細胞パターン回収ツール
 本発明による細胞パターン回収ツールは、� ��記したように、基本的に、
 表面が易接着処理された基材層と、
 前記基材層上に形成された、表面がシラン� ��理された温度応答性ポリマー層と、
 前記温度応答性ポリマー層上に形成された� ��細胞接着阻害材料層と
から構成されてなる。すなわち、本発明によ る細胞パターン回収ツールは、前記した基材 層と、温度応答性ポリマー層と、細胞接着阻 害材料層とを少なくとも含んでなるものあり 、必要に応じて、例えば、粘着層を介して、 基材層を底面部に形成してなるポリスチレン ディシュなどの任意構造をさらに含んでいて もよいことを意味する。
 図1は、本発明による細胞パターン回収ツー ルの概念図である。
 ここで細胞パターン回収ツールとは、その� ��ール上にて細胞を培養でき、かつ、再生医� ��などの現場で使用可能な細胞パターン(細胞 シート)を所望の形状に培養して、迅速に回� �可能な細胞培養用の支持体(または、細胞培� ��用の基材もしくはデバイス)を意味する。

基材層
 ここで、「表面が易接着処理された基材層� ��における「基材層」の基材としては、その� ��面を後述する易接着処理できるものであれ� ��、いずれの材料によるものであってもよく� ��えば、ポリエチレンテレフタレート(PET)、� �リスチレン(PS)、ポリカーボネート(PC)、TAC(� �リアセチルセルロース)、ポリイミド(PI)、ナ イロン(Ny)、低密度ポリエチレン(LDPE)、中密� �ポリエチレン(MDPE)、塩化ビニル、塩化ビニ� �デン、ポリフェニレンサルファイド、ポリ� �ーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレ� �ト、ポリプロピレン、アクリル等が挙げら� �る。ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカ� �ロラクタン、もしくはその共重合体のよう� �生分解性ポリマーであってもよい。好まし� �は、ポリエチレンテレフタレート、ポリス� �レン、ポリカーボネートであり、より好ま� �くは、ポリエチレンテレフタレートである� �この内特に、ポリエチレンテレフタレート� �、透明性、寸法安定性、機械的性質、電気� �性質、耐薬品性等の性質に優れているため� �細胞パターン回収ツールの材料として好適� �ある。

 「表面が易接着処理された基材層」にお� ��て、基材の「表面が易接着処理された」と� ��、例えば、ポリエステル、アクリル酸エス� ��ル、ポリウレタン、ポリエチレンイミン、� ��ランカップリング剤、ペルフルオロオクタ� ��スルホン酸(PFOS)等の易接着剤により、基材� ��表面に易接着層が設けられたものを挙げる� ��とが出来る。この内、好ましい易接着剤と� ��ては、ポリエステル、アクリル酸エステル� ��ポリウレタン等が挙げられる。基材表面を� ��接着処理することによって、それを覆う温� ��応答性ポリマー層の接着を容易にできる。

 基材の「表面が易接着処理」について、� ��材がポリエチレンテレフタレートの場合を� ��体例として挙げ、説明すると、ポリエチレ� ��テレフタレートフィルムに易接着性を付与� ��るには、易接着性付与塗料をインラインコ� ��ト方式またはオフラインコート方式にて塗� ��することができる。易接着性付与塗料とし� ��は、前記易接着剤と架橋剤成分のメラミン� ��樹脂等を組み合わせたものが例示できる。� ��ンラインコート方式とは、フィルムの成膜� ��程のなかで塗布する方式であり、オフライ� ��コート方式とは、成膜にて得られた二軸延� ��ポリエチレンテレフタレートフィルムをコ� ��ターにかけ、塗料を塗布・乾燥する方式で� ��る。塗料の塗布方式としては、ロールコー� ��法、グラビアコート法、マイクログラビア� ��ート法、リバースコート法、リバースグラ� ��アコート法、バーコート法、ロールブラッ� ��ュ法、エアーナイフコート法、カーテンコ� ��ト法、ダイコート法などの任意の塗布方式� ��適宜、単独または組み合わせて適用するこ� ��ができる。

