Beschreibung:

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der automatischen Kultivierung und Weiterverarbeitung von biologischen Zellen und Geweben und betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur automatischen Passage von biologischen Zellen oder Geweben bei der Zellkultivierung mittels Druckbeaufschlagung.

Bei der Produktion von Zellen und aus Zellen aufgebauten Geweben oder Gewebeschichten stellen Maßnahmen zur Zellproliferati- on/Zellvermehrung zentrale Prozessschritte dar. Biologische Zellen sind teilungsfähig; aus einzelnen Zellen können sich über eine bestimmte Kultivierungsdauer Zellverbände und gegebenenfalls ganze Gewebeschichten ausbilden. Zur effektiven Zellvermehrung wird dieser Vorgang iterativ wiederholt. Einzelne Zellen werden beispielswei- se zu einem Gewebeverband kultiviert, der Gewebeverband wird aufgelöst und die Zellen werden vereinzelt. Die vereinzelten Zellen werden anschließend erneut jeweils zu Zellverbänden oder Geweben kultiviert. Dieser Vorgang wird als„Passage" bezeichnet. Zur Passage von Zellen ist insbesondere das Transferieren von Zellen aus einem ersten Zellkulturgefäß in eines oder mehrere weitere Zellkulturgefäße erforderlich. Dies erfolgt in bekannten manuellen Prozessen durch Herstellen einer möglichst homogen Zellsuspension in dem ersten Kulturgefäß, Absaugen der Zellsuspension mittels Pipette und Aliquotieren der in die Pipette gesaugten Zellsuspension in die weiteren Zellkulturgefäße. Bekannte Lösungsansätze für die automatisierte Passage beruhen auf einer Nachbildung dieser manuellen Prozesse mit technischen Mitteln. Dabei werden letztlich der Arm

BESTÄTIGUNGSKOPIE und die Hand des Laborpersonals durch eine geeignete Roboterkinematik ersetzt. Der herkömmliche Ablauf der manuellen Passage soll am Beispiel der Passage von adhärenten Zellen beschrieben werden: In einem ersten Schritt wird das die adhärenten Zellen ent- haltene Kulturgefäß geöffnet, in einem zweiten Schritt Überstand über den Zellen, der in der Regel aus verbrauchtem Nährmedium besteht, abgesaugt, in einem weiteren Schritt werden die am Boden des Kulturgefäßes anhaftenden Zellen durch gegebenenfalls mehrfaches Überschichten mit Pufferlösung gespült. In einem weiteren Schritt wird zur Auflösung des Gewebeverbands und zum Ablösen der Zellen vom Gefäßboden Enzymlösung (Trypsin) zugegeben und in der Regel unter Bewegung inkubiert. In einem weiteren Schritt wird durch zu dosierendes Enzym Inhibitors die Enzymaktivität gestoppt. In einem weiteren Schritt werden die abgelösten Zellen und Zellverbände oder Gewebestücke in Nährmedium suspendiert. In einem weiteren Schritt wird die Suspension aus dem Kulturgefäß abgesaugt. In einem optionalen Schritt wird die Zelldichte (Zellzahl pro Volumeneinheit) in der Suspension bestimmt. In den abschließenden Schritten wird die Zellsuspension auf andere Zellkulturgefä- ße verteilt (aliquotiert) und die Zellkulturgefäße werden verschlossen.

An den Prozess werden sehr hohe Anforderungen gestellt. Alle Handhabungsschritte müssen steril durchgeführt werden, eine Kontamination des Zellmaterials muss ausgeschlossen werden. Flüssigkeitsmengen sind bis auf wenige Volumenprozent genau zu dosie- ren, da ansonsten die Reproduzierbarkeit und die auf den Zellkulturen basierenden Untersuchungen verfälscht sein können. Im Zusammenhang mit der Passage adhärenter Zellen ist es erforderlich, enzymatische Prozesse einzusetzen. Hierbei muss eine vordefinierte Verweildauer exakt eingehalten werden. Gleichzeitig wird von einem automatisierten System verlangt, dass es flexibel einsetzbar ist, um unterschiedliche Zellen und unterschiedliche Kultivierungsansätze durchführen zu können. Die Anpassbarkeit der Volumina, die Anpassung an unterschiedliche Nährmedien und Reagenzien, besonders enzymatische Lösungen, Färbelösungen und Hilfsflüssigkeiten, ist ebenfalls erforderlich. Da die Passage und der Medienwechsel regelmäßig wiederholt durchgeführt werden müssen, soll der hierfür benötigte Zeitaufwand minimal sein. Weiter wird gefordert, dass der Aufwand für die benötigte Infrastruktur, besonders der aparative Aufwand zur Realisierung der automatisierten Passage möglichst gering ist.

