Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Genexpression und die Herstellung von Proteinen unter Verwendung von transformierten Wirtszellen und rekombinanten DNA-Vektoren. Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Expression von Zielproteinen, dadurch gekennzeichnet, dass Faltungshelferproteine, welche auch als Chaperone bezeichnet werden, coexprimiert werden. Die coexprimierten Chaperone werden dabei aus einer Liste von einzelnen Faltungshelferproteinen ausgewählt und eine Vielzahl von Kombinationen aus zwei, drei oder mehreren Proteinen gebildet (Chaperon-Toolbox), die eine Expression gruppierter Chaperone-Gene mit heterologen Genen für Zielproteine ermöglicht.

Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung von Plasmiden, die Polynucleotide, die für Faltungshelferproteine (Chaperone) codieren, umfassen, wobei das Plasmid zur Expression der Faltungshelferproteine (Chaperone) befähigt ist; und sie betrifft ein Verfahren, die Faltungshelferproteine-codierenden Polynucleotide auszuwählen und zwei, drei oder mehrere davon randomisiert zu kombinieren. Hintergrund der Erfindung

Mit der voranschreitenden Nutzung von Proteinen als Biokatalysatoren oder als Pharmaka und der stetig steigenden Anzahl an Sequenzdaten pro- und eukaryotischer Genome besteht ein zunehmendes Interesse an leistungsfähigen industriell nutzbaren Expressionssystemen. Da nur sehr wenige Wirtsstämme für die Expression zur Verfügung stehen, werden die meisten rekombinanten Proteine heterolog exprimiert, d. h. das zu exprimierende Zielprotein stammt nicht aus dem Organismus, der als Wirtsstamm für die Expression dient. Ein häufig auftretendes Problem bei der heterologen Produktion rekombinanter Proteine ist die Aggregation des Zielproteins (Bildung von sog. Inclusion bodies) im Cytoplasma des Wirtsstamms. Der Grund für die Aggregation sind inkorrekte inter- und intramolekulare Wechselwirkungen von Proteinketten des Zielproteins, wobei diese Aggregate in aller Regel biologisch bzw. biochemisch inaktiv sind. Die Ursachen sind zum Teil bekannt, beispielsweise kann das Gen des Zielproteins Tripletts von Polynucleotiden (Codons) enthalten, die für den Wirtsstamm nicht gut oder gar nicht genutzt werden können. Weitere Probleme können durch die fehlende Knüpfung von Disulfidbrücken entstehen oder durch eine zu hohe Expressionsrate des Zielproteins. Daher wurden unterschiedliche Strategien entwickelt, um die Bildung von Inclusion bodies zu reduzieren oder sogar zu verhindern. Dazu zählen beispielsweise das Herabsetzen der Inkubationstemperatur, die Reduktion der Expressionsrate durch Verwendung entsprechender Vektoren, die Wahl eines anderen Expressionswirtes, die Veränderung des Zielgens oder die Coexpression von Faltungshelferproteinen [1].

Faltungshelferproteine kommen in allen Zellen vor, sie sind für eine Reihe von Proteinen zur Ausbildung der richtigen Struktur notwendig. Speziell bei Zellstress ist die Gefahr des vermehrten Auftretens fehlgefalteter Proteine besonders groß, daher werden unter diesen Bedingungen eine Vielzahl sogenannter „Heat shock-Proteine (HSP)" als Faltungshelfer gebildet. In einigen Fällen sind die biochemischen Funktionen von Faltungshelferproteinen gut untersucht. So gibt es in Prokaryoten schon bei der Bildung der wachsenden Polypeptidkette am Ribosom eine Wechselwirkung mit dem Triggerfaktor Tf, danach wird die Faltung des Zielproteins von den Faltungshelferproteinen DnaK und DnaJ kontrolliert und in der Folge steht noch der Proteinkomplex aus GroEL und GroES bereit, den Faltungsprozess zu lenken (siehe z.B. Review [2]).

Führt man sich vor Augen, wie vielfältig die Wechselwirkungen neusynthetisierter Proteine mit Faltungshelfern bis zum Erreichen der endgültigen Struktur sind, ist es nicht überraschend, dass es bei der heterologen Überexpression von Proteinen in hohem Ausmaß zu fehlgefalteten Proteinen kommt, die dann als Proteinaggregate (Inclusion bodies) anfallen oder direkt degradiert werden. Zur Überwindung dieses Problems wurden daher die bekannten Systeme bzw. Komponenten an Chaperone ebenfalls mit exprimiert, um zu versuchen, Proteinaggregate zu vermeiden. In der Literatur sind Beispiele dafür beschrieben, dass sowohl die Coexpression von einzelnen Chaperonen wie dem Triggerfaktor Tf oder von DnaK als auch von Chaperonsystemen, die aus natürlicherweise ebenfalls zusammenwirkenden Proteinen bestehen, wie dem GroEL/GroES- (GroELS-) System oder DnaK gemeinsam mit DnaJ zu einer erhöhten Bildung von löslichem Zielprotein führen können [3]. Allerdings hat sich auch gezeigt, dass kein Faltungshelferprotein oder eine Kombinationen von solchen als generelle Lösung gegen Fehlfaltung angesehen werden kann [4].

Eine detaillierte Zusammenstellung, welche Proteine überhaupt Faltungshelfer-Funktion besitzen, zeigt, dass es verschiedene Gruppen solcher Proteine mit unterschiedlichen biochemischen Wirkungsmechanismen gibt, beispielsweise molekulare Chaperone. Dabei handelt es sich um eine Gruppe verwandter Proteine, die aufgrund ihrer Molekulargewichte in Klassen oder Familien unterteilt werden können (Heatshock-Proteine Hsp 60, Hsp 70, Hsp 90, Hsp 100 oder sHsp). Faltungshelfer-Funktion findet man auch bei den Peptidyl-Prolyl cis-trans Isomerasen, (PPIasen) [5] oder den Dsb-Proteinen (disulfide- bond Proteinen), die die Bildung von Disulfidbrücken katalysieren können [6].

Bislang ist aber nicht von allen Faltungshelfer-Proteinen bekannt, inwiefern sie tatsächlich eine Funktion als Faltungshelfer bei der Expression heterologer Gene ausüben. Neben solchen Proteinen, die eindeutig als Faltungshelfer bezeichnet werden können, wie der Triggerfaktor Tf, DnaK, DnaJ, GroEL oder auch GroES gibt es Proteine, von denen man nur auf Grund ihrer Sequenzmotive vermuten kann, dass sie für Faltungshelferproteine codieren (putative Faltungshelferproteine).

Versuche zur Coexpression von Faltungshelfer-Proteinen haben für das Zielprotein sehr unterschiedliche Ergebnisse gezeigt: Bei der Verwendung einzelner Faltungshelferproteine zeigt sich, dass es sowohl positive als auch negative als auch keine Einflüsse auf die Expression eines Zielproteins gibt. Ergebnisse, die mit einem Zielprotein gefunden wurden, lassen sich nicht auf andere Proteine übertragen. Dies trifft auch für die Kombination von mehreren Helferproteinen zu. Ein genereller und umfassender Ansatz zur Verbesserung der Expression heterologer Gene durch Coexpression von Faltungshelferproteinen ist daher bislang nicht verfügbar.

A u f g a b e der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur verbesserten Expression von einer Vielzahl unterschiedlicher Proteine, insbesondere mittels heterogener Expression von rekombinaten Proteinen bereitzustellen.

G e l ö s t wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur verbesserten Expression von rekombinanten Proteinen, wobei ein für ein rekombinantes Protein codierendes Expressionsplasmid in Kombination mit wenigstens zwei für unterschiedliche Chaperone codierenden Nukleotidsequenzen in einen Wirtsorganismus eingebracht wird und das rekombinante Protein und die Chaperone coexprimiert werden.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden verschiedene Gene, die für Faltungshelferproteine codieren, aus einer Vielzahl verfügbarer Gene derart miteinander kombiniert, dass einerseits verschiedene biochemische Prinzipien von Chaperonen miteinander kombiniert werden, andererseits die Anzahl der Kombinationen derart gering gehalten wird, dass im Rahmen einer Verfahrensentwicklung zur Produktion von Proteinen ein vertretbarer experimenteller Aufwand erforderlich ist.

In einer Ausgestaltung der Erfindung werden die wenigstens zwei für unterschiedliche Chaperone codierenden Nukleotidsequenzen permutierend aus einer Gruppe von für Chaperone eines oder unterschiedlicher Organismen codierenden Nukleotidsequenzen ausgewählt.