 ここで、表面が易接着処理された基材層� ��厚さは、特に制限は無いが、例えば、10~500� �m、好ましくは、50~200μmである。

 なお、表面が易接着処理された基材層は� ��必要であれば市販品を使用してもよい。

温度応答性ポリマー層
 本発明において、「表面がシラン処理され� ��温度応答性ポリマー層」は、前記したよう� ��、前記基材層上、特に易接着処理された基� ��層表面に形成されてなる。

 「温度応答性ポリマー層」において使用可� ��な温度応答性ポリマーは、細胞培養温度下( 通常、37℃程度)において疎水性を示し、培養 した細胞シートの回収時の温度下において親 水性を示し得るものである。
 ここで、温度応答性ポリマーが、疎水性か� ��親水性に変化する温度(水に対する臨界溶解 温度(T))は、特に限定されないが、培養後の� �胞シートの回収の容易さの観点からは、細� �培養温度よりも低い温度であることが好ま� �い。このような温度応答性ポリマー成分を� �むことで、細胞培養時においては、細胞の� �場(細胞接着面)が充分に確保されるため、細 胞培養を効率よく行うことができる一方、培 養後の細胞シートの回収時においては、疎水 性部分を親水性に変化させ、培養された細胞 シートを細胞培養基材から分離させることで 、細胞シートの回収をより一層容易にするこ とができる。特に所定の臨界溶解温度未満の 温度で親水性を示し、同温度以上の温度で疎 水性を示す温度応答性ポリマーが好ましい。 このような温度応答性ポリマーにおける臨界 溶解温度を特に下限臨界溶解温度と呼ぶ。

 本発明において好適に使用できる温度応� ��性ポリマーは、具体的には下限臨界溶解温� ��Tが0~80℃、好ましくは0~50℃、より好ましく� ��室温程度であるポリマーが好ましい。Tが80� ��を越えると細胞が死滅する可能性があるの� ��好ましくない。またTが0℃より低いと、一� �に細胞増殖速度が極度に低下するか、また� �細胞が死滅してしまうため好ましくない。� �お、例えば、Tが室温程度であると、細胞培� ��温度(通常、37℃程度)からTまで温度を下げ� �には、培養用のインキュベーターから培養� �ているツールをインキュベーター外に出す� �けで、温度Tを達成できるため、操作性をよ� ��向上させることができる。

 このような好適なポリマーとしてはアク� ��ル系ポリマー又はメタクリル系ポリマーが� ��げられる。好適なポリマーは例えば特許文� ��1にも記載されている。具体的に適当なポリ マーとしては、例えば、ポリ−N−イソプロ� �ルアクリルアミド(T=32℃)、ポリ−N−n−プロ ピルアクリルアミド(T=21℃)、ポリ−N−n−プ� ��ピルメタクリルアミド(T=32℃)、ポリ−N−エ トキシエチルアクリルアミド(T=約35℃)、ポリ −N−テトラヒドロフルフリルアクリルアミ� �(T=約28℃)、ポリ−N−テトラヒドロフルフリ� ��メタクリルアミド(T=約35℃)、及び、ポリ−N ,N−ジエチルアクリルアミド(T=32℃)等が挙げ� ��れる。その他のポリマーとしては、例えば� ��ポリ−N−エチルアクリルアミド、ポリ−N� �イソプロピルメタクリルアミド、ポリ−N−� ��クロプロピルアクリルアミド、ポリ−N−シ クロプロピルメタクリルアミド、ポリ−N−� �クリロイルピロリジン、ポリ−N−アクリロ� ��ルピペリジン、ポリメチルビニルエーテル� ��メチルセルロース、エチルセルロース、ヒ� ��ロキシプロピルセルロース等のアルキル置� ��セルロース誘導体や、ポリポリプロピレン� ��キサイドとポリエチレンオキサイドとのブ� ��ック共重合体等に代表されるポリアルキレ� ��オキサイドブロック共重合体や、ポリアル� ��レシオキサイドブロック共重合体が挙げら� ��る。

