서 진피층이 균일하게 세포를 포함하는 영역으로 구성되거나 세포 포함 영역과 세포 불포함 영역을 포함하는 경우， 표피충은 진피층의 상부 영역과 동일하게 세포 포함 영역을 제조할 수 있다. 즉， 진피층이 전체 영역에서 세포를 포함하는 경우， 표피층은 진피층의 전체 상부에 형성될 수 있으며， 진피층이 배양 지지체의 외곽 격벽부와 일정 간격， 예를 들면 50 마이크로미터 이상， 예를 들면 50 내지 5000 마이크로미터 거리 또는 100 내지 1000 마이크로미터 거리로 이격하여 그 내부에 세포를 포함하여 수평방향으로 세포 포함 영역과 불포항 영역을 형성하는 경우 표피층은 상기 세포 포함 영역 상부에만 형성될 수 있다.

본 발명에 따른 진피 유사 구조체 또는 인공 피부는， 진피층 및 표피층에 세포와 겔화 고분자를 함유하는 바이오잉크를 삼차원 인쇄법으로 인쇄하여 제조된다. 상기 배양 지지체와 진피층은 비교적 고점도의 바이오잉크를 이용한 토출식 삼차원 인쇄법으로 제조하고， 상기 표피층은 토출식 또는 잉크젯 방식의 삼차원 인쇄법으로 제조할수 있다.

세포와 겔화 고분자를 포함하는 바이오잉크의 점도는 세포의 현탁을 유지하면서도 바람직하게는， 예를 들면， 니들 또는 노즐을 통한 주사에 의한 분산을 위해 충분한 유체가 되도록 조절될 수 있다 ^' .

본 발명에서 사용하는 바이오잉크는 예를 들면， 원하는 세포를 흔합한 /비흔합 하이드로 겔， 특정 성장인자 (growth factor )가 함유된 하이드로겔, 세포와 /성장인자가 함유된 하이드로겔, 사이토카인 (cytokine)이 함유된 하이드로겔， 서로 다른 종류의 하이드로겔 등을 포함한다. 상기 겔화 고분자는 콜라겐， 젤라틴, 마트리겔， 알지네이트， 아가로스. 탈세포화된 조직유래 세포잉크， 히알루론산 및 피브린겔로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며， 상기 겔화 고분자로 제조된 하이드로겔은 수분 함량이 높고, 생체 적합성이 뛰어나고 기계적 특성을 조절할 수 있고 생분해성이 우수하다는 장점이 있다.

본 발명에 다른 겔화 고분자는 바람직하게는 하이드로겔을 형성할 수 있는 겔화 고분자이며， 더욱 바람직하게는 온도 민감성을 갖는 하이드로겔 형성 고분자， 예를 들면 콜라겐 및 젤라틴일 수 있다. 콜라겐은 생체친화적 및 온도민감성 특성을 가지며， 젤라틴은 온도-민감성 특성을 나타내기 때문에 상기 세포 운반물질로서 특히 적합하다. 즉, 젤라틴은 37 ^° C에서 액상화되며 상온 이하에서 고체화되는 특성을 지니고 있다. 상기 바이오 잉크는 조직특이성을 강확하기 위하여 조직유래 성분이 추가로 포함할 수 있으며， 예를 들면 조직유래 성분은 연골， 신장， 심장， 간， 근육 등과 같은 동물의 특정조직이 탈세포화되고 세포외기질을 주성분으로 하는 물질의 겔 (gel )화 된 것일 수 있다. 상기 바이오 잉크는 세포 배양 배지를 추가적으로 포함할 수 있으며， 상기 세포 배양 배지는 목적하는 세포에 적합한 임의의 배지를 포함하는 것이다.

본 발명에 따른 바이오잉크는 세포를 포함할 수 있으며， 적용 가능한 세포 또는 조직은 특별히 한정되지 않으며， 동물세포 또는 식물세포이거나 동물 또는 식물의 조직일 수 있다. 상기 세포는 줄기세포 (stem cell) 조골세포 (osteoblast), 근아세포 (myoblast )， 건세포 (tenocyte) 신경아세포 ( neur oblast), 섬유아세포 ( f i br ob 1 as t ) 신경교아세포 (glioblast), 배세포 (germcell), 간세포 (hepatocyte) 신장세포 (renal cell), 지대세포 (Sertoli cell), 연골세포 (chondrocyte) 상피세포 (epithelial cell), 심혈관세포， 각질세포 (keratinocyte) 평활근세포 (smooth muscle cell), 심장근세포 (cardiomyocyte) 신경교세포 (glial cell), 내피세포 (endothel ial cell), 호르몬 분비세포 면역세포， 췌장섬세포 (pancreatic islet cell) 및 신경세포 (neuron)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 인공 피부를 제조하는 경우에는， 진피층에는 섬유아세포를 표피층에는 각질세포， 상피세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 제조된 인공 조직에서 사용되는 세포 유형은 당업계에 공지된 임의의 방식으로 배양될 수 있다. 세포 및 조직 배양 방법은 당업계에 공지되어 있다.

본 발명에서의 '바이오 프린팅 '이란 자동화된， 컴퓨터 보조의， 삼차원 시제품화 장치 (예， 바이오프린터)와 상용되는 방법론을 통해 삼차원의 정확한 세포 침착 (예， 세포 용액, 세포 함유 겔， 세포 현탁액, 세포 농축물， 다세포 웅집체， 다세포체 등)을 이용하는 것을 의미한다. 삼차원 프린팅은 바이오플로터 (bio— plotter)를 이용하여 생분해성 고분자를 노즐로부터 압출하여 스테이지에 적층함으로써 수행될 수 있다.

바이오 잉크는 삼차원 바이오 프린터에 의해 분사되어 적층된 이후에는 이를 가열하거나, 자외선에 노출시키거나 또는 가교 결합용액을 첨가함으로써 바이오 잉크 조성물의 가교결합을 촉진할 수 있다. 이러한 가교결합은 적충된 바이오 잉크 조성물이 보다 단단한 구조물로 완성될 수 있도록 해준다. 상기 가교결합을 촉진하기 위해서 광학 개시제 (photoinitiator)를 사용할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일예는 , 삼차원 인쇄법을 이용하여 일괄하여 배양 지지체와 진피층을 포함하는 진피 유사 구조체를 제조하거나, 배양 지지체， 진피층 및 표피충을 포함하는 인공 피부를 제조할 수 있다.

