Campo de la técnica

La presente invención se relaciona con el campo de la biotecnología y la salud humana. Describe el desarrollo de un antígeno vacunal quimérico que comprende más de 200 aminoácidos de la región extracelular de la proteína PD-L1 . Provee una composición vacunal que comprende dicho antígeno y al menos un adyuvante. La composición es capaz de inducir una respuesta inmune específica contra PD-L1 , que neutraliza los efectos mediados por este ligando, y puede ser empleada para el tratamiento del cáncer y sus metástasis.

Estado de la técnica anterior

El ligando 1 del receptor proteico de muerte celular programada 1 (PD-1 ), conocido como PD-L1 , es un receptor de membrana de 40 kDa, miembro de la familia B7. Se conoce que PD-L1 también posee interacción específica y funcional con otro receptor de membrana, conocido como CD80. PD-L1 consta de 290 aminoácidos, codificados por el gen Cd274, localizado en el cromosoma 9 del genoma humano. Se expresa en células T, células B, células mieloides, células dendríticas, células no hematopoyéticas de órganos no linfoides, y en una gran variedad de tumores (Wang, et al., OncoTargets and Therapy, 2016: 9: 5023-39, Salmaninejad, et al., Journal of Cellular Physiology, 2019: 234: 16824-37).

La interacción PD-1/PD-L1 interviene en diferentes mecanismos, mediante los cuales los tumores generan un ambiente inmunosupresor, y con ello evaden el ataque del sistema inmune. La unión de PD-L1 (presente en la superficie de la célula tumoral) con PD-1 (presente sobre las células T) induce la supresión de la respuesta inmune. Esto ocurre mediante la disminución de la proliferación y diferenciación de los linfocitos T. Además, se produce la activación de la apoptosis, el incremento de la anergia, y la aparición del agotamiento funcional de los linfocitos T. La expresión de PD-L1 es elevada en una amplia gama de neoplasias humanas, y se correlaciona con un mal pronóstico clínico.

Dentro de las estrategias para la terapia del cáncer relacionadas con el ligando PD- L1 se encuentra la inmunoterapia pasiva con anticuerpos monoclonales que bloquean la interacción de la molécula con los receptores naturales. Dentro de este grupo de anticuerpos se encuentran el atezolizumab, el durvalumab y el avelumab, aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de Estados Unidos para el tratamiento de pacientes portadores de diferentes tipos de tumores, por ejemplo, carcinoma urotelial de vejiga, tumor de células no pequeñas de pulmón, carcinoma de células de Merkel y carcinoma renal en estadios avanzados (Lee, et al., Molecules, 2019: 24: 1190). El tratamiento con anticuerpos monoclonales anti PD-L1 muestra cierto éxito clínico, pero requiere de frecuentes administraciones, a elevadas dosis del terapéutico, lo que conduce a altos costos y a efectos adversos como neumonitis, miocarditis, colitis, entre otros (Wang y Xu, JAMIA Open, 2018: 2: 173-8). En muchas ocasiones, la severidad de estas toxicidades provoca el retraso o la interrupción de la terapia pasiva.

Por otro lado, existen aproximaciones de inmunoterapia activa basadas en PD-L1 como antígeno, como las que emplean polipéptidos que abarcan la mayor parte de la proteína o péptidos de la misma. Munir y colaboradores realizaron ensayos in vitro con dos péptidos de PD-L1 , y evaluaron la capacidad de estos péptidos de coestimular células mononucleares de sangre periférica aisladas de pacientes con melanoma avanzado, tratados con una vacuna denominada DCvacc. Esta vacunación consistió en la administración a los pacientes de células dendríticas transfectadas con ácido ribonucleico mensajero (ARNm) que codifica para las moléculas p53 y telomerasa. Las células mononucleares de sangre periférica de estos pacientes mostraron una baja reactividad contra DCvacc. Sin embargo, cuando estas células se coestimularon con los péptidos de PD-L1 denominados PDLongl (identificado en este documento como SEQ ID NO: 23) y PDLong2 (identificado en este documento como SEQ ID NO: 24) hubo un aumento significativo en el número de células T que reaccionaron a la vacuna (Munir, et al., Oncoimmunology, 2013: 2: e23991 ).

Debido al hallazgo anteriormente mencionado, y a datos adicionales, se desarrolló una vacuna peptídica contra PD-L1 basada en el péptido PDLongl . Este péptido, que contiene epitopes para linfocitos T CD4+ y CD8+, se mezcló con el adyuvante Montanide™, y se administró a pacientes con mieloma múltiple en un estudio clínico fase I. Dicha preparación antigénica fue segura e inmunogénica. Los linfocitos obtenidos a partir de las biopsias de piel de los pacientes se activaron en presencia del péptido. Sin embargo, no se detectó la inducción de una respuesta de anticuerpos específicos a PD-L1 en los pacientes inmunizados (Jorgensen, et al., HemaSphere, 2019: 3: 631 -2). Este elemento representa una limitación, debido a que se ha demostrado que la respuesta de anticuerpos es un factor relevante en la eficacia de este tipo de tratamiento. Cuando se generan, los anticuerpos contra este ligando son capaces de bloquear la interacción entre PD-L1 y sus receptores, además inciden de manera positiva en la activación de las células T.

También se ha desarrollado una estrategia de inmunoterapia activa con una vacuna de ácido desoxirhbonucleico (ADN). La misma se basa en la administración oral de una bacteria viva atenuada (de la especie Salmonela typhimurium) transformada con un plásmido que codifica para el dominio extracelular de PD-L1 . Esta forma de inmunoterapia activa se divulgó en la solicitud de patente WO 2018/167290. Aprovechando el mecanismo de infección de la bacteria, se generaron linfocitos CD8+ citotóxicos, que se activaron por células dendríticas que presentaron péptidos de PD-L1 , en el contexto del complejo principal de histocompatibilidad de tipo I. Los linfocitos citotóxicos fueron capaces de eliminar, a su vez, células tumorales PD-L1 positivas. Además de la activación de la rama celular de la respuesta inmune, dicha vacuna indujo una respuesta de anticuerpos anti-PD-L1 , aunque sus niveles fueron relativamente bajos (Wieckowski, et al., Journal of Clinical Oncology, 2018: 36: 74). Este elemento no es favorable para el éxito de esa variante de inmunoterapia activa. En la solicitud de patente WO 2014/183649 se describió la inmunoterapia activa con un polipéptido de fusión basado en el dominio extracelular de PD-L1 (Phe 19 - Glu 228) y la toxina de la difteria. Este segundo segmento del polipéptido se incluyó para favorecer una respuesta inmune mediada por linfocitos T CD4+ robusta. En este caso, el antígeno fue producido en el sistema de expresión de GST (abreviado del inglés Glutathione S-transferase). Este sistema garantiza su correcto plegamiento y conformación tridimensional, lo que asegura la integridad estructural de la proteína de fusión, y de los elementos que la componen. El antígeno vacunal (de 43,5 kDa) mezclado con el adyuvante de Freund indujo una respuesta de anticuerpos específicos al PD-L1 y linfocitos T citotóxicos. Los efectores de esta respuesta inmune inhibieron el crecimiento tumoral y la formación de metástasis (Lin, et al., Molecular Therapy Oncolytics, 2019: 14: 222-32). Sin embargo, los niveles de anticuerpos que se describen son relativamente moderados, más si se tiene en cuenta el uso de un adyuvante tan potente como el adyuvante de Freund.

Por tanto, sigue siendo de interés el desarrollo de antígenos vacunales basados en PD-L1 que tengan mayor inmunogenicidad, a la vez que tengan inhibida su capacidad pro-tumoral. Estos deben ser capaces de generar de manera simultánea una respuesta humoral y celular robusta, sin aumentar las cantidades del antígeno que se administra.

Explicación de la invención

La presente invención resuelve el problema antes planteado, al proveer un antígeno quimérico que comprende el dominio extracelular del ligando 1 del receptor proteico de muerte celular programada 1 (PD-L1 ) humano y que forma un multímero que tiene reducida la capacidad de unión a los receptores PD-1 y CD80 respecto a la forma nativa de PD-L1. Dicho antígeno quimérico está estructuralmente agregado, por lo que la conformación del dominio extracelular de PD-L1 presente en este polipéptido está modificada, si se compara con la conformación que tiene este dominio en el ligando nativo.

En el contexto de la invención se entiende por dominio extracelular de PD-L1 humano a la región comprendida entre los aminoácidos Phe 19 y Arg 238 de PD-L1 . En una materialización de la invención, el antígeno quimérico que comprende el dominio extracelular de PD-L1 humano comprende también un segmento amino terminal para aumentar su expresión en bacterias y un segmento carboxilo terminal para facilitar su purificación por cromatografía de afinidad. En una realización de la invención, el antígeno quimérico tiene una secuencia de aminoácidos que se identifica como SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 95% con la SEQ ID NO: 1 .

