[01] Esta invenção pertence ao campo dos compostos e preparações contendo ingredientes orgânicos ativos; especificamente, aos compostos contendo polinucleotidios contendo bases modificadas para identificação de células.

ESTADO DA TÉCNICA

[02] A indústria farmacêutica e empresas de biotecnologia têm utilizado diversas técnicas de química combinatória como ferramenta para a identificação de novos materiais com propriedades específicas.

[03] Esta ferramenta é marcada pela síntese e análise simultânea de grandes bibliotecas constituídas de compostos com fórmulas moleculares relacionadas, mas estruturalmente distintas, sendo que a probabilidade de sucesso na identificação de moléculas funcionais cresce com a diversidade da biblioteca (Stoltenburg et al., 2007, Ulrich and Trujillo, 2008) .

[04] Os polinucleotídeos são compostos atrativos para a química combinatória, já que eles se dobram em estruturas secundárias e terciárias definidas e podem ser amplificados por síntese enzimática.

[05] Bibliotecas de polinucleotídeos com sequências aleatórias, com aproximadamente IO ¹⁵ moléculas diferentes, podem ser obtidas por síntese química e então utilizadas para a identificação de diversos compostos com diferentes finalidades, tal como alta afinidade de ligação a um determinado alvo (polinucleotídeos de fórmula (I)) ou atividade catalítica (ribozimas e DNAzimas) (Stoltenburg et al., 2007, Ulrich and Trujillo, 2008).

[06] Em 1990 foi descrita uma técnica para selecionar, a partir de bibliotecas combinatórias de oligonucleotideos (DNA ou RNA) , moléculas que se ligassem com alta afinidade e especificidade a alvos moleculares determinados. Essa técnica denominada SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) , foi desenvolvida simultânea e independentemente por Tuerk e Gold e por Ellington and Szostak (Tuerk e Gold., 1990 Ellington and Szostak., 1990) (U.S. Pat. No. 5, 475, 096 Gold and Tuerk, 1995; U.S. Pat . No 5,270,163 Gold and Tuerk, 1993)).

[07] As moléculas funcionais identificadas nesse procedimento são denominadas "polinucleotideos de fórmula (I)" (do latim, aptus o qual significa "se encaixar, adequado, ajustado", e do grego, meros o qual significa "uma das partes constituintes de um todo, partícula") (Ellington and Szostak, 1990) .

[08] A técnica SELEX tem sido usada para selecionar polinucleotideos de fórmula (I) de RNA e DNA contra uma ampla variedade de alvos, que incluem: íons (Ciesiolka et al., 1995), nucleotídeos (Sassanfar and Szostak, 1993), ácidos nucléicos (Ko et al., 1999), carboidratos (Yang et al., 1998), aminoácidos (Geiger et al., 1996), peptídeos (Bock et al.,1992), antibióticos (Berens et al., 2001), alvos complexos como receptores de membrana (Ulrich et al., 1998, 2002) e células inteiras (Wang et al., 2003, Homann and Gõringer, 1999), entre outros.

[09] Diversos polinucleotideos de fórmula (I) identificados se ligam aos seus alvos com afinidade e especificidade semelhante a dos anticorpos monoclonais, com constantes de afinidade próximas a nano e femto molar, sendo capazes, por exemplo, de diferenciar o ATP do dATP (Sassanfar and Szostak, 1993) ou ainda discriminar células PC12 diferenciadas em neurónios de células PC12 parentais (Wang et al. , 2003) .

[10] Polinucleotideos de fórmula (I) como ligantes ou inibidores de proteínas baseiam-se na propriedade das moléculas de DNA e RNA de reconhecer epítopos proteicos específicos, semelhante à interação RNA-proteína e DNA- proteína existentes na célula.

[11] Estruturas tridimensionais formadas pelos polinucleotideos de fórmula (I) , tendo como base suas sequências específicas que por sua vez levam a estruturas únicas, quando complexadas aos seus ligantes revelaram que a especificidade e afinidade da ligação deles aos seus alvos são conferidas pela combinação das seguintes propriedades: compatibilidade estrutural, preciso empilhamento de anéis aromáticos, interações de van der Waals e eletrostáticas e finalmente, formação de pontes de hidrogénio .