구체적인 진피 유사 구조체의 제조방법은，

(a) 하부 지지부의 상부 외곽을 따라 위치하는 외곽 격벽부를 포함하는 배양 지지체를 제조하는 단계，

(b.)상기 하부 지지체 위에， 섬유아세포와 겔화 고분자를 함유하는 바이오잉크를 토출식 삼차원 인쇄법으로 인쇄하여 유사 진피층을 제조하는 단계, 및

(C)상기 겔화 고분자의 가교 결합을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 인공 피부의 제조방법은，

(a) 하부 지지부의 상부 외곽을 따라 위치하는 외곽 격벽부를 포함하는 배양 지지체를 제조하는 단계，

(b)상기 하부 지지체 위에， 섬유아세포와 겔화 고분자를 함유하는 바이오잉크를 토출식 삼차원 인쇄법으로 인쇄하여 유사 진피층을 제조하는 단계,

(c)상기 겔화 고분자의 가교 결합을 형성하는 단계，

(d) 상기 유사 진피층 위에， 피부 각질세포와 겔화 고분자를 함유하는 바이오잉크를 삼차원 인쇄법으로 인쇄하여 유사 표피층을 제조하는 단계， 및

(e) 상기 각질세포를 배양 및 분화하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 진피 유사 구조체 또는 인공 피부는， 진피층 및 표피층에 세포와 겔화 고분자를 함유하는 바이오잉크를 삼차원 인쇄법으로 인쇄하여 제조된다. 상기 배양 지지체와 진피층은 비교적 고점도의 바이오잉크를 이용한 토출식 삼차원 인쇄법으로 제조하고， 상기 표피층은 토출식 또는 잉크젯 방식의 삼차원 인쇄법으로 제조할 수 있다 (도 12 참조) . 본 발명에 따른 인공피부를 제조하는 단계는， 본 발명에 따라, 3차원 인쇄방법으로 배양 지지체 및 진피층을 포함하는 2층 구조의 진피층 유사 구조체 또는 지지체， 진피층 및 표피층을 포함하는 3층 구조의 인공피부를 삼차원 인쇄법으로 일괄 제조할 수 있다. 본 발명의 일예에 따라， 삼차원 인쇄법을 적용하여 일괄하여 배양 지지체， 진피층 및 표피층을 인쇄할 수 있으며, 배양 지지체와 진피층 및 표피층이 인쇄순서는， 배양 지지체의 하부 지지부와 외곽 격벽부를 1차로 인쇄하고， 진피층을 인쇄하고， 외곽 격벽부를 2차로 인쇄하고， 표피충을 인쇄하거나， 또는， 배양 지지체의 하부 지지부와 외곽 격벽부를 인쇄한 후에， 진피층과 표피층을 연속적으로 인쇄할 수도 있다.

예를 들면， 본 발명의 인공피부 제조의 일예를 도 12에 나타냈으며， 구체적으로 토출식 삼차원 인쇄법으로 하부 지지부와 외곽 격벽부로 구성된 배양 지지체를 제조하고， 토출식 삼차원 인쇄법으로 하부 지지부의 상부 및 외곽 격벽부의 내부에 진피층을 제조하고, 토출식 삼차원 인쇄법으로 진피층의 외곽을 따라 외곽 격벽부를 제조한 후에 저점도 바이오잉크를 이용한 잉크젯식 삼차원 인쇄법 또는 고점도 바이오잉크를 이용한 토출식 삼차원 인쇄법으로 상기 제조된 외곽 격벽부 내부에 표피층을 제조할 수 있다.

또한， 세포층의 수축을 더욱 방지하고자， 본 발명에 따른 진피 유사 구조체는 수직방향 또는 수평방향으로 세포 포함 영역과 세포 불포함 영역으로 인쇄할 수 있으며， 예를 들면 ( i )전체 세포층에 섬유아세포를 함유하는 것에 추가하여， ( i i )하부 지지부에 인접하는 하부 진피층에는 세포를 포함하지 않고 상부 진피층에만 세포를 포함하여 수직방향으로 세포 포함 영역과 불포함 영역을 형성하거나， ( i i i ) 배양 지지체의 외곽 격벽부와 일정 간격, 예를 들면 50 마이크로미터 이상， 예를 들면 50 내지 5000 마이크로미터 거리 또는 100 내지 1000 마이크로미터 거리로 이격하여 그 내부에 세포를 포함하여 수평방향으로 세포 포함 영역과 불포함 영역을 형성하거나， ( iv) 상기 ( i i ) 및 ( i i i )를 조합하여， 수직방향과 수평 방향 모두에서 세포 포함 영역과 불포항 영역을 형성하는 것일 수 있다.

상기 세포 포함 영역은 세포를 함유하는 바이오잉크를 사용하여 삼차원 인쇄를 수행하고， 상기 세포 불포함 영역은 세포 불포함 바이오잉크를 사용하여 삼차원 인쇄를 수행하여 진피층을 제조할 수 있다. 상기 세포， 바이오잉크， 겔화 고분자는 진피 유사 구조체 및 인공피부에서 상술한 바와 같다. 이하, 본 발명께 따른 진피 유사 구조체 및 인공피부의 제조방법을 각 단계별로 자세히 설명하고자 한다.

(a)상기 하부 지지체와 상기 하부 지지부의 상부 의곽을 따라 위치하는 외곽 격벽부를 포함하는 배양 지지체를 제조하는 단계

본 발명에 따른 배양 지지체는 하부 지지부와 지지부의 ；상부 외곽을 따라 위치하는 외곽 격벽부를 포함하며， 상기 하부 지지부는 토출 방식의 삼차원 인쇄법으로， 일정한 간격으로 위치하는 적어도 2개 이상의 인쇄 라인을 함유하는 인쇄층을 2층 이상 포함하며, 상기 다른 인쇄층의 인쇄 라인은 일정 교차각을 갖도록 인쇄되어 형성된 공극을 포함하는 다공성 구조를 가지며， 2층 이상으로 적층되어 있을 수 있다.

구체적으로， 상기 배양 지지체는， 토출식 삼차원 인쇄법으로， 열가소성 수지를 분사하여 인쇄용 플레이트 위에 열가소성 수지를 분사하여 2이상의 인쇄 라인을 포함하는 인쇄층을 제조할 수 있다. 2개 이상의 인쇄층을 포함하는 상기 배양 지지체를 제작하는 단계는， 게 1 인쇄층 및 게 2인쇄층의 제작 단계 이후에， 형성된 공극에 젤라틴올 분사하여 충진하여 회생층을 체조하고， 젤라틴이 층진된 지지체 위에 열가소성 수지를 분사하여 2이상의 인쇄라인을 포함하는 인쇄층을 제조하여 인쇄층을 적층하는 단계를 1회 이상 추가로 수행하는 것일 수 있으며， 원하는 높이의 지지체를 제조하기 위한 만큼 수행할 수 있다. 상기 열가소성 수지, 인쇄 라인 (내부 격벽， 섬유)의 인쇄폭， 높이, 및 서로 상이한 인쇄층에 포함된 인쇄라인의 교차각 형성에 대해서는 상술한 바와 같다. 상기 하부 지지부의 높이는 500 내지 3 , 000 마이크로미터 일 수 있으며, 외곽 격벽부의 높이는 1 , 000 내지 5 , 000 마이크로미터 일 수 있다.

상기 열가소성 수지는 시린지에 봉입시킨 후 70 ^° C 내지 90 ^° C가 되도록 10분 내지 20분 동안 가열하여 용융시켜 분사하는 것일 수 있다. 상기 희생층 제조를 위한 젤라틴은 농도가 20 내지 45 중량 %， 20 내지 40 중량 %, 또는 20 내자 35 중량 %인 것일 수 있다. 젤라틴의 농도가 20 중량 % 미만인 경우에는 인쇄된 콜라겐이 가교되기 전에 젤라틴이 용액 상태가 되기 때문에 희생층의 역할을 할 수 없기 때문에， 상기 범위에서 사용하는 것은 콜라겐이 가교 되는 동안의 희생층 역할을 ^, 층분히 할 뿐만 아니라 추후에 제거가 용이하다. (b)상기 하부 지지부 위에， 섬유아세포와 겔화 고분자를 함유하는 바이오잉크를 토출식 삼차원 인쇄법으로 인쇄하여 유사 진피층을 제조하는 단계

본 발명에 따라 삼차원 인쇄법으로 하부 지지부와 지지부의 상부 외곽을 따라 위치하는 외곽 격벽부를 포함하는 배양 지지체를 제조한 후에， 상기 하부 지지부 위에 섬유아세포와 겔화 고분자를 포함하는 바이오잉크를 이용하여 토출식 삼차원 인쇄법으로 진피층을 인쇄하는 단계로서， ( i )전체 세포층에 섬유아세포를 함유하거나， ( i i )하부 지지부에 인접하는 하부 진피층에는 세포를 포함하지 않고 상부 진피층에만 세포를 포함하여 수직방향으로 세포 포함 영역과 불포항 영역을 형성하거나, ( i i i ) 배양 지지체의 외곽 격벽부와 일정 간격으로 이격하여 그 내부에 세포를 포함하여 수평방향으로 세포 포함 영역과 불포함 영역을 형성하거나， ( iv) 상기 ( i i ) 및 ( i i i )를 조합하여， 수직방향과 수평 방향 모두에서 세포 포함 영역과 불포항 영역을 형성하는 것일 수 있다.

