技术领域

本发明属于生化技术领域， 涉及一种基于阿片肽和神经肽 FF而构建的嵌合肽及其合 成方法； 本发明同时还涉及该嵌合肽在高效、 低副作用镇痛药物制备中的应用。

背景技术

疼痛是人类所经受的最常见的病症之一， 每个人的一生都会经历疼痛的困扰。据统计 全球大约有 1/3的人忍受着持续或周期性疼痛的折磨， 美国在疼痛相关社会问题的花费约 为 1千亿美元 /年 ( Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 2001, 98: 11845)。 在临床上， 吗啡类的阿片 药物已被人们广泛的应用于治疗和缓解各种疼 痛，但由于阿片类的镇痛药物能引起严重的 耐受、 成瘾、 便秘和呼吸抑制等不良反应， 从而大大限制了其临床应用范围。

已有的研究结果表明， 机体内的阿片肽同样也能通过激活阿片受体而 介导镇痛作用。 为了获得选择性高、 高效、 分子较为稳定的阿片类配体分子， 在脑啡肽等阿片肽的结构基 础上通过化学修饰并筛选出了大量的高效配体 。 Lipkowski等人以脑啡肽为化学模板分子， 通过 2位氨基酸定点替换、肽链 C末端肼键连接实现了分子二聚化， 成功构建了一个高效 的阿片肽 Biphalin ,其化学结构为 (Tyr-OAIa-Gly-Phe-NH) ₂ ( Pepf/cies 1982, 3 :697； Life Sci 1987, 40:2283)。 进一步的药理学活性研究表明， Biphalin 在中枢和腹腔注射时都能引起强镇痛 作用， 特别是侧脑室注射时其镇痛强度为吗啡的 257倍， 并且腹腔注射 Biphalin引起的成 瘾戒断反应较小 U. Pharmacol. Exp, Ther. 1993, 265:1446)。 因此， Biphalin在低副作用的阿 片类镇痛药的研发中具有较好的应用前景。

众所周知， 神经肽在机体内都能介导一种或多种主要的生 理和药理学活性。 但是， 神 经肽在发挥其主要活性的同时也伴随着一些次 要活性，而大部分次要活性成为了它的副作 用。 例如， 内源性阿片肽在缓解疼痛的同时， 会伴随着耐受、 成瘾和呼吸抑制等副作用。 为了解决这一矛盾问题， 传统的策略是以神经肽的母体为化学模板， 进行了系统的化学修 饰而筛选出受体选择性较高且具有优势构象的 神经肽类似物，从而达到保持较高生物活性 并降低其副作用的预期效果。

近年来还发展了一些新策略， 即基于高效的肽类配体设计并合成了一系列嵌 合肽， 以 期使嵌合肽在发挥主要活性的同时， 能最大限度的降低其副作用。 尤其是， Foran等人基 于阿片肽 EM-2 和速激肽 P 物质 （SP ) 而成功地设计构建了一种全新的杂合肽 ESP7 (Tyr-Pro-Phe-Phe-Gly-Leu-Met- NH ₂ )，并且发现脊髓水平注射 ESP7能产生阿片受体依赖的 镇痛作用，但又不产生镇痛耐受的阿片样副作 用（Prac. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 2000, 97:7621)。 神经肽 FF最早是作为一种抗阿片肽从牛脑中被分离和� ��定的， 并发现它具有抗吗啡 镇痛的作用 ( Pmc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 1985, 82:7757)。 神经肽 FF系统涉及到两种不同的 受体前体（Pro-NPFF _A 禾口 Pro-NPFF _B 受体）禾口两禾中不同受体（ NPFFi禾口 NPFF ₂ 受体） ( FEBS Lett. 1997, 409:426； Mol. Pharmacol. 1999, 55:804； Nat. Cell Biol. 2000, 2: 703； J. Biol. Chem. 2001, 276:36961； J. Biol. Chem. 2000, 275:25965； 8/·。/. Chem. 2000, 275 :39324等）。 近年的药理 学活性鉴定表明， NPFF及其相关肽能介导多种生物学活性， NPFF不仅具有抗阿片的功能， 还具有原阿片活性，从而被归为一类重要的阿 片调节肽（ ν/τ. Top. Med. Chem. 2005, 5:341)。 NPFF自身对基础痛阈值无影响，即在生理剂量� �平对机体的生物学活性影响不大。但 NPFF 作为阿片调节肽， 在维持机体的内源性阿片和抗阿片系统平衡过 程中起着重要作用， 它参 与了镇痛耐受的调节， 并能减弱吗啡等阿片物质所引起的条件位置偏 爱作用 ( CU/T. Top. Med. Chem. 2005, 5 :341； Peptides. 2006, 27:964； Peptides. 2007, 28:2235； Peptides. 2010, 31:1374等）。 因此， NPFF 的药理学功能使其适合作为化学模板分子来发 展一类全新的阿 片 /NPFF系统的嵌合肽。