Die bekannte Automatisierung des bekannten manuellen Prozesses verlangt einen hohen apparativen Aufwand, um die Arbeitsschritte und Handlungen des Laborpersonals nachzubilden. Gleichzeitig überwindet die bekannte Automatisierung nicht die wesentlichen Nachteile der manuellen Passage. Diese sind vor allem die Kontaminationsgefahr, unkontrollierter mechanischer Stress auf die biologischen Zellen während des Pipettiervorgangs, der vor allem durch abwechselndes Anlegen von Unterdruck und Überdruck (aufsaugen, auspumpen), unkontrollierbare Strömungsverhältnisse und mehrfachen Wechsel der Strömungsrichtung gekennzeichnet ist. Weiter treten Ungenauigkeiten bei der Aliquotierung der Zellen aufgrund einer Entmischung der Suspension während des Verweilens der Suspension in der Pipette auf. Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, eine Vorrichtung zur automatischen Passage biologischer Gewebe oder Zellen (Zellpassagevorrichtung) bereitzustellen, die die vorbeschriebenen Nachteile aus dem Stand der Technik weitgehend oder vollständig überwindet. Die Erfindung löst dieses technische Problem besonders durch völlige Abkehr von aus den manuellen Passageverfahren bekannten Lösungsprinzipien. Besonders wird der Einsatz einer Pipette vermieden. Gemäß eines ersten Aspekts stellt die Erfindung eine Zellpassagevorrichtung zur automatischen Passage einer Suspension biologischer Gewebe oder Zellen oder Flüssigkeit aus einem ersten Kulturgefäß in mindestens eines oder mehrere weitere Kulturgefäße bereit. Diese Vorrichtung enthält erfindungsgemäß mindestens eine Ent- nahmeeinheit zur Aufnahme und zum Abführen der Suspension oder Flüssigkeit aus dem ersten Kulturgefäß. Die Entnahmeeinheit weist mindestens ein Steigrohr zur Aufnahme der Suspension oder Flüssigkeit und mindestens ein Druckrohr zur Druckbeaufschlagung des ersten Kulturgefäßes auf. Dabei ist besonders vorgesehen, dass Steigrohr und Druckrohr der Entnahmeeinheit in das erste Zellkulturgefäß einführbar sind und die Entnahmeeinheit das Zellkulturgefäß druckdicht abschließen kann. Die Entnahmeeinheit ist speziell ausgebildet, dass im eingeführten Zustand das Steigrohr in die im ersten Zellkulturgefäß befindliche Suspension oder Flüssigkeit eintaucht und das Druckrohr sich oberhalb des Flüssigkeitsspiegels befindet.

Weiter weist die erfindungsgemäße Zellpassagevorrichtung mindestens eine Dosiereinheit zur Dosierung der Suspension oder Flüssigkeit in eines oder mehrere der weiteren Kulturgefäße auf. Die Dosiereinheit ist speziell ausgebildet, die mittels der integralen Entnah- meeinheit entnommene Suspension oder Flüssigkeit in eines oder mehrere der weiteren Kulturgefäße zu überführen, besonders in mehrere weitere Kulturgefäße verteilt zu aliquotieren. Weiter weist die erfindungsgemäße Zellpassagevorrichtung mindestens ein Reservoir für Flüssigkeit (Flüssigkeitsreservoir) auf. Bevorzugt sind mehrere Flüssigkeitsreservoirs vorgesehen. Die Flüssigkeitsreservoirs sind speziell ausgebildet, um die für den Vorgang der Passage erforderlichen Medien, wie Zellkulturmedium (Nährmedium), Puffer oder Waschflüssigkeit, Enzymlösung und gegebenenfalls Resuspendierungsflüssigkeit sowie Sterilisationsflüssigkeit, aufzunehmen. Die für den Passagevorgang erforderlichen Mengen sind automatisiert aus den Reservoirs dosierbar. Weiter weist die erfindungsgemäße Zellpassagevorrichtung eine Druckvorlage auf. Diese ist speziell ausgebildet, um den zur Durchführung des Passagevorgangs erfindungsgemäß erforderlichen Überdruck bereitzustellen. Bevorzugt ist die Druckvorlage wahlweise mit einem oder mehreren der vorstehenden Elemente verbindbar, um Flüssigkeitstransport (Transport von Suspension) entlang des gebildeten Druckgefälles gegebenenfalls entgegen der Schwerkraft (hydrostatischer Druck) zu ermöglichen.