[12] Na presença do alvo, com a formação do complexo de ligação, o aptâmero sofre mudanças conformacionais adaptativas. O dobramento em uma estrutura tridimensional definida permite ao aptâmero encapsular completamente substâncias pequenas pela geração de um bolso de ligação específica.

[13] Para as moléculas com alta massa molecular, como proteínas, diferentes estruturas da superfície do alvo são envolvidas pela interação com o aptâmero (Hermann and Patel, 2000) . Nos últimos 20 anos, a investigação e o desenvolvimento dos polinucleotideos de fórmula (I) demonstraram o seu potencial como uma nova e efetiva classe de moléculas terapêuticas.

[14] A sequência destes ligantes, especialmente dos com potencial em aplicações biomédicas, otimizações em seus protocolos de seleção, assim como modificações químicas que melhoram sua estabilidade e farmacocinética, tem sido protegidos por patentes. Um destes polinucleotideos de fórmula (I) , o produto farmacêutico acugen™ (pegaptanib sodium injection da Pfizer-Eyetech Pharmaceuticals) , o qual antagoniza de forma eficiente e seletiva a ação da isoforma 165 do fator de crescimento endotelial-vascular (VEGF) , foi o primeiro aptâmero a ser aprovado, em 2004, pelo FDA (US Food and Drug Administration) , para o tratamento da degeneração macular relacionada ao envelhecimento (Bell et al., 1999, Eyetech Study Group, 2002, Ishida et al., 2003, Majumder et al., 2009).

[15] Diversas patentes descrevem ou utilizam a tecnologia SELEX. O documento US7179894, demonstra a produção de polinucleotideos de fórmula (I) resistentes a nucleases, o que possibilitaria a produção dessas moléculas para aplicações in vivo como a utilização de polinucleotideos de fórmula (I) para tratamentos de doenças, em uso diagnóstico e até em validação de alvos terapêuticos, como descrito no documento US20070066551.

[16] Com essa base tecnológica temos o desenvolvimento de polinucleotideos de fórmula (I) que se ligam com alta afinidade a proteínas plasmáticas como, por exemplo, a trombina, processo descrito no documento US7998939B2 e que visando utilização como forma terapêutica poderia ser expresso em células para a produção e secreção em locais específicos como demonstrado no documento US7700759.

[17] Especificamente, utilizando a técnica de Cell- SELEX, o documento US20090239762 demonstra a produção de polinucleotídeos de fórmula (I) para a identificação de células de câncer de pulmão, visando tanto o diagnóstico quanto a utilização dessas moléculas para futuras terapias.

[18] Portanto, o estado da técnica carece de informações relativas a polinucleotídeos ou sequências de DNA com sequências específicas ou envolvidos em processos exógenos de purificação de células, no caso células tronco mesenquimais de tecido adiposo, incluindo polinucleotídeos de fórmula (I) modificados.

OBJETIVO DA INVENÇÃO

[19] A presente invenção tem por objetivo prover polinucleotídeos quimicamente modificados de fórmula (I) : 5'- CONS-SEQ. ID. n-CONS-3' , capazes de identificar e isolar células-tronco provenientes do tecido adiposo, tal como por exemplo, provenientes do lipoaspirado humano.

[20] É ainda um objetivo desta invenção o processo de produção dos polinucleotídeos quimicamente modificados de fórmula (I): 5'- CONS-SEQ. ID. n-CONS-3' .

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[21] A presente invenção refere-se a uma família de 32 sequências de polinucleotídeos quimicamente modificados de fórmula (I) , pela adição de biotina ou sonda fluorescente na região terminal 5', sendo relevantes em qualquer processo que envolva a identificação, purificação e concentração de células tronco mesenquimais, incluindo, mas não limitando, o seu uso como reagente em ensaios farmacológicos, como por exemplo, ensaios in vivo e in vitro, de citômica, em testes de diagnóstico e como ligante de alta afinidade para enriquecimento de células para subsequentes aplicações terapêuticos como, por exemplo, terapia regenerativa em doenças de osso, arteriosclerose, isquemia cardiovascular ou cerebral e para transplante em doenças neurodegenerativas como por exemplo Parkinson e esclerose lateral amiotrófica entre outros.