En el antígeno que se identifica como SEQ ID NO: 1 en la Lista de Secuencias están incluidos los primeros 47 aminoácidos de la zona amino terminal de la proteína LpdA de Neisseria meningitidis, el dominio extracelular de la molécula de PD-L1 (Phe 19 hasta Arg 238). Ambas regiones se encuentran separadas por 13 aminoácidos que funcionan como un puente entre ambos polipéptidos. La proteína de interés para esta invención se obtuvo a partir del ensamblaje del gen mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa, con el empleo de 18 oligonucleótidos parcialmente sobrelapados. Para el clonaje en el vector de expresión se usaron cebadores diseñados según las características del vector, donde el ADN obtenido se insertó y posteriormente se secuenció. Esta secuencia se comparó con la reportada para el dominio extracelular de PD-L1 , publicada en las bases de datos UniProtKB/Swiss-Prot con identificador Q9NZQ7 (httDs://www.un¡Drot.orq/un¡orot/Q9NZQ7) y se confirmó su naturaleza. El polipéptido obtenido por el método descrito anteriormente puede ser clonado en vectores de expresión en virus, bacterias, levaduras, fagos, plantas o células de mamíferos, cambiando los sitios de inserción según corresponda. Una vez realizada la construcción genética debe pasarse a la verificación de su secuencia empleando los métodos tradicionales de secuenciación automática.

En una realización particular, para obtener el polipéptido quimérico se utilizó el vector pM238 para la bacteria Escherichia coii, que cuenta entre otros elementos con un promotor Trip, la secuencia de 47 aminoácidos correspondiente a la región amino terminal de la proteína LpdA de N. meningitidis (Patente EP0816506B1 ), un segmento de seis histidinas y el terminador T4. Este vector también porta el gen de resistencia a la ampicilina, como gen de selección. El polipéptido de fusión obtenido se denominó PKPD-L1 .

Una vez purificado el polipéptido quimérico, se realizó un análisis por filtración en gel a alta presión, el que mostró un pico mayohtario que eluyó en el volumen de exclusión de la columna, y que constituyó más del 90% del total de la proteína aplicada a la columna. Este pico mayohtario contiene un agregado de la proteína PKPD-L1 con un peso molecular superior a los 670 kDa, lo cual difiere del peso de 26 kDa correspondiente al dominio extracelular de la proteína PD-L1 natural (Ejemplo 2). Inesperadamente, este polipéptido de fusión posee cambios en la estructura que conllevan a la formación de un agregado de alto peso molecular. La formación estable de estos agregados resulta en una vahante de PD-L1 con las siguientes características: (1 ) una disposición espacial de vahas moléculas de PD- L1 que alteran la estequeometría particular de la unión natural PD-1/PD-L1 o CD80/PD-L1 , lo que provoca que el antígeno tenga una interacción reducida a dichos receptores, en comparación con una vahante de PD-L1 natural biológicamente activa; (2) la unión de vahas moléculas de PD-L1 conlleva a la exposición repetida de epítopos como consecuencia de esta agregación, que provoca a su vez, un incremento de la inmunogenicidad, en comparación con la que se obtiene cuando PD-L1 se encuentra como monómero en su estructura tridimensional natural. Estos hallazgos sientan las bases para el desarrollo de una terapia novedosa mucho más efectiva y segura, que puede ser aplicada en el control del cáncer.

La invención revela una composición farmacéutica que comprende el antígeno quimérico que comprende el dominio extracelular de PD-L1 humano (que forma un multímero que tiene reducida la capacidad de unión a los receptores PD-1 y CD80 respecto a la forma nativa de PD-L1 ) y al menos un adyuvante vacunal farmacéuticamente aceptable. La característica distintiva del polipéptido PKPD-L1 de estar estructuralmente agregado, y que en presencia de un adyuvante tenga más inmunogenicidad, sin comprometer el perfil de seguridad, le confiere a este polipéptido ventajas desde el punto de vista inmunológico, al compararlo con otras variantes de PD-L1. También tiene ventajas desde el punto de vista de su seguridad, al ser parte de una vacuna que se administra repetidamente (por la cronicidad del tratamiento) al compararse con la estrategia de inmunoterapia pasiva con anticuerpos específicos. Estos elementos convierten a PKPD-L1 en un antígeno con un alto potencial para el tratamiento de enfermedades que cursan por un incremento de PD-L1. La presente invención describe la inmunoterapia activa específica que se caracteriza por la administración de un polipéptido quimérico recombinante estructuralmente agregado representativo del PD-L1 humano, el cual se combina con un adyuvante.

En una realización de la invención, en la composición farmacéutica el adyuvante vacunal se selecciona del grupo compuesto por adyuvantes oleosos, sales minerales, proteoliposomas y proteoliposomas conjugados a gangliósidos. Con el objetivo de favorecer el desarrollo de la respuesta inmune, el antígeno quimérico de la presente invención puede combinarse con inmunopotenciadores y/o adyuvantes. La naturaleza de estos compuestos suele ser diversa, por ejemplo compuestos de sales minerales (por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, fosfato de calcio); citocinas solubles (por ejemplo, IL-2, IL-15, IL-12, GM-CSF, IFN-gamma, IL- 18); receptores de membrana (por ejemplo CD40, CD154, cadena invariante del complejo principal de histocompatibilidad tipo I, LFA3); saponinas (por ejemplo, QS21 ); oligonucleótidos como el CpG; glicolípidos como los lipopolisacáhdos; formulaciones en forma de emulsiones (por ejemplo, adyuvante de Freund, formulación sintética adyuvante (SAF), MF59, Montanide™), liposomas, nanopartículas y virosomas; adyuvantes microparticulados, poloxámeros, adyuvantes de origen viral (por ejemplo, HBcAg, HCcAg, HBsAg) y bacteriano (por ejemplo, NAcGM3-VSSP, N-GIÍGM3-VSSP); adyuvantes mucosales como enterotoxina termolábil, toxina del cólera y toxinas mutantes (por ejemplo, LTK63 y LTR72).

El inmunógeno puede ser administrado en vehículos aceptados para el uso farmacéutico que no son tóxicos ni presentan efectos terapéuticos, y que son conocidos por los versados en esta rama de la técnica. Los ejemplos presentados en esta invención no restringen de manera alguna el uso de un tampón o combinaciones de tampones en particular, e incluso el uso de excipientes que contribuyan a incrementar su estabilidad.

En otro aspecto, la invención provee el uso del antígeno quimérico que comprende el dominio extracelular del PD-L1 humano y que forma un multímero que tiene reducida la capacidad de unión a los receptores PD-1 y CD80, respecto a la forma nativa de PD-L1 , para la manufactura de un medicamento para el tratamiento del cáncer o sus metástasis. Esto se debe a que, en el polipéptido de fusión PKPD-L1 humano la conformación considerablemente estable y de alto peso molecular incrementó sus propiedades inmunogénicas, con respecto a una vahante sin fusión de la proteína o a una mezcla de péptidos de PD-L1 . La proteína de fusión PKPD- L1 , administrada con los adyuvantes fosfato de aluminio o VSSP (abreviado del inglés Very small size proteoliposomes (proteoliposomas de tamaño muy pequeño) patente US6149921 ; solicitud internacional de patente WO201986056A1 ) da lugar a una vacuna que es capaz de romper la tolerancia del sistema inmune, y de inducir una respuesta inmune humoral y celular específica al PD-L1 nativo. Esta respuesta inmune es superior, cualitativa- y cuantitativamente, si se compara con la inmunoterapia pasiva con anticuerpos monoclonales, o si compara con la respuesta inmunológica generada cuando se emplean como antígenos la proteína PD-L1 nativa o una mezcla de sus péptidos. Este incremento de la inmunogenicidad del polipéptido PKPD-L1 se traduce en un aumento de la actividad anti-tumoral de los efectores de respuesta inmune que se induce, superior a la que se genera por las demás estrategias evaluadas.

Los efectos inhibitorios sobre el crecimiento tumoral demostrados en la invención pueden estar basados en mecanismos diferentes, sin descartar sus posibles combinaciones. La respuesta de anticuerpos anti-PD-L1 policlonales generada por la vacunación es capaz de bloquear la interacción entre el ligando PD-L1 , expresado en la superficie de la célula tumoral, y PD-1 , presente en la membrana de los linfocitos T CD8+ citotóxicos, evitando la inactivación funcional de los mismos. Por otro lado, los anticuerpos generados por la vacunación pueden disminuir, mediante el proceso de internalización, los niveles de PD-L1 sobre la superficie de la célula tumoral. La disminución del PD-L1 podría conllevar a que la capacidad de la célula maligna de inactivar a los linfocitos T CD8+ citotóxicos disminuya. Por otro lado, la baja expresión del ligando PD-L1 en la célula tumoral propicia que la misma adquiera un fenotipo similar al epitelial, y por tanto, modula de manera negativa su capacidad metastásica. La naturaleza policlonal de la respuesta de anticuerpos, que se induce como resultado de la inmunización, es un factor importante en la efectividad de los eventos biológicos antes descritos.