상기 세포 포함 영역은 세포를 함유하는 바이오잉크를 사용하여 삼차원 인쇄를 수행하고, 상기 세포 불포함 영역은 세포 불포함 바이오잉크를 사용하여 삼차원 인쇄를 수행하여 진피층을 제조할 수 있다. 상기 세포， 겔화 고분자. 바이오잉크， 진피층의 높이는 상술한 바와 같다. ' (C)상기 겔화 고분자의 가교 결합을 형성하는 단계

본 발명의 토출식 삼차원 인쇄법에 따라， 하부 지지부와 외곽 격벽부를 포함하는 배양 지지체를 제조하고， 상부에 섬유아세포와 겔화 고분자를 함유하는 진피층을 인쇄하고， 겔과 고분자의 가교결합을 형성하는 단계를 수행할 수 있다.

상기 가교결합은 가열하거나， 자외선에 노출시키거나 또는 가교 결합용액을 첨가함으로써 바이오 잉크 조성물의 가교결합을 촉진할 수 있다. 이러한 가교결합은 적층된 바이오 잉크 조성물이 보다 단단한 구조물로 완성될 수 있도록 해준다. 상기 가교결합을 촉진하기 위해서 광학 개시제 (photoini t i ator)를 사용할 수 있다.

상기 진피층 제조를 위한 겔화 고분자으로 콜라겐을 사용하고 가열하여 가교 결합 형성하는 경우， 37 ^° C 미만의 온도에서는 콜라겐 가교 결합이 일어나지 않기 때문에 37 ^° C 이상의 은도에서 수행하는 것일 수 있으며， 예를 들어, 37 내지 40 ^° C , 37 내지 39 ^° C , 또는 37 내지 38 ^° C에서 수행하는 것일 수 있다. 또한, 상기 콜라겐 바이오 잉크는 콜라겐의 농도가 1 %(w/v) 내지 10 ¾(w/v) , 예를 들면， 1 내지 5%(w/v) , 1.5 내지 4.5 (w/v) 또는 1.5 내지 3%(w/v)이거나， 1.5(w/v)인 것일 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다.

구체적으로， 상기 콜라겐 바이오 잉크는, 2%(w/v)의 콜라겐 용액과 우태아혈청을 10 : 1 내지 5 : 1 부피비로 흔합된 용액에 인간 진피 유래 섬유아세포 (human dermal f ibroblasts)를 세포의 밀도가 2.5 x 10 ⁵ cel l s/ml 내지 1 X 10 ⁶ cel l s/ml 되도록 흔합된 것일 수 있다.

상기 제조방법으로 제조된 진피층 유사 구조체의 경우에는 하부 지지부의 맨상부층의 인쇄라인과 콜라겐 바이오 잉크를 순차적으로 연속하여 제조하고， 동일 인쇄층에 포함된 인쇄라인의 사이의 공간에 콜라겐 바이오 잉크가 적층되어 지지체와 콜라겐 바이오 잉크가 형성하는 유사 진피층의 결착력이 강력하며， 이 상태에서 콜라겐의 가교 결합을 수행하기 때문에 별도로 콜라겐을 가교 결합 수행 후 지지체에 부착하는 경우에 비해서 최초 진피층 단면적 감소율이 현저하게 낮아지는 효과가 있다. 따라서， 상기 진피층 유사 구조체의 유사 진피층은 세포배양 후에도 수축이 방지되어 이는 더 안정적으로 오랜 시간 동안 생체 외에서 배양을 가능하게 할 뿐만 아니라 창상 치유를 위해 생체 내에 적용 되었을 때 흉터를 억제할 수 있는 효과를 가짐을 의미한다.

상기 배양 지지체를 제조할 때 희생층으로서 젤라틴을 사용한 경우， 상기 진피 유사 구조체는 세포 배양기 중에서 배양하게 되고, 희생층의 젤라틴은 세포 배지와 함께 씻겨나가게 되고， 최종적으로 열가소성 수지 제작된 다공성지지체는 상용화된 트렌스웰의 역할을 수행하게 된다.

(d) 상기 유사 진피층 위에, 피부 각질세포와 겔화 고분자를 함유하는 바이오잉크를 삼차원 인쇄법으로 인쇄하여 유사 표피층을 제조하는 단계

본 발명에 따른 인공피부를 제조하는 방법은， 상기 진피 유사 구조체 위에 각질세포와 겔화 고분자를 함유하는 바이오잉크를 삼차원 인쇄법으로 인쇄하여 유사 표피층을 제조하는 단계를 포함하며， 표피층은 토출식 삼차원 인쇄법으로 진피층의 외곽을 따라 외곽 격벽부를 제조한 후에 저점도 바이오잉크를 이용한 잉크젯식 삼차원 인쇄법 또는 고점도 바이오잉크를 이용한 토출식 삼차원 인쇄법으로 상기 제조된 외곽 격벽부 내부에 표피층을 제조할 수 있다.

상기 표피층을 잉크젯식 (또는 분사식) 삼차원 인쇄로 제조하는 경우 상대적으로 낮은 점도의 바이오잉크를 사용하고， 토출식 삼차원 인쇄법으로 인쇄하는 경우 상대적으로 높은 점도의 바이오잉크를 사용할 수 있다. 표피층에서는 세포가 conf luent mono layer를 형성해야 하므로 세포 -함유 바이오잉크를 이용하여 잉크젯식 (또는 분사식) 삼차원 인쇄를 수행하면 추가의 공정을 수행하지 않아도 conf luent monol ayer을 형성할 수 있으며， 토출식 삼차원 인쇄를 수행하는 경우 바이오잉크로 인쇄한 이후에， 일정 온도에서 겔화 고분자를 액상화하여 단일층 세포층 제조하는 공정을 추가로 수행할 수 있다.

잉크젯 방식은 비교적 높은 정밀도로 세포를 원하는 지점에 위치시킬 수 있는 장점이 있으며， 기존의 피펫으로 진행되었을 때 비균일한 표피층이 제조되는 것을 해결하기 위한 것으로， 표피 세포를 진피 층 위에 균일하게 위치시킨 후 공기 중에 노출 시킴으로써 표피 형성의 기능을 향상시키고， 기존의 한계점인 반복성 및 대량생산의 문제점을 극복하였다.