[22] Foram caracterizados todos os polinucleotideos de fórmula (I) presentes nessa invenção, sendo que os de SEQ.ID.9 e SEQ.ID.ll demonstraram identificação de 16 e 23% respectivamente de células com assinatura exclusivas dentre a população inicial dita pura de células tronco mesenquimais de lipoaspirado .

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[23] Para se obter uma completa visualização dos objetivos da presente invenção, é necessária a leitura deste documento e a análise dos desenhos que o acompanham e aos quais se faz referências conforme segue abaixo.

[24] Figura 1: Classes de sequências presentes nas bibliotecas R12 e BR5.

[25] Figura 2: Estruturas e sequências da Classe I de polinucleotideos de fórmula (I) encontrados no sequenciamento das bibliotecas BR5 e R12.

[26] Figura 3: Estruturas e sequências da Classe II de polinucleotideos de fórmula (I) encontrados no sequenciamento das bibliotecas BR5 e R12.

[27] Figura 4: Estruturas e sequências da Classe III de polinucleotideos de fórmula (I) encontrados no sequenciamento das bibliotecas BR5 e R12. [28] Figura 5: Estruturas e sequências da Classe IV de polinucleotideos de fórmula (I) encontrados no sequenciamento das bibliotecas BR5 e R12.

[29] Figura 6: Estruturas e sequências da Classe V de polinucleotideos de fórmula (I) encontrados no sequenciamento das bibliotecas BR5 e R12.

[30] Figura 7: Estruturas e sequências de polinucleotideos de fórmula (I) encontrados no sequenciamento das bibliotecas BR5 e R12 incluindo uma sequência controle com a região randômica composta por uma sequência Poli-A.

[31] Figura 8: Caracterização por citometria com polinucleotideos de fórmula (I) isolados.

[32] Figura 9: Caracterização por citometria com polinucleotideos de fórmula (I) isolados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[33] A presente invenção trata dos polinucleotideos quimicamente modificados de fórmula (I) :

5'- CONS-SEQ. ID.n-CONS-3' (I),

em que :

5' CONS é uma das sequencias identificadoras SEQ. ID. 33 e/ou SEQ. ID. 34;

CONS-3' é uma das sequencias identificadoras SEQ. ID. 33 e/ou SEQ. ID. 34;

SEQ.ID.n é alternada ou separadamente, uma ou mais das sequências identificadoras das SEQ.ID. 1 a SEQ.ID 32 contendo uma ou mais pirimidinas modificadas e ao menos um nucleotideo invertido.

[34] Nos polinucleotideos quimicamente modificados de fórmula (I) 5'- CONS-SEQ. ID.n-CONS-3' (I), preferencialmente :

5'-CONS é a SEQ. ID. 33;

CONS-3' é a SEQ. ID. 34;

SEQ.ID.n é separadamente cada uma das sequências identificadoras das SEQ.ID. 1 a SEQ.ID 32 contendo uma ou mais pirimidinas modificadas e último nucleotídeo invertido .

[35] As modificações de uma ou mais pirimidinas são feitas pela substituição da 2-OH por um átomo de halogênio. Preferencialmente, as modificações de uma ou mais pirimidinas ocorre pela substituição do grupo 2'-H dos nucleotídeos de pirimidina por um átomo de flúor. Mais preferencialmente ainda, as pirimidinas modificadas são a 2'F-dCTP e a 2'F-dCUTP.

[36] Além disso, os polinucleotídeos quimicamente modificados de fórmula (I) sofrem modificações nas regiões 5' e/ou 3' pela adição de marcadores pertencentes ao grupo consistido de: FAM, TET, HEX, TAMRA, ROX, CY3, CY3.5, Texas Red, CY5, CY5.5, CY7, compostos fluorescentes da família Alexa, e biotina.