中专利申请 201110097843.4公开了一种基于内吗啡肽 2和神经肽 FF的嵌合肽， 其在 保留内吗啡肽 2的 N末端结构和神经肽 FF的 C末端结构基础上， 利用内吗啡肽 2的 C末 端和神经肽 FF的 N末端中都存在的苯丙氨酸残基的特点而构建� �一种全新的嵌合肽 EN-9。 体内的药理学研究发现： EN-9表现出比内吗啡肽 2更强、更持续的镇痛活性， 并具有无耐 受作用、 低成瘾性等优点。 此外， 化合物 EN-9皮下 EN-9能引起显著的镇痛作用， 能克服 内吗啡肽外周注射无镇痛活性的缺陷，从而具 有用于临床疼痛治疗的潜在应用价值。但是， EN-9的镇痛活性比临床用镇痛药吗啡低 4-10倍， 从而导致其有效镇痛剂量高于吗啡。 发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的问题， 提供一种镇痛效果好、 副作用低的基于 阿片肽 Biphalin和 NPFF的嵌合肽 BN-9。

本发明的另一目的是提供一种基于阿片肽 Bipha lin和 NPFF的嵌合肽 BN-9的合成方法。 本发明还有一个目的， 就是提供该基于阿片肽 Bipha lin和 NPFF的嵌合肽 BN-9在制备 镇痛药物中的应用。

(一） 基于阿片肽 Biphalin和 NPFF的嵌合肽

本发明基于阿片肽 Bipha lin和 NPFF的嵌合肽 （BN-9 ) , 是以高效阿片肽 Bipha lin和神 经肽 FF为化学模板，构建的嵌合肽，其 N末端为阿片肽 "药效团"（即半个分子的 Biphalin) , C末端为 NPFF "药效团 "（即 NPFF的 C端五肽结构， NPFF ( 3-8 ) )， 其结构式如下：

(二） 基于阿片肽 Biphalin和 NPFF的嵌合肽的合成

本发明中基于阿片肽 Biphalin和 NPFF的嵌合肽的合成方法， 包括以下工艺步骤：

( 1) 树脂预处理： 将 Rink-Amide-MBHA树脂在二氯甲烷中搅拌 30-40 min, 使树脂充 分溶胀后减压抽干溶剂；

( 2)脱除 Fmoc保护：将溶胀、抽干溶剂后的树脂在体积� �度 18-25 %的六氢吡啶 /DMF 溶液中， 搅拌 3-10min后抽干， 重复 2-3次； 再加入体积浓度 18-25 %的六氢吡啶 /DMF溶 液， 搅拌 10-15min， 使 Fmoc基团脱除完全， 然后抽干溶剂； 最后用 DMF洗涤除净六氢 吡啶， 得到脱除 Fmoc基团保护的树脂；

( 3 ) 縮合： 依次将 A/-a-Fmoc 保护基团氨基酸、 Λ/-羟基苯并三氮唑、 0-苯并三氮唑 -Λ/,Λ/,Λ/',Λ/'-四甲基脲-六氟磷酸盐完全溶解� �� DMF中，再加入二异丙基乙胺后混匀得混合溶 液； 然后在氩气保护下， 将脱除 Fmoc 基团保护的树脂加入所述混合溶液中搅拌反应 40-60min， 抽干溶剂； 用 DMF重复洗涤除去未反应的 A/-a-Fmoc保护基团氨基酸、 Λ/-羟基 苯并三氮唑、 0-苯并三氮唑 -Λ/,Λ/,Λ/',Λ/ '-四甲基脲-六氟磷酸盐；

所述 A/-a-Fmoc保护基团氨基酸、 Λ/-羟基苯并三氮唑、 0-苯并三氮唑 -Λ/,Λ/,Λ/',Λ/'-四甲基 脲-六氟磷酸盐的用量分别为脱除 Fmoc基团保护的树脂摩尔量的 2-5倍；

所述二异丙基乙胺的用量为脱除 Fmoc基团保护的树脂摩尔量的 4-10倍；

(4)肽链的延长： 重复步骤（2)、 ( 3 ) 8次， 按照嵌合肽结构由 C-末端向 N-末端的顺 序， 依次将带有 /V-a-Fmoc保护基团氨基酸逐个縮合至树脂上， 直至完成所有氨基酸残基 的縮合， 得到肽树脂；

( 5 ) 肽链从树脂上的切割： 按照步骤 （2 ) 的方法将肽树脂最后一个氨基酸的 Fmoc 基团完全脱除；用 DCM、MeOH交替洗涤树脂，充分抽干溶剂后，按� �克肽树脂加入 10-25ml 的切割剂， 于室温下切割反应 1.5-5小时； 过滤， 滤液在不高于 37°C的条件下充分减压旋 干， 然后用不高于 -10°C的乙醚中析出沉淀； 静置后先去除上清的乙醚， 再用水充分溶解 后用分液漏斗除去乙醚相， 水相经冷冻干燥， 得白色粗肽固体粉末；