Además, la inmunización con PKPD-L1 indujo linfocitos citotóxicos específicos contra las células del tumor primario y sus metástasis, las que potencialmente presentan los péptidos de PD-L1 en el contexto del complejo principal de histocompatibilidad de tipo I. La ventaja que ofrece la inmunización con la proteína de fusión PKPD-L1 , además de generar un mayor número de linfocitos, es la posibilidad de activar tanto a linfocitos T CD4+ como CD8+ y con ello lograr diversidad de clones de los mismos. Al inmunizar con una proteína quimérica que comprende más de 200 aminoácidos de la región extracelular de la proteína PD-L1 se asegura: (1 ) la presentación simultánea de epitopes lineales activadores de linfocitos CD4+ auxiliadores y de linfocitos CD8+ citotóxicos, lo cual garantiza una respuesta inmune más efectiva contra los tumores; (2) la presencia de vahos epitopes restringidos para linfocitos CD4+ auxiliadores y para linfocitos CD8+ citotóxicos, que garantiza la presencia de diferentes clones de células para ambos tipos celulares, lo que pudiera traducirse igualmente en una respuesta inmune más efectiva contra los tumores; (3) la presencia de vahos epitopes también permite que, en el contexto de vacunación en una población de pacientes con diferentes alelos del complejo principal de histocompatibilidad de tipo I o II, se incremente el número de individuos con respuesta humoral o celular o ambas, específicas a PD-L1 . Estos elementos constituyen provechosas ventajas que no existen o están muy limitadas cuando se inmuniza con péptidos restringidos a un alelo del complejo principal de histocompatibilidad.

Todas estas propiedades de la respuesta inmune que se genera tras la inmunización con la proteína PKPD-L1 adquieren mayor relevancia cuando se compara con la estrategia de inmunoterapia activa con PD-L1 nativo. Un elemento importante es que se logra una respuesta inmune superior con la misma cantidad de antígeno. Este rasgo implica que la estrategia de inmunoterapia que involucra a PKPD-L1 tenga ventajas desde el punto de vista productivo y de seguridad en humanos. Debido a que el polipéptido PKPD-L1 es biológicamente menos activo, si se compara con la vahante nativa, la administración de altas dosis de antígeno no compromete su perfil de seguridad.

La invención también provee un método para el tratamiento del cáncer o sus metástasis en un individuo que lo necesita, este se caracteriza porque se administra una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende a) el antígeno quimérico que comprende el dominio extracelular de PD- L1 humano y que forma un multímero que tiene reducida la capacidad de unión a los receptores PD-1 y CD80, respecto a la forma nativa de PD-L1 , y b) al menos un adyuvante vacunal farmacéuticamente aceptable. Este método, que involucra la inmunización con el mencionado antígeno quimérico, disminuye de manera más efectiva el desarrollo del tumor primario y evita la ocurrencia de metástasis a distancia, lo que ofrece ventajas para el aumento de la supervivencia de los pacientes con cáncer.

En una materialización de la invención, el método que involucra la administración de la composición que comprende el antígeno quimérico se combina con inmunoterapia pasiva o con la terapia estándar del cáncer de forma simultánea o secuencial. Este método de tratamiento puede ser utilizado como terapia de primera o segunda línea, en asociación o no con otros agentes anti-tumorales químicos, radiológicos o biológicos.

En una realización de la invención, la administración de la vacuna que comprende el antígeno quimérico se combina con la inyección en bolo, o con la liberación controlada, de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos específicos para antígenos relevantes al crecimiento tumoral o para antígenos involucrados en la inmunosupresión inducida por los tumores. Las preparaciones vacunales que comprenden el antígeno quimérico son administradas a un mamífero, preferentemente a un humano, pero sin descartar su uso veterinario, en una cantidad terapéuticamente efectiva. La mezcla de antígeno y adyuvante, también conocido como inmunógeno, puede administrarse por diversas rutas, entre ellas la vía subcutánea, intramuscular, mucosal, peritoneal, intralinfática, tópica o por inhalación. En una realización preferida, la vía de administración del inmunógeno que comprende el antígeno quimérico PKPD-L1 es la subcutánea. Los ejemplos presentados en esta invención no restringen el empleo del antígeno a un adyuvante o por una vía de administración particular. Las dosis de antígeno a emplear pueden establecerse de acuerdo a diferentes parámetros. Estas dosis dependen de la vía de administración, de la patología en cuestión, y del período de tratamiento. Un cambio en el intervalo de administración de las dosis, o una ruta de administración diferente a las descritas en los ejemplos que siguen, no se apartan de la esencia de la presente invención, siendo posible lograr una optimización de los esquemas de inmunización con el fin de obtener una mejor respuesta inmune específica a PD-L1 .

En una materialización de la invención la inmunoterapia activa con el antígeno quimérico se combina con la inmunoterapia pasiva que se realiza con anticuerpos contra el ligando PD-L1 humano o contra el receptor proteico PD-1 humano.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Respuesta de anticuerpos generados tras la inmunización de ratas con el polipéptido PKPD-L1 en combinación con los adyuvantes sNAcGM3-VSSP (A) y fosfato de aluminio (B), medida por ELISA. Los niveles de anticuerpos se expresan como unidades de absorbencia a 450 nm para la dilución 1 :250 de los sueros evaluados. Letras diferentes representan significación estadística según la prueba de Tukey.

Figura 2. Capacidad de los sueros de ratas inmunizadas con la proteína PKPD-L1 en combinación con los adyuvantes sNAcGM3-VSSP (A) y fosfato de aluminio (B) de bloquear la interacción entre el receptor PD-1 y su ligando PD-L1. Las determinaciones se realizaron por ELISA.

Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos de realización Ejemplo 1. Clonaje y expresión de la proteína recombinante PKPD-L1 y de la variante PD-L1 ^CHO .

Se amplificó el ADN correspondiente a la región madura del dominio extracelular de PD-L1 humana, según la secuencia de la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot con identificador Q9NZQ7 (https://www.uniprot.org/uniprot/Q9NZQ7). Se diseñaron 18 oligonucleótidos parcialmente sobrelapados (SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 19). Para ello, se amplificó y se ensambló el gen completo, mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa, utilizando el juego de reactivos KOD Hot Start Master Mix™ (Novagen). Posterior al ensamblaje del gen que codifica para el dominio extracelular de PD-L1 , se adicionaron los sitios de restricción de las enzimas, para la clonación en el vector pM238, con el uso de dos cebadores diseñados para lograr tal propósito (SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21 ). Estos cebadores contenían los sitios de restricción para las enzimas Nhel y BamH I, respectivamente. Con la inclusión de la región madura de PD-L1 (aminoácidos de Phe 19 a Arg 238) en el vector pM238, se fusionó este segmento a 47 aminoácidos del extremo amino terminal de la proteína LpdA de N. meningitidis (Patente EP0816506). Estas regiones están conectadas por 13 aminoácidos que funcionan como un puente. Hacia el extremo carboxilo terminal del polipéptido de fusión se ubicó una región de seis histidinas, para facilitar la purificación del mismo. El plasmidio resultante del clonaje se denominó pPKPD-L1. La secuencia de nucleótidos de este plasmidio se verificó en un 100%. En la Lista de Secuencias se identifica como SEQ ID NO: 22 la secuencia nucleotídica de la región codificante para la proteína recombinante PKPD-L1. Por su parte, al polipéptido de fusión se le denominó PKPD-L1 , y su secuencia de aminoácidos se identifica en la Lista de Secuencias como SEQ ID NO: 1 .

Para la expresión del polipéptido PKPD-L1 , bacterias E. coli de la cepa BL21 transformadas con el plásmido pPKPD-L1 se crecieron durante 3 h a 37 ^S C en un termentador de 5 L. Se empleó medio mínimo M9, suplementado con hidrolizado de caseína 10%, glucosa 40% y ampicilina 100 pg/mL (pH 7,0). Para la inducción de la expresión de la proteína PKPD-L1 se adicionaron 40 pg de ácido 3|3-indolacrílico por mL de medio, y el cultivo se dejó crecer a 28 ^S C durante 16 horas.

Por otro lado, con el objetivo de tener un polipéptido que fuera representativo de PD-L1 nativo, se realizó una construcción genética para su expresión en células de mamíferos. Esta variante de PD-L1 nativo (denominada PD-L1 ^CHO ) se obtuvo al transfectar células CHO con ADN que codifica para el dominio extracelular del ligando (Phe 19 hasta Glu 228) insertado en el vector pcDNA 3.1/ myc-His C (Invitrogen). El sobrenadante del cultivo celular se recogió siete días después de alcanzar el 100% de confluencia, y la proteína de interés se purificó mediante cromatografía con una resina Ni-NTA (Qiagen).

Ejemplo 2. Obtención, purificación y evaluación del estado de agregación del polipéptido PKPD-L1.

La biomasa bacteriana obtenida por fermentación (como se describe en el Ejemplo 1 ) se sometió a ruptura de la estructura celular, mediante ultrasonido, en tampón fosfato (NaH ₂ PO4 50 mM; NaCI 300 mM; pH 7,8). La fracción insoluble de la ruptura se resuspendió en el tampón fosfato, en condiciones desnaturalizantes, con 6 M de urea. La proteína PKPD-L1 , contenida en la fracción soluble de la extracción, se purificó mediante cromatografía de afinidad a quelatos metálicos, mediante el empleo de una matriz Ni-NTA, y luego se sometió a una filtración en gel.