 本発明の好ましい態様においては、該ポ� ��マーとしては、ポリ−N−イソプロピルアク リルアミド(PIPAAm)、ポリ—N−n—プロピルメ� �クリルアミド、ポリ—N,N−ジエチルアクリ� �アミド、より好ましくは、ポリ−N−イソプ� ��ピルアクリルアミドが挙げられる。

 これらのポリマーを形成するためのモノ� ��ーとしては、例えばモノマーの単独重合体� ��T=0~80℃を有するようなモノマーであって、� ��射線照射(好ましくは電子線照射)によって� �合し得るモノマーが挙げられる。モノマー� �しては例えば、(メタ)アクリルアミド化合物 、N−(若しくはN,N−ジ)アルキル置換(メタ)ア� ��リルアミド誘導体、環状基を有する(メタ)� �クリルアミド誘導体、及びビニルエーテル� �導体等が挙げられ、これらの1種以上を使用� ��てよい。モノマーが一種類単独で使用され� ��場合、基材上に形成されるポリマーはホモ� ��リマーとなり、モノマーが複数種一緒に使� ��された場合、基材上に形成されるポリマー� ��コポリマーとなるが、どちらの形態も本発� ��に包含される。また、増殖細胞の種類によ� ��て「T」を調節する必要がある場合や、被覆 物質と細胞培養支持体との相互作用を高める 必要が生じた場合や、細胞支持体の親水/疎� �性のバランスを調整する必要がある場合な� �には、上記以外の他のモノマー類を更に加� �て共重合してよい。更に本発明に使用する� �記ポリマーとその他のポリマーとのグラフ� �またはブロック共重合体、あるいは本発明� �ポリマーと他のポリマーとの混合物を用い� �もよい。また、ポリマー本来の性質が損な� �れない範囲で架橋してもよい。

 本発明の好ましい態様においては、該モ� ��マーとしては、N−イソプロピルアクリルア ミド、N−n−プロピルメタクリルアミド、N,N� ��ジエチルアクリルアミド、より好ましくは� ��N−イソプロピルアクリルアミドが挙げられ る。

 本発明において、温度応答性ポリマー層の� ��成は下記のようにして行うことが出来る。
 すなわち、前記モノマーと、該モノマーを� ��解しうる有機溶媒と含む塗布用組成物を調� ��し、これを慣用の塗布方法に従って塗布す� ��ことにより形成することができる。ここで� ��慣用の塗布方法としては、小面積の基材層� ��の塗布方法としては、例えば、スピンコー� ��ー、バーコーター等による塗布法、噴霧塗� ��法等が挙げられ、また大面積の基材層への� ��布方法としては、例えば、ブレードコーテ� ��ング法、グラビアコーティング法、ロッド� ��ーティング法、ナイフコーディング法、リ� ��ースロールコーティング法、オフセットグ� ��ビアコーティング法等が使用できる。

 前記したモノマーを溶解しうる有機溶媒� ��しては、モノマーを溶解しうるものであれ� ��特に制限はないが、常庄下に於いて沸点120� ��以下、特に60~110℃のものが好ましい。好ま� ��い溶媒としては、具体的にはメタノール、� ��タノール、n−プロパノール、2−プロパノ� �ル、n−ブタノール、2−ブタノール、及び水 等が挙げられ、これらは組み合わせて使用し ても良い。その他の溶媒、例えば1−ペンタ� �ール、2−エチル−1−ブタノール、2−ブト� �シエタノール、及びエチレン(若しくはジエ� ��レン)グリコール又はそのモノエチルエーテ ル、等も使用可能である。必要であれば、上 記溶液にはその他添加剤として、硫酸等で代 表される酸類、モール塩等を配合してよい。