所述切割剂是由三氟乙酸、三异丙基硅烷、水 以 95:2.5:2.5的体积比混合形成的溶剂。 ( 6 ) 粗肽的脱盐和纯化： 以体积浓度 10-20%的乙酸溶液为流动相， 将粗肽通过 Se _P had _eX G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐， 利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥， 得到脱盐的 肽化合物； 再利用反向高效液相色谱柱进行分离纯化， 收集主峰， 冷冻干燥后得到白色的 纯肽固体粉末。

上述方法制备的产物经质谱和色谱分析检测， 与设计的化合物结构一致。表明成功合 成了阿片 /神经肽 FF系统的全新嵌合肽， 纯化后样品纯度在 98 %以上。

(三） 基于阿片肽 Biphalin和 NPFF的嵌合肽的活性实验

本发明基于阿片肽 Biphalin和 NPFF的嵌合肽 BN-9,同时保留了激活阿片和 NPFF受体 的两个关键药效团， 在保持了阿片镇痛作用的同时， 能有效地降低阿片镇痛耐受和便秘等 副作用。 下面通过体内实验说明本发明的嵌合肽 BN-9在痛觉调节、 耐受和便秘方面的药 理学功能。

1、 BN-9的镇痛实验

通过侧脑室、脊髓和尾静脉三个水平注射后， 利用小鼠光热甩尾实验进行了体内痛觉 调节作用的活性检测和比较。 并以阳性对照药物吗啡作为对照组。

( 1) 小鼠的侧脑室给药

侧脑室水平痛觉检测实验用小鼠， 需提前进行小鼠的侧脑室埋管手术， 以保证药物注 射位点的准确性。 利用脑立体定位仪进行小鼠的侧脑室埋管。 昆明系雄性小鼠， 体重 20±2 g; 脑立体定位仪为江湾 I型。 小鼠用戊巴比妥钠麻醉 （i.p， 80mg/kg小鼠体重） 后， 将小 鼠头部手术区剪去毛发， 置于脑立体定位仪上固定后， 手术区用碘伏消毒， 沿矢状缝切开 头皮， 露出颅骨， 找到前囟位置。 从前囟向后 3 mm， 向左 /右 l mm， 即为侧脑室的上方位 置。 自制不锈钢管（24-gauge的一段， 上面接一小段 PE-10管）按上述位置向下插入 3 mm， 即为侧脑室。 一段不锈钢琴弦 （28-gauge ) 插入到上述钢管中， 以防止脑脊液外溢、 感染 和堵塞钢管。用医科牙托粉和胶水固定钢管， 凝固后， 缝合伤口。手术后， 小鼠恢复 4天， 第 5天开始后续实验。 实验中涉及到的手术器械、 不锈钢管等均已在手术前消毒。 药物溶 解在生理盐水中， 在 -20°C保存， 使用前解冻。

( 2) 小鼠的鞘内和尾静脉注射 脊髓水平给药采用清醒小鼠鞘内注射法， 具体操作参考 Hylden和 Wilcox已报道的方法 ( Eur.丄 Pharmacol. 1980, 67:313)。将 25 μΙ微量进样器直接插入到 L5和 L6之间的蛛网膜下腔。 蛛网膜被刺破时伴随着小鼠猛烈而明显的甩尾 动作或者尾巴呈 "S' '形， 生理盐水和药物以 5 μΙ/10秒的速率注射至蛛网膜下腔中。

尾静脉注射前用固定器将小鼠固定， 露出整个尾巴， 用 75%的酒精棉球擦拭注尾部射 位点使静脉扩张， 此时清晰可见尾部两侧红色的静脉。注射位点 在靠近尾巴根部的 1/3-1/2 处。 选用带 4号半针头的 lml注射器， 注射体积为 0.1ml/只。 注射时用左手轻轻拉直固定尾 巴， 右手拿注射器沿着尾巴小于 30度角倾斜进针。 进针后， 30秒内完成药物注射， 注射完 成后用棉球压迫止血。

( 3 ) 痛觉检测实验

使用昆明系雄性小鼠， 利用光热甩尾仪来检测药物对痛觉作用的影响 。环境温度控制 在 22±1°C， 实验动物可自由进食、 饮水。 小鼠侧脑室每次注射 4 μΙ药物。 给药前先测定 基础甩尾潜伏期（3-5秒），过于敏感或迟钝的 小鼠弃去不用。记录给药之后第 5， 10， 15， 20， 30， 40， 50, 60， 90分钟的甩尾潜伏期 （尾静脉注射时痛觉检测不测定 90分钟时间 点的甩尾潜伏期）。 为防止烫伤， 将 10秒设为最长甩尾潜伏期， 甩尾时间超过 10秒均以 10秒来计。