Para caracterizar los extremos carboxilo- y amino-terminal del polipéptido, y verificar su secuencia, se empleó la técnica de espectrometría de masa en un espectrómetro de configuración híbrida ortogonal QTOF-2TM. Los espectros de masas ESI-MS y ESI-MS/MS permitieron comprobar que la proteína se encuentra íntegra, tal como se diseñó, y se verificó el 94% de su secuencia. Los extremos carboxilo- y amino- terminal de la proteína se secuenciaron, a partir del análisis de la digestión con la endoproteinasa Glu-C, y su secuencia de aminoácidos coincidió con la esperada.

Con el objetivo de verificar el estado de agregación del polipéptido PKPD-L1 purificado, este se sometió a una filtración en gel a alta presión, en una columna Superdex™ 200 (GE Healthcare Life Sciences™), previamente equilibrada en tampón fosfato salino (PBS). Para este experimento se empleó un patrón de peso molecular comercializado por Biorad™, cuya composición se muestra en la Tabla 1 .

Tabla 1. Resultados de la estimación del peso molecular de los polipéptidos PD- L1 ^CHO y PKPD-L1.

Tiempo de Retención

Proteína Peso Molecular (kDa)

(minutos)

Tiroglobulina bovina ³ 670,0 15,9

Globulina y bovina ³ 158,0 23,1

Ovoalbúmina de pollo ³ 44,0 26,3

Mioglobina equina ³ 17,0 29,3

Vitamina B12 ^a 1 ,35 36,4 D-L1 ^CH0 32, 0 ^b 27,0

PKPD-L1 1078,0 ^b 15,7 ^a : Proteínas de peso molecular conocido que forman parte del patrón de peso molecular. ^b peso molecular estimado a partir de la curva del patrón.

Como resultado de la evaluación mediante filtración en gel, se obtuvo un pico mayoñtaño que eluyó en el volumen muerto de la columna, y constituyó más del 90% del total de la proteína PKPD-L1 aplicada. Este pico contiene agregados de la proteína con pesos moleculares superiores a los 670 kDa (molécula de mayor peso molecular del patrón empleado). A partir de la estimación del peso de las proteínas del patrón y sus tiempos de retención, se consideró que el agregado tiene alrededor de 1078 kDa. Este valor no se corresponde con el peso molecular teórico esperado para el monómero del polipéptido PKPD-L1 , que es de 31 kDa, de lo cual se infiere que la preparación se compone de multímeros del polipéptido de fusión. El valor estimado para el agregado de PKPD-L1 (1078 kDa) también es superior a los 32 kDa del ligando PD-L1 ^CHO , que posee la conformación nativa y es biológicamente activo.

Ejemplo 3. Evaluación de la capacidad de unión de la proteína PKPD-L1 a los receptores PD-1 y CD80.

La capacidad de la proteína quimérica PKPD-L1 de unirse a los receptores PD-1 y CD80 se midió mediante un ELISA de tipo indirecto, y con el empleo de vahantes biológicamente activas de estas moléculas en forma de proteínas de fusión a Fe. Las proteínas PD-1 /Fe (RyD Systems™) o CD80/Fc (RyD Systems™) se inmovilizaron en placas de ELISA. Luego se adicionaron las proteínas PD-L1/Fc (RyD Systems™), PKPD-L1 y PD-L1 ^CHO en diferentes concentraciones. Para detectar la unión de los receptores a sus ligados se empleó un anticuerpo específico al PD-L1 humano conjugado a biotina (RyD Systems™), y después se adicionó un conjugado estreptavidina-peroxidasa (Sigma™).

Como se observa en la Tabla 2, la unión de PD-1 /Fe y CD80/Fc a los ligandos PD- L1/Fc y PD-L1 ^CHO fue similar, lo que evidencia que la proteína PD-L1 ^CHO expresada en células de organismos superiores tiene propiedades similares a una proteína disponible comercialmente que es biológicamente activa. Sin embargo, para el polipéptido de fusión PKPD-L1 , la unión al receptor PD-1 fue 1420 veces más débil que la encontrada para PD-L1/Fc. Adicionalmente, la unión del polipéptido de fusión PKPD-L1 al receptor CD80/Fc fue inferior en 689 veces con respecto a la unión de PD-L1/Fc al mismo receptor.

Tabla 2. Concentración efectiva que provoca el 50% de la unión máxima (EC ₅ o) para la interacción de PD-1 /Fe y CD80/Fc con variantes de PD-L1 .

PD-1 /Fe CD80/FC

PD-L1/FC 201 ng/mL 529 ng/mL

PD-L1 ^CH0 231 ng/mL 540 ng/mL

PKPD-L1 284901 ng/mL 364452 ng/mL Estos resultados evidencian que el polipéptido PKPD-L1 tiene una interacción reducida con los receptores PD-1 y CD80, en comparación con la variante de PD-L1 natural biológicamente activa. Esto sugiere que la disposición espacial de muchos monómeros de PKPD-L1 , que forman el agregado de alto peso molecular, altera la estequiometría particular de la unión natural PD-1/PD-L1 o CD80/PD-L1. Este elemento es favorable, debido a que reduce el riesgo asociado a administrar una proteína con elevada actividad pro-tumoral.

Ejemplo 4. Respuesta de anticuerpos generados tras la inmunización con la proteína PKPD-L1.

Para evaluar la inmunogenicidad del polipéptido PKPD-L1 , se inmunizaron ratas Wistar hembra, por vía subcutánea, con este polipéptido en combinación con dos adyuvantes. Además, en este experimento se empleó como control la mezcla de dos péptidos sintéticos de PD-L1 (identificados como SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 en la Lista de Secuencias) conjugados a la proteína LpdA de N. meningitidis. También se evaluó la inmunogenicidad en ratas del polipéptido biológicamente activo PD-L1 ^CHO . En todos los casos, cada rata recibió 200 pg de polipéptido o de conjugado por dosis. Tanto para PKPD-L1 , para PD-L1 ^CHO como para la mezcla de péptidos conjugados se emplearon como adyuvantes el fosfato de aluminio (Brenntag Biosector™) y sNAcGM3-VSSP, adyuvante desarrollado por el Centro de Inmunología Molecular (CIM), Habana, Cuba. Como control negativo, se inmunizaron ratas con la mezcla de excipiente (Tris 40 mM pH 8,0) y cada adyuvante.

Las inmunizaciones que incluían el adyuvante sNAcGM3-VSSP (a 200 pg/dosis) se aplicaron en un esquema de una vez por semana, para un total de 8 inmunizaciones. Por otra parte, las mezclas con fosfato de aluminio (0,7 mg de AL ³ 7dosis) se administraron cada dos semanas, para un total de 4 inmunizaciones. Los sueros se extrajeron una semana después de la última inmunización (según el adyuvante).

Para detectar la respuesta de anticuerpos específicos al PD-L1 humano se realizó un ELISA de tipo indirecto. La proteína PD-L1/Fc (RyD Systems™) se capturó con anticuerpos de carnero específicos a la región Fe de una IgG humana, inmovilizados en una placa de ELISA. Los sueros de las ratas se adicionaron a una dilución de 1 :250. La detección se realizó con un anticuerpo policlonal de carnero específico a IgG de rata (Sigma™) conjugado. La Figura 1 muestra los resultados de la evaluación de los niveles de anticuerpos IgG específicos al PD-L1 humano, expresados en unidades de absorbencia. La administración del polipéptido PKPD-L1 , que forma agregados de alto peso molecular, en combinación con los adyuvantes mencionados, fue capaz de generar una respuesta de anticuerpos que reconocen a la proteína biológicamente activa PD-L1/Fc. Los niveles de anticuerpos generados al inmunizar con el polipéptido PKPD-L1 en combinación con sNAcGM3-VSSP fueron significativamente superiores a los inducidos por PD-L1 ^CHO (prueba de Tukey, p< 0,0001) y por la mezcla de péptidos (prueba de Tukey, p< 0,0001) con este mismo adyuvante. Se obtuvieron resultados similares cuando se empleó el adyuvante fosfato de aluminio, los títulos de anticuerpos específicos generados por el polipéptido PKPD-L1 fueron superiores a los inducidos por las otras dos vahantes, con significación estadística (prueba de Tukey 's, p< 0,0001). Estos dos resultados indican que el polipéptido PKPD-L1 tiene una mayor inmunogenicidad, lo que puede explicarse por la elevada agregación del polipéptido de fusión. En este se produce un incremento en el número de los determinantes antigénicos, con respecto a la proteína PD-L1 nativa. Además, se pueden producir cambios estructurales que favorecen la exposición de determinantes que están en el centro de la estructura, y que pueden inducir una respuesta inmune superior, al existir una baja tolehgenización de los mismos.

Ejemplo 5. Evaluación de la capacidad de los sueros de ratas inmunizadas con PKPD-L1 de bloquear la interacción PD-1/ PD-L1.