 本発明のより好ましい態様によれば、モ� ��マーを溶解しうる有機溶媒としては、2−プ ロパノールである。また、塗布用組成物中の モノマーの含有量は5~70重量%であることが好� ��しい。

 塗布用組成物の塗布による塗膜形成後、� ��こに電子線を照射することによって、重合� ��応によるポリマー形性と、基材表面とポリ� ��ーとの間のグラフト化反応を起こさせ、必� ��により塗膜を乾燥させて、前記有機溶媒を� ��去する。

 このようにして形成された温度応答性ポ� ��マー層を、必要時応じてさらに洗浄しても� ��い。基材表面上に共有結合により固定化さ� ��たポリマー分子だけでなく、固定化されて� ��ない遊離のポリマー分子や、未反応のモノ� ��ー等が存在していると考えられ、洗浄によ� ��、これら遊離ポリマーや未反応物を除去す� ��ことができるので好ましい。また後述する� ��ラン処理の実効性を高める上でも有利であ� ��。ここで、洗浄方法は特に限定されないが� ��典型的には浸漬洗浄、遥動洗浄、シャワー� ��洗浄、スプレー洗浄、超音波洗浄等が挙げ� ��れる。また洗浄液としては典型的には各種� ��系、アルコール系、炭化水素系、塩素系、� ��・アルカリ洗浄液が挙げられる。

 本発明において、温度応答性ポリマー層の� ��覆量は、グラフトされたポリマーが温度応� ��性を発揮する必要な塗布量であればよく、� ��えば、5~80μg/cm ² であり、10~50μg/cm ² であることが好ましい。ポリマー被覆量が50� �g/cm ² を超過すると細胞接着性が低下してしまうと いう問題があり、逆に被覆量が5μg/cm ² 未満だと細胞剥離性が低下する。

 本発明においては、このようにして形成� ��れた温度応答性ポリマー層は、慣用のシラ� ��カップリング剤、例えば、メタクリロキシ� ��ラン、ビニルシラン、アミノシラン、エポ� ��シシラン等を用いて、表面をシラン処理す� ��。好ましくは、ここで使用するシランカッ� ��リング剤としては、メタクリロキシシラン� ��ある。表面にシラン処理を施さないと、温� ��応答性ポリマー層と、細胞接着阻害材料層� ��の結合が十分でなく、温度応答性ポリマー� ��上に細胞接着阻害材料層を細胞パターン上� ��形成させることが十分にできなくなる場合� ��ある。これに対し、表面をシラン処理する� ��とで、温度応答性ポリマー層と、細胞接着� ��害材料層との間の結合を確実にし、細胞接� ��阻害材料層による所望の細胞パターンの形� ��を確実にすることができる。

 ここで、シラン処理は、シランカップリ� ��グ剤を溶解しうる有機溶媒を使用して溶解� ��せ、これを慣用の塗布方法、例えば、スピ� ��ナー法、ダイコート法、浸漬法、グラビア� ��刷法、CVD(化学蒸着法)等により形成された� �度応答性ポリマー層を塗布することにより� �うことができる。例えば、スピンナー法で� �う場合、条件は、700~2000rpmで、3~20秒程度と� �ることができる。

 またここで、シランカップリング剤を溶� ��しうる有機溶媒としては、例えば、イソプ� ��ピルアルコール(IPA)、エタノール、1,3−ブ� �ンジオール、n−ブタノール、ペンタン、ク� ��ロベンゼン、メチルアルコール、n−プロピ ルアルコール、イソペンチルアルコール、ベ ンジルアルコール、フェノール、ジエチルエ ーテル、1,4−ジオキサン、エチレングリコー ルジメチルエーテル、ジエチレングリコール ジメチルエーテル、アセトニトリル、プロピ オニトリル、酢酸メチル、酢酸エチル、塩化 メチレン、1,2−ジクロロエタン、ニトロエタ ン、ニトロメタン、ニトロベンゼン、アニリ ン、ピリジン、モルホリン、キノリン、ジメ チルスルホキシド、N,N−ジメチルホルムアミ ド、N,N−ジメチルアセタミドおよび水等が挙 げられ、これらは組み合わせて使用しても良 い。好ましくは、該有機溶媒は、イソプロピ ルアルコールである。