토출 방식은 높은 점도의 하이드로젤 (hydrogel ) 안에 세포를 봉입하여 원하는 위치에 적층하여 3차원 구조물을 제작할 수 있으나， 잉크젯 모들에 비해 높은 두께로 인해 세포가 높은 농도로 존재하기 어려우므로 바이오잉크에 포함된 젤화 고분자를 승온하여 액상 (sol )으로 변경하여 세포를 아래쪽으로 가라앉혀 세포 농도를 증가시킬 수 있으며， 이를 위해서는 온도감웅성 (thermosens ive) 겔화 고분자를 사용하는 것이 바람직하며， 예를 들면， 젤라틴 (gelat in)은 저온 (37 ^° C이하)에서는 고체처럼 거동하지만， 고온 (37 ^° C이상)에서는 액상으로 변하는 특징을 가지므로 유리하다.

토출식 삼차원 인쇄법을 이용하여 표피층을 제조하는 경우， 다량의 세포를 균일하게 프린팅 하기 위한 기술로， 세포를 포함한 젤라틴 바이오잉크로 표피층을 프린팅 한 후， 다양한 조건으로 겔화 고분자를 액상으로 변화하면서 내부 세포들은 진피층 위에 균일하게 쌓이게 된다. 상기 액상으로 변화하는 방법은 온도 변화 및 염농도등을 이용하는 방법이 있으며， 젤라틴은 승온하거나， 콜라겐은 온도를 낮추어 액상화 할 수 있다. 본 발명에 일예에서， 표피층 형성을 위한 바이오잉크는 적절한 점도범위를 가질 수 있으며， 겔화 고분자의 농도를 조절하여 달성할 수 있다. 겔화 고분자로 젤라틴을 사용할 경우， 젤라틴의 농도가 높을 경우 프린팅 정밀도는 향상되나 젤라틴 재료의 강성이 높아서 진피층의 균열을 유발시키므로， 바이오잉크에 포함된 젤라틴의 함량은 1 %(w/v) 내지 10 %(w/v) , 예를 들면， 1 내지 5%(w/v) , 1.5 내지 4.5%(w/v) 또는 1.5 내지 3%(w/v)이거나， 2.5¾>(w/v)일 수 있다. 표피층의 겔화 고분자， 예를 들면 젤라틴의 경우 특별히 농도의 제한은 없지만 농도가 지나치게 높을 경우 강도가 증가하여 진피층의 훼손을 발생시킬 수 있습니다. 잉크젯 방식의 삼차원 인쇄법을 적용할 경우 적절한 농도는 없지만 고농도일 경우는 잉크젯 토출이 어려워서 일반적으로 저 도의 액상을 사용하는 것이 바람직하다.

(e) 상기 각질세포를 배양하는 단계

본 발명에 따른 인공피부를 제조하는 방법은 진피 유사 구조체 위에 표피층을 제조하고， 세포의 배양를 수행하여 증식 및 분화하는 단계를 포함한다.

상기 세포 배양 단계는 통상의 인공 피부의 제조방법에서 사용하는 방법과 동일하게 적용할 수 있다. 예를 들면， 상기 배양 단계는 35 내지 40 ^° C , 35 내지 39 ^° C , 35 내지 38 ^° C , 36 내지 40 ^° C， 36 내지 39 ^° C , 36 내지 39 ^° C , 또는 36 내지 38 ^° C , 예를 들어, 37 ^° C에서 수행하는 것일 수 있다. 상기 배양 단계는 5% C0 ₂ 배양기에서 12 내지 36시간， 12 내지 32시간， 12 내지 28시간， 16 내지 36시간, 16 내지 32시간， 16 내지 28시간， 예를 들어 24시간 동안수행하는 것일 수 있다.

상기 분화 단계는， 인산완충식염수 (phosphate buf fered sal ine ; PBS)로 진피층 유사 구조체를 세척하여 젤라틴을 제거한 후 수행하는 것일 수 있다. 상기 케라틴 세포는 6 X 10 ⁵ cel l의 케라틴 세포가 1 mL의 세라틴 세포 성장 배지 (kerat inocyte growth media)에 봉입되어 분사하는 것일 수 있다. 세포를 배양하여 세포 수를 증가시키는 증식 단계와 세포 특이적 특성을 발현시키는 분화 단계로 나뉘게 되는데， 피부조직의 경우， 표피세포는 배양액에 잠기지 않고 공기중에 노출시켜야 분화가 되는 특성이 있기 때문에 공기중에 노출시키는 과정 (ai r-l iquid interface , ALI )이 필요하다.

【발명의 효과】

본 발명은 3차원 세포 프린팅 기술로 진피층 유사 구조체를 제조하는 방법， 상기 방법으로 제조된 진피층 유사 구조체， 상기 진피층 유사 구조체를 이용하여 인공피부를 제작하는 방법 및 상기 방법으로 제작된 인공피부에 관한 것으로， 본 발명에 따른 3차원 세포 프린팅 제작방법에 의해 제작된 인공피부는 대량 생산에 용이하며 더욱 더 실제피부와 가까운 인공피부모델 개발의 기반 기술로 활용될 수 있다. 【도면의 간단한 설명】

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 삼차원 인쇄법으로 제조된 배양 지지체의 수축을 극복하기 위한 배양 지지체의 구조를 확인하기 위한 3개 지지체의 모식도를 나타낸다.

도 2는 실시예 1에 따라 제조된 진피 유사 구조체를 배양하면서 배양기간 1일， 3일， 5일 및 7일에서의 진피층의 콜라겐 수축 (col lagen contract ion)을 촬영한 실제 사진을 나타낸다.

도 3은 본 발명의 실시예에 따른 1일， 3일， 5일 및 7일에서의 콜라겐의 수축 된 정도를 수치화한 그래프를 보여준다.

도 4는 본 발명의 실시예에 따른 7일 동안 수축된 콜라겐 바이오- 잉크를 각 그룹별로 생존 /사멸 분석 (Live and dead assay)을 통해 세포 형태 (eel hil ar morphology)를 촬영한사진이다.

도 5은 본 발명의 실시예에 따른 통합형 세포 프린팅 기술을 이용한 원스텝 인공피부의 제조 공정을 보여주는 공정도이다.

도 6은 본 발명의 실시예에 따른 통합형 세포 프린팅 기술을 이용하여 제작된 직사각형 및 원형의 인공피부를 보여주는 사진이다.

도 7는 본 발명의 실시예에 따른 잉크젯 모들을 이용해 콜라겐 위에 프린팅 된 표피세포 (kerat inocyte)를 보여주는 사진이다.

도 8은 본 발명의 실시예에 따른 잉크젯 모들의 가능성을 보여주기 위한 비교그룹으로 피펫으로 콜라겐 위에 위치된 표피세포 (kerat inocyte)를 보여주는 사진이다.

도 9는 본 발명의 실시예에 따른 상용화 된 트렌스웰 위에 제작된 인공피부와 비교하여 개발된 인공피부의 14일 동안의 표피층 형성 정도를 보여주는 사진이다.

도 10은 본 발명의 실시예에 따른 인공피부의 7일， 14일에서의 표피층의 두께를 ^' 수치화한 그래프이다.

도 11은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 인공피부의 단면을 나타낸 그림이다.

도 12는 본 발명의 실시예에 따라 배양지지체 및 인공피부 (진피 및 표피 포함)를 제작하는 방법을 나타낸 도식도이다.

도 13은 본 발명의 실시예에 따라 젤라틴을 이용한 표피세포 프린팅 (도 12에서 C2) 결과를 나타낸다.