Ein wesentlicher Schritt zur Realisierung des Ziels, mehrere Gene und damit mehrere Faltungshelferproteine in eine Produktionszelle einzubringen, besteht in der Nutzung von Vektoren, die für Faltungshelferproteine codierende Gene tragen. Um mehrere dieser Gene in Produktionszellen einzubringen, können verschiedene Wegen beschriften werden, beispielsweise indem Zellen mit einem einzigen Vektor transformiert werden, der mehrere inserierte Gene trägt. Alternativ können aber auch Zellen mit mehreren Vektoren, die jeweils nur ein Gen oder eine geringere Zahl von Genen tragen, transformiert werden, so dass man durch die Kombination mehrerer Vektoren in der Folge zu den gewünschten Kombinationen an Faltungshelfern kommt. Dies kann beispielsweise durch Klonierung der Einzelchaperone in verschiedene, miteinander kompatible Vektorsysteme unter Kontrolle eines oder mehrerer geeigneter, induzierbarer Promotoren erreicht werden. Die Kompatibilität der Vektorsysteme bezüglich ihrer ORI (origin of replication) und entsprechender Selektionsmarkergene ist dabei entscheidend für die Kopienzahl der Plasmide pro Zelle und die damit verbundenen vergleichbaren Konzentrationen der entsprechenden Chaperone. Solche Plasmidbibliotheken können in einem einzigen Schritt transformiert werden, wodurch eine kombinatorische Zusammenstellung und Coexpression unterschiedlicher Chaperone gewährleistet wird.

Zur Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe wurde daher eine Genexpressionsbank („Chaperon-Toolbox") konstruiert, die in Wirtszellen eine randomisierte Expression einzelner oder gruppierter Faltungshelfergene mit heterologen Genen für Zielproteine ermöglicht. Wirtszellen können dabei pro- oder eukaryotische Zellen sein, also beispielsweise Hefen oder Pilze, Pflanzen- oder Säugetierzellen oder Zellen einer Zellkultur, speziell beispielsweise Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas sp., Saccharomyces sp., Pichia sp., Hansenula sp., Schizosaccharomyces pombe, Corynebacteriυm sp. oder Aspergillus sp.

Zur Konstruktion der Genexpressionsbank wurden folgende Teilschritte bearbeitet:

1. Aufgrund der unterschiedlichen Funktionen im Faltungsprozeß sollten möglichst viele verschiedene Faltungshelfer Bestandteil dieser Chaperon-Toolbox sein. Dazu sollten zunächst durch ein umfassendes „in silico"-Screening sämtliche Gene identifiziert werden, die für putative Faltungshelfer in einem Bakterium (in diesem Fall Pseudomonas aeruginosa) codieren.

2. Die identifizierten Gene, die für Faltungshelfer in diesem Organismus codieren, sollten aus dem Chromosom des Wildtyp-Stammes P. aeruginosa isoliert und in spezielle Klonierungsplasmide eingebracht werden.

3. Anschließend sollte eine Genexpressionsbank erzeugt werden. Darin sollten nicht nur eine Vielzahl einzelner Chaperone und Faltungskatalysatoren vorliegen, sondern vor allem randomisierte Kombinationen von drei Faltungshelfergenen auf je einem broad-host-range Expressionsplasmid der Expressionsbank verfügbar gemacht werden. Durch Coexpressionsversuche mit verschiedenen Zielproteinen aus Pro- und Eukaryoten sollte schließlich die Nützlichkeit dieser Genexpressionsbank untersucht werden. Dabei war das Ziel, die jeweiligen Faltungsmodulatoren oder Kombinationen dieser Proteine, die zu einer Verbesserung der Ausbeute löslichen, aktiven Zielproteins führen, zu identifizieren.

Fig. 1A bis 1C: Übersicht über die Klonierungsstrategie zur Erzeugung einer Chaperon-Genexpressionsbank. Die Abbildung ist in drei Punkte unterteilt. Unter A ist die Amplifikation und Klonierung der Faltungshelfergene dargestellt. B beschreibt die Konstruktion von Expressionsvektoren mit einzelnen Chaperone und C zeigt die Schritte zur Erzeugung von Λ//u#/s/te-Plasmiden, auf denen drei unterschiedliche Chaperon-Gene auf einem Vektor vorliegen. Nähere Beschreibungen der Abbildung erfolgen im Text. Die einzelnen Klonierungsschritte werden nachfolgend detailliert erläutert.

Fig. 2: Einfluß von P. aeruginosa Faltungshelfern auf die Aktivität der löslichen R. erythropolis ADH in E. coli. Der Nachweis der Enzymaktivität erfolgte durch Einsatz von 10 μl Protein der löslichen Proteinfraktion, die auf gleiche Zelldichten eingestellt war. Die Aktivität ist in U/ ml angegeben und die Standardabweichung aus drei voneinander unabhängigen Messungen durch Fehlerbalken dargestellt. Die Stämme sind durch die Angabe der /Wu/f/s/te-Plasmid-Nummer benannt (s. Tab. 6). Durch die Unterteilung in Ergebnisgruppen (K = Kontrolle, bzw. Gruppe I-Ill) werden Stämme zusammengefaßt, die vergleichbare ADH-Aktivitäten aufweisen (LV = Leervektor, d.h. ein Stamm mit RE-ADH- Vektor und dem Vektor, der in den übrigen Stämmen jeweils Gene für Faltungshelferproteine trägt, im Fall des LV-Stamms keine solche Gene trägt).

Fig. 3: Einfluß von einzelnen P. aeruginosa Faltungshelfern auf die Aktivität der R ruber ADH in E. coli. Nach Aufschluß und Fraktionierung der Proteinproben wurde jeweils die Aktivität im photometrischen Test gemessen. Die Aktivität ist in U/ml angegeben. Dargestellt sind Mittelwerte aus drei voneinander unabhängigen Messungen, Standardabweichungen sind durch Fehlerbalken angegeben. Die in den jeweiligen Stämmen enthaltenen Faltungshelfer sind angegeben. Durch die Unterteilung in Ergebnisgruppen (K = Kontrolle, bzw. Gruppe MV) werden Stämme zusammengefaßt, die vergleichbare ADH-Aktivitäten aufweisen. Fig. 4: Bestimmung der Esteraseaktivität der katalytisch aktiven EstAα-Domäne aus P. aeruginosa nach Coexpression mit verschiedenen Kombinationen von Faltungshelferproteinen. Die Aktivität der EstAα-Domäne der Esterase wurde in der löslichen Fraktion der unterschiedlichen Expressionsstämme bestimmt. Als Kontrolle diente der Stamm mit EstAα und Chaperon-Leervektor (LV). Die Werte der Aktivitäten sind Mittelwerte aus drei unabhängigen Messungen. Abhängig von der ermittelten Aktivität wurden die Stämme in Ergebnisgruppen unterteilt (K = Kontrolle; I-Ill). Die in den Expressionsstämmen enthaltenen Λ//u/f/s/te-Expressionsplasmide sind als Ziffern angegeben; die darin enthaltenen Chaperone sind in Tab. 6 aufgeführt.

Fig. 5: Einfluß der Coexpression von verschiedenen Faltungshelferkombinationen auf die Löslichkeit und Aktivität des LipA Proteins aus S. marcescens. Die Aktivität (A) des löslichen LipA-Proteins ist für alle untersuchten Stämme in nkat/OD (580 nm) angegeben. Die Werte stammen aus drei unabhängigen Messungen, anhand derer die Standardabweichungen berechnet und in Form von Fehlerbalken angegeben wurden. Als Kontrolle dienten der Stamm mit Lipase-Expressionsplasmid und Chaperon-Leervektor (LV) sowie der Stamm BL21(DE3) mit beiden Leervektoren (-). Die Nummer der Plasmide mit Kombinationen aus Chaperonen und Foldasen ist angegeben (s. Tabelle 6). In einer durchgeführten SDS-PAGE sind 10 μl von GZE-Proben aufgetragen. Deutlicher wird die Menge an LipA-Protein (60 kDa) in einem durchgeführten Zymogrammgel (Daten nicht gezeigt).

Durch Coexpression von Faltungshelfern zusammen mit dem Zielprotein LipA konnten deutliche Unterschiede zu dem Kontrollstamm BL21(DE3)-LV aufgezeigt werden. Ausschließlich durch zwei Kombinationen von Chaperonen und Faltungskatalysatoren, den Kombinationen 6 und 8 (s. Tab. 6), wurde die Aktivität der Lipase nicht beeinflußt (Fig. 5, A: Gruppe II). Bei einer Anzahl von acht Coexpressionsstämmen führte die Expression der jeweiligen Faltungsenzyme zu einer verringerten Produktion aktiven LipA-Proteins (Fig. 5; A: Gruppe I). Mit Hilfe von drei Kombinationen von Faltungshelfern aus P. aeruginosa konnte eine Verbesserung der Aktivität festgestellt werden. Bei den Expressionsstämmen, in denen die Plasmide pEXP-1 , pEXP-4 bzw. pEXP-41 vorlagen, konnte die Aktivität der Lipase LipA im photometrischen Enzymtest um 125 % gesteigert werden (Fig. 5; A: Gruppe III). Fig. 6: Bestimmung der lipolytischen Aktivität von CALB durch Umsatz des Substrates Tributyrin auf Agarplatten. Die erzeugten Expressionsstämme wurden auf Tributyrin-haltige Platten gepickt und über Nacht bei 30 ⁰ C inkubiert. Die Aktivität wird durch Bildung eines Hofes um die Kolonie herum detektiert. Die Ergebnisse konnten in zwei unabhängigen Anzuchten verifiziert werden. Im oberen Teil der Abbildung sind die Nummern der Chaperonkombinationen aufgeführt, die in den Stämmen vorlagen, die auf die Tributyrinplatten gepickt wurden (unterer Teil der Abbildung). Die in den Teststämmen enthaltenen Faltungsmodulatoren sind durch die Nummern der Expressionsplasmide angegebenes. Tab. 6).