[37] Cada um dos polinucleotídeos quimicamente modificados de fórmula (I) contendo uma ou mais pirimidinas modificadas possuem alta afinidade de ligação à proteínas e células, sendo, portanto, úteis para a detecção, identificação e purificação de proteínas e células.

[38] Desta forma, os polinucleotídeos quimicamente modificados de fórmula (I) podem ser úteis na seleção de proteínas e células, tais como, as células-tronco mesenquimais; preferencialmente, células tronco mesenquimais do tecido adiposo.

[39] O segundo objeto da presente invenção trata de um processo para produção dos polinucleotideos quimicamente modificados de fórmula (I):

5'- CONS-SEQ. ID.n-CONS-3' (I);

que compreende as etapas de:

(a) Produção de uma biblioteca de polinucleotideos ;

(b) Apresentação dos polinucleotideos a possíveis alvos ligantes;

(c) Seleção e amplificação dos ligantes; e,

(d) Modificação dos ligantes.

[40] Na etapa (a) os polinucleotideos iniciadores das sequências SEQ. ID. 33 e SEQ. ID.34 são usados para produzir uma biblioteca de ssDNA contendo aproximadamente IO ²⁰ polinucleotideos que codificam sequências contendo uma região aleatória flanqueada por regiões constantes representadas pelos polinucleotideos que se pareiam com as sequências iniciadoras SEQ. ID. 33 e SEQ. ID. 34.

[41] Os polinucleotídios quimicamente modificados assim produzidos são identificados e isolados por meios conhecidos pelos versados na arte, tal como a medição do tamanho das cadeias por gel de acrilamida e/ou agarose, seguido de purificação com solução fenol/clorofórmio, além de outras.

[42] Na etapa (b) , os polinucleotideos quimicamente modificados de fórmula (I) 5'- CONS- SEQ.ID.n -CONS-3' são incubados em tampão de seleção, e possíveis alvos, e aqueles que se ligarem ou permanecerem ligados após as lavagens em cada ciclo de lavagem, são coletados e diretamente passam para as etapas de amplificação, enzimática através da reação em cadeia da DNA polimerase (PCR) . Esta reação destina-se a encontrar as moléculas com maior afinidade pelo alvo de interesse.

[43] Para fins desta invenção, os possíveis alvos dos polinucleotídeos quimicamente modificados de fórmula (I) 5'- CONS- SEQ.ID.n -CONS-3' são as moléculas orgânicas da assinatura molecular de membrana das células-tronco mesenquimais . O PCR tem inicio pela desnaturação das moléculas coletadas por cerca de 10 min a uma temperatura entre 75 a 85 °C, seguida de renaturação por cerca de 15 min a temperatura entre 20 a 25 C, depois é incubada com o alvo por um período de entre 40 a 60 minutos, em uma temperatura de entre 20 a 25 °C.

[44] As sequências com baixa ou nenhuma afinidade tendem a permanecer livres no tampão de seleção consistido de 145mM NaCl, 5.3mM KC1, 1.8mM CaCl ₂ »2H ₂ 0, 1.7mM MgCl ₂ »6H ₂ 0 e 25mM HEPES, ajustado entre pH 7.0 a 7.5, enquanto que as demais se associam ao alvo. O complexo polinucleotídeo de fórmula (I)-alvo é separado das moléculas livres por um dos vários processos disponíveis, que incluem: adsorção em filtro de nitrocelulose, separação por gel-shift, eletroforese capilar, entre outros.

[45] As moléculas de RNA ou DNA são eluídas dos seus sítios de ligação, coletadas e amplificadas por RT-PCR ou por PCR, respectivamente. A coleção de dsDNA resultante, enriquecida com sequências com afinidade pelo alvo, é preparada para um novo ciclo de seleção.

[46] Para os polinucleotídos quimicamente modificados de fórmula (I) de DNA, o dsDNA é desnaturado para a purificação da fita sense, utilizada no procedimento, e no caso dos de RNA, a biblioteca é gerada por transcrição in vitro .

