Les interactions protéine/protéine sont des mécanismes cellulaires fondamentaux gui interviennent dans la formation de complexes multimeriques responsables aussi bien de fonctions comme la transcription, la traduction, que de la transmission des signaux, la réponse à des agents pathogènes, etc...

Pour analyser ces interactions, les techniques biochimiques classiques (cross-lin ing, co-immunopré- cipitation, co-fractionnement par chromâtographie) ayant pour but d'isoler les protéines interagissant avec une protéine-cible sont généralement difficiles à mettre en oeuvre, surtout quand les protéines en interaction sont en faible quantité. En outre, elles permettent d'identifier les protéines en interaction, mais pas d'obtenir directement les gènes correspondant auxdites protéines .

Un procédé dénommé : "méthode double-hybride", permettant de détecter des interactions entre 2 protéines, a été mis au point par FIELDS et SONG [FIELDS and SONG, Nature, 340, 245-246 (1989) et Brevet US 5283173] .

Ce procédé est basé sur la co-expression dans une même cellule de levure, des gènes suivants :

- un gène rapporteur exprimant une protéine détectable, dont le niveau d'expression dépend de 1 ' activation transcriptionnelle par un domaine polypeptidique ; et - deux gènes chimériques, codant pour deux protéines hybrides comprenant respectivement les

séquences des deux protéines dont on souhaite détecter l'interaction : l'une comprend en outre un domaine d'activation transcriptionnelle régulant l'expression du gène rapporteur, et l'autre comprend en outre un domaine de liaison à l'ADN, qui reconnaît un site de liaison situé sur le gène rapporteur dans la cellule-hôte.