Fig. 7: Nachweis der Aktivität löslichen CALB-Proteins nach einer Überexpression in Flüssigmedium. Die gemessene Aktivität ausgewählter Expressionsstämme ist in U/ ml angegeben. Die in den Stämmen vorliegenden Chaperonkombinationen sind durch die aufgeführten Zahlen unter dem Graphen genannt (s. Tab. 6). Die Daten sind Mittelwerte aus drei unabhängigen Messungen. Die Standardabweichung ist durch Fehlerbalken angezeigt. Je nach Verhältnis der Enzymaktivität der Teststämme zur Kontrolle (K) wurden sie in Ergebnisgruppen zusammengefaßt (I-Ill).

Fig. 8: Einfluß von P. aeruginosa Faltungshelfern auf die relative Fluoreszenz des Faltungsreporters GFP. Die relative Fluoreszenz des GFP wurde nach Anregung bei 475 nm pro 1 OD und ml Probe bei einer Emissionswellenlänge von 515 nm bestimmt. Die Standardabweichungen aus zwei voneinander unabhängigen Messungen sind durch Fehlerbalken angegeben. Die in den Teststämmen enthaltenen pEXP-Plasmide sind durch die Nummern angegeben (s. Tab. 6).

Fig. 9: Einfluß von P. aeruginosa Faltungshelfern auf die relative Fluoreszenz des Faltungsreporters GFP. Die relative Fluoreszenz des GFP wurde nach Anregung bei 475 nm pro o.D. 1 und ml Probe bei einer Emissionswellenlänge von 515 nm bestimmt. Die Standardabweichungen aus zwei voneinander unabhängigen Messungen sind durch Fehlerbalken angegeben. Die in den Teststämmen enthaltenen pEXP-Plasmide sind durch die Nummern angegeben (s. Tab. 6).

Fig. 10: Einfluß von Chaperonen und Faltungskatalysatoren aus P. aeruginosa auf die Stabilität des humanen IF2ctb-Proteins. Zur Bestimmung der Lokalisation und Menge des produzierten Zielproteins wurden Proteinproben aus dem Kulturüberstand (A) und aus GZE (B) in einem Western-Blot unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers detektiert. Als Kontrolle wurde Standardprotein (0,05 μg; S) bzw. der IFN2αb- Expressionsstamm mit Chaperon-Leervektor (K) aufgetragen. Die coexprimierten Chaperonkombinationen sind durch Nummern gekennzeichnet (s. Tab. 6).

Es wurde überraschend entdeckt, dass Kombinationen von zwei, drei oder mehreren Faltungshelferproteinen (Chaperonen) zu einer signifikant verbesserten Expression eines Zielproteins führen können, auch wenn es sich nicht um natürlicherweise vorkommende Kombinationen handelt. Kombinationen bedeutet in diesem Fall, dass mehrere auf willkürlichem kombinatorischem Wege erzeugte für Faltungshelfer codierende Gene, beispielsweise zwei oder drei, in einer Zelle gemeinsam mit dem Gen für ein Zielprotein coexprimiert werden und zusammenwirken. Das erfindungsgemäße Verfahren, die Konstrukte und Wirtszellen sind geeignet für die Produktion von Zielproteinen in Standard- Kultursystemen in kleinem Maßstab sowie für Produktionssysteme in großem Maßstab, einschließlich und nicht begrenzt auf Fermentationssysteme, Hohlfaserkultursysteme, Becher- und Kolbensysteme und Suspensionskultursysteme.

Die notwendigen molekularbiologischen Arbeitsmethoden sind dem Fachmann gut bekannt und in einer Vielzahl von Laborhandbüchern und Texten nachzulesen, also Protokolle und Verfahren für die Manipulation von Nukleinsäuren, PCR-Amplifikation von Nucleinsäuren, Konstruktion von Expressionsvektoren, die Transformation von Wirtszellen und die Vermehrung transformierter Zellen für die Produktion von Proteinen; siehe beispielsweise das Standard-Klonierungshandbuch von Sambrook [7].

Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

Beispiel 1 Identifizierung von Chaperonen (Faltungshelferproteinen) in Pseudomonas aeruginosa

Um für die Konstruktion einer Expressionsbank von Kombinationen verschiedenster Faltungshelferproteinen eine möglichst große Heterogenität solcher Proteine einsetzen zu können, sollten beispielhaft für die Vorgehensweise alle bekannten definierten und alle putativen Sequenzen eines Mikroorganismus isoliert und eingesetzt werden. Seit dem Jahr 2000 ist das 6,33 Mbp große Genom des Bakteriums P. aeruginosa vollständig sequenziert, die Sequenzdaten sind unter www.pseudomonas.com verfügbar [8]. Diese Datenbank umfaßt 5.570 annotierte Leserahmen (open reading frames) und wurde für die Sequenzanalyse von Faltungshelferproteinen zugrunde gelegt. Dabei wurde die Möglichkeit genutzt, in der Pseudomonas-Datenbank Funktionssuchen durchführen zu können. So wurde eine umfassende Datenbankanalyse zur Identifikation von Chaperonen, Hitzeschockproteinen, Peptidyl-Prolyl cis-trans Isomerasen (PPIasen) und Disulfidbrücken-bildende-Proteine (Dsb-Proteine) durchgeführt, wobei eine große Anzahl von Genen identifiziert wurden, deren Genprodukte hohe Sequenzübereinstimmungen zu bereits beschriebenen, bekannten Faltungshelfern aus anderen Bakterien aufweisen. Anschließend wurden Sequenzvergleiche mit der von der DNA-Sequenz abgeleiteten Aminosäuresequenz des jeweiligen P. aeruginosa Faltungshelfers durchgeführt, um die erhaltenen Ergebnisse zu verifizieren. Die auf diese Weise erhaltenen Gene sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Zusätzlich zu den molekularen Chaperonen, den Hitzeschockproteinen oder auch den PPIasen, die bereits in P. aeruginosa annotiert sind, konnten in im Rahmen dieser Erfindung weitere Leserahmen gefunden werden, die bisher lediglich als putative Faltungshelferproteine in der Pseudomonas-Datenbank geführt wurden. Nach einem Homologievergleich mit ihren ermittelten Aminosäuresequenzen konnte mit Hilfe einer Funktion, die die Suche nach Proteindomänen erlaubt, weiter untersucht werden, welche solcher Domänen, die für Chaperone und Hitzeschockproteine charakteristisch sind, diese putativen Proteine enthalten.

Auf diese Weise konnten sieben weitere Gene für molekulare Chaperone bzw. Hitzeschockproteine identifiziert werden, welche in die vorgesehene Chaperon- Coexpressionsbank aufgenommen wurden. Bei diesen Kandidaten sind unterschiedliche Proteingruppen der molekularen Chaperone vertreten. So besitzt das putative Protein PA1068 eine Hsp90-ATPase-Domäne [9], die auch im HtpG-Protein aus E. coli vorliegt. Zwei weitere orfs (PA2725 und PA3365) weisen eine AAA- (= ATPase associated with various cellular activities) Domäne in ihrer abgeleiteten Proteinsequenz auf [10, 11], die in verschiedenen Hitzeschockproteinen vorkommt. Für den Leserahmen PA3647 konnte gezeigt werden, daß dieser eine OmpH (outer membrane protein like)-ähnliche Domäne besitzt. Mit diesem Kandidaten konnte ein homologes Protein zu dem periplasmatischen Chaperon Skp aus E. coli identifiziert werden, das in diesem Organismus als einziges echtes periplasmatisches Chaperon beschrieben ist [12, 13]. Dort ist dieses Chaperon an der Reifung von Proteinen der äußeren Membran beteiligt [14]. Auch das putative Protein PA3842 weist eine Homologie von 56 % zu einem bereits in Y. pestis beschriebenen Chaperon auf [15]. Mit dem putativen Protein PA4873 konnte ein mögliches Chaperon identifiziert werden, das eine Hsp70-Domäne enthält [16], und eine Ähnlichkeit von 50 % zu dem DnaK-Protein aus R capsulatυs besitzt. Damit konnte neben dem in einem Operon codierten DnaK-Protein (orf PA4761 ) ein zweiter Vertreter der Hsp70-Familie in P. aeruginosa ermittelt werden. Schließlich konnte mit PA5195 ein putatives homologes Protein zu dem E. coli Protein YrfH identifiziert werden.