Ein weiteres erfindungsgemäßes Element der Zellpassagevorrichtung ist ein Fluidikblock, der eine Mehrzahl von Fluidkanälen sowie eine Mehrzahl von den Fluidkanälen zugeordneten Ventilen aufweist. Dabei sind die Fluidkanäle mit den vorbeschriebenen Elementen, besonders also mit Entnahmeeinheit, Dosiereinheit, mindestens einem Flüssigkeitsreservoir und der Druckvorlage in Fluidverbindung. Fluidikblock, Fluidkanäle und Ventile sind dabei speziell ausgebildet, um zur Durchführung des Passagevorgangs vorzugsweise sequentiell eine oder mehrere der vorstehenden Elemente mit mindestens einem weiteren der vorstehenden Elemente selektiv in Fluidverbindung zu bringen, um eine selektive Druckbeaufschlagung und, da- durch bedingt, einen gezielten Flüssigkeitstransport innerhalb der Zellpassagevorrichtung zu ermöglichen.

Der Fluidikblock ist bevorzugt weiter dadurch gekennzeichnet, dass die Fluidikkanäle in dem Fluidikblock im Wesentlichen waagerecht orientiert sind. Darunter ist gemäß dieser Erfindung zu verstehen, dass die Fluidkanäle im Wesentlichen senkrecht zum Schwerkraftvektor orientiert sind. Die erfindungsgemäße Zellpassagevorrichtung ist speziell ausgebildet, die Verweildauer einer Suspension in im Wesentlichen parallel zum Schwerkraftvektor verlaufenden Fluidlei- tungen zu minimieren. Somit kann der Einfluss der schwerkraftbedingten Entmischung der Suspension auf die Verteilung der suspendierten Zellen oder Gewebe verhindert oder vermindert werden.

Die Erfindung sieht nun vor, dass durch Druckbeaufschlagung des ersten Kulturgefäßes über das mindestens eine Druckrohr des integ- ralen Entnahmeelements die sich in dem ersten Zellkulturgefäß befindliche Flüssigkeit oder Suspension über das mindestens eine Steigrohr der integralen Entnahmeeinheit abgeführt werden kann.

Durch die erfindungsgemäße Druckbeaufschlagung können so in Suspension befindliche biologische Zellen oder Gewebeteile auf kon- trollierte Weise aus dem ersten Zellkulturgefäß schonend entnommen und über den Fluidikblock, der bevorzugt zusätzlich als Zwischenspeicher der Suspension dienen kann, in die Dosiereinheit überführt werden. Durch Druckbeaufschlagung der entnommenen Suspension kann diese über die Dosiereinheit in eines oder mehrere der weiteren Kulturgefäße überführt werden.

Die Erfindung sieht weiter vor, die in den Flüssigkeitsreservoirs gespeicherten Medien sequentiell und selektiv durch Druckbeaufschla- gung des Flüssigkeitsreservoirs über den Fluidikblock und die integrale Entnahmeneinheit in das erste Kulturgefäß zu dosieren. In einer besonderen Ausgestaltung wird so die Dosierung von Enzymlösung in das erste Kulturgefäß ermöglicht, um dort adhärente Zellen in Suspension zu bringen, um sie aus dem Kulturgefäß abzuführen.