도 14는 본 발명의 실시예에 따라 젤라틴을 이용한 표피세포 프린팅 후 세포관찰 결과를 나타낸다.

도 15는 본 발명의 실시예에 따라 젤라틴 농도에 따른 프린팅 결과를 나타내는 사진이다.

도 16은 본 발명의 실시예에 따라 배양 지지체의 하부 지지부의 공극 크기에 의한 배양액 침투 과를 비교한 것이다.

도 17은 본 발명의 실시예에 따라 제작된 인공피부의 세포에 의한 수축 설명 도식도이다.

도 18은 본 발명의 실시예에 따라 세포에 의한 수축을 방지하기 위한 진피 및 표피층 프린팅 방법을 나타낸 도식도이다.

도 19는 본 발명의 실시예에 따라 세포에 의한 수축을 방지하기 위한 진피 및 표피층 프린팅 방법 차이에 의한수축 결과를 나타낸다.

【발명을 실시를 위한 형태】

이하， 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며， 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 제조예 1. 바이오 잉크 (col lagen bioink)의 제조

(1)콜라겐 바이오 잉크

스폰지 (sponge) 형태의 Col lagen type 1 (^다림티센)을 0.02M 아세트산 (Acet i c acid; DUKSAN) 에 하루 동안 상온 (25 ^° C )에서 용해시켜 농도가 2%(w/v)가 되도록 한다. 그 다음， 얼음에 담궈 둔 0.5M NaOH (Sigma-Aldr ich)를 이용하여 산성 콜라겐을 중화시켜 약 pH 7.0의 콜라겐 용액을 제조하였다.

상기 중화된 콜라겐 용액에 우태아혈청 (Fetal bovine serum; FBS)을

10 : 1의 부피비로 흔합하고 (콜라겐 용액:우태아혈청)， 인간 진피 유래 섬유아세포 (human dermal f ibroblasts)를 세포의 밀도가 2.5 x 10 ⁵ cel l s/ml가 되도록 흔합하여， 콜라겐, 우태아 혈청 및 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 바이오 잉크를 제조하고, 상기 콜라겐 바이오 잉크 내 콜라겐의 농도가 1.5¾>(w/v)가 되도록 증류수를 첨가하여， 콜라겐, 우태아 혈청 및 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 바이오 잉크를 제조하고， 상기 콜라겐 바이오 잉크 내 콜라겐의 농도가 1.5%(w/v)가 되.도록 증류수를 첨가하여 최종 콜라겐 바이오 잉크를 제조하였다. (2)젤라틴 바이오 잉크

파우더 형태의 젤라틴을 1 XPBS에 10%(w/v)으로 넣고 상온에서 최대한 녹인 후， 120 ^° C 온도에서 20분 동안 멸균 혹은 65 ^° C 이상의 온도에서 완벽히 액체 상태로 제조하였다. 제조된 젤라틴 용액을 상온에서 식히고， 액체 상태에서 0.22/ΛΠ 필터를 통해 여과하였다.

표피층 제작을 위하여 상기 제작된 젤라틴과 l x iOVml 혹은

5 X l0 ⁶ /ml의 피부 각질세포 (dermal kerat inocytes)를 4: 6 비율로 섞어 프린팅 시린지에 탑재하고 4 ^° C 혹은 아이스에 보관하여 고체 형태로 제작하였다. 실시예 1: 세포층수축 방지 구조 분석

(1) PCL 내부 격자를 포함하는 지지체와 진피층을 포함하는 유사 진피 구조체 (A) 제조

폴리카프로락톤 (Polycaprolactone ; 이하， PCL) lg을 시린지 (syr inge)에 봉입 시킨 후 80 ^° C가 되도록 10분 동안 가열하여 용융시켰다. 그 다음， 상기 용융된 PCL을 600kPa의 압축 디스펜서 (di spenser ) ( (주) Musashi Engineer ing, Inc . )로 분사시켜 직경 12隱, 높이 0.8 隱의 PCL 격자무늬로 지지체를 제작하였으며， PCL 내부 격자를 포함하는 지지체를 제조하였다.

상기 제작된 지지체 위에， 제조예 1에서 제조한 섬유아세포를 함유하는 콜라겐 바이오잉크를 높이가 1mm가 되도록 유사 진피층을 토출방식의 삼차원 인쇄법으로 인쇄하고， 37 ^° C에서 1시간 동안 콜라겐을 가교화시켜 직경 13画 및 높이 2.0mm를 가지는 진피층 유사 구조체를 제조하였다 (지지체 A) . 상기 제조된 배양 지지체와 진피층을 포함하는 진피 유사구조체의 모식도를 도 1에 나타냈다. (2) 외곽 격벽부를 갖는 지지체와 진피층을 포함하는 유사 진피 구조체 (B) 제조

폴리카프로락톤 (Polycaprolactone ; 이하， PCL) lg을 시린지 (syr inge)에 봉입 시킨 후 80 ^° C가 되도록 10분 동안 가열하여 용융시켰다. 그 다음， 상기 용융된 PCL을 600kPa의 압축 디스펜서 (di spenser ) ( (주) Musashi Engineer ing, Inc . )로 분사시켜 직경 12瞧， 높이 3.0匪의 높이를 가지도록 PCL 외곽 격벽부를 제작하였으며， 외곽 격벽부를 갖는 지지체를 제조하였다.

상기 제작된 지지체 위에， 제조예 1에서 제조한 섬유아세포를 함유하는 콜라겐 바이오잉크를 높이가 1隱가 되도록 유사 진피층을 토출방식의 삼차원 인쇄법으로 인쇄하고， 37 ^° C에서 1시간 동안 콜라겐을 가교화시켜 직경 13mm 및 높이 2.0mm를 가지는 진피층 유사 구조체를 제조하였다 (지지체 B) . 상기 제조된 배양 지지체와 진피층을 포함하는 진피 유사 구조체의 모식도를 도 1에 나타냈다. (3) 하부 지지부가 없는 진피층을 포함하는 진피 유사 구조체 (C)의 제조 상기 PCL 격벽을 제조하지 않고， 인쇄 플레이트 상에 바로 제조예 1에서 제조한 섬유아세포를 함유하는 콜라겐 바이오잉크를 높이가 1mm가 되도록 유사 진피층을 토출방식의 삼차원 인쇄법으로 인쇄하고， 37 ^° C에서 1시간 동안 콜라겐을 가교화시켜 직경 13隱 및 높이 2.0匪를 가지는 진피층 유사 구조체 (C)를 제조하였다. 상기 제조된 배양 지지체와 진피층을 포함하는 진피 유사 구조체의 모식도를 도 1에 나타냈다. 실험예 1. 진피충수축 정도측정

진피층의 수축 정도를 알아보기 위해, 실시예 1의 지지체 A, B, C에서 제조한 진피 유사 구조체를 각각 37 ^° C를 유지하며 섬유아세포 성장 배지 (fibroblasts growth media; Dulbecco' s Modified Eagle's medium with high glucose (DMEM/HG) , 10% FBS, 1% Penici 11 in-Streptomycin)에서 2일에 한번씩 배지를 교체하면서 7일 동안 배양하고, 7일 동안 배양된 각각의 진피 유사 구조체들을 인산완충식염수 (phosphate buffered saline; PBS)를 이용하여 세척하였다.