Ferner konnten fünf weitere Leserahmen in P. aeruginosa gefunden werden, die als Proteine der Peptidyl-Prolyl cis-trans Isomerasen (PPIasen) angesehen werden. In den meisten Fällen konnte eine PPIase-Domäne gefunden werden, die für den FKBP-Typ (FK506-binding protein) dieser Enzyme charakteristisch ist [17, 18]. Hierzu zählen die durch die orfs PA3262, PA3717, PA4558 und PA5254 codierten Proteine. Zwei weitere Gene konnten über die Möglichkeit, Proteindomänen zu identifizieren, gefunden werden, deren Genprodukte eine Rotamase-Domäne aufweisen [17]. Dies sind die orfs PA0699 und PA3871 , die beide Homologien zu bereits beschriebenen und charakterisierten Proteinen aus anderen Organismen aufweisen. Diese Gene für putative Chaperone sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Die für das Dsb-System notwendigen Proteine [19-21] konnten alle an Hand annotierter Sequenzen identifiziert werden.

Schließlich muß noch eine Enzymgruppe erwähnt werden, deren Mitglieder an der richtigen Faltung und Herstellung von Proteinen beteiligt sind, die zum Bewegungsapparat von P. aeruginosa gehören. Zu dieser Gruppe können vier Kandidaten gezählt werden. Hierbei handelt es sich um die Chaperone CupA2, CupA5 sowie CupB2 und CupB4. Auch für diese Gruppe konnte mit PA0499 zusätzlich ein Leserahmen identifiziert werden, dessen putatives Genprodukt eine für pili assembly chaperones charakteristische Domäne enthält [22]. Die entsprechenden Gene wurden ebenfalls in die Chaperon-Toolbox aufgenommen.

Insgesamt konnten somit 58 unterschiedliche Leserahmen identifiziert werden, deren DNA-Sequenzen im Anhang zu finden sind. Unter den identifizierten Leserahmen befinden sich 53 einzelne Faltungshelfergene sowie 5 Operons. Tabelle 1 : Annotierte Faltungshelferproteine in Pseudomonas aeruginosa. Die aufgeführten Gene wurden durch Sequenzvergleiche identifiziert. Sie gehören zur Gruppe der Heatschockproteine, Peptidyl-Prolyl cis-trans Isomerasen, und der Disulfidbrücken- bildenden (Dsb) Proteine, welche insgesamt als Chaperone bezeichnet werden. Bei diesen bereits annotierten Open-reading-frames (orf) ist der Genname mit angegeben. Außerdem sind die Größen der identifizierten Gene [bp] angegeben. Die Homologien gegenüber bekannten Proteinen [%] und der Ursprungsorganismus sind genannt.

Tabelle 2: Putative Chaperone in Pseudomonas aeruginosa. Über spezifische Domänen in der Proteinsequenz konnten weitere Gene identifiziert werden, die als Kandidaten für klassische Heatschockproteine und Peptidyl-Prolyl cis-trans Isomerasen (PPIasen) angesehen werden können. Neben der Nummer des orf ist die Größe des Gens [bp] angegeben. Die für die jeweiligen Faltungshelferproteine charakteristische Domäne ist ebenfalls angeführt.

Beispiel 2 Amplifikation der identifizierten Gene

Nach Identifikation der annotierten und putativen Chaperon-Gene in P. aeruginosa wurden diese aus dem Chromosom des Wildtyp Stammes PAO1 isoliert werden. Dazu wurden diese Gene mittels PCR amplifiziert. Die Oligonukleotide zur Amplifikation sämtlicher Gene wurden so gewählt, daß ein DNA-Fragment erzeugt werden konnte, welches ein Gen vom Start- bis zum Stop-Codon enthielt. Außerdem wurde an das 5'-Ende der Primer, die an den stromaufwärts gelegenen DNA-Bereich binden, eine Topoisomerase- Erkennungssequenz aus den vier Basen CACC angefügt, wodurch eine spätere Ein- Schritt-Klonierung mit dem TOPO-Klonierungskit der Firma Invitrogen (Karlsruhe) ermöglicht werden sollte.

Um die unterschiedlichen Gene und die entsprechenden Operons der Chaperonsysteme zu amplifizieren, wurden Polymerasekettenreationen durchgeführt. Dazu wurden für jedes notwendige PCR-Produkt mehrere parallele Reaktionen angesetzt, zudem wurden in verschiedenen Ansätzen unter anderem die Annealingtemperatur, die Elongationszeit oder die Zyklusanzahl variiert. Im Anschluß an die durchgeführten Reaktionen wurde für jedes PCR-Produkt und jede Reaktionsbedingung ein Aliquot von 5 μl des Reaktionsansatzes auf ein Agarosegel aufgetragen und somit die Größe und DNA-Menge bestimmt.

Schließlich konnten insgesamt 55 Polymerasekettenreaktionen erfolgreich durchgeführt und die PCR-Produkte in die nachfolgende Klonierungsreaktion eingesetzt werden.

Beispiel 3 Klonierung der Chaperon-Gene

Zur Klonierung der entsprechend Beispiel 2 erzeugten PCR-Produkte in einen geeigneten Klonierungsvektor kann das hier näher beschriebene „pENTR® Directional TOPO® Cloning Kit" (Invitrogen, Karlsruhe) verwendet werden, es sind aber auch andere Systeme genauso geeignet.

Die hier beschriebene Methode basiert auf dem Einsatz des Enzyms Topoisomerase I aus dem Virus Vaccinia, das einen der beiden Stränge der doppelsträngigen DNA an spezifischen Stellen öffnen kann [23]. Mit Hilfe dieses Einschritt-Klonierungs-Systems wurden die erhaltenen PCR-Produkte in den Vektor pENTR/SD/D-TOPO eingebracht. Dieser Vektor besitzt neben den Rekombinationsstellen attl_1 und attl_2 ein Kanamycin- Resistenzgen, eine für Bakterien geeignete Ribosomenbindestelle (RBS) sowie einen CoIEI -Replikationsursprung, welcher eine Replikation mit hoher Kopienzahl in E. coli ermöglicht. Eine schematische Darstellung der durchgeführten Klonierung ist in Fig. 1 (A.2) gezeigt. Auf diese Weise wurden alle erzeugten PCR-Produkte in den Zielvektor pENTR/SD/D-TOPO eingebracht und zur Bestätigung sequenziert. Die hergestellten Plasmide wurden als pENTR- mit dem jeweiligen Namen des einklonierten Faltungshelfergens (Chaperon-Gens) bezeichnet, zum Beispiel pENTR-tig. In Tabelle 3 sind unter „pENTR-,, die erfolgreich hergestellten pENTR-Plasmide durch ein Kreuz (X) markiert.

Tabelle 3: Zusammenstellung der erfolgreich erzeugten pENTR-Plasmide. Die für die weiteren Experimente vorliegenden Plasmide sind durch ein X gekennzeichnet.

Beispiel 4 Konstruktion von Expressionsplasmiden

Im Anschluß an die erfolgreiche Klonierung der Chaperon-Gene in den pENTR-Vektor konnten die erzeugten Plasmide dazu verwendet werden, Expressionsvektoren herzustellen. Dabei kann beispielsweise die „Gateway®"-Technologie der Firma Invitrogen (Karlsruhe) angewandt werden, ebenso können aber auch eine Reihe anderer Systeme für diesen Zweck eingesetzt werden. Dieses System beruht auf Mechanismen der homologe Rekombination, die für den Bakteriophagen Lambda gut beschrieben sind [24].

Um diese Klonierungsmethode anwenden zu können, mußte in den Zielvektor eine Destination-Kassette eingebracht wurde. Diese Kassette konnte aus dem Vektor pGATRfA (s. Tab. 4) isoliert und über die Restriktionsschnittstellen Kpnl und Xbal in den Vektor pVLT31 (s. Tab. 4) einkloniert werden. Das daraus resultierende Plasmid wird im Folgenden als pDEST-VLT31 bezeichnet. Der Expressionsvektor pVLT31 wurde für diese Anwendung ausgewählt, da er sowohl einen induzierbaren tac-Promotor besitzt, als auch ein Shuttlevektor ist, der in E. coli ebenso wie in P. aeruginosa und weiteren Gram- negativen Bakterien stabil repliziert werden kann. So kann die Chaperon-Toolbox später in einem breiten Spektrum von Expressionsstämmen eingesetzt werden.