[47] A etapa (c) ocorre aleatoriamente, sendo realizada simultaneamente entre 15 a 30 reações em cadeia da polimerase (PCR) cada uma entre 0,5 a 2 pmol/μΐ dos polinucleotideos iniciadores das SEQ. ID. 33, dideoxinuclotídeos e reagentes conhecidos por aqueles versados na arte, para amplificar aproximadamente lOfmol de polinucleotideos da biblioteca de ssDNA. A reação ocorre em ciclos de 4 a 6 minutos a uma temperatura entre 90 a 100 C; seguido de 4 a 6 minutos a uma temperatura entre 40 a 45 C e 10 minutos a 72 C. Após essa síntese da dupla fita, é adicionado o iniciador da e SEQ. ID. 34 que confere uma cauda marcadora tripla de biotina.

[48] A amplificação prossegue durante cerca de 1 a 5 minutos a uma temperatura entre 90 a 100 C para a separação das fitas e ciclos com 30 a 60 segundos a uma temperatura entre 90 a 100 C, seguidos de 30 a 60 segundos a uma temperatura entre 40 a 50 C e uma etapa de 1 a 5 minutos a uma temperatura entre 70 a 75 C sendo este ciclo repetido 20 a 30 vezes antes de uma etapa de extensão final de 5 a 12 minutos a uma temperatura entre 70 a 75 C.

[49] Uma sequência de eventos de ligação ao alvo, seleção e amplificação é chamada de ciclo de SELEX. Estas etapas são repetidas várias vezes até estabilizar a afinidade da biblioteca pelo seu alvo.

[50] Após o processo de seleção e estabilização das afinidades os polinucleotideos quimicamente modificados de fórmula (I) selecionadas são amplificadas por PCR e clonadas em vetor bacteriano, como por exemplo, um vetor como pGEM ou semelhante seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante. Clones são isolados e polinucleotideos quimicamente modificados de fórmula (I) individuais são identificados por sequenciamento e posteriormente caracterizados quanto à afinidade e especificidade de ligação ao alvo.

[51] A tabela 1 apresenta os polinucleotideos quimicamente modificados de fórmula (I) 5'- CONS- SEQ.ID.n -C0NS-3' , em que a SEQ.ID.n é independente e aleatoriamente uma sequência dentre a SEQ. ID. l a SEQ. ID. 32 produzidos de acordo com o processo acima, e indica o número de base de cada fita simples de DNA (ssDNA) e o índice de presença de cada uma das sequências de SEQ. ID. 1 a SEQ. ID. 32 em um biblioteca de ssDNA produzida para a identificação dos polinucleotídieos capazes de reconhecer a assinatura molecular de membrana das células-tronco mesenquimais . índice