 なお、表面をシラン処理した温度応答性� ��リマー層において、シラン処理層は温度応� ��性ポリマーと一体もしくは、区別不能な状� ��となっており、別個独立したそれぞれの層� ��形成しているのではないと考えられる。こ� ��ため、本明細書においては、温度応答性ポ� ��マー層という場合には、シラン処理を施し� ��ものを含めて言う場合がある。なお、これ� ��は理論もしくは仮定であって、本発明を限� ��するものではない。

 このようなポリマー被覆量またはシラン� ��理被覆量は、例えばフーリエ変換赤外分光� ��全反射法(FT−IR−ATR法)、被覆部若しくは非� ��覆部の染色や蛍光物質の染色による分析、� ��に接触角測定等による表面分析、X線光電子 分光法測定(XPS)を単独または併用して求める� ��とが出来る。

 本発明の細胞パターン回収ツールにおい� ��、シラン処理された温度応答性ポリマー層� ��乾燥時の厚さは、0.001~10μmであることが好� �しく、より好ましくは0.01~0.03μmである。

細胞接着阻害材料層
 本発明において、「細胞接着阻害材料層」� ��、前記したように、シラン処理された温度� ��答性ポリマー層上に形成されてなる。

 ここで、細胞接着阻害材料としては、細� ��と接着することを阻害する細胞接着阻害性� ��有するものであって、そのモノマーを、光� ��合開始剤と共に使用して、光重合反応に付� ��ことよって、光(例えば、紫外光)照射部分� �ついて光重合反応を起こし、細胞接着阻害� �料層を形成できるものであれば、特に制限� �ない。このような細胞接着阻害材料として� �、例えば、エチレングリコール系樹脂、具� �的には、ポリエチレングルコールジアクリ� �ート、ポリエチレングルコールメタクリレ� �ト、リン脂質ポリマー、長鎖アルキル系材� �、フッ素系材料などの撥水性材料、ポリビ� �ルアルコール(PVA)などの親水性材料等が挙げ られる。

 ここで使用可能な光重合開始剤としては� ��例えば、2−ヒドロキシ−4’−(2−ヒドロオ キシエトキシ)−2−メチルプロピオフェノン� ��カンフォキノン、1−ヒドロキシシクロヘキ シルフェニルケトン、2,2−ジエトキシアセト フェノン、2−クロロベンゾフェノン、2−エ� ��ルアントラキノン、4,4’−ビス(ジエチルア ミノ)ベンゾフェノン、9−フルオレノン、ベ� ��ジル、ベンゾリン、ジフェニルヨードニウ� ��ヘキサフルオロフォスフェート、N−メチル −9−アクリドン、トリブロモメチルフェニ� �スルホン等が挙げられる。

 本発明において、細胞接着阻害材料層の� ��成は下記のようにして行うことが出来る。� ��なわち、前記細胞接着阻害材料と、光重合� ��始剤と、これらを溶解しうる溶媒と含む溶� ��を調製し、これを慣用の塗布方法に従って� ��布した後、必要に応じて所望の細胞パター� ��形状をなすようにマスキングし、これを光( 紫外線)をマスク照射して、光重合反応を起� �させる。次いで、表面を水等を用いて洗浄� �て、重合反応に関与しなかった領域を洗い� �し、これによって、所望の細胞パターン状� �細胞接着阻害材料層を形成させることがで� �る。あるいは、前記細胞接着阻害材料と、� �重合開始剤と、これらを溶解しうる溶媒と� �含む溶液をインクジェット方式、オフセッ� �印刷方式、グラビア印刷方式、フレキソ印� �方式、グラビアオフセット印刷方式、スク� �ーン印刷方式などで所定のパターンを形成� �、全面光(紫外線または光重合開始剤の吸収� ��長)を照射する方法が考えられる。