Durch die eingebrachte Destination-Kassette erhält der Vektor zu seiner Tetracyclin- Resistenz (Tc ^r ) eine zusätzliche Chloramphenicol-Resistenz (Cm ^r ) und das Gen ccdB, das für einen Gyrasehemmer codiert [25, 26]. Flankierend besitzt dieses DNA-Fragment die beiden Rekombinationsstellen attR1 und attR2. Für die Konstruktion des pDEST-VLT31- Vektors mußte der E. coli Stamm DB3.1 verwendet werden. Dieser kann trotz Expression des ccdB-Gens überleben, da durch eine Mutation in dem ccdA-Gen, das für die Topoisomerase Il codiert, das CcdB-Protein nicht wirken kann. Nachdem der Zielvektor pDEST-VLT31 erfolgreich hergestellt werden konnte, wurden Rekombinationsreaktionen mit den pENTR-Plasmiden (s. Beispiel 3) durchgeführt.

Im Anschluß an die Reaktion wurde ein Aliquot der Ansätze in den Stamm E. coli TOP10 transformiert und die erhaltenen Klone weiter untersucht. Da die Expression des ccdB- Gens für TOP10-Zellen letal ist, wird eine positive Selektion dieser Rekombination ermöglicht. Um falsch-positive Klone auszuschließen, wurde zusätzlich auf den Verlust der Cm-Resistenz selektiert, bevor die Plasmid-DNA isoliert und in Restriktionsanalysen mit den Enzymen Kpnl und Xbal untersucht wurde.

So konnten 47 Expressionsplasmide konstruiert werden, die einzelne Gene oder Operons von Faltungshelfern aus P. aeruginosa enthielten.

Tabelle 4: Übersicht der verwendeten Vektoren.

Beispiel 5 Herstellung von Multisite-Expressionsplasmiden

Damit ein Zielprotein nacheinander mit mehreren Chaperonen in Kontakt kommen kann, wurden für die Toolbox Plasmide konstruiert, mit deren Hilfe die Gene von mehreren Faltungshelfern gleichzeitig in einer Zelle zusammen mit dem Zielgen coexprimiert werden können, so dass ein Zielprotein zwei, drei oder mehrere Faltungshelferproteine in der Zelle vorfindet. Dazu kann beispielsweise das „MultiSite Gateway® Three-Fragment Vector Construction Kit" der Firma Invitrogen eingesetzt werden, das nach Angaben des Herstellers eine schnelle und effiziente Klonierung von drei unterschiedlichen DNA- Fragmenten in einen gemeinsamen Vektor ermöglicht. Ebenso können aber auch andere Vektoren für diesen Zweck eingesetzt werden. Das dem Kit der Firma Invitrogen zugrunde liegende System beruht auf dem Prinzip der homologen Rekombination, das vom Bakteriophagen Lambda abgeleitet wurde. Mit Hilfe dieses Kits wurde eine Plasmidbank erzeugt, welche die Expression von jeweils drei unterschiedlichen Faltungshelfergenen erlaubt.

Mit dieser Methode erhält man einen Vektor, in dem die drei Zielgene in der gewünschten Reihenfolgen hintereinander angeordnet und lediglich durch die resultierenden attB-Stellen voneinander getrennt sind. Die erzeugten Expressionsvektoren werden als pEXP bezeichnet und erhalten fortlaufende Nummern.

In den folgenden Abschnitten 5a) und 5b) wird die Konstruktion der verschiedenen pEXP- Plasmide im Detail erläutert. 5a) Konstruktion der Ausgangsvektoren für Multisite-Rekombinationen

Um eine Kombination von drei verschiedenen Genen in einem Zielplasmid erzeugen zu können, mußten zunächst die notwendigen Ausgangsvektoren konstruiert werden. Dazu mußte zum einen das Expressionsplasmid pBBR1 MCS-3 mit der attR4R3-Destination- Kassette versehen werden, welches dann als Zielvektor in die Rekombinationsreaktion eingesetzt werden konnte. Vorteile dieses Plasmides sind, daß es in verschiedenen Gramnegativen Bakterien repliziert werden kann, und, daß Gene so einkloniert werden können, daß ihre Expression durch einen induzierbaren lac-Promotor reguliert werden kann. Des weiteren mußte die 1.704 bp große Destination-Kassette aus dem Plasmid pDESTTMR4- R3 isoliert werden. Dazu wurden die beiden Primer ccdBattR4-up und ccdBattR3-dwn (s. Tabelle 5) verwendet. Nach erfolgreicher Aufreinigung des erhaltenen PCR-Produktes konnte dieses in die Smal-Erkennungsstelle des Shuttlevektors pBBR1 MCS-3 kloniert werden. Im Anschluß daran wurde das Konstrukt in E. coli TOP10-Zellen eingebracht und positive Klone auf Tc- und Cm-haltigem LB-Medium selektioniert. Diese Klonierung war erfolgreich und in der Folge wurde mit dem Plasmid weiter gearbeitet, in das die Zielgene unter Kontrolle des lac-Promotors kloniert werden konnten; dieser Vektor wird im Weiteren pDEST-BBRTc-R4R3 genannt.

Neben dem späteren Zielvektor mußten für die angestrebten Rekombinationsreaktionen die unterschiedlichen pENTR-Vektoren erzeugt werden. Die Vektoren, welche die Gene enthalten, die nachher das mittlere Gen liefern sollten, wurden bereits erfolgreich konstruiert, sie entsprechen den pENTR-Chaperon-Konstrukten aus Beispiel 3. Bei diesen Vektoren liegen die klonierten Gene zwischen den att-Stellen L1 und L2. Für die Konstruktion der beiden weiteren pENTR-Vektoren mußten die Zielgene mit anderen Erkennungsstellen reamplifiziert werden. Um die Gene der Chaperone und Faltungskatalysatoren mit den Sequenzen für attl_4 und attR1 klonieren zu können, mußten sie in den Vektor pDONRTMP4-P1 R eingebracht werden. Damit die Rekombinationsstellen attR2 und attl_3 neben den Zielgenen vorlagen, mußten diese in den Vektor pDONRTMP2R-P3 kloniert werden. Für beide Klonierungen mußten die Gene mit entsprechenden Erkennungsstellen amplifiziert, aufgereinigt und über eine BP- Rekombinationsreaktion in die beiden pDONR-Vektoren eingebracht werden. Deshalb wurden Primer gewählt, die teilweise homolog zu Bereichen des bereits vorhandenen pENTR-Vektors waren und zusätzlich die für die Rekombinationsreaktion essentiellen att- Stellen aufwiesen. Für die Klonierungen der Vektoren pENTR-Chaperon-5" mußten die Sequenzen für attB4 und attB1 an das PCR-Produkt angefügt werden, um in den Vektor pDONRTMP4-P1 R eingebracht werden zu können. Für die Vektoren pENTR-Chaperon-3' waren es die attB2 und attB3 Erkennungsstellen.

Mit den Primern AttB4-5'-up und AttB1-5'-dwn konnten die PCR-Produkte amplifiziert werden, die in einer anschließenden Reaktion in den Vektor pDONRTMP4-P1 R eingebracht werden sollten. Die daraus resultierenden Plasmide wurden als pENTR-5' bezeichnet. Das Primerpaar AttB2-3'-up und AttB3-3'-dwn wurde zur Konstruktion von pENTR-3'-Plasmiden eingesetzt.

5b) Erzeugen von Expressionsvektoren

Mit den erzeugten pENTR-Plasmiden (s. Beispiel 5a) konnten nun verschiedene Rekombinationsreaktionen durchgeführt werden. So wurden beispielsweise die Plasmide pENTR-tig-5', pENTR-dnaKJ und pENTR-clpX-3' in gleichen molaren DNA-Mengen mit dem Vektor pDEST-BBRTc-R4R3 in die Klonierungsreaktion eingesetzt. In dieser Reaktion sollten also die Gene tig - dnaKJ - clpX hintereinander in den Vektor eingebaut werden, der als pEXP-1 bezeichnet wurde. Beim gerichteten Vorgehen konnten auf diese Weise 40 Konstrukte hergestellt werden, die eine Kombination von drei Genen bzw. Operons enthielten (s. Tab. 6).

Tabelle 5: Übersicht über die verwendeten Oligonukleotide.

Bezeichnung DNA-Sequenz (in 5'- → 3' Richtung) Merkmal/

Modifikation

AttB2-3'-up GGG GAC AGC TT r CTT GTA CAA AGT attB2-

GGA ATC CGC GGC CGC CTT GTT T Erkennungssequenz

AttB3-3'-dwn GGG GAC AAC TT r GTA TAA TAA AGT affB3-

TGT GTC GGC GCG CCC ACC CTT Erkennungssequenz

AttB1-5'-dwn GGG GAC TGC TT r TTT GTA CAA ACT attB1-

Tabelle 6: Auflistung der erzeugten Multisite-Expressionsplasmide. Die Plasmide wurden mit fortlaufenden Nummern versehen (pEXP-1 - pEXP-40). Der Genname sowie die Position des Gens auf dem pEXP-Plasmid sind angegeben.