La capacidad de los sueros de ratas inmunizadas con PKPD-L1 de bloquear la interacción de PD-L1 con su receptor PD1 se evaluó en un ensayo tipo ELISA de competencia. Los sueros obtenidos en el experimento que se describe en el Ejemplo 4, a la dilución de 1 :100, se incubaron durante 2 h a 37 ^S C con 500 ng/mL de la proteína PD-L1/Fc. Esta mezcla se adicionó a una placa de ELISA con la proteína PD-1 /Fe capturada (en una condición similar a la forma que se capturó PD- L1 en el Ejemplo 4). La cantidad de PD-L1 que se unió a PD-1 capturado en la placa se detectó con un anticuerpo específico a PD-L1 biotinilado, y con la adición posterior de conjugado de estreptavidina-peroxidasa. El valor de absorbencia de unión máxima se obtuvo a partir de la condición en la cual la interacción de PD-1 con PD-L1 ocurrió en ausencia de competidor. La inhibición de la interacción de PD- 1 con PD-L1 que producen los sueros se expresó como porcentaje, mediante el empleo de la siguiente fórmula: % de inhibición = 100%-[(Absorbancia a 450nm de la muestra)/(Absorbancia a 450nm de la unión máxima))*100]

La Figura 2 muestra los resultados, expresados en porcentaje, de la evaluación de la capacidad de los sueros de ratas inmunizadas con PKPD-L1 , PD-L1 ^CHO y la mezcla de péptidos de PD-L1 conjugados de bloquear la interacción entre el receptor PD-1 y su ligando PD-L1. La administración de PKPD-L1 en combinación con sNAcGM3-VSSP o fosfato de aluminio generó una respuesta de anticuerpos que poseen elevada capacidad de bloqueo de la unión del receptor PD-1 con su ligando PD-L1. Esta actividad bloqueadora fue superior, en términos de porcentaje de inhibición, a la obtenida con los anticuerpos generados con las vahantes PD- L1 ^CHO y la mezcla de péptidos de PD-L1 conjugados (prueba de Tukey, p< 0,0001) en combinación con los mismos adyuvantes.

Ejemplo 6. Evaluación de la capacidad de los sueros de ratas inmunizadas con PKPD-L1 de bloquear la interacción de PD-L1 con anticuerpos monoclonales contra este ligando.

Para evaluar si los anticuerpos inducidos tras la inmunización de ratas con el antígeno quimérico PKPD-L1 están dirigidos a diferentes determinantes antigénicos de PD-L1 se realizó un ELISA de competencia. Para ello, se evaluó la capacidad de estos sueros (provenientes del experimento del Ejemplo 4) de desplazar la unión de los anticuerpos monoclonales atezolizumab (MedChemExpress™), durvalumab (Selleckchem™) y avelumab (MedChemExpress™) a PD-L1. Estos tres anticuerpos anti-PD-L1 están aprobados por la FDA para el tratamiento de diferentes tumores, y se unen a diferentes epitopes de PD-L1 (Tan, et al., Protein & cell, 2018: 9: 135-9). Para realizar el ELISA de competencia, primeramente, los anticuerpos monoclonales se conjugaron a biotina, y luego se procedió a determinar la EC ₅₀ de la interacción de PD-L1 y dichos AcM biotinilados. Para ello, la proteína quimérica PD-L1/Fc se inmovilizó en la placa de ELISA. Posteriormente, se adicionaron los AcM biotinilados en diferentes concentraciones, y la unión antígeno-anticuerpo se detectó con un conjugado de estreptavidina- peroxidasa. Para las interacciones de PD-L1 con los anticuerpos atezolizumab, durvalumab y avelumab, se obtuvieron EC ₅ O de 5,2 ng/mL; 5,8 ng/mL y 3,1 ng/mL, respectivamente. Una vez establecidas las condiciones, y mediante el mismo sistema ELISA, se pusieron a competir los anticuerpos presentes en los sueros de las ratas inmunes (dilución de los sueros 1 :25) con los anticuerpos monoclonales en las EC ₅₀ mencionadas. Se evaluó la condición en la cual la interacción de PD-L1 con cada uno de los anticuerpos monoclonales ocurrió en ausencia de sueros de rata, donde se alcanza una unión máxima, medida como absorbencia. La inhibición que producen los sueros de ratas inmunizadas con PKPD-L1 adyuvada en fosfato de aluminio sobre la interacción de los anticuerpos monoclonales con PD-L1 se expresó como porcentaje (con el empleo de la fórmula descrita en el Ejemplo 5). Los resultados del ensayo se reflejan en la Tabla 3. Se utilizaron sueros de las ratas inmunizadas con Tris 40 mM pH 8,0 (excipiente) y fosfato de aluminio como control negativo.

Tabla 3. Capacidad de los sueros de ratas inmunizadas con PKPD-L1 de bloquear la interacción entre PD-L1 y anticuerpos monoclonales anti-PD-L1 .

Porcentaje de bloqueo (Media ± SD) atezolizumab durvalumab avelumab

Control negativo 3,49±2,34% 3,80±2,67% 1 ,67±1 ,30%

PKPD-L1 52,26±4,33% 57,09±4,84% 36,11±4,56%

SD: desviación estándar

La Tabla 3 muestra que la administración del polipéptido PKPD-L1 en las ratas (en combinación con el adyuvante fosfato de aluminio) es capaz de generar anticuerpos que bloquean la unión de PD-L1 con los anticuerpos monoclonales atezolizumab, durvalumab y avelumab. El porcentaje de bloqueo tuvo diferencias significativas con respecto al obtenido en el grupo control negativo (prueba t-student no pareada, p< 0,0001). Este resultado indica que la respuesta policlonal que se genera contra PD-L1 humano, tras la inmunización con el antígeno PKPD-L1 en combinación con un adyuvante, está dirigida a diferentes determinantes antigénicos de esa proteína, al ser capaz de desplazar la unión de tres anticuerpos monoclonales a PD-L1 que reconocen diferentes epitopes de este ligando. Además, la respuesta policlonal inducida por la inmunización está dirigida a epitopes relevantes en PD-L1 , debido a la generación de anticuerpos bloqueadores de los anticuerpos monoclonales atezolizumab, durvalumab y avelumab, aprobados en la clínica para el tratamiento de diferentes tipos de tumores. Ejemplo 7. Evaluación de la capacidad de bloqueo de la interacción PD-1/PD- L1 exhibida por IgG purificada del suero de primates no humanos inmunizados con PKPD-L1.

El objetivo del experimento fue evaluar si los anticuerpos inducidos tras la inmunización con el polipéptido PKPD-L1 eran capaces de bloquear los efectos biológicos mediados por la interacción de PD-1 con PD-L1 en un ensayo en células. Con este propósito, se empleó el ensayo J1250 de Promega™, que remeda el mecanismo de acción de biológicos que bloquean la interacción entre estas dos moléculas. El ensayo se basa en dos líneas celulares genéticamente modificadas. La primera es la llamada célula efectora, que expresa en su membrana celular PD-1 humana y un receptor de células T (RCT) que transduce señales que inducen luminiscencia. La segunda, denominada célula presentadora, expresa PD-L1 humana y una proteína activadora del RCT. Cuando se realiza un cultivo simultáneo de ambas líneas celulares, la interacción de PD-1 con PD-L1 inhibe la inducción de luminiscencia mediada por la señalización del RCT. Sin embargo, la presencia de biológicos inhibidores del eje PD-1/PD-L1 induce el efecto contrario.

La capacidad del polipéptido PKPD-L1 de inducir una respuesta inmune relevante, en un contexto más autólogo, se evaluó en primates no humanos (Chlorocebus aethiops sabaeus). Para ello, se inmunizaron los primates, por vía subcutánea, con 200 pg de polipéptido quimérico adyuvado con fosfato de aluminio. Además, en este experimento se empleó la mezcla de dos péptidos sintéticos de PD-L1 (identificados como SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 en la Lista de Secuencias) conjugados a la proteína LpdA de N. meningitidis (200 pg/dosis) adyuvada con fosfato de aluminio. Las mezclas adyuvadas (cada dosis tenía 0,7 mg de Al ³⁺ ) se administraron cada dos semanas, para un total de 4 inmunizaciones. Los sueros se extrajeron una semana posterior a la cuarta inmunización.

Los sueros obtenidos de cada grupo experimental (n=5) se mezclaron, y las IgG se purificaron por cromatografía de afinidad con la proteína A (GE Healthcare™). El ensayo basado en células se realizó según instrucciones del fabricante, y se empleó el atezolizumab como control positivo del bloqueo de la interacción PD-1/PD-L1. Además, cada condición que se evaluó en el sistema de célula efectora PD-17célula presentadora PD-L1 ⁺ , también fue sometida al sistema control negativo y de máxima luminiscencia de célula efectora PD-17célula presentadora PD-L1 ⁺ . En cada caso se evaluaron 6 réplicas por cada condición. Treinta minutos posteriores al cultivo simultáneo de ambas líneas celulares se leyó la luminiscencia. En este ensayo, la actividad de bloqueo de la interacción de PD-1/PD-L1 se evidencia por el incremento en la actividad de la luciferasa. Por consiguiente, la actividad bloqueadora es directamente proporcional al incremento de los valores de luminiscencia.

Tabla 4. Actividad biológica in vitro mostrada por la fracción IgG de antisueros de primates no humano específicos a PD-L1.