( 4) 计算药物镇痛作用的 Μ ΡΕ和 EC ₅

痛觉调节作用利用最大可能效应 M PE ( maximum possible effect )值来评价， M PE ( ) = ΙΟΟχ [(给药后的痛阈一基础痛阈) /(10秒一基础痛阈)]。相关的 M PE数据用平均值 ±标准 误差 （Means±S.E.M. ) 表示， 不同药物浓度处理的组间差异用单因素方差分 析 （one-way AN OVA的 Dunnett检验） 来进行数据的统计和分析， ***P < 0.001 表示药物处理组的 M PE 值与生理盐水组之间存在显著性差异。 实验结果见图 1~3。

BN-9和吗啡的镇痛作用通过 EC _5Q 值进行比较。 (： ₅₍₅ 值表示药物产生 50%最大镇痛效应 时的药物剂量。利用统计学软件 GraphPad Prism 5.0版本， 分别绘制了 BN-9和吗啡在侧脑 室、 鞘内和尾静脉三种不同给药水平的最大镇痛效 应时间点的 M PE值的量效曲线 （见图 4~6 ) , 并计算出它们在不同注射水平的 EC _5Q 值和 95%的置信区间， 相关数据如表 1所示。

表 1不同水平注射 BN-9和吗啡所产生的镇痛作用的比较 a 、 , EC ₅₀ 值 （nmol) ( 95%的置信区间） EC ₅₀ 的比值 给药途径 ₉ « (吗啡 /BN-9) 脑室 （i.c.v. ) 0.39 (0.33, 0.46) 1.02 (0.88, 1.18) .61倍 鞘内 （i.t. ) 0.29 (0.24, 0.34) 0.35 (0.30, 0.40) 1.21 倍 尾静脉 ( i.v. ) 58.6 (50.8, 67.4) 46.2 (38.7, 55.2) 0.79 倍

生理盐水组为空白溶剂对照组， 侧脑室注射 BN-9的药物浓度分别为 0.25, 0.5, 1和 2 nmol。 每组动物数为 8只。 如图 1所示， 小鼠侧脑室注射新化合物 BN-9能剂量依赖地产 生镇痛作用。 BN-9在脊髓以上水平的镇痛作用能持续 60分钟， 并在药物注射后 15分钟 达到最大镇痛效应。 侧脑室注射吗啡 （0.5, 1, 2和 4 nmol)， 其镇痛活性能持续 90分钟， 并在药物注射后 30分钟达到最大镇痛效应。

同样， 鞘内注射 BN-9 ( 0.125, 0.25, 0.5, 1禾 B 2 nmol ) 能引起量效依的镇痛作用， 该作 用在药物注射后 10分钟达到最强， 并能持续 60分钟 （如图 2所示）。 而脊髓水平注射的 吗啡（0.125, 0.25, 0.5, 1和 2 nmol ), 其镇痛活性只能持续 40分钟， 它在注射后 10分钟时 引起最大镇痛效应。

尾静脉注射 1.25, 2.5, 5和 10 mg的新嵌合肽 BN-9时能介导剂量依赖的镇痛活性， 其 最大镇痛效应时间点为药物注射后的 10分钟，并能维持镇痛作用 60分钟（如图 3所示）。 同样， 尾静脉注射的吗啡 （0.25, 0.5, 1和 2 mg) 所引起的镇痛活性持续作用时间也为 60 分钟， 最大镇痛效应的时间点为药物注射后 10分钟。

如图 4~6和表 1所示， 比较 BN-9和吗啡的镇痛量效曲线作用发现， 在侧脑室、 脊髓 和尾静脉三种不同的注射水平下， 新化合物 BN-9保持了较强的镇痛活性。 并且， 脊髓和 脊髓以上水平的 BN-9镇痛作用强于吗啡的， 但尾静脉给药时， BN-9的镇痛作用稍弱于吗 啡的。

2、 BN-9的镇痛耐受实验

小鼠侧脑室连续八天注射药物， 利用光热甩尾法检测它们的镇痛耐受现象， 进一步比 较本发明的化合物 BN-9和吗啡在镇痛耐受方面的药理学活性。

( 1) 小鼠的痛觉耐受实验方法

昆明系雄性小鼠， 侧脑室或鞘内连续注射药物八天， 每天注射一次， 利用光热甩尾仪 来检测药物连续注射对痛觉作用的影响。环境 温度控制在 22±1°C，实验动物可自由进食、 饮水。 小鼠侧脑室每次注射 4 μΙ药物。 第一天药物注射前测定基础甩尾潜伏期 （3-5秒）， 过于敏感或迟钝的小鼠弃去不用。实验中记录 给药之后相关药物最大镇痛效应时间点的甩 尾潜伏期， 如侧脑室注射 ΒΝ-9和吗啡的记录时间点分别为给药后 15和 30分钟； 鞘内注 射这两个药物的记录时间点均为给药物 10分钟；空白溶剂对照组的时间记录点与 ΒΝ-9的 保持一致。 为防止小鼠尾巴烫伤， 将 10秒设为最长甩尾潜伏期。