Tabelle 6b: Auflistung der erzeugten Multisite-Expressionsplasmide gem. Tabelle 6 unter Verwendung der orfs der Gene. Die Plasmide wurden mit fortlaufenden Nummern versehen (pEXP-1 - pEXP-40). Die orfs der Gene sowie die Position des Gens auf dem pEXP-Plasmid sind angegeben.

Nahezu alle identifizierten Chaperon-Gene konnten aus dem Genom von P. aeruginosa amplifiziert und in geeignete Vektoren kloniert werden. Bei den erzeugten Konstrukten konnte die DNA-Sequenz durch Sequenzierungen verifiziert werden. Ausgehend von diesen pENTR-Chaperon-Plasmiden wurden die Gene in den Expressionsvektor pDEST- VLT31 eingebracht, so daß sie in Coexpressionsversuche mit heterologen Zielproteinen eingesetzt werden können. Zusätzlich wurden, erneut basierend auf den pENTR- Chaperon-Plasmiden, pENTR-Chaperon-5'- und pENTR-Chaperon-3'-Vektoren reamplifiziert und kloniert. Durch Einsatz dieser Plasmide konnten 42 Expressionsplasmide mit Kombinationen aus jeweils drei Genen von Chaperonen und weiteren Faltungshelferproteinen konstruiert werden. Diese wurden im Folgenden in Coexpressionsversuche gemeinsam mit verschiedenen Zielgenen eingesetzt.

Vorbemerkung zu den folgenden Beispielen:

Im Folgenden werden mehrere Beispiele für die Expression von Zielproteinen und der Coexpression von Faltungshelferproteinen (entsprechend Beispiel 5) aufgeführt. Dazu wurden eine Reihe von Arbeitsschritten durchgeführt, die für die verschiedenen Beispiele immer in der gleichen Weise verliefen und hier zusammenfassend beschrieben sind. Zunächst wurden E. coli Expressionsstämme hergestellt, in denen sowohl das Zielprotein als auch ein Plasmid der Genexpressionsbank aus Beispiel 5 (Tabelle 6) enthalten war. Dazu wurde zunächst das Plasmid mit dem entsprechenden Zielgen in den E. coli Expressionsstamm eingebracht. Hiervon wurden elektrokompetente Zellen hergestellt, in die sämtliche Plasmide der Chaperon-Expressionsbank (Tabelle 6) in separaten Transformationsansätzen eingebracht wurden. Anschließend erfolgte die Anzucht der Teststämme in 20 ml Kulturen bei 30 oder 37 ⁰ C. Kulturen von E. coli wurden, soweit nicht anders angegeben, in LB-Medium angeimpft und über Nacht bei 37 ⁰ C inkubiert. Flüssigkulturen mit einem Volumen von 5 ml wurden in Reagenzgläsern in einem Reagenzglas-Rotator (Neolab, Heidelberg), größere Volumina in Erlenmeyer-Kolben auf einem Inkubationsschüttler (Unitron, lnfors HT, Bottmingen, CH) bei 150 Upm inkubiert, wobei das Volumen zwischen Kulturvolumen und Volumen des verwendeten Kolbens 1 :5 bis 1 :10 entsprach. Bakterienstämme mit plasmid- oder genomcodierten Resistenzmarken wurden unter Selektionsdruck durch Zugabe des jeweiligen Antibiotikums kultiviert. Übernachtkulturen (L)K) wurden mindestens 16 h bebrütet; Hauptkulturen wurden aus einer LIK auf eine OD (580nm) = 0,05 beimpft. Zur Induktion einer Überexpression wurden die Kulturen mit 0,4 mM IPTG induziert und, je nach zu synthetisierenden Zielprotein, für 3-42 h bei 37°C bzw. 30 ⁰ C bis zur Ernte der Zellen weiter inkubiert.

Gewinnung von Kulturüberständen und Gesamtzellextrakten:

Zellfreie Kulturüberstände wurden durch Zentrifugation (15 min, 6.000 Upm, 4°C) gewonnen und im Bedarfsfall sterilfiltriert (Schleicher & Schüll, NC45 Membranfilter, 0,45 μm Porendurchmesser). Das Zellsediment wurde entsprechend einer OD (580 nm) = 15 in 1 ml Zellaufschlußpuffer, Trispuffer (100 mM Tris-HCI, pH 8,0) oder Kaliumphosphatpuffer (100 mM KP ₁ , pH 6.0), aufgenommen und anschließend einer Ultraschallbehandlung unterzogen (Branson-Sonifier W250, 2 min, Leistungszyklus 50 %, 20 Watt). Die so erhaltenen Gesamtzellextrakte (GZE) konnten in Enzymtests eingesetzt, weiter fraktioniert oder bei -20 ⁰ C gelagert werden.

Fraktionierung von E. co//-Zellen:

Die Zelltrümmer wurden durch eine Zentrifugation für 2 min bei 3.000 Upm aus dem GZE entfernt. Zur weiteren Auftrennung des GZE in lösliche und nicht-lösliche Fraktionen wurde für 30 min bei 14.000 Upm zentrifugiert. Die im Überstand lokalisierten löslichen Proteine (Rohextrakt) wurden direkt in Enzymtests eingesetzt. Die Lagerung der Proteinproben erfolgte bei -20 ⁰ C.

Beispiel 6 Coexpression von Chaperonen mit Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus erythropolis

Um eine verbesserte Löslichkeit der Alkohol-Dehydrogenase aus Rhodococcus erythropolis (RE-ADH) zu erreichen, wurde dieses Enzym in E. coli mit 20 verschiedenen Faltungsmodulatoren entsprechend Tabelle 6 (Beispiel 5) coexprimiert. Diese 20 verschiedenen Expressionsstämme wurden dann wie in der Vorbemerkung erwähnt angezogen, die Zellen durch Zentrifugation geerntet. Nach Zellaufschluss und Zentrifugation wurde die Aktivität der löslichen RE-ADH im Rohextrakt in einem photometrischen Assay gemessen. Dazu wurden 970 μl 100 mM KP _r Puffer (pH 6,0) mit 3 mM p-CI-Acetophenon, 20 μl 12,5 mM NADH sowie 10 μl Enzymlösung (Rohextrakt) eingesetzt (Endvolummen 1 ml). In Fig. 2 sind die gemessenen Aktivitäten der RE-ADH aufgetragen, wobei der Kontrollstamm mit rekombinanter RE-ADH ₁ aber ohne zusätzliche Faltungshelferproteine zeigt dabei eine Aktivität von ca. 50 U/ml. Im Vergleich dazu können die untersuchten Expressionsstämme in vier Gruppen unterteilt werden, die jeweils vergleichbare Enzymaktivitäten aufweisen.

Eine Anzahl von zehn untersuchten Stämmen zeigte im Vergleich mit der Kontrolle (s. Fig. 2, A: K) eine deutliche Verringerung der Aktivität. Teilweise konnte überhaupt keine Aktivität detektiert werden (z.B. die Stämme mit den /Wu/f/s/te-Kombinationen pEXP-5, -9 oder pEXP-24). Als Gruppe Il wurden die Teststämme in Fig. 2 zusammengefaßt, die mit ca. 50 U/ ml in etwa die gleiche Enzymaktivität aufwiesen wie der Kontrollstamm LV. Bei den 16 verbleibenden Stämmen, in denen Chaperone mit dem Protein RE-ADH erzeugt wurden, konnte eine signifikant höhere ADH-Aktivität nachgewiesen werden. Diese war um den Faktor 2 bis 5 höher als bei dem Kontrollstamm LV. Das beste Ergebnis wurde erzielt, indem mit dem Vektor pEXP-13 die Gene der Faltungsmodulatoren CsaA, GroELS und PpiD exprimiert wurden.

Beispiel 7 Coexpression von Chaperonen mit Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus ruber

In einem weiteren Beispiel wurde die Verbesserung einer weiteren Alkohol- Dehydrogenase durch Coexpression von Faltungshelferproteinen untersucht, einem Enzym aus Rhodococcus ruber (RR-ADH). Die Vorgehensweise entspricht vollständig der in Beispiel 6 beschriebenen Methodik, lediglich das dort beschrieben Gen für RE-ADH wurde durch die RR-ADH ersetzt. Auch der Enzymtest entspricht dem vorab beschriebenen. Der RR-ADH-Expressionsstamm mit dem Leervektor (Kontrollstamm) wies eine Aktivität von ca. 8 U/ml auf (Fig. 3). Dessen ADH-Aktivität wurde mit der von Stämmen verglichen, in denen einzelne Faltungsmodulatoren coexprimiert wurden. Anhand der ermittelten RR-ADH-Aktivitäten konnten die Stämme in vier Gruppen unterteilt werden. Die erste Gruppe faßt die Stämme zusammen, in denen schwache oder keine RR-ADH-Aktivität gemessen werden konnte. Hier waren die Faltungshelfer SurA, PA0499 sowie DnaKJ in dem RR-ADH-Expressionsstamm enthalten. Enzymaktivitäten, die mit 6 - 8 U/ml in der Größenordnung des Kontrollstamms lagen, wurden durch die Coexpression der Chaperone IbpA, FkIB, PA4873, GroELS und PpiC2 erzielt (Fig. 3; Gruppe II). Sechs Chaperonsysteme (Fig. 3; Gruppe III) führten zu einer Steigerung der RR-ADH-Aktivität um 25 %, verglichen mit der Kontrolle. Bei diesen Faltungshelfern handelt es sich um DsbG, PA2725, Skp, PpiD, CsaA sowie HsIU. Die deutlichste Verbesserung der RR-ADH- Aktivität um 45 % - 65 %, bezogen auf den Kontrollstamm, konnte durch die Chaperone PA3717, PA5254, HscAB und Yrfl erreicht werden.