 本発明においては、照射する光としては、� ��外光、例えば、波長150~600nm、照度1~100mW/cm ² が使用することができるが、紫外光が好まし い。

 すなわち、本発明の好ましい態様によれ� ��、細胞接着阻害材料層において、温度応答� ��ポリマー層が露出されてなる領域と、温度� ��答性ポリマー層が細胞接着阻害材料に覆わ� ��てなる領域とが交互に配置されることによ� ��て、目的とする細胞パターンが形成されて� ��る。すなわち、細胞接着阻害材料層におい� ��、かかる領域の交互の配置によって、目的� ��する細胞パターン(細胞シート)を形成可能� �所望の形状が形成されてなる。より好まし� �は、このとき、温度応答性ポリマー層が露� �されてなる領域を挟んで存在する、細胞接� �阻害材料に覆われてなる領域同士の間の幅� �、1μm~500μm、さらに好ましくは、2~200μmであ� ��。

 本発明の細胞パターン回収ツールにおい� ��、細胞接着阻害材料層の乾燥時の厚さは、0 .01~15μmであることが好ましく、より好ましく は、0.05~1.5μmである。

他の層または構造
 本発明において、基材層の形状としては、� ��ィッシュ形状や、フィルム形状などが挙げ� ��れる。フィルム形状基材を用いる場合、フ� ��ルム形状基材表面にグラフトされる温度応� ��性ポリマー層を形成した後、細胞培養に適� ��た形状(例えばディッシュ形状)に加工する� �とができる。加工の際は、必要に応じて他� �材料からなる部材を前記基材と組み合わせ� �使用することもできる。例えば、基材層の� �面と粘着層を介して、ポリスチレンディシ� �、シャーレの底面に形成し、それらを含め� �、本発明による細胞パターン回収ツールと� �て使用することもできる。

細胞パターン回収ツールの製造方 法
 本発明の別の態様によれば、前記したよう� ��、本発明の細胞パターン回収ツールの製造� ��法であって、
 表面が易接着処理された基材層上に、温度� ��答性ポリマー層を形成した後、温度応答性� ��リマーの層の表面をシラン処理し、その上� ��光重合反応を利用して、細胞接着阻害材料� ��を、目的とする細胞パターンを形成しうる� ��状として、形成させることを含んでなる方� ��が提供される。
 なお図2は、本発明による細胞パターン回収 ツールの製造方法を、具体例を挙げて示した 概念図である。

細胞パターンの作製方法
 また本発明による細胞パターンの作製方法� ��、前記したいように、
 本発明による細胞パターン回収ツール上に� ��細胞を播種して、培養に適した温度条件下� ��て細胞を培養した後、該ツールの温度を、� ��度応答性ポリマーが疎水性から親水性に変� ��する臨界溶解温度またはそれより低い温度� ��変化させて、細胞を該ツールから剥離させ� ��ことによって、目的とする細胞パターン(す なわち、所望の形状の細胞シート)を迅速に� �収することを含んでなる。

 本発明の細胞パターン回収ツールを用い� ��、種々の細胞、例えば生体内の各組織、臓� ��を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を� ��す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神� ��系を構成するニューロン、グリア細胞、繊� ��芽細胞、生体の代謝に関係する肝実質細胞� ��非肝実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する� ��胞として、種々組織に存在する幹細胞、さ� ��には骨髄細胞、ES細胞等から細胞パターン� �作製することができる。こうして作製され� �細胞パターンは、所望する特定の形状を有� �、かつ、表面の接着因子が損なわれていな� �ことに加えて、細胞培養面に接した部分が� �一な品質を有することから、再生医療など� �の利用に適したものである。また、細胞パ� �ーンを利用することでバイオセンサー等の� �出デバイスへの応用へも展開できる。

 なお本明細書において、「約」および「� ��度」を用いた値の表現は、その値を設定す� ��ことによる目的を達成する上で、当業者で� ��れば許容することができる値の変動を含む� ��味である。