( 2) 耐受实验数据统计

实验数据用 MPE ( maximum possible effect) 表示， MPE ( ) = 100χ[ (给药后的痛 阈一基础痛阈） I ( 10秒一基础痛阈） ]。 药物的镇痛耐受作用利用相关药物最大镇痛效 应 时间点的 ΜΡΕ值来进行比较。 ΜΡΕ数据用平均值 ±标准误差 （Means±S.E.M. ) 来表示， 小 鼠八天镇痛作用的差异用单因素方差分析（one -way AN0VA的 Bonferroni检验)进行统计， ***P < 0.001表示与第一天吗啡镇痛作用相比有显著性� ��异。 实验结果如图 7、 8所示。

生理盐水组为空白溶剂对照组， 侧脑室注射 BN-9的药物剂量为 0.5, 1, 2和 4 nmol, 吗啡的剂量为 4 nmol o图 7的实验数据表明小鼠侧脑室连续八天注射空� �溶剂对照生理盐 水后， 小鼠都不产生镇痛活性。 与空白溶剂对照生理盐水组相比， 第一天侧脑室注射吗啡 和各种剂量的 BN-9都显著地增加了小鼠的甩尾潜伏期。 但小鼠侧脑室连续注射八天吗啡 组， 在给药后第四天 MPE值开始显著地下降， 并持续至第八天， 即吗啡镇痛从第四天起 就开始出现了镇痛耐受现象。与第一天相比， 第四天至第八天的差异性均为极其显著（P < 0.001)。 然而， 0.5, 1, 2和 4 nmol的 BN-9侧脑室连续注射期间， 其镇痛作用的 MPE值都 无明显变化 （P > 0.05)， 在连续注射的八天内一直保持较好的无耐受镇 痛活性。

与脊髓以上水平的镇痛耐受检测结果相一致， 在脊髓水平连续八天注射 0.5, 1 和 2 nmol的 BN-9, 均无镇痛耐受现象出现。 与第一天的 MPE相比， 不同剂量 BN-9在第二天 至第八天的相应镇痛效应均无明显的变化。 但是， 鞘内注射 2 nmol的吗啡， 在连续给药 后的第 4天就开始出现镇痛耐受， 并且其镇痛耐受逐渐加强。 具体结果如图 8所示。

3、 BN-9胃肠运动调节作用的检测

阿片类镇痛药物除了耐受外， 还能引起便秘等副作用。 因此， 对嵌合肽 BN-9和吗啡 在胃肠运动调节方面的作用作了进一步的评价 。通过小鼠侧脑室注射药物， 用碳粉胃肠运 动检测法评价了它们对在体胃肠运动的影响。

( 1) 小鼠的在体胃肠运动检测方法

昆明系雄性小鼠， 体重 20±2 g。 侧脑室埋管后恢复 4天后用于胃肠运动检测。 在体胃 肠运动检测选用常用的碳粉检测法 ( Peptides, 2000, 21:295 )。 具体的实验过程为： 胃肠运 动实验前小鼠禁食 16小时 （禁食期间可随意饮水）， 然后侧脑室注射药物， 15分钟后将 预先准备好的活性炭悬浮液 （一种含 5%活性炭和 10%阿拉伯树胶的生理盐水悬浮液） 以 每 10 克体重 0.1 ml的体积经口灌注到胃。 活性炭悬浮液灌注 30分钟后， 颈部脱白处死 动物， 然后仔细地取出从幽门到盲肠的动物小肠。测 量幽门到盲肠的长度以及活性炭悬浮 液移动的最远距离。

( 2) 在体胃肠运动实验数据统计

胃肠运动实验结果用胃肠运动百分比来评价， 每只小鼠的胃肠运动百分比通过活性炭 悬浮液移动距离除以小肠总长度之后的百分比 来计算。相关的数据用胃肠运动百分比的平 均值 ±标准误差 （Mea _nS ±S.E.M. ) 来表示， 不同药物浓度处理的组间差异用单因素方差分 析 （one-way AN OVA的 Bonferroni检验） 进行数据统计和分析， < 0.01, ***P < 0.001 表 示药物处理组的胃肠运动百分比与生理盐水组 的之间存在显著性差异。实验结果如图 9所 示。