Beispiel 8

Coexpressionen von Chaperonen mit dem katalytisch aktiven Teil der Esterase EstA aus P. aeruginosa

Die Esterase EstA aus dem Bakterium P. aeruginosa ist ein lipolytisches Enzym, welches bevorzugt kurzkettige Glycerolester von Fettsäuren hydrolysiert [37]. Bei der Überexpression des katalytisch aktiven N-Terminus der Esterase EstA (EstAα) aus P. aeruginosa im heterologen Wirt E. coli BL21(DE3) akkumulierte ein großer Teil des Proteins in Form von Inclusion bodies. Deshalb wird im Folgenden das EstAα-Fragment zusammen mit den Faltungsmodulatoren entsprechend Beispiel 5 exprimiert, um die Löslichkeit des Proteins zu verbessern. Dabei stammen sowohl das Zielprotein als auch die coexprimierten Faltungshelferproteine aus demselben Organismus, P. aeruginosa.

Die Vorgehensweise der Gewinnung der Expressionsstämme und der Präparation von Rohextrakt entspricht vollständig der in Beispiel 6 beschriebenen Methodik, lediglich das dort beschrieben Gen für RE-ADH wurde durch das Gen für den N-Terminus der Esterase EstA ersetzt. Die Aktivität der Esterase EstA wurde mit folgendem Assay bestimmt: Pro Reaktion wurden 1 ,5 ml Testlösung [25 μl p-Nitrophenyl-Caproat in 5 ml Ethanol gelöst; plus 100 ml Puffer (100 mM KPi pH 7,2; 1OmM Mg2SO ₄ )] mit 5-50 μl Probe vermischt und für 15 min bei 30 ⁰ C inkubiert. Anschließend wurde die OD (410 nm) der Ansätze im Spektralphotometer bestimmt. Angegeben werden die Werte als relative Aktivität in U/ml (Extinktionskoeffizient ε = 10400 M ^"1 ). Die Figur 4 zeigt das Ergebnis dieser Aktivitätsmessungen für die einzelnen Expressionsstämme. Die Aktivität des Kontrollstammes BL21(DE3)-EstAα-LV betrug 0,25 U/ (ml ^■ OD (580 nm)). Im Vergleich dazu wiesen einige Stämme (Fig. 4; Gruppe I) eine leicht bis deutlich verminderte Aktivität der Esterase auf. Der Expressionsstamm 2, bei dem die Gene tig, groELS und clpX coexprimiert wurden, zeigte keinen Einfluss auf die Ausbeute an aktivem Protein, verglichen mit der Kontrolle (Fig. 4; Gruppe II). In einer weiteren Gruppe (Fig. 4; Gruppe III) konnte eine signifikante Erhöhung der Esterase-Aktivität durch die Coexpression von Faltungshelferproteinen erreicht werden. Neben den Plasmiden pEXP-5 (ppiA - groELS - tig) sowie pEXP-7 {dnaJ - dnaKJ - tig) zeigte auch die Expression des Vektors pEXP-11 (ppiA - groELS - ppiD) einen positiven Einfluß auf die Produktion des EstAα-Proteins. Gegenüber dem Vergleichsstamm lag hier eine Erhöhung der Aktivität um den Faktor 1,6 vor. Dies bedeutet eine Aktivität von ca. 0,35-0,4 U/ (ml ^■ OD (580 nm)). Am effektivsten war die Produktion der katalytisch aktiven Domäne der Esterase EstA, wenn das Plasmid mit der Faltungshelferkombination 1 (tig - dnaKJ - clpX) im Expressionsstamm vorlag. Hier konnte eine Verdopplung der Aktivität im Vergleich zum Kontrollstamm auf ca. 0,5 U/ (ml ^■ OD (580 nm)) erzielt werden.

Beispiel 9

Untersuchungen zur Coexpression von Chaperonen aus P. aeruginosa mit der Serratia marcescens Lipase LipA

Das Enzym LipA aus dem Bakterium S. marcescens besitzt durch seine Zugehörigkeit zu der Enzymklasse der Lipasen eine besondere biotechnologische Bedeutung, sie sind wichtige stereoselektive Biokatalysatoren, die sowohl bei der Veresterung als auch der Spaltung von Lipiden eine entscheidende Rolle spielen. Bei dem Versuch, die Lipase LipA aus S. marcescens in großen Mengen zu produzieren, akkumulierte der größte Teil des Proteins in Form von Inclusion bodies [38]. Daher wurde im Folgenden die Coexpression von Faltungshelfern auf die Ausbeute löslicher Lipase im heterologen Wirt E. coli auswirkt. Die in Coexpressionsversuchen mit den verschiedenen Expressionsstämmen entsprechend Beispiel 5 produzierten Proteinproben wurden in Enzymtests untersucht, die folgende Zusammensetzung hatten: Substratemulsion: 207 mg Natriumdesoxycholat, 100 mg Gummi arabicum, 90 ml Sörensen Phoshatpuffer pH 8,0 (Lösung A: 8,9 g/l Na ₂ HPO ₄ , Lösung B: 0,68 g/l KH ₂ HPO ₄ [A: B → 17:1]); 30 mg p-Nitrophenyl-Palmitat in 10 ml Isopropanol. Pro Reaktion wurden 2,5 ml Substratemulsion mit 20-100 μl Probe vermischt und für 15 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die OD (410nm) der einzelnen Ansätze im Spektralphotometer gemessen. Dabei entspricht die gemessene OD (410 nm) = 1 einer Lipasemenge von 0,121 ng bzw. einer Enzymaktivität von 0,161 nkat. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt. Als Positivkontrolle und Referenz gegenüber den Stämmen, in denen Chaperone und Foldasen coexprimiert wurden, diente der als LV bezeichnete Stamm, in welchem neben dem //joA-Expressionsplasmid ausschließlich der Chaperon-Leervektor in den Zellen vorlag. Für diesen Stamm konnte eine Lipase-Aktivität von ca. 0,8 nkat/ o.D. _{580 nm} detektiert werden (Fig. 5; A). Die Negativkontrolle wurde durch den Bakerienstamm repräsentiert, der beide verwendeten Expressionsplasmide als Leervektor enthielt und somit kein LipA-Protein erzeugen kann. Für diesen Stamm konnte keine Umsetzung des Lipase-Substrates p-Nitrophenyl-Palmitat im durchgeführten Enzymtest festgestellt werden.

Beispiel 10

Coexpression von Chaperonen aus P. aeruginosa mit der Lipase B (CALB) aus der Hefe Candida antarctica

In einem weiteren Beispiel sollte untersucht werden, ob die Coexpression von Chaperonen auch die Expression der Lipase CALB aus Candida antarctica verbessern kann. Diese Lipase ist biotechnologisch von besonderer Bedeutung, da sie eine hohe Enantioselektivität, vor allem bei der Umsetzung von 1 -Methoxy-2-Propanolacetat (MPA), aufweist. Da die Ausbeute von heterolog in E. coli produziertem CALB-Protein bisher sehr gering ist, sollte untersucht werden, ob die Ausbeute durch Zugabe von Faltungsmodulatoren erhöht werden kann. Durch Fusion des Lipase-Gens hinter eine pe/ß-Signalsequenz kann die Lipase ins Periplasma der E. coli Zellen transportiert werden. Auf diese Weise kann in Plattentests untersucht werden, ob die Zellen Lipase produzieren oder nicht. Deshalb wurden einzelne Kolonien der unterschiedlichen Stämme auf Tributyrin-Platten überimpft. Die Testplatten hatten folgende Zusammensetzung: 7,5 ml Tributyrin und 0,75g Gummi arabicum ad 15 ml Aqua dest. mischen, das Tributyrin mit Ultraschall (3 min, 75 W, 100%) emulgieren und zu 500 ml autoklaviertem LB-Agar (60 ⁰ C) geben [39]. Lipolytische Aktivität zeigt sich durch Bildung klarer Höfe um die Bakterienkolonie. In Fig. 6 sind drei solcher Tributyrin-Platten gezeigt (A, B und C), auf die unterschiedliche Expressionsstämme entsprechend Beispiel 5 aufgebracht wurden. Neben einigen Stämmen, in denen keine oder nur eine sehr geringe lipolytische Aktivität festgestellt werden konnte, fallen mehrere Expressionsstämme auf, in denen leicht bis signifikant mehr Lipase-Aktivität, verglichen mit dem Kontrollstamm, detektiert werden konnte. Mit den Plasmiden pEXP-18, -19, -28 und pEXP-33 konnte das beste Ergebnis erzielt werden. Durch die Zugabe dieser unterschiedlichen Faltungsmodulator- Kombinationen konnte die Menge aktiver Lipase deutlich gesteigert werden.