Núcleo ideos Sequência n Nome

Presença

30 23, 50 GACCCAAGCCGACCGCCCCCCATGAGTCGGGGTGTA SEQ. ID. 1

33 0, 39 GAGGGCCGCCTGGAACAATGGGTTCGGCGCGA SEQ. ID. 2

34 0,36 GCACGGACGGGCCGCACGCGCTTGAGCCCGGGGA SEQ. ID. 3

35 0,46 GCAGGGGCGGGCCGCATACGCTTGAGCCCGGGCGA SEQ. ID. 4

34 0, 43 GCAGGGGCGGGCCGCATGCGCTTGAGCCCGGGGA SEQ. ID. 5

34 48,00 GCCGCAGGCCGACCGGTTCCCTTGAGTCGGGGTGGA SEQ. ID. 6

35 0,26 GCCGAAGGGCGTCGGAGCGCGCCATCACAGGGGGA SEQ. ID. 7

35 0,26 GCCGGGGGGCGTCGGAGCGCGCCATCACAGGGGCA SEQ. ID. 8

35 0,30 GCCGGGGGGCGTCGGAGCGCGCCGTCCCAGGGGGA SEQ. ID. 9

34 0, 31 GGCGGGGGCGCCTGGAACGATGGGTTCGGCGCGA SEQ. ID. 10

33 0,26 GGCGGGGGGCGCCGGAGCGCGCCATCGCAGGGGGA SEQ. ID. 11

35 23, 00 GGGCAGGCCGACCGGTTCCCTTGAGTCGGGGTGGA SEQ. ID. 12

33 0,29 GGGGATCGCCTGGAACGATGGGTTCGGCACGA SEQ. ID. 13 índice

Núcleotideos Sequência n Nome

Presença

33 0, 31 GGGGCACCGCCCTGGAGCGATGGGCTCGGGCTGTA SEQ. ID. 14

34 0, 31 GGGCACCGCCCTGGAGCGATGGGCTCGGGCTGCA SEQ. ID. 15

35 0, 66 GGGGCATCCCGCTGGACCCATGGCGTGCGCGGATA SEQ. ID. 16

35 0, 63 GGGGCATCCCGCTTGGCACAATGCGTGAGCTGGCA SEQ. ID. 17

35 0, 68 GGGGCATCCCGCTTGGCACAATGCGTGCCCGGATA SEQ. ID. 18

34 0, 59 GGGGCATCCCGCTTGGCACAATGCGTGCGCGAGGA SEQ. ID. 19

35 0, 63 GGGGCATCCCGCTTGGCACAATGCGTGCGCGGGTA SEQ. ID. 20

35 0, 67 GGGGCATCCCGTTTGGCACAATGCGTGCGCGGATA SEQ. ID. 21

34 0, 38 GGGGGACCGCCTGTAACGGTGGGTTCGGCGCGA SEQ. ID. 22

34 0,28 GGGGGAGCGCGCCGGAGCGATGGGTTCCGGGGGTA SEQ. ID. 23

34 0, 35 GGGGGAGCGCGCTGGACGCTGGGGTCGCCGGGGGA SEQ. ID. 24

33 0, 30 GGGGGCCGCCTGGAACGATGGGTTCGGCGTGA SEQ. ID. 25

33 0,29 GGGGGCCGCCTGGAACGATGGGTTCGGTGCGA SEQ. ID. 26

33 0,29 GTGGGGACCGCCTGGAACGATGGGTTCGGCGCGA SEQ. ID. 27

33 0, 31 _. GTAGGCACCGCCCTGGAGCGATGGGCTCGGGCTGTA SEQ. ID. 28

33 0, 26 GTCGGGGGGCGTCGGAGCGCGCCATCACAGGTGGA SEQ. ID. 29

34 1,14 TACCCTAGCTCAAGCGCATGCGGCCCGTCCCTGC SEQ. ID. 30

35 18, 00 TCCACCCCGACTCAAGGGAACCGGTCGGCCCGCGC SEQ. ID. 31

33 1, 67 TCGCGCCGAACCCATCGTTCCAGGCGGTCCCCC SEQ. ID. 32

[52] Os polinucleotídeos da tabela 1 foram submetidos à busca de similaridades dentro da ferramenta BLAST do PUBMED, e o resultado desta busca não demonstrou nenhum correspondente natural, uma vez que na modalidade Blast-n apenas pedaços da sequência foram encontrados, e nenhuma das possíveis sequências 5' -CONS-SEQ . ID . n-CONS-3' (I) completa foi identificada como natural, e considerando o MEGABLAST que tende a procurar a sequência inteira, nenhuma das sequências apresentou respectivo correspondente natural.

[53] A partir das sequências identificadas na tabela 1, os polinucleotídeos quimicamente modificados de fórmula (I) 5'- CONS-SEQ. ID. n-CONS-3' (I) obtidos, foram agrupados em classes de moléculas de acordo com suas similaridades de motivos de sequência na região previamente aleatória (Figura 1) . Dentro dessas classes, podemos verificar que além de terem sequências similares, as moléculas também compartilham alta conservação estrutural como demonstrado nas Figuras 2 a 7.

[54] As sequências em negrito são aquelas que apresentaram um índice de presença próximo nas duas bibliotecas analisadas. Percebe-se que no alinhamento por similaridade, 5 classes de polinucleotídeos foram formadas (I, II, III, IV e V) e mais quatro sequências ficaram evidenciadas, duas com índices de presença entre 0,5 e 1,5 que não tiveram similaridade com nenhuma outra, e duas sequências que tiveram o maior e o menor índice de presença, indicando forte presença em BR5 e R12, respectivamente. Em azul é possível verificar quais sequências foram selecionadas para sintetizarmos e seguirmos para os experimentos com polinucleotídeos isolados, que por sua vez receberam os nomes de APT1-32 de acordo com o processo de alinhamento descrito acima.