在图 9中， 生理盐水组为空白溶剂对照组， 吗啡的药物浓度为 4 nmol， BN-9的药物 浓度分别为 0.5, l, 2和4 _n m _O l。 每组小鼠数为 9只。 实验结果表明， 空白溶剂对照组的胃 肠运动百分比为 80 %， 与生理盐水组相比， 侧脑室注射 4 nmol的吗啡组显著地抑制小鼠 胃肠运动， 其胃肠运动百分比仅为 14%。 然而， 小鼠侧脑室注射低剂量的 BN-9 ( 0.5禾口 1 nmol ), 对小鼠的胃肠运动几乎无影响； 当注射 2和 4 nmol的 BN-9时， 胃肠运动百分比 分别为 58%和 34%， 高剂量的 BN-9能明显地抑制小鼠的胃肠运动， 但抑制作用强度低于 吗啡的。 由于 BN-9在侧脑室水平镇痛效应的 (： ₅₍₅ 值要低于吗啡， 因此， 在有效镇痛剂量 范围内， BN-9的便秘副作用要远远低于吗啡。

4、 中枢注射 BN-9对福尔马林致痛作用的调节

为了进一步评价 BN-9的镇痛作用， 利用临床前镇痛药物评价方法研究了嵌合肽 BN-9 对炎症痛的调节作用。在小鼠福尔马林致痛模 型中，分别评价了 BN-9和吗啡的镇痛活性。

( 1) 小鼠福尔马林致痛实验方法

昆明系雄性小鼠， 体重 20±2 g。 侧脑室埋管后第 5天用于福尔马林致痛实验。 环境温 度控制在 22±1°C， 实验动物可自由进食、 饮水。 具体的检测方法参考」 ohn Wiley & Sons 出版社 (John Wiley & Sons, Inc. ) 2007出版的 Curr. Protoc. Neurosci. ( 8.9.1-8.9.16. ) 一书。 具体实验操作为：将小鼠放入有机玻璃盒中（ 20x20x30 cm ),先使其适应环境 10-15分钟， 然后给小鼠侧脑室注射药物， 给药体积为 5 μΙ。 给药 5 min后， 将小鼠取出， 用手轻柔的 抓住小鼠颈部及后背的皮肤， 小拇指压住小鼠的尾巴， 腹部朝上固定小鼠且露出小鼠的后 爪。 在小鼠的右后脚掌中间皮肤下注射 20 μΙ的福尔马林溶液 （浓度为 5 %)， 迅速将小鼠 放回观察盒中， 同时开始计时， 并记录注射福尔马林溶液后 40 分钟内小鼠行为学反应。 福尔马林一般能引起两个时相的反应， 根据实验需要， 采用了两种行为学记录方法： （1) 记录注射福尔马林后每隔 1分钟小鼠舔、 咬、 抖被注射足的时间， 共记录 40 分钟； （2) 记录注射福尔马林后 0~5 分钟 （第一相）和 15-30分钟 （第二相） 内小鼠舔、 咬、 抖被注 射足的时间。

( 2) 小鼠福尔马林致痛实验结果的统计

根据两种不同的行为学记录方法，药物对福尔 马林致痛作用的影响结果统计方法也分 为两种： （1)根据每隔 1分钟所记录的舔、 咬、 抖被注射足的时间， 来评价不同药物对福 尔马林致痛作用的反应， 具体见图 10; ( 2)药物对福尔马林痛的调节利用 MPE ( maximum possible effect) 值来评价， MPE ( ) = 100χ [ (空白溶剂对照组的舔、 咬、 抖被注射足时 间一药物组的舔、 咬、 抖被注射足时间) /( 空白溶剂对照组的舔、 咬、 抖被注射足时间)]。 数据用平均值 ±标准误差（Mea _nS ±S.E.M. )表示，不同药物处理组各时间段内所测定的 MPE 值与空白溶剂对照组之间的差异用单因素方差 （ one-way AN0VA的 Bonferroni检验） 来进 行分析和统计， **P < 0.01, ***P < 0.001 表示药物处理组的 MPE值与生理盐水组相同时间段 内的 MPE值相比差异显著。 实验结果如图 11和图 12所示。

图 10中， 生理盐水组为空白溶剂对照组， BN-9和吗啡处理组的药物浓度分别为 5和 lO nmoL 每组动物数为 7~10只。 实验结果表明小鼠侧脑室注射生理盐水后， 福尔马林会 引起两个时相的痛觉反应， 即 0~5 分钟的第一相的急痛反应和 15~30 分钟的第二相炎症 痛反应。 而侧脑室注射 5 nmol的 BN-9和 10 nmol的吗啡能明显地抑制福尔马林所引起两 相痛觉反应。 进一步研究了 BN-9和吗啡分别对第一相和第二相反应的镇痛� �用的量效关 系，具体结果如图 11和图 12所示。侧脑室注射 BN-9的药物剂量为 0.625, 1.25, 2.5禾 B 5 nmol, 吗啡的剂量为 1.25, 2.5, 5和 10 nmol。实验结果表明不同剂量的 BN-9和吗啡都对第一相急 性痛具有较强的镇痛活性， 其抑制率均在 70 ~ 100%之间。 而且， BN-9和吗啡能剂量依赖 地抑制福尔马林所引起的第二相炎症痛， 其量效曲线显示， BN-9 对第二相炎症痛的镇痛 作用稍强于吗啡。