Die erfindungsgemäße Lösung basiert vor allem darauf, dass Flüssigkeit oder Suspension aus dem Kulturgefäß nicht abgesaugt, in einer Pipette zwischengespeichert und anschließend dosiert abgegeben werden. Stattdessen werden Flüssigkeit oder Suspension durch Druckbeaufschlagung über das erfindungsgemäße Druckrohr der integralen Entnahmeeinheit in ein erfindungsgemäßes in die Flüssigkeit oder Suspension eintauchendes Steigrohr der Entnahmeeinheit gepresst, und gegebenenfalls ohne weitere Zwischenspei- cherung und unter Beibehaltung der Strömungsrichtung geführt. Be- sonders kann so die Suspension aus dem ersten Kulturgefäß abgeführt und in einem Arbeitsschritt unter Beibehaltung der Strömungsrichtung, bevorzugt ohne Zwischenspeicherung, in die nachgeschaltete Dosiereinheit zur Dosierung der Suspension in eines oder mehrere der weiteren Kulturgefäße„gedrückt" werden. Ein Wechsel zwi- sehen Unterdruck und Überdruck, eine Zwischenspeicherung mit damit verbunden Verweilzeiten mit Entmischungsrisiko und die nachteilige mehrfache Umkehrung der Strömungsrichtung werden vermieden.

Zu Transport und Dosierung von Flüssigkeit oder Suspension sieht die Erfindung außerdem bevorzugt vor, dass bei im Wesentlichen konstantem Druck die Menge der Flüssigkeit unter Berücksichtung der spezifischen Strömungsgeschwindigkeit durch die Öffnungsdauer der Ventile im Fluidikblock gesteuert wird. Der Fluidikblock dient zusammen mit den Ventilen als zentrale Steuerungseinheit, um den Strom von Flüssigkeit und Suspension in der Vorrichtung zu ermöglichen. Die Ansteuerung der Ventile erfolgt vorzugsweise programmgesteuert. In einer besonderen Ausgestaltung erlaubt die Pro- grammsteuerung eine Anpassung der Dosiermengen, die Vorbestimmung der Zahl der Aliquote in Verbindung mit der Zahl der jeweils vorgesehenen weiteren Kulturgefäße sowie die Vorwahl zusätzlicher Wasch-, Sterilisierungs- und/oder Kalibrierungsschritte.

In einer bevorzugten Ausgestaltung der Entnahmeeinheit sind Steig- rohr und Druckrohr zusammen als integrale Einheit in Form einer Doppelnadel oder Mehrfachnadel ausgebildet. Diese wird bevorzugt durch ein elastisches Septum, das an dem Kulturgefäß ausgebildet ist, eingestochen, wobei vorzugsweise das Septum das Kulturgefäß im Bereich der eingestochenen Nadel druckdicht verschließt. In einer anderen Ausgestaltung sind an der Entnahmeeinheit zusätzliche Mittel zum druckdichten Verschließen des Kulturgefäßes vorgesehen. Diese können in an sich bekannter Weise als Dichtlippen, Flächenoder Labyrinthdichtungen ausgebildet sein, die in besonderer Ausgestaltung mit dem Kulturgefäß dichtend in Eingriff kommen. Durch den erfindungsgemäßen Einsatz von Überdruck kann die Gefahr einer Kontamination im Gesamtsystem vermieden werden. Zweckmäßigerweise beträgt der Überdruck 0,5 bis etwa 2 bar. Das zur Druckbeaufschlagung erforderliche Gas kann steril und kontaminationsfrei bereitgestellt werden. In einer ersten Variante ist das Gas Umgebungsluft. Daneben erlaubt das System, die Verwendung von für die Zellkultivierung günstigen Gase oder Gaszusammensetzungen, beispielsweise mit Kohlendioxid angereichertes Sauerstoffgas (95% 0 ₂ /5% C0 ₂ ). Dies erlaubt die Verwendung zellschonender physikalischer Puffersysteme in den Zellkulturmedien. Der Druck kann dabei im einfachsten Fall über eine angeschlossene Gasflasche bereitgestellt werden; eine mechanische Pumpe erübrigt sich dabei, was das Kontaminationsrisiko weiter reduziert und die War- tung vereinfacht.