Concentración LUMINISCENCIA (url)

(pg/mL) Media ± SD

IgG Excipiente/FA 500 375130 ± 1087

IgG PKPD-L1/FA 500 1335475 ± 46172

IgG MP/FA 500 525030 ± 1401 atezolizumab 0,1 240708 ± 1253 atezolizumab 20 1470587 ± 36617

FA: Fosfato de aluminio más excipiente Tris 40mM pH 8,0. MP: Mezcla de péptidos conjugados, url: unidades relativas de luminiscencia.

La Tabla 4 muestra que la administración del polipéptido PKPD-L1 , en forma de agregados de alto peso molecular, con el adyuvante fosfato de aluminio, es capaz de generar anticuerpos IgG biológicamente activos, con diferencias significativas respecto al grupo control negativo (prueba t-student no pareada, p< 0,0001). La luminiscencia detectada para la fracción de IgG purificada del suero de los primates inmunizados con el polipéptido PKPD-L1 fue 3,56 veces superior con respecto a la obtenida para su grupo control negativo. Para la estrategia de inmunización activa con péptidos de PD-L1 , esta relación fue de 1 ,4 veces con respecto al placebo correspondiente (prueba de Mann-Whitney, p< 0,0022). Este resultado indica una actividad biológica superior de la vahante PKPD-L1 con respecto a la mezcla de péptidos. La actividad biológica encontrada para la fracción IgG purificada del suero de los monos inmunizado con el polipéptido PKPD-L1 fue similar a la observada en el control positivo atezolizumab a 20 pg/mL. Ejemplo 8. Evaluación de la capacidad de los linfocitos de ratones inmunizados con el polipéptido PKPD-L1 de lisar células tumorales que expresan PD-L1.

Con el objetivo de evaluar si el polipéptido PKPD-L1 inducía respuesta de linfocitos T citotóxicos, se desarrolló un ensayo en el que los linfocitos aislados del bazo de ratones inmunocompetentes inmunizados se co-cultivaron con células tumorales, y la actividad citotóxica se expresó como porcentaje de lisis de estas últimas. Para el experimento se emplearon las líneas tumorales MC38 y CT26, que son singénicas con las cepas de ratón C57BI6 y Balb/c, respectivamente. Estas células expresan PD-L1 en membrana, y pueden presentar péptidos de esta proteína asociados al complejo principal de histocompatibilidad de tipo I.

Los ratones C57BI6 y Balb/c se inmunizaron por vía subcutánea, con 100 pg de diferentes variantes de PD-L1 en combinación con el adyuvante sNAcGM3-VSSP (100 pg). Los animales (n=5) recibieron una administración a la semana de las preparaciones de PD-L1 ^CHO , PKPD-L1 o de la mezcla de péptidos conjugados en combinación con el adyuvante mencionado, durante dos meses. Una semana posterior a la última inmunización, el bazo de los ratones se extrajo quirúrgicamente, se realizó la perfusión del órgano y se lisaron los eritrocitos. Posteriormente, los linfocitos se resuspendieron en medio RPMI suplementado con suero fetal bovino al 10%, y se procedió al conteo de los mismos (células efectoras), mediante el mareaje con un anticuerpo anti-CD3 de ratón (e-Bioscience™). Se emplearon, como células diana, la línea celular MC38 y CT26, que se marcaron con el reactivo fluorescente éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE). Las células se resuspendieron en medio RPMI y se realizó el conteo por citometría de flujo.

Una vez preparadas las células efectoras y las células diana, se mezclaron 2x10 ⁶ linfocitos CD3 ⁺ de ratones C57BI6 con 2x10 ⁴ células MC38 (relación 100:1). En el caso específico de los linfocitos extraídos del bazo de ratones Balb/c, estos se activaron previamente in vitro durante 6 días con 30 pg/mL de la proteína PD-L1 nativa (PD-L1/Fc), con la adición de 10 unidades/mL de IL-2 al tercer día. Luego de la activación, y empleando la misma relación, se co-incubaron las células efectoras con células diana CT26. Se empleó un control negativo de lisis, en el cual las células diana se incubaron con medio RPMI suplementado con suero fetal bovino, en lugar de adicionar células efectoras. Después de 4 h de incubación de las células efectoras con las células diana, la mezcla se resuspendió en PBS y se procedió al conteo por citometría de flujo (citómetro PARTEC, Alemania) de células diana positivas a CFSE. Los resultados se muestran en la Tabla 5. La citotoxicidad se expresó como porcentaje de lisis de las células diana (células tumorales) según la expresión:

% de lisis=100%-[(número de células dianas CFSE positivas incubadas con células efectoras)/(número de células dianas CFSE positivas incubadas con medio ) x100]

Tabla 5. Actividad citotóxica sobre células tumorales de los linfocitos extraídos del bazo de ratones inmunizados con diferentes vahantes de PD-L1 .

Porcentaje de lisis de las células diana

Inmunógeno MC38 CT26

Media ± SD Media ± SD

Excipiente + VSSP 4,72 ± 4,61 % 1 ,56 ± 2,28%

PD-L1 ^CH0 + VSSP 21 ,28 ± 7,30% 9,68 ± 2,60%

PKPD-L1 + VSSP 53,92 ± 12,09% 19,82 ± 4,84%

Mezcla de péptidos + VSSP 16,62 ± 3,92% 3,52 ± 2,88%

Excipiente: Tris 40 mM pH 8,0. VSSP: sNAcGM3-VSSP. SD: Desviación estándar

La Tabla 5 muestra que la administración del polipéptido PKPD-L1 en forma de agregados de alto peso molecular incide de manera positiva sobre la inmunidad celular. En el experimento con la cepa C57BI6 se detectó un incremento significativo de la lisis de las células tumorales MC38 por los linfocitos provenientes del bazo de los grupos inmunizados con PD-L1 ^CHO (prueba de Tukey, p=0,0169); con PKPD-L1 (prueba de Tukey, p<0,0001) y con la mezcla de péptidos (prueba de Tukey, p=0,0332) con respecto al grupo control. El polipéptido PKPD-L1 fue capaz de generar linfocitos con una actividad citotóxica significativamente superior a la de los linfocitos que se obtienen para la vahante nativa PD-L1 ^CHO (prueba de Tukey, p<0,000T) o para la mezcla de péptidos de PD-L1 (prueba de Tukey, p<0,000T).

En el experimento con la cepa Balb/c se detectó un incremento significativo de la lisis de las células tumorales CT26 por los linfocitos provenientes del bazo de los grupos inmunizados con PD-L1 ^CHO (prueba de Tukey, p=0,0065) y con PKPD-L1 (prueba de Tukey, p<0,0001) con respecto al grupo control. La mezcla de péptidos no indujo linfocitos con actividad citotóxica (prueba de Tukey, p=0,7857). El polipéptido PKPD-L1 también evidenció superioridad en la inmunogenicidad en esta cepa de ratón con diferente fondo genético. Los linfocitos inducidos tuvieron mayor actividad que los linfocitos aislados de los ratones inmunizados con la vahante nativa PD-L1 ^CHO (prueba de Tukey, p=0,0009).

Ejemplo 9. Efecto antitumoral y antimetástasico en el modelo murino de carcinoma de mama F3II tras la inmunización con variantes de PD-L1.

La actividad antitumoral y antimetastásica desarrollada tras la administración de diferentes vahantes de PD-L1 en combinación con el adyuvante sNAcGM3-VSSP se evaluó mediante el empleo del modelo de carcinoma de mama F3II. Los ratones Balb/c hembra (9 por grupo) se inmunizaron por vía subcutánea con 100 pg de antígeno adyuvado con sNAcGM3-VSSP, según el grupo, tal como se describe en el Ejemplo 8. Células de la línea celular F3II, generada a partir de un carcinoma de mama con capacidad de realizar metástasis espontáneas a pulmón, se inocularon cuatro días después de la cuarta inmunización. El inoculo tumoral consistió en 2x10 ⁵ células, que se administraron por vía subcutánea en la región dorsal contraria al sitio de inmunización. Una vez implantadas las células tumorales y tras la detección de un crecimiento medióle se procedió a la determinación del volumen tumoral.

A los 35 días del reto tumoral se realizó la eutanasia de los ratones y la posterior extracción de los pulmones. Para el conteo de las macrometástasis los pulmones se sumergieron, al menos durante 48 h, en solución Bouin (Sigma™). Las macrometástasis se contaron empleando un estereoscopio (Zeiss™). Los resultados se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6. Volumen tumoral y número de macrometástasis en ratones inmunizados con vahantes de PD-L1 e inoculados con la línea tumoral F3II.