[55] O último objeto da presente invenção trata de um processo de separação de células-tronco presente no lipoaspirado que compreende a utilização dos polinucleotídeos de fórmula (I) de classes I a V, na identificação das células-tronco. Como os polinucleotídeos quimicamente modificados de fórmula (I) têm afinidade com as moléculas marcadoras presentes na membrana das células- tronco, os polinucleotídeos de fórmula (I) que apresentam maior afinidade com as ditas moléculas marcadoras, se ligam a elas tornando possível a identificação destas células pelos aparelhos de identificação celular conhecidos pelos versados nesta área técnica, tal como, um aparelho de facs, e outros.

[56] As Figuras 8 e 9 mostram que os polinucleotideos quimicamente modificados de fórmula (I) cuja sequência aleatória corresponde às SEQ. ID 4 e 10 são capazes isoladamente de identificar com precisão um grande percentual de células-tronco . Na figura 8, as legendas significam: Células" ( o ) . Controle negativo (Cnt-) são os experimentos de determinação dos perfis de marcação sem nenhum anticorpo ou polinucleotidios quimicamente modificados de fórmula ( I ) ; CD90/CD34/CD45 é a padronização de marcação para esses marcadores moleculares, onde CD34

(a) e CD45 (B) têm como eixo FL-2, e estão representados juntos pois, sabidamente não marcam células-tronco provenientes do lipoaspirado . A marcação das células-tronco provenientes do lipoaspirado para CD90 (■) foi de 98,0% dos eventos marcados impossibilitando avaliar os eventos dentro da região de células. A partir desse ponto, foi realizada a avaliação de cada uma das classes de polinucleotideos de fórmula (I) encontradas, para a verificação de qual classe tem a maior eficiência em marcar sub-grupos celulares; sendo obtidas células marcadas apenas por CD90 (■) e APTx/CD90 ( o ) .

[57] Já a Figura 9 apresenta um experimento em que: os eventos são "Células" (■) . 0 controle negativo (Cnt-) é determinado pelos perfis de marcação sem nenhum anticorpo ou polinucleotidios quimicamente modificados de fórmula

( I ) ; CD90/CD34/CD45 apresenta a padronização de marcação para esses marcadores moleculares, onde CD34 (m) e CD45 ( a ) têm como eixo FL-2, e estão representados juntos pois, sabidamente não marcam células-tronco provenientes do lipoaspirado . A marcação das células-tronco provenientes do lipoaspirado para CD90 (■) foi de 98,2% dos eventos marcados impossibilitando avaliar os eventos dentro da região de células. A partir desse ponto, foi realizada a avaliação de cada uma das classes de polinucleotidios quimicamente modificados de fórmula (I) encontradas, onde poderíamos avaliar quais delas teriam uma maior eficiência em marcar sub-grupos celulares; sendo obtidas células marcadas apenas por CD90 (■) e APTx/CD90 ( a ) .

[58] Assim, conforme observado, o polinucleotídeo 5'- CONS-SEQ. ID.9-CONS-3' isoladamente foi capaz de identificar 15,8% das células e o 5'- CONS-SEQ. ID. ll-CONS-3' identificou isoladamente 23,7% das células-tronco isoladas do lipoaspirado. Indicando assim, que provavelmente esse é o número de células que apresentam assinatura molecular exclusiva e não compartilhada com outras células somáticas presentes no tecido adiposo, sendo que cada um dos polinucleotídeos testados pode estar se ligando em alvos diferentes e com constantes de afinidades distintas.

[59] Embora a presente invenção e os melhores modos da mesma tenham sido descritos de uma maneira que estabelece aqueles versados na técnica fazer e usar a mesma, será entendido e apreciado que há equivalentes para as modalidades de exemplo mostradas aqui e que modificações e variações podem ser realizadas, sem que se desvie do escopo e do espírito das invenções, os quais não devem ser limitados pelas modalidades exemplificadas.