Die erfindungsgemäße Zellpassagevorrichtung ermöglicht in besonderer Ausgestaltung die Passage auf Grundlage einer rein unidirek- tionalen Strömung der Suspension durchzuführen. Die in bekannten Pipettierverfahren durch die dort notwendige Strömungsumkehr be- stehende Gefahr der Bildung von Residuen wird so vermieden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt in besonderer Ausgestaltung einen im Wesentlichen kontinuierlichen Transport/Fluss der Suspension in der Passage, wodurch besonders die Verweildauer der Suspension innerhalb der Entnahmeeinheit minimiert werden kann. Die Entnahmeeinheit kann daher gegebenenfalls parallel zum Schwerkraftvektor (senkrecht) geführt werden. Ein gegebenenfalls erforderliches Verweilen der Suspension in der erfindungsgemäßen Vorrichtung findet nur im Bereich der waagerechten Fluidkanäle in dem Flu- idikblock statt. Aufgrund der erfindungsgemäß waagerechten Anord- nung der Fluidkanäle, im Wesentlichen senkrecht zum Schwerkraftvektor, wird die bei der schwerkraftbedingte Entmischung der Suspension, das heißt ein ungewolltes Absinken der Zellen im Fluidka- nal, vermieden.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung vermeidet in besonderer Ausges- taltung jegliche kinematische Vorgänge innerhalb des durch Entnahmeeinheit, Dosiereinheit, Flüssigkeitsreservoir, Druckvorlage und Fluidikblock gebildeten Systems. Dadurch können vorteilhafterweise Totvolumen minimiert werden. Weiter sind kinematische Vorgänge, beispielsweise Kolbenhübe, einem Verschleiß unterworfen. Gemäß der Erfindung wird so das Risiko des Dichtigkeitsverlusts durch Verschleiß und der Kontamination durch Abrieb an bewegten Teilen innerhalb des Systems ausgeschlossen. Einsetzbare Medien zur Realisierung der Passage sind insbesondere Pufferlösungen oder mit Nährsubstanzen angereicherte Nährmedien, die an sich bekannt sind. Für die Zellvereinzelung und Ablösung ad- härenter Zellen zur Herstellung einer Suspension können Enzymlösungen, insbesondere Trypsin, die gegebenenfalls in Verbindung mit EDTA eingesetzt werden. Weitere an sich proteolytische Enzyme sind ebenfalls gut zur Vereinzelung der Zellen zur Vorbereitung der Passage geeignet. Daneben können über ein erfindungsgemäßes Flüssigkeitsreservoir Reinigungsmedien für die Leitungen, Gefäße und Ventile bereitgestellt werden, um, beispielsweise in Vorbereitung eines Passageprozesses oder im Anschluss daran, die gesamte Vorrichtung von Zellen und anderen Kontaminationen zu befreien. Als Reinigungsmedien sind insbesondere Ethanol, Propanol, Peressigsäure und/oder Wasserstoffperoxid einsetzbar.

Um einen zuverlässigen Transport von Flüssigkeit und Suspension durch Druckbeaufschlagung mittels Luft oder Gas zu ermöglichen, ist besonders vorgesehen, dass der Querschnitt der Fluidkanäle, in Abhängigkeit von den physikalischen Eigenschaften der Flüssigkeiten und des Wandmaterials der Fluidkanäle eine bestimmte Größe nicht überschreitet, um eine sichere Bildung von Menisken zu gewährleis- ten und eine Vermischung von Luft oder Gas mit Flüssigkeit oder Suspension zu verhindern. In besonderer Ausgestaltung wird weiter eine abrupte Änderung des Querschnitts der Fluidikkanäle, das heißt besonders abrupte Übergänge, Ecken und Kanten, vermieden, um bei durch Strömung Kavitäten und Unterdruckbildung mit dem Risiko der Ausgasung der Flüssigkeit oder Suspension zu verhindern. Dadurch kann die Schaumbildung im System verhindert werden.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur automati- sehen Passage von Zellen oder Geweben in Suspension aus einem ersten Kulturgefäß in ein oder mehrere weitere Kulturgefäße unter Verwendung der hierin beschriebenen erfindungsgemäßen Zellpassagevorrichtung. Das Verfahren weist erfindungsgemäß zumindest folgende Schritte auf: In einem ersten Schritt wird die Entnahmeein- heit, enthaltend mindestens ein Steigrohr und mindestens ein Druckrohr in das erste Kulturgefäß eingeführt und das Kulturgefäß, vorzugsweise über die Entnahmeeinheit, druckdicht verschlossen. In einem weiteren Schritt wird das Innere des Kulturgefäßes das Druckrohr mit Druck beaufschlagt, wodurch in dem Kulturgefäß befindliche Flüssigkeit oder Suspension über das mindestens eine Steigrohr, dem Druckgefälle folgend, abgeführt wird.