综上所述， 本发明基于阿片肽 Biphalin和 NPFF的嵌合肽 BN-9表现出比吗啡更强的中 枢镇痛活性， 并具有无镇痛耐受、 对胃肠运动影响小等优点， 有效克服了阿片类镇痛药物 普遍存在的耐受和便秘等副作用问题。 此外， 侧脑室注射 BN-9能显著地抑制福尔马林所 引起的急性痛和炎症痛， 且镇痛作用稍强于吗啡， 因此该嵌合肽 BN-9具有治疗临床疼痛 的潜在应用价值。

附图说明

图 1为小鼠侧脑室注射 BN-9所产生的剂量依赖性镇痛作用的时效曲线� �

图 2为小鼠鞘内注射 BN-9所产生的剂量依赖性镇痛作用的时效曲线� � 图 3为小鼠尾静脉注射 BN-9所产生的剂量依赖性镇痛作用的时效曲线� �（A)为注射； ( B ) 为注射；

图 4为小鼠侧脑室注射 BN-9和吗啡所产生的镇痛作用的量效曲线；

图 5为小鼠鞘内注射 BN-9和吗啡所产生的镇痛作用的量效曲线；

图 6为小鼠尾静脉注射 BN-9和吗啡所产生的镇痛作用的量效曲线；

图 7为小鼠脊髓和脊髓以上水平连续八天侧脑室� �射 BN-9和吗啡所引起的镇痛作用 的变化；

图 8为小鼠脊髓和脊髓以上水平连续八天鞘内注� � BN-9和吗啡所引起的镇痛作用的 变化；

图 9 小鼠侧脑室注射 BN-9和吗啡分别对胃肠运动的影响；

图 10小鼠脑室注射高剂量 BN-9和吗啡分别福尔马林所引起的急性痛和炎� �痛的抑制 作用；

图 11小鼠脑室注射 BN-9和吗啡分别福尔马林所引起的急性痛（第� �相）抑制的量效 曲线；

图 12小鼠脑室注射 BN-9和吗啡分别福尔马林所引起的炎症痛（第� �相）抑制的量效 曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的嵌合肽合成方 法作进一步说明。

I 材料

仪器： 高效液相色谱仪 （HPLC ) 为 Waters公司的 Delta 600; 分析柱： DELTA PAK 5μ〔18 300A 3.9xl50mm _; 制备柱： DELTA PAK 15μ C18 300 Λ 7.8x300mm。质谱仪为 PE Biosystems, Mariner System 5074。 手动固相多肽合成仪， 由本实验室设计后由玻璃工制作 （合成仪的 设计原理具体参考 Chen WC和 White PD所编的 《Fmoc solid phase peptide synthesis)) 中第 14 页图 4， 并在其基础上作了部分改进， 即用以机械搅拌方式替代鼓氮气法， 从而达到反应 溶液充分混合的目的）。 试齐 U: 树脂为 Rink-Amide-M BHA-Resin ( 1% DVB, 200 ~ 400 mesh , 取代值 S = 0.40 mmol/g resin ) ,购自天津南开和成公司。 A/-a-Fmoc保护的氨基酸（Fmoc-Aa )、 Λ/-羟基苯并三氮唑（HOBt)、 0-苯并三氮唑 -Λ/,Λ/,Λ/',Λ/ '-四甲基脲 -六氟磷酸盐（HBTU )、 二异 丙基乙胺 （DI EA)和三异丙基硅烷（TIS )购自吉尔生化（上海）有限公司。 茚三酮为上海 试剂三厂产品。 二氯甲烷 （DCM )、 Λ/,Λ/-二甲基甲酰胺 （DMF)、 六氢吡啶 （哌啶）、 甲醇 ( MeOH ) 和吡啶都购自天津第二试剂厂， 三氟乙酸 （TFA)、 苯酚和吡啶均为天津试剂一 厂产品； 以上有机试剂使用前均经过重蒸处理。

II 粗肽合成

采用 Fmoc保护策略的固相多肽合成法。 肽链延长采用逐一接肽法 （st _ep by _S te _P )。 具 体操作步骤如下：

( 1)树脂预处理：将 500 mg Rink-Amide-MBHA树脂加入合成仪中，再加入 8 ml的 DCM 后搅拌 30 min， 使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂。

( 2)脱除 Fmoc基团保护： 在溶胀、抽干溶剂的树脂中， 加入 8 ml体积浓度 20 %的六 氢吡啶 /DMF溶液， 搅拌 5 min后抽干， 重复 2次。再加入 8 ml 的体积浓度 20 %的六氢吡 啶 /DM F溶液， 搅拌 15 min 后抽干。 最后力口入 8 ml 的 DMF， 揽摔 3 min后抽干， 重复 4 次， 得到脱除 Fmoc基团保护的树脂样品。