7일 동안 배양하면서 진피층 구조체의 수축 정도를 1일 , 3일， 5일 및 7일차에 현미경을 이용하여 관찰하고 그 결과를 도 2에 나타내었으며， 수축 정도를 수치적으로 측정하기 위해， 수축된 진피층의 단면적을 Image J 소프트웨어를 이용하여 측정하여 백분율로 표시하여 도 3 및 표 1에 나타내었다. 하기 표 1에는 실험 일자가 경과할수록 최초 진피층 단면적 100을 기준으로 나타낸 진피층의 상대적인 단면적 비율을 의미한다.

【표 1】

도 2， 도 3 및 표 1에서 확인할 수 있듯이， 진피층의 단면적 감소율은 15% 이하로 일어나야 하는데， 실시예 1의 지지체 A는 처음 제작된 구조물의 단면적이 약 10% 정도로만 감소하지 않아 구조를 가장 잘 유지함을 확인하였다. 반면， 실시예 1의 지지체 B는 진피층의 단면적이 25% 감소하였고， 실시예 1의 지지체 C는 진피층 단면적이 68%가 감소함을 확인하였다. 본원발명의 진피층 유사 구조체는 기존 피펫으로 제작된 (conventional) 순수 콜라겐 기반의 진피층의 한계점인 콜라겐 수축이 극복될 수 있음을 확인하였다. 이는 인공피부 모델 개발 시， 더 안정적으로 오랜 시간 동안 생체 외에서 배양을 가능하게 할 뿐만 아니라 창상 치유를 위해 생체 내에 적용되었을 때 흉터를 억제할 수 있는 효과를 가짐을 의미한다ᅳ 실험예 2. 섬유아세포의 생존 분석 (Live and dead assay)

진피층의 수축 여부가 세포에게 미치는 영향을 알아보기 위해， 수축이 완료된 시점인 7일 후， 생존 /사멸 분석 (Live and dead assay)을 이용하여 세포 생존율 및 세포 형태 (cellular morphology)를 확인하였다. 구체적으로， 실시예 1의 지지체 A, B, C에서 제조한 진피 유사 구조체를 실험예 1과 동일한 배양방법으로 7일 동안 배양하였다.

그 다음， 살아있는 세포는 초록색으로， 죽은 세포는 빨간색으로 염색하기 위해， Working solution을 2uL EthD-4uM; Life Technologies)와 2uL calcein AM 2uM (Life Technologies)를 각각 lmL의 PBS 버퍼와 흔합하여 제조하고， 제조된 Working solution에 각각의 구조물을 20분간 침지시킨 후， 형광 현미경을 이용하여 이미지를 촬영하여， 형광현미경 사진을 도 4에 나타내었다.

도 4에서 확인할 수 있듯이, 실시예 1의 지지체 A, B, C 모두에서 적절한 세포 생존율 (viability)을 보였으나， 실시예 1의 지지체 A의 수축이 억제된 진피 유사 지지체에서 가장 안정적인 세포 형태 (cellular morphology)가 관찰되었다. 실시예 2. 인공피부 제작 (A-Bᅳ C1방식)

(1)배양지지체 제작

실시예 1에서 제조한 것과 동일한 방식으로， 상기 인쇄용 플레이트 상에 격자무늬로 0.2 隱의 높이를 가지도록 PCL 인쇄라인으로 격자무늬의 다공성 하부 지지부를 인쇄하고， 상기 하부 지지부의 격자 사이에 희생층 (sacrificial layer) 재료인 25% gelatin (Sigma-Aldrich)을 프린팅하여 빈공간이 없도록 하여， 1隱의 두께의 지지체를 제작하였다. 상기 제조된 지지체의 상부 외곽을 따라 PCL을 삼차원 인쇄를 수행하여 0.2 mm의 높이를 가지도록 PCL 외곽 격벽부를 제조하여， 격자무늬의 공극을 갖는 내부 격벽부로 구비된 하부 지지부와 외곽 격벽부을 갖는 배양 지지체를 제조하였다.

(2)진피층 제작

상기 제조한 배양 지지체의 하부 지지부의 상부 및 외곽 격벽부의 내부에， 제조예 1에서 제조한 섬유아세포를 함유하는 콜라겐 바이오잉크를 토출방식의 삼차원 인쇄법으로 인쇄하고， 37 ^° C에서 1시간 동안 콜라겐을 가교화시켜 직경 13mm 및 높이 2.0隱를 가지는 진피층 유사 구조체를 제조하였다.

(3)표피층 제작

상기 인.공피부의 제조 모식도는 도 5에 나타냈으며， 제조된 원형 구조체와사각형 구조체의 사진을 도 6에 나타냈다.

구체적으로， 진피층 유사 구조체 위에， 제조예 1에서 제조한 6 X 10 ⁵ cel l의 표피 세포가 1 mL의 kerat inocyte growth medi a (Gibco™)에 봉입된 젤라틴 바이오잉크를 잉크젯 모들을 통해 삼차원 인쇄법으로 균일하게 분사하였다.

그 다음， 진피층 유사 구조체위에 각질세포를 포함하는 젤라틴 바이오잉크가 인쇄된 구조물을 배양 용기에 넣고, 진피층 유사 구조체가 잠길 때까지 섬유아세포 배양액올 채워준 주고 37 ^° C , 5% C0 ₂ 배양기에 넣어 하루 동안 넣어두었다. 젤라틴 희생층의 특성상 상온에서 고체화되고 37 ^° C에서 액체화가 되기 때문에， 하루 동안 배양한 후에， PBS 세척을 통해 희생층 재료를 제거하였다. 그 다음, 3 내지 5일 동안 배양액 완전히 담긴 상태로 유지하고, 그 이후 케라틴 세포의 분화를 위해 배양액 부피를 줄여 표면이 공기 중에 노출되도록 하여 인공피부를 제작하였다. _.

도 6에서， 본 발명에 따른 인공피부의 제조방법은 다양한 모양 및 크기를 가지는 인공피부를 제조할 수 있으며， 구체적으로 트렌스웰 역할을 할 수 있는 다공성 PCL 배양 지지체와 진피층과 표피층을 함께 인쇄한 실제 이미지를 보여준다. 또한， 도 8에는 바이오 프린팅으로 제작된 인공피부 개발에 있어 필수적인 3가지환경 (fabrication, submerge condition, air- liquid interface)를 보여주는 사진이다. 본 발명에 따른 인공피부 제조 기술은, 제작 공정의 단순화， 저가의 인공피부 및 다양한 모양 및 형태로 제작 가능하게 해준다. 비교예 1

실시예 2와 실질적으로 동일한 방법으로 인공피부를 제조하였으나， 다만 실시예 2에서 각질세포를 포함하는 젤라틴 바이오잉크를 잉크젯 방식으로 삼차원 인쇄를 수행하는 것 대신에， 진피 유사 구조체 위에 표피세포를 피펫으로 위치시킨 세포층을 포함하는 인공피부를 제조하였다. 실험예 3· 각질세포 분포 분석 (keratinocyte morphology)

본 발명에 따라 통합형 세포 프린팅 시스템을 이용하여 잉크젯 방식의 삼차원 인쇄법으로 표피층을 제조한 경우， 고농도의 하이드로젤에 봉입 없이도 표피 세포인 케라틴세포 (keratinocyte)가 진피층 위에 균일하게 위치하는지 확인하고자 실험하였다.