In einer besonderen Ausgestaltung zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren weiter dadurch aus, dass die über das Steigrohr abgeführte Flüssigkeit oder Suspension über einer mit dem Steigrohr in Verbindung stehenden Dosiereinheit in mindestens ein weiteres Kulturgefäß überführt wird.

Bevorzugt stellt die Druckbeaufschlagung des Kulturgefäßes über das Druckrohr die einzige treibende Kraft zum Abführen der Flüssigkeit oder Suspension aus dem Kulturgefäß, und bevorzugt zum Überführen der Flüssigkeit oder Suspension, über die Dosiereinheit in mindestens ein weiteres Kulturgefäß dar. Das Verfahren sieht weiter bevorzugt vor, dass zum Überführen der Flüssigkeit oder Sus- pension aus dem ersten Kulturgefäß in das mindestens eine weitere Kulturgefäß eine, zumindest temporäre, Fluidverbindung zwischen dem Steigrohr und der Dosiereinheit hergestellt wird. Bevorzugt wird diese Fluidverbindung während der automatischen Passage von der Flüssigkeit oder Suspension stets in derselben Flussrichtung durchflössen.

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Figuren und konkreten Ausführungsbeispiele näher beschrieben, ohne dass diese beschränkend zu verstehen sind. Figur 1 zeigt eine Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Entnahmeeinheit (1 10) mit einem Steigrohr (1 12) zur Aufnahme der Suspension oder einer anderen Flüssigkeit und einem Druckrohr (1 14) zur Druckbeaufschlagung, die in ein Kulturgefäß (200) eingeführt sind. In der dargestellten Ausgestaltung sind Steigrohr (1 12) und Druckrohr (114) als integrale Doppelnadel ausgebildet, die im Bereich des Sep- tums (202) des ersten Kulturgefäßes (200) eingestochen wird. Das Kulturgefäß (200) wird so gegenüber der Umgebung druckdicht verschlossen.

Figur 2 zeigt den Gesamtaufbau einer besonderen Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Zellpassagevorrichtung (100) mit Entnahmeeinheit (110), Dosiereinheit (120), Flüssigkeitsreservoirs (131 , 132, 133, 134) und Druckvorlage (140). Das Reservoir (131) enthält bevorzugt Pufferlösung, das Reservoir (132) enthält bevorzugt Enzymlösung, das Reservoir (133) enthält bevorzugt Nährmedium, das Reservoir (134) enthält bevorzugt Reinigungsflüssigkeit. Die Dosiereinheit (120) weist eine Einzelnadel (122) auf, die in die weiteren Kulturgefäße (210) selektiv verbracht werden kann, um dort die Sus- pension oder Flüssigkeit zu dosieren. Die Ventile (154) und die Flu- idverbindungen zwischen den Ventilen und den vorgenannten Elementen sind in einem integralen Fluidikblock (150) angeordnet (in der schematischen Darstellung nicht dargestellt). In der dargestellten Ausführung sind die Ventile elektromagnetisch aktuiert. Die Steuerung erfolgt über einen zentralen Rechner mittels Hardware/Software implementierten Programms. Optional sind Abfallgefäß (160) und Druckpumpe (170) mit Druckminderer (172) vorgesehen.

Beispiel: Automatisierte Passage Es wird das erste Kulturgefäß (200), welches die zu passagierenden Zellen oder Gewebe enthält, bereitgestellt. Es wird die Entnahmeeinheit (110) mit Steigrohr (112) und Druckrohr (114) in das Kulturgefäß (200) eingeführt, wobei das Steigrohr (112) unterhalb des Flüssigkeitsspiegels, möglichst nahe des Bodens des Kulturgefäßes (200) positioniert wird. Das Druckrohr (114) befindet sich dabei im Kulturgefäß oberhalb des Flüssigkeitsspiegels. Durch Schaltung mindestens eines Ventils (154) im Fluidikblock (150) wird die Druckvorlage (140) mit dem Druckrohr (114) verbunden, um das Innere des Kulturgefäßes (200) mit Überdruck zu beaufschlagen. In Folge des Überdrucks weicht die sich im Kulturgefäß (200) befindliche Flüssigkeit über das Steigrohr (112) aus und wird so aus dem Kulturgefäß (200) in Richtung Fluidikblock (150) befördert. In diesem initialen Flüssigkeitstransferschritt wird Nährmediumüberstand aus dem Kulturgefäß (200) abgenommen. Über den Fluidikblock (150) wird das aus dem Kulturgefäß (200) abgeführte Nährmedium aus dem System entfernt. Bevorzugt wird dabei das Steigrohr (112) über den Fluidikblock (150) mit einem optionalen Abfallgefäß (160) in Verbindung gebracht und über die Druckbeaufschlagung des Kultur- gefäßes (200) das Nährmedium aus dem Kulturgefäß (200) über das Steigrohr (112) und dem Fluidikblock (150) in das optionale Abfallgefäß (160) geführt.