Inmunógeno VT (mm ³ ) Número de metástasis

Media ± SD Media ± SD

Excipiente + VSSP 362 ± 127 11 ,0 ± 4,0

PD-L1 ^CH0 + VSSP 222 ± 68 2,22 ± 1 ,92

PKPD-L1 + VSSP 83 ± 18 0,67 ± 1 ,84

MP + VSSP 279 ± 73 8,78 ± 4,30

Excipiente: Tris 40 mM pH 8,0. VSSP: sNAcGM3-VSSP. MP: mezcla de péptidos de PD-L1 humana. VT: Volumen tumoral. SD: Desviación estándar La Tabla 6 muestra las mediciones del volumen del tumor, realizadas 18 días después del reto con las células tumorales de ratón F3II. La administración del polipéptido PKPD-L1 con el adyuvante indicado redujo, de manera significativa, el crecimiento del tumor (prueba de Tukey, p< 0,0001), al compararse con el grupo control negativo. La administración de la variante PD-L1 ^CHO también produjo una reducción del crecimiento tumoral, pero menos marcada (prueba de Tukey, p= 0,0052). Por el contrario, no se evidenció disminución del crecimiento tumoral con la mezcla de péptidos conjugados (prueba de Tukey, p=0, 1598). La inmunización con el polipéptido PKPD-L1 causó una disminución mayor del volumen tumoral, si se compara con el efecto que se genera con la inmunoterapia activa con PD-L1 ^CHO (prueba de Tukey, p<0,0058).

La Tabla 6 también ¡lustra el número de metástasis espontáneas a pulmón contabilizadas en los animales inmunizados con diferentes vahantes de PD-L1 . La administración, en el contexto del adyuvante sNAcGM3-VSSP, del polipéptido de fusión PKPD-L1 o de la vahante PD-L1 ^CHO inhibió la implantación de metástasis en pulmón, con significación estadística (prueba de Tukey, p<0,0001) respecto a las metástasis encontradas en los animales del grupo control, que se trataron con el adyuvante y el excipiente solamente. Por el contrario, no se evidenció un efecto sobre la disminución de la implantación de metástasis cuando se inmunizó con la mezcla de péptidos conjugados (prueba de Tukey, p=0,4311). Al igual que para el volumen tumoral, la respuesta inmune generada por el polipéptido PKPD-L1 tuvo una capacidad superior en la reducción del número de metástasis, al compararse con los efectos de la respuesta inmune que se genera tras la inmunoterapia activa con PD-L1 nativo (prueba de Tukey, p=0,0004) o con mezcla de dos péptidos de ese ligando (prueba de Tukey, p <0,0001).

Ejemplo 10. Eficacia de la administración del polipéptido PKPD-L1 en el tratamiento de metástasis pulmonares en ratón.

Las metástasis pulmonares son la causa fundamental de la muerte por cáncer. La inmunización con el polipéptido PKPD-L1 induce una respuesta humoral y celular potente. Por ello, se evaluó la capacidad anti-metástasica de los efectores de la respuesta inmune que se generan tras la administración de ese polipéptido de fusión en vahos modelos. En todos los casos se inmunizaron grupos de 12 ratones con 100 pg del polipéptido en combinación con 100 pg de sNAcGM3-VSSP. Los animales se inmunizaron durante dos meses, con una dosis a la semana, por vía subcutánea. El reto tumoral se efectuó con las células tumorales, de acuerdo a los requerimientos de cada modelo. El análisis de la carga metastásica se realizó mediante la evaluación del peso de los pulmones o del número de macrometástasis. Para el estudio en la cepa de ratón C57BI/6, se inocularon 2,5 x 10 ⁵ células del carcinoma pulmonar metastásico 3LLD122, en la almohadilla plantar, 3 días después de la cuarta inmunización. El tumor primario se eliminó mediante cirugía a los 20 días del implante, y los animales se sacrificaron 15 días después de efectuar la cirugía, tiempo requerido para el desarrollo de las metástasis espontáneas en pulmón. En este caso, se determinó el peso de los pulmones en cada grupo.

En el segundo experimento, se empleó un modelo de metástasis experimental. Ratones C57BI/6 se inocularon por la vena de la cola con células de melanoma muhno MB16F10 (5 x 10 ⁴ ), 4 días después de la sexta inmunización. Diecisiete días después se sacrificaron los animales, y se contaron las colonias pigmentadas de un color negro intenso en los pulmones.

En la cepa de ratón BALB/c, se evaluó el establecimiento de metástasis experimentales en pulmón después de la inoculación intravenosa de 5 x 10 ⁴ células del carcinoma colorectal CT26. El reto se realizó por el plexo retro-orbital, cinco días después de la cuarta inmunización. Los animales se sacrificaron 30 días después del reto tumoral y se contaron las colonias en los pulmones. Los resultados de estos experimentos se resumen en la Tabla 7.

Tabla 7. Efecto sobre las metástasis a pulmón de la respuesta inmune que se genera tras la inmunización con PKPD-L1 y un adyuvante.

Peso del pulmón (g) Número de macrometástasis

Modelo Tratamiento

Media ± SD Media ± SD

Excipientes/ VSSP 0,2898±0, 06256 nd

3LLD122 PKPD-L1/ VSSP 0,1632±0, 03861 nd

Excipientes/ VSSP nd 61 ±24

MB16F10

PKPD-L1/ VSSP nd 42±23

Excipientes/VSSP nd 30 ± 14

CT26 PKPD-L1/VSSP nd 15 ± 9

SD: Desviación estándar. VSSP: sNAcGM3-VSSP. nd: No determinado. La comparación de los resultados alcanzados con respecto a los ratones del grupo control fue independiente para cada modelo. Como se observa en la Tabla ?, la carga metastásica fue inferior en los ratones inmunizados con PKPD-L1 en los tres modelos, lo cual tuvo significación estadística (prueba t de student: 3LLD122, p<0,0001 MB16F10, p=0,0475; CT26, p=0,0046).

Ejemplo 11. Combinación de inmunoterapia pasiva y activa específicas al PD- L1.

La actividad anti-tumoral lograda por la combinación de inmunoterapia pasiva con un anticuerpo monoclonal específico al PD-L1 de ratón y la inmunoterapia activa con PKPD-L1 se evaluó en el modelo CT26. Los ratones Balb/c hembra (n=9 por grupo) se inmunizaron por vía subcutánea con 200 pg del polipéptido PKPD-L1 adyuvado con 0,7 mg de fosfato de aluminio, en un esquema similar al descrito en el Ejemplo 4. Doce días después de la segunda inmunización, se realizó el reto tumoral con 2 x 10 ⁴ células CT26, inoculadas por vía subcutánea en la región dorsal contraria al sitio de inmunización. Un día después del reto tumoral, se comenzó a administrar el anticuerpo de rata específico al PD-L1 de ratón, de subclase lgG2b (BioXCell™, clon 10F.9G2), a una dosis de 12,5 mg/Kg de peso, por vía intraperitoneal. Las administraciones de anticuerpos se realizaron con una frecuencia semanal, para un total de 4 dosis. Para cada tipo de inmunoterapia se empleó un grupo placebo, en el caso de la inmunoterapia pasiva se administró un anticuerpo control, de ¡sotipo lgG2b de rata (BioXCell™, BE0090), mientras que para la inmunoterapia activa se incluyó un grupo que recibió PBS y adyuvante fosfato de aluminio. Una vez implantadas las células tumorales, y detectado un tumor medióle, se procedió a determinar el volumen tumoral.

La Tabla 8 muestra las mediciones de volumen tumoral, a los 30 días después del reto con las células tumorales de ratón CT26, se reflejan como la media ± la desviación estándar. Tabla 8. Efecto anti-tumoral de la combinación de inmunoterapia pasiva y activa dirigidas al PD-L1 en el modelo carcinoma de colon CT26.

Tratamiento Volumen tumoral (mm ³ )

Anticuerpo control de ¡sotipo 2764 ± 789

Anti-PD-L1 de ratón 1178 ± 988

Anti-PD-L1 de ratón/PKPD-L1 + FA 247 ± 134

PBS + FA 2717 ± 832

PKPD-L1 + FA 1046 ± 593

FA: fosfato de aluminio

Como se aprecia, la administración del anticuerpo de rata anti-PD-L1 de ratón mostró una reducción significativa del volumen tumoral, con respecto al grupo tratado con el control de ¡sotipo (prueba de Dunnett, p=0,003). La inmunización con el polipéptido PKPD-L1 también mostró un efecto significativo en la reducción del volumen tumoral con respecto al grupo tratado con excipiente más adyuvante (prueba de Dunnett, p=0,0001). El tratamiento combinado mostró resultados superiores sobre la reducción del tumor, con respecto a la inmunoterapia activa con PKPD-L1 (prueba de Dunnett, p=0,0233) y a la inmunoterapia pasiva con el anticuerpo anti-PD-L1 (prueba de Dunnet, p=0,0332). Los resultados sugieren la posibilidad de combinar la inmunoterapia pasiva con la inmunoterapia activa ambas dirigidas al PD-L1 .

Ejemplo 12. Efecto de la administración de PKPD-L1 sobre las subpoblaciones celulares en los linfonodos drenantes y en los linfocitos infiltrantes del tumor.