Neben diesem Plattenassay wurde der Einfluss der Faltungsmodulatoren mit löslichen Proteinproben in einem photometrischen Test mit p-Nitrophenyl-Palmitat als Substrat (s. Beispiel 9) eingesetzt und die Aktivität in U/ ml bestimmt (Fig. 7). Für den Kontrollstamm (LV) konnte eine sehr geringe Aktivität von 0,05 U/ ml bestimmt werden. Bei den weiteren zwölf Expressionsstämmen korrelieren die Ergebnisse aus den beiden Aktivitätstests. Dabei können einige Stämme identifiziert werden, die im Enzymtest eine Verbesserung der Aktivität um 60 %, verglichen mit der Kontrolle, aufweisen (Fig. 7; Gruppe II).

Bei drei weiteren Stämmen führte die Coexpression von Chaperon-Kombinationen zu einer Steigerung der CALB-Aktivität um 180 %. Dazu zählt unter anderem der Stamm mit dem Plasmid pEXP-19, in dem die Faltungsmodulatoren GroES - GroELS - PA5195 coexprimiert wurden. In beiden Enzymtests wies er eine signifikante Steigerung der lipolytischen Aktivität auf. Die Coexpression der Chaperone DsbC, GroELS und PA5195 (pEXP-18) führte bei einer Anzucht auf Agarplatten zu der deutlichsten Steigerung. Die Inkubation in Flüssigmedium rief eine Verdreifachung der Aktivität im Vergleich zum Kontrollstamm hervor, was den Umsatz des Substrates Tributyrin im ersten Enzymtest bestätigte.

Die drei Stämme mit den /Mv/f/s/te-Vektoren pEXP-33, -35 und -39 zeigen im photometrischen Test eine ebenso schwache Lipase-Aktivität auf wie der Kontrollstamm (Fig. 7; Gruppe I). In dem durchgeführten Tributyrin-Plattentest dagegen konnte für diese drei Stämme ein deutlich größerer Hof als bei dem Expressionsstamm mit dem Chaperon- Leervektor festgestellt werden. Auch für den Stamm mit dem Plasmid pEXP-12 entsprach der photometrische Aktivitätstest nicht dem Ergebnis der Tributyrin-Agarplatten. Während auf den Agarplatten mit Tributyrin als Substrat fast kein Hof um die Kolonie sichtbar wurde, zeigte sich im pNPP-Test, der mit Flüssigkulturen durchgeführt wurde, eine Verdopplung der Aktivität.

Beispiel 11

Coexpression von Chaperonen und Faltungskatalysatoren mit dem Grün-fluoreszierende Protein (GFP)

Das Grün-fluoreszierende Protein wird in der Wissenschaft unter anderem als Marker für Faltungsprozesse eingesetzt. Dabei konnte gezeigt werden, daß GFP durch direkten Einfluß von Chaperonen seine aktive Konformation erreicht [40, 41]. In diesem Beispiel wurde daher überprüft, ob Kombinationen von Faltungshelfer-Proteinen entsprechend Beispiel 5 die Faltung von GFP verbessern konnten. Als quantitatives Maß für die Faltung wird die Fluoreszenzemission des GFP-Proteins gemessen. Es wurde jeweils 1 ml GZE (siehe Vorbemerkung) mit einer Zelldichte, die einer OD (580 nm) von 1 entsprach, in Viertelmikroküvetten bei einer Anregungswellenlänge von 475 nm in einem Emissionsbereich von 490 - 550 nm vermessen. Die jeweilige Fluoreszenzintensität als „relative Fluoreszenzemission" wurde aus der gemessenen Fluoreszenzemission pro Zelldichte, die einer OD von 1 entsprach, und pro 1 ml Zellextrakt oder Zellsuspension berechnet. Für den Kontrollstamm wurde eine relative Fluoreszenz von ca. 240 pro ml ermittelt (Fig. 8; K). Die Proben wurden vorher auf eine Zelldichte von 1 eingestellt, ermittelt durch die OD (580 nm). Mit 28 Proben führten die meisten Chaperon- Kombinationen zu einer Reduktion der Menge an fluoreszierendem, löslichen Protein (Fig. 8; Gruppe I). Durch die Coexpression von sechs /Wi/tf/s/te-Expressionsplasmiden wurde eine vergleichbare Fluoreszenz zum Kontrollstamm ermittelt (Fig. 8; Gruppe II). Es konnten aber auch Stämme identifiziert werden, die mehr aktives GFP produzieren konnten als die Kontrolle. Hier führte die Expression von Faltungsmodulatoren zu Werten der relativen Fluoreszenz von 400-500, also einer Steigerung der Menge aktiven Proteins um 100 % in den besten Fällen. Die effektivsten Mutf/s/te-Kombinationen hinsichtlich der GFP-Expression waren pEXP-1 (Tig, DnaKJ und CIpX), pEXP-40 (SurA, GroELS und HsIU), aber vor allem pEXP-19 (GroES, GroELS und PA5195), pEXP-27 (PpiC2, HsIVU und PA5195) und pEXP-33 (PA3262, HscAB und LoIA).

Beispiel 12 Verbesserung der Produktion von humanem Interferon α2b

Ein weiteres Zielprotein stellt das menschliche Interferon alpha 2b (IFNα2b) dar. Dieses Protein wird in der Medizin zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten eingesetzt, wie Hepatitis, Krebsarten wie beispielsweise Leukämie oder bei Al DS- vermitteltem Kaposisarkom [42]. Die Produktion einer großen Menge löslichen Proteins hat demnach eine besondere Bedeutung für die pharmazeutische Industrie. Zwar kann das IFNα2b- Protein heterolog in E. coli exprimiert werden, doch werden zum Einen nur geringe Ausbeuten erzielt und zum Anderen akkumuliert der größte Teil in Form von Inclusion bodies. Bislang wird dann im Anschluß das IFNα2b-Protein isoliert, renaturiert und weiter verwendet [43], ein zwar gängiger, aber kosten- und zeitaufwendiger Prozeß.

In diesem Beispiel wurde daher das menschliche Protein Interferon α2b mit den entsprechend Beispiel 5 hergestellten Faltungshelferproteinen coexprimiert. Dabei wurde das IFNα2b-Protein mit einer N-terminalen Signalsequenz exprimiert, die einen Transport aus dem Cytoplasma heraus ermöglichen sollte. Als Kontrolle wurde ein BL21(DE3)- Stamm verwendet, der neben dem Interferon-Expressionsplasmid den Chaperon- Leervektor pBBR1 MCS-3 enthielt (Fig. 10; K). Für diesen Stamm konnte gezeigt werden, daß ca. 70 % des erzeugten IFNα2b-Proteins im GZE vorlag und 30 % im Medium nachgewiesen werden konnte (s. Fig. 10).

Von 13 unterschiedlichen Teststämmen führte die Coexpression von drei Chaperon- Kombinationen dazu, daß keine nachweisbare IFNα2b-Menge, weder im GZE noch im Kulturüberstand, detektiert werden konnte (pEXP-10, -13 und pEXP-14; Daten nicht gezeigt). In weiteren Stämmen führte die zusätzliche Expression von Faltungsmodulatoren dazu, daß IFNα2b-Protein nachgewiesen werden konnte. In den meisten Fällen entsprach die Menge und Verteilung des Zielproteins der des Kontrollstammes, beispielsweise der Stamm mit dem Multisite-Expressionsvektore pEXP-2 (Tig, GroELS, CIpX). Die Coexpression des Plasmides pEXP-3 (Tig, DnaKJ und PpiD) führte dazu, daß nur ein sehr geringer Proteinanteil ins Kulturmedium gelangen konnte und ca. 90 % des produzierten IFNα2b-Proteins unlöslich in Form von Inclusion bodies im Cytoplasma akkumuliert war (Fig. 10; 3). In zwei weiteren Stämmen mit den Expressionsplasmiden pEXP-4 bzw. pEXP- 12 (s. Tab. 6) war mehr IFN2αb-Protein nachweisbar als in der Kontrolle. Durch Coexpression beider Vektoren konnte beobachtet werden, daß der größte Anteil des IFNα2b-Proteins hier im Kulturmedium vorhanden war, während nur eine sehr geringe Menge des Proteins im GZE detektiert werden konnte. Fast das gesamte IFNα2b-Protein wurde also aus der Bakterienzelle heraus transportiert.

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