구체적으로， 실시예 2에 따라 진피층 유사 구조체 위에 잉크젯 방식의 삼차원 인쇄법으로 제조된 표피층을 포함하는 인공피부와， 비교예 1에 따라 진피층 유사 구조체 위에 피펫으로 각질세포를 분사한 인공피부를 하루 동안 keratinocyte growth media에 넣은 루， immune-staining (E— cadherin/DAPI)을 통해 세포의 핵 및 세포 부착 (cell to cell adhesion)을 관찰하여， 그 결과를 도 7 및 도 8에 나타내었다.

도 7 및 도 8에서 확인할 수 있듯이, 실시예 2에 따라 잉크젯 모들을 이용하여 진피층 유사 구조체 위에 균일하게 분사한 경우에는 대부분의 면적에 균일하게 위치되었지만 (도 7)， 비교예 1에 따라 진피층 유사 구조체 위에 각질 세포를 피펫을 이용하여 위치시킨 경우에는 드문드문 빈 공간이 발생하는 등 각질 세포가 불균일하게 분포하는 것을 확인하였으며， 특히， 콜라겐 하이드로젤 가장 바깥쪽에는 표피 세포가 거의 관찰되지 않았다 (도 8).

각질 세포가 공기 중에 노출되어 정상적인 분화를 하기 위해서는 진피층 위에 위치되었을 때 conf luent mono-layer를 형성해야 하지만， 피펫을 사용한 경우에는 바이오잉크의 양을 미세하게 조절하지 못하기 때문에， 각질 세포가 진피층 밖으로 빠져 나가거나 진피층에 부착 (adhesion)되는데 시간이 필요하다. 이러한 문제는 conf luent l ayer 형성에 좋지 못한 요소로 작용하게 되고 결과적으로 인공피부 개발의 반복성 및 대량생산에 한계를 가지고 있다.

반면， 본원발명은 세포를 포함한 바이오잉크를 미세하게 조절할 수 있기 때문에 진피층 위에 각질세포를 균일하게 채울 수 있었다. 이러한 결과는 인공피부 개발 시， 기존의 한계점인 복잡한 제작 공정， 낮은 반복성 및 대량생산 어려움 등의 한계점을 극복 해 즐 수 있는 핵심 기술 중에 하나로 사용될 것이다. 실험예 4. 표피층 (epidermis) 형성 정도 분석

실시예 2에서 제조된 인공피부가 실제 상용화된 트렌스웰 (Corning Inc . )의 대체 역할을 제대로 수행하는지 확인을 위한실험을 진행하였다. 구체적으로， 실시예 2에서 제조된 인공피부를 공기 중에 노출시킨 후， 7일 차 및 14일 차에서 헤마톡실린 에오진 염색 (Hematoxyl in and Eosin staining)을 수행하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 또한， Image J 소프트웨어를 이용하여 각 그룹간의 표피층 두께를 정량적으로 측정하여 도 10 및 표 2에 나타내었다. 대조군으로는 실제 상용화된 트렌스웰 (Corning Inc . )을 이용하여 동일한 방법으로 수행하였다.

【표 2]

도 9에 나타낸 바와 같이， 왼쪽에 나타낸 실시예 2의 인공피부 (one- step fabr i cat ion)은 오른쪽에 나타낸 트랜스웰을 이용한 비교예 l(cel l culture insert )와 비교하여 14일 동안 표피층 두께가 큰 유의한 차이 없이 잘 형성됨을 확인하여， 본 발명에 따른 세포 다공성 지지체가 기존의 고가의 상용화된 트렌스웰을 대체할 수 있음을 확인하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이， 7일 차에서 실시예 2의 인공피부에서 표피층의 두께가 비교예 1에 비해 더 두꺼웠고， 14일 차에는 유의한 차이를 보이지 않음을 확인하여 진피층 유사 구조체로 인공피부가 제작 가능함을 확인하였다. 표피층의 두께는 표피층이 잘 분화된 것을 의미 ^' 하며， 본원의 배양 지지체도 air- l iquid interface condi t ion를 제공하는 기능을 수행하여， 기존에 상용화된 트랜스웰과 동일하게 표피층 분화를 원활하게 수행할 수 있음을 확인하였다. 실시예 2는 진피층 및 표피층 모두 세포의 배열이 균일하고 밀집해 있음을 알 수 있었고, 이는 대조군에 비해 더욱더 실제 피부와 유사한 구조적 형태를 가짐을 의미한다. 실시예 3: 젤라틴 진피층을 이용한 인공피부의 제작 (A-B-C2방식)

(1) 피부 각질세포를 함유하는 젤라틴 바이오잉크의 제조

제조예 1과 같이 파우더 형태의 젤라틴을 1 XPBS에 10%(w/v)으로 넣고 상온에서 최대한 녹인 후， 120 ^° C 온도에서 20분 동안 멸균 혹은 65 ^° C 이상의 은도에서 완벽히 액체 상태로 제조하였다. 제조된 젤라틴 용액을 상온에서 식히고， 액체 상태에서 0.22 필터를 통해 여과하였다. 표피층 제작을 위하여 상기 제작된 젤라틴과 i x i0 ⁷ /ml 혹은 5 X l0 ⁶ /ml의 피부 각질세포 (dermal kerat inocytes)를 4 : 6 비율로 섞어 프린팅 시린지에 탑재하고 4° C혹은 아이스에 보관하여 고체 형태로 제작하였다.

상기 피부 각질세포를 함유하는 젤라틴 바이오잉크를 인쇄용 시린지에 . 넣고 15~25 ^° C로 미리 설정한 인쇄 헤드부에 장착한 후， 10-30분정도 유지시키면서 프린팅이 가능한 점도가 될 때까지 보관하였다.

(2) 진피 유사구조체의 제조

도 12에서 보는 바와 같이 , 지지체， 진피층 및 표피층을 모두 토출식

3차원인쇄방식으로 제조한 인공피부를 제작하였다. PCL(Polycaprolacton, Polyscience Inc . )을 고분자용 스틸 시린지에 넣고 90~140 ^° C로 설정된 시린지 히터 (TCD-200EX)에 체결하여 10~20분 동안 PCL을 녹인 후， 완전히 용융된 PCL을 300 노즐로 토출하여 하부 지지부 및 외곽 격벽부를 삼차원 인쇄법으로 제조하여 배양 지지체 (A)를 제조하였다.

진피층 (B) 제작을 위하여， 콜라겐 함유 하이드로겔과 피부 섬유아세포 (dermal Fr ibroblast )를 흔합한 바이오 잉크를 시린지에 탑재하고， 노즐 250//m, 공압 30~ L00 kPa , 이송속도 약 200議 /min의 인쇄조건으로 토출식 3차원 인쇄법으로 첫 번째 층은 PCL 지지층의 상측부에 잘 융합될 수 있도록 약 200 두께로 인쇄하고， 두 번째 및 세 번째 층은 약 800~1，000 의 층 두께로 인쇄하였다.

(3)인공피부의 제작

도 15의 인공피부 제작 모식도에 따라， 표피층 (C2)은 얇은 단일층 구조로 표피세포를 인쇄하기 위하여， 상기 피부 각질세포 * 함유하는 젤라틴 바이오잉크를 이용하여 표피층을 인쇄하였다. 구체적으로 상기 피부 각질세포 2 X 10 ⁶ cel l의 표피세포를 포함한 2.5 %(W/V) 농도의 젤라틴 바이오잉크를 상기 진피 유사 구조체 위에 노즐 250-400/ , 공압 15~30 kPa , 이송속도 200~500 隱 /min의 조건에서 토출식 삼차원 인쇄법으로 인쇄하였다. 상기 인쇄된 젤라틴 바이오잉크는 인큐베이터 (약 37 ^° C)에서 액상으로 변하여 표피세포가 진피층 위에 단일층을 형성하였다. 상기 얻어진 삼차원 인쇄된 인공피부의 사진을 도 13에 나타냈다.