( 3 ) 茚检： 按以下顺序加入试管中： 树脂样品、 0.1 ml试剂①、 0.2ml试剂②、 0.1 ml 试剂③， 沸水浴 3-10 min后观察。 溶液、 树脂均为蓝色表示 Fmoc保护基团脱除完全。 用 于茚检的三种试剂的配方为： 试剂① 80 g苯酚 /20ml乙醇； 试剂② 2.0 ml的 0.001 M氰化 钾 （水） / 98ml吡啶； 试剂③ 5 g 茚三酮 /100 ml乙醇。

(4)縮合： 在小烧杯中用 DMF依次将 A/-a-Fmoc保护基团氨基酸（Fmoc-Aa )、 Λ/-羟基 苯并三氮唑（HOBt)、 0-苯并三氮唑 -Λ/,Λ/,Λ/',Λ/ '-四甲基脲 -六氟磷酸盐（HBTU ) 以 1:1:1的摩 尔比完全溶解， 再加入 Fmoc-Aa两倍量的二异丙基乙胺 （DIEA) 后充分混匀， 得混合溶 液； 将 8 ml混合溶液和步骤 （2) 得到的脱除 Fmoc基团保护的树脂加入到合成仪中， 在 氩气保护下搅拌反应 60 min， 抽干溶剂。 加入 8 ml 的 DMF， 搅拌 3 min后抽干， 重复 3 次， 得肽树脂样品； 按照步骤 （3 ) 进行茚检， 茚检溶液为淡黄、 树脂为无色表示縮合完 全。

( 5 )肽链的延长： 重复步骤 （2)、 （4) 八次， 按照嵌合肽结构由 C-末端向 N-末端的顺 序， 依次将带有 /V-a-Fmoc保护基团氨基酸逐个縮合， 每步反应完成后， 经负压作用过滤 去除反应器中试剂， 直至完成所有氨基酸残基的縮合。

III 肽链从树脂上的切割

肽链的氨基酸残基全部縮合完成后， 按照上述步骤 （2) 中操作将肽树脂最后一个氨 基酸的 Fmoc基团脱除完全。然后按照 DCM 3 minx2次， MeOH 3 minxl次； DCM 3 minxl次， MeOH 3 minx2次的操作交替洗树脂。 移开搅棒， 将合成仪密封（胶塞）， 彻底抽干（至少 2 小时）。 将干燥的肽链树脂置于反应器中， 加入 18ml的切割剂 （体积比为 TFA:TIS^ = 95:2.5:2.5 ), 于室温下切割反应 2.5小时 （每 15分钟搅拌一次， 每次搅拌 1分钟）。 过滤， 滤 液在不高于 37°C的条件下充分减压旋干， 然后用不高于 -10°C的乙醚析出沉淀， 振荡使粗 肽以白色沉淀的形式充分析出。 静置后将上清液吸出， 加水充分溶解析出的沉淀， 用分液 漏斗将乙醚从水相中分离除去， 合并水相通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉 末 127.8 mg, 产率为 57.5 %。

IV粗肽的脱盐和纯化。

将全部粗产物溶于 20%乙酸溶液中， 将溶液过 Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱 ( 2.0x25cm ) , 流动相为体积浓度 20%乙酸溶液。 利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥， 得到脱盐处理后的白色粉末 116.2 mg。 再用反向高效液相色谱 （HPLC) C ₁₈ 柱 （XBridge TM BEH 130 C ₁₈ ， 19 mmx250mm ) 对上述脱盐的肽化合物进行分离纯化， 经分离后收集样品 主峰， 冷冻干燥得到白色的纯肽固体粉末 82.2 mg o 纯化后的 BN-9样品纯度在 98 %以上， 其合成的总产率为 40%。 质谱和色谱分析检测结果如表 2所示。

表 2 BN-9的质谱和色谱分析检测结果

分析色谱的保留时间 高分辨质谱 (MD-TOF-MS)

HPLC t _R (min) m/z (MH ⁺ )

肽样品

体系 1 体系 2 计算值 检测值

BN-9 16.335 17.277 1112.5641 1112.5655 注： 体系 1: 梯度洗脱体系 1为： 10-100% 乙腈 /水 (0.05% TFA) (30 分钟完成)， 流速 为： l mL/min， 检测波长为 220 nm， 分析色谱柱为： Delta Pak C ₁₈ , 5 μιη, 150x3.9 mm ; 体系 2: 梯度洗脱体系 2为： 10-80%乙腈 /水 (0.05% TFA) (30 分钟完成)， 流速为： 1 mL/min, 检测波长为 220 nm， 分析色谱柱为： Delta Pak C ₁₈ , 5 μιη, 150x3.9 mm。

通过质谱结果分析说明， 所合成的肽化合物 BN-9与设计的化合物结构一致。色谱检测 结果表明， 所合成的肽化合物 BN-9在两种不同体系的梯度洗脱时， 其保留时间分别为 16.335禾口 17.277分钟。