In einem weiteren Schritt wird zum Waschen der in dem Kulturgefäß (200) verbleibenden Zellen oder Gewebe Pufferlösung zugegeben. Dazu wird das Flüssigkeitsreservoir mit Pufferlösung (131) durch Schalten mindestens eines Ventils innerhalb des Fluidikblocks (150) mit der Druckvorlage (140) in Verbindung gebracht, um Pufferlösung aus dem Reservoir (131) zu dosieren. Bevorzugt durch Schalten mindestens eines weiteren Ventils innerhalb des Fluidikblocks (150) wird die aus dem Reservoir (131) dosierte Pufferlösung über das Steigrohr (112) oder optional über ein weiteres Zuführungsrohr der Entnahmeeinheit (113, nicht dargestellt) in das Kulturgefäß dosiert. Anschließend wird die zudosierte Pufferlösung durch Druckbeauf- schlagung des Kulturgefäßes (200) über das Druckrohr (114) über das Steigrohr (112) wie vorbeschrieben abgenommen und bevorzugt in das optionale Abfallgefäß (160) überführt. Der Vorgang des Waschens wird gegebenenfalls einmal oder mehrfach wiederholt.

Entsprechend der vorbeschriebenen Zugabe der Pufferlösung aus Reservoir (131) wird zum Ablösen adhärenter Zellen zur Vorbereitung der Suspendierung anschließend Enzymlösung aus Reservoir (132) durch Betätigung der entsprechenden Ventile im Fluidikblock (150) über Steigrohr (112) oder optional über das zusätzliche Zuführungsrohr (113) in das Kulturgefäß (200) geführt und die Zellen im Kulturgefäß (200) mit Enzymlösung zu inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit und gegebenenfalls durch Unterstützung des Ablösevorgangs durch mechanische Vibrationen (Ultraschall etc.) wird durch Zugeben einer die Enzymaktivität hemmenden Lösung (analog zur vorbeschriebenen Zugabe einer Pufferlösung) abgestoppt. Dazu wird insbesondere Nährmedium aus Reservoir (133) in vorbeschriebener Weise durch Betätigung mindestens eines entsprechenden Ventils im Fluidikblock (150) über Steigrohr (112) oder optionales zusätzliches Zuführungsrohr (113) in das Kulturgefäß (200) dosiert. Die abgelösten Zellen werden in dem zudosierten Nährmedium suspendiert (resuspendiert). Gegebenenfalls wird die Bildung einer weitgehend homogenen Suspension durch zusätzliche mechanische Maßnahmen (Ultraschall etc.) im Kulturgefäß (200) unterstützt. Analog zu den vorbeschriebenen Schritten wird nun durch Druckbeaufschlagung des Kulturgefäßes (200) über das Druckrohr (114) die gewonnene Suspension über das Steigrohr (112) in den Fluidikblock (150) und über den Fluidikblock (150) letztlich in die Dosiereinheit (120) geführt. Vorzugsweise wird durch gezielte Steuerung der Öff- nungszeiten der Ventile eine Dosierung der Suspension an der Dosiereinheit (120) und damit die Aliquotierung der Suspension auf mehrere Kulturgefäße (210) ermöglicht.

In einem optionalen weiteren Schritt wird nach erfolgter Passage die Vorrichtung durch Durchspülen mit Reinigungsflüssigkeit aus Reser- voir (134) durchspült und gereinigt, um Querkontamination zwischen einzelnen Passagen zu vermeiden.