상기 제조된 인공피부에 포함된 표피세포에 빨간색으로 세포임을 보일 수 있는 Di l를 부착하여 공초점현미경 분석방법으로 확인하였으며， 도 14과 같이 다량의 세포가 골고루 고밀도로 인쇄된 것을 확인하였다. 실시예 4: 다양한농도의 젤라틴을 이용한 인공피부의 제조

실시예 3에 따른 피부 각질세포를 함유하는 젤라틴 바이오 잉크 제조방법과 실질적으로 동일한 방법으로 젤라틴 바이오 잉크를 제조하였으나， 다만 젤라틴 농도를 2.5%(w/v) , 5%(w/v) 및 10%(w/v)로 3가지 농도로 바이오잉크를 제조하였다. 상기 제조된 젤라틴 바이오 잉크를 이용하여 실시예 3과 실질적으로 동일한 방법으로 인공피부를 제조하였다. 젤라틴 농도에 따른 프린팅 경향성을 분석하여 그 사진을 도 15에 나타냈다. 도 15에서 인쇄 직후 사진 (맨 왼쪽 칼럼)， 가교결합을 형성한 직후 사진 (중간 칼럼) , 세척 수 사진 (맨 오른쪽 칼럼)을 나타냈다. 3가지 젤라틴 농도를 이용한 바이오잉크로 제조한 표피층을 포함하는 인공피부에 대한 실험결과， 젤라틴의 농도가 높을 경우 인쇄 정밀도는 향상되나 젤라틴 재료의 강성이 높아서 진피층의 균열을 유발시키는 것을 확인하였으며, 이를 통해 적절한 농도 (강성과 연계) 탐색을 진행하였다. 도 15의 실험 결과를 보면， 2.5% 젤라틴은 진피층의 균열 유도 없이 일정하게 인쇄된 반면， 5% 및 10%의 젤라틴 농도에서는 진피층 균열이 관찰되었다. 실시예 5: 인공피부의 제작

하부 지지부의 공극 크기 (인쇄라인 간의 간격)을 다양하게 설정한 배양 지지체 (공극 300/通)를 세포 배양용액에 주입했을 때， 배양 지지체가 배양용액에서 뜨는 현상이 발생하여 이를 해결하고자， 지지체의 공극 크기를 조절하는 실험을 진행하였다.

실시예 1과 실질적으로 동일한 방법으로 배양 지지체의 하부 지지체를 제조하되， 다만 진피층 바이오잉크가 공극사이로 빠지는 것을 방지하기 위해， 지지체 상층부의 공극크기는 300/zm으로 고정하고， 세포 배양액의 원활한 순환을 위해 지지체의 하측부의 공극크기는 300~800 ， 구체적으로 300， 500， 600， 700 및 800 의 다양한 공극을 갖는 배양 지지체를 제작하였다. 구체적으로， 상기 지지체는 2 내지 10개의 층으로 구성된 것이며， 맨 상부층은 공극 크기를 300 m로 하고， 아랫 층은 균일하게 공극을 300， 500， 600 , 700 및 800 /m로 제조하였다. 제조된 배양 지지체의 사진을 도 16의 상부에 나타냈다. 상기 하부 지지부의 공극은 삼차원 인쇄법으로 인쇄할 때 인쇄영역의 간격에 해당되며， 인쇄영역의 간격은 인쇄되지 않는 영역이므로 최종 지지체에서 공극으로 표현된다.

상기 제작된 지지체의 액체 흡수력을 조사하고자 상기 지지체 위에 물- 0.05mL을 올려 공극 크기에 따른 액체의 흡수력을 측정한 결과， 지지체의 하부 층의 공극이 300/zm에서는 물의 흡수가 낮은 반면, 500 zm 이상의 공극에서는 물이 잘 흡수되는 것을 확인하였다. 하부 지지체부는 총 3층으로 제작될 수 있으며， 상부 1층은 300 이내로， 하부 2-3층은 500 m이상의 공극 크기로 제작되었다. 실시예 6: 인공피부의 제작

인공피부의 삼차원 인쇄방법에서 많은 양의 세포가 웅집된 진피층의 상층부에서 수축현상이 발생하여， 외곽 격벽부와 인쇄된 바이오잉크 사이에서 분리현상이 발생한다 (도 17) . 세포 인쇄방법에 의한 분리현상의 개선을 위해， Gl , G2 , G3의 3 가지 인쇄법을 설정하여 실험을 진행하였다. Gl, G2 , G3의 3 가지 인쇄법의 개략적 모식도를 도 18에 나타냈다.

구체적으로, G1은 실시예 3의 토출식 삼차원 인쇄방법과 동일한 방법으로 진피층 및 표피층 인쇄를 할 때, 진피층 및 표피층 전 영역에 세포가 위치하도록 인쇄하였다. G2는 실시예 3의 토출식 삼차원 인쇄방법과 동일한 방법으로 인쇄를 수행하였으나， 진피층 및 표피층의 세포 상호작용만을 고려하여， 진피층의 하층부에는 섬유아세포가 없는 콜라겐 함유된 바이오잉크를 인쇄하고 상층부에만 섬유아세포가 함유된 콜라겐 바이오잉크 인쇄하고， 표피층은 전 영역에 세포가 위치하도록 인쇄하였다. G3는 실시예 3의 토출식 삼차원 인쇄방법과 동일한 방법으로 인쇄를 수행하였으나， 진피층의 하부 및 외곽 격벽부의 접촉면에는 세포 무함유 콜라겐 바이오잉크를 인쇄하고, 상기 외곽 격벽부와 1000마이크로미터 이내의 간격으로 떨어진 내부에만 세포 함유 콜라겐 바이오잉크를 인쇄하였고 표피층은 상기 형성된 진피층 위에 세포가 위치하도록 인쇄하였다.

상기 실험예 1의 세포층 수축 정도 측정 실험과 동일한 방법에 따라， 상기 제조된 인공피부 (Gl , G2, G3)의 세포층 수축 여부를 측정하고， 상기 인공피부를 보관 기관 7일째 사진을 도 19에 나타냈다.

도 19의 실험결과에 나타낸 바와 같이， G1 실험에 비해 G2 실험은 진피층 하측부의 세포 무함유 콜라겐 바이오잉크가 수축을 방지하여 Z축 방향으로의 수축은 개선되었지만， 진피층 상측부 전체에 인쇄된 섬유아세세포에 의해 외곽 격벽부와 이격되어 수축 현상이 나타냈다. G3실험은 세포 무함유 바이오잉크를 인쇄한 진피층 하층부 및 외곽 격벽부 접촉면 모두에서 세포층의 수축을 방지하여 전체적인 수축을 방지하는 것을 확인하였다. 즉， G2 실험은 진피층 하층부에서 세포층의 수축을 방지할 수 있었으며， G3 실험은 진피층의 하층부 및 외곽 격벽부의 접촉면에서 세포층의 수축을 모두 방지할 수 있는 방법이다.