Para evaluar si la terapia anti-PD-L1 tenía un efecto sobre la reversión de la inmunosupresión inducida por PD-1 , se estudiaron las proporciones de las poblaciones celulares presentes en los nodulos linfáticos y en el propio tumor. En este experimento los ratones de la cepa Balb/c (n=9) recibieron por vía subcutánea dos inmunizaciones, espaciadas por 14 días, que contenían una mezcla de 200 pg del polipéptido quimérico PKPD-L1 con 0,7 mg del adyuvante fosfato de aluminio. Tres días posteriores a la primera inmunización, los ratones recibieron por vía subcutánea 2 x 10 ⁴ células tumorales de colon CT26, las cuales se administraron en el lado opuesto a la inmunización. Siete días posteriores a la segunda dosis de inmunógeno, se procedió al sacrificio de los ratones para la extracción del tumor y los linfonodos drenantes del mismo. Se evaluaron en la muestra los niveles de PD-1 en membrana, medidos como intensidad media de fluorescencia, en los linfocitos T CD4+ y CD8+.

Un gramo de masa tumoral fue sometido a disociación enzimática (eBioscience™) y mecánica. De la suspensión tumoral, se eliminaron las células muertas con el juego de reactivos (eBioscience™) y un magneto. La suspensión de células vivas se sometió a una selección positiva de leucocitos con el marcador de selección CD45 y el uso de perlas magnéticas (eBioscience™). Posterior a la elución de la suspensión celular CD45+, se procedió con el inmunomarcaje múltiple con anticuerpos anti- CD3, anti-CD4 o anti-CD8 y anti-PD-1 (eBioscience™). Los linfonodos drenantes se maceraron en medio de cultivo RPMI y la suspensión celular se pasó por un filtro de 30 pM, la cual se sometió al mareaje múltiple tal como se describe en el caso anterior. La evaluación de la presencia de PD-1 en membrana, en linfocitos T CD4 y CD8 localizados en el linfonodo drenante y en el tumor se realizó mediante citometría de flujo.

Tabla 9. Evaluación de la presencia de PD-1 en membrana, en linfocitos T CD4 y CD8 localizados en el linfonodo drenante y en el tumor.

Intensidad de fluorescencia

Muestra Mareaje Media ± SD

Exc + FA PKPD-L1 + FA

Linfonodo CD3+, CD4+, ^PD1 + ^alt ° 7,946 ± 0,628 6,662 ± ¹ >064 drenante CD3+, CD8+, PD1 + ^alt0 10,140 ± 1 ,546 7,513 ± 1 ,436

CD45+, CD3+, CD4+, PD1 + 4,024 ± 0,281 3,586 ± 0,348

Tumor

CD45+, CD3+, CD8+, PD1 + 4,555 ± 0,658 3,780 ± 0,559

Exc: Excipiente (Tris 40 mM pH 8,0). FA: Fosfato de aluminio

Los resultados que se muestran en la Tabla 9 indican que, en los linfonodos drenantes, los linfocitos T CD4+ procedentes de ratones inmunizados con el polipéptido PKPD-L1 adyuvado poseen niveles de PD-1 en membrana significativamente inferiores que los encontrados para los linfocitos de los ratones del grupo placebo (prueba t-student no pareada, p=0,0056). La misma observación se realizó para los linfocitos T CD8+ de los linfonodos drenantes (prueba t-student no pareada, p=0,0014). Esta evidencia experimental se obtuvo también para los linfocitos CD4+ (prueba t-student no pareada, p=0,0156) y CD8+ (prueba t-student no pareada, p=0,0240) localizados en la masa tumoral. Por tanto, la inmunoterapia activa específica al PD-L1 , que emplea como antígeno vacunal el polipéptido quimérico PKPD-L1 , genera células T CD4+ y CD8+ con un fenotipo característico de linfocitos activados, específicamente en sitios inmunológicos relevantes como el tumor y los linfonodos drenantes.

Ejemplo 13. Evaluación del perfil de seguridad tras la administración del polipéptido PKPD-L1 y adyuvante fosfato de aluminio o sNAcGM3-VSSP.

Ratones Balb/c hembra (n=5) y conejos New Zealand hembra (n=4) se inmunizaron por vía subcutánea, con 200 pg del polipéptido quimérico PKPD-L1 adyuvado, el cual se administró de manera semanal en el caso del adyuvante sNAcGM3-VSSP, hasta que se aplicaron un total de 8 inmunizaciones. Para la administración en ratones, el polipéptido quimérico se adyuvó con 100 pg de sNAcGM3-VSSP, mientras que para los conejos el polipéptido se adyuvó con 200 pg de dicho adyuvante.

En el caso de la combinación de PKPD-L1 con fosfato de aluminio, 200 pg del polipéptido quimérico se adyuvaron con 0,7 mg de fosfato de aluminio y las dosis se administraron cada 14 días, para un total de 4 inmunizaciones. Cada combinación de antígeno y adyuvante contó con un grupo placebo, el cual se inmunizó con los excipientes que conforman la formulación del antígeno vacunal y el adyuvante correspondiente.

En el bloque experimental correspondiente a los ratones, se incluyeron dos grupos adicionales de inmunoterapia pasiva. A un grupo se le administró un anticuerpo de rata específico al PD-L1 de ratón (BioXCell™, clon 10F.9G2), a una dosis de 12,5 mg/Kg por vía intraperitoneal, con una frecuencia semanal, para un total de 4 dosis. Al otro grupo se le administró un control de anticuerpo no relacionado del mismo ¡sotipo (BioXCell™, clon BE0090) en la misma dosis.

En ambos estudios se realizaron evaluaciones semanales del peso corporal, en momentos diferentes a las inmunizaciones. Una vez culminadas las inmunizaciones, se procedió a la extracción de las muestras biológicas, la cual se pudo realizar en el 100% de los animales incluidos en la experimentación, en ambas especies animales. En el caso de los ratones, al final del esquema de inmunización se realizó la extracción del corazón, pulmón, bazo y diez órganos más. A los órganos se les efectuó una evaluación de tipo cualitativa, tanto macroscópica como microscópica. Para la evaluación microscópica y diagnóstico histológico, las muestras fueron procesadas por métodos bien conocidos. Se consideró como un evento adverso relacionado con el tratamiento cuando se hallaron alteraciones en los grupos inmunizados por vía activa o pasiva que no se encontraron en el grupo placebo correspondiente.

En el caso de los conejos, se realizaron dos extracciones de sangre en momentos diferentes, y cada extracción de sangre fue destinada a la obtención de plasma (para determinaciones de hematología) y suero (para determinaciones de bioquímica clínica). Las extracciones se efectuaron antes de iniciar la inmunización, y una semana después de la última inmunización. Las determinaciones de hematología incluyeron el conteo y/o el porcentaje de vahos tipos de células, entre otros parámetros. Las determinaciones de la bioquímica sanguínea incluyeron concentración de hemoglobina, concentración de enzima alanina amino transferasa, concentración de enzima aspartato aminotransferasa, concentración de creatinina, entre otras. Para cada parámetro se realizaron comparaciones entre los valores obtenidos antes y después de las inmunizaciones, entre el grupo tratado y el grupo placebo correspondiente, y si dichos valores se encontraban dentro del rango fisiológico reportado para la especie. Se consideró como un evento adverso relacionado con el tratamiento cuando se hallaron alteraciones en los grupos inmunizados con el polipéptido PKPD-L1 que no se encontraron en el grupo placebo correspondiente.

El análisis macroscópico de los órganos extraídos de los ratones indicó la presencia de hemorragia en los pulmones de dos de los cinco ratones que recibieron la inmunoterapia pasiva con el anticuerpo de rata específico al PD-L1 de ratón. De estos dos ratones, uno de ellos también presentó hemorragia en el timo. En el resto de los grupos experimentales, los órganos no presentaron alteraciones a nivel macroscópico. Por su parte el análisis microscópico confirmó los eventos hemorrágicos observados en pulmón y timo que se detectaron a nivel macroscópico en los dos ratones antes mencionados. Los otros tres ratones de este grupo se caracterizaron por tener en sus pulmones un infiltrado de células inflamatorias a nivel de los bronquios. En los cinco ratones tratados con el anticuerpo específico al PD-L1 de ratón, todos presentaron mucositis a nivel de colon. El resto de los órganos pertenecientes a este grupo no mostraron ningún tipo de alteración microscópica. En contraste, no se observaron alteraciones microscópicas en los órganos de los ratones pertenecientes a los diferentes grupos placebo ni en los inmunizados con el polipéptido PKPD-L1 con ambos adyuvantes.

Los resultados de hematología y bioquímica clínica obtenidos en conejos indicaron la ausencia de cambios significativos cuando se compararon las determinaciones realizadas antes y después de inmunizar con el polipéptido PKPD-L1. Tampoco se encontraron diferencias significativas entre el grupo inmunizado y su grupo placebo correspondiente. De manera general, todos los parámetros de hematología y bioquímica para los grupos inmunizados y placebo se encontraron dentro del rango fisiológico. Tanto en ratones como en conejos, no hubo afectaciones de significación en el peso corporal de los grupos inmunizados con respecto al encontrado en los grupos placebo correspondientes, en los diferentes tiempos que se evaluaron.

El análisis global de estos resultados demuestra que la inmunización con el polipéptido quimérico PKPD-L1 , adyuvado tanto en sNAcGM3-VSSP como en fosfato de aluminio, genera una respuesta inmune segura. Esta estrategia de inmunoterapia activa ofrece ventajas en relación a la estrategia de inmunoterapia pasiva con anticuerpos monoclonales específicos, debido la inexistencia de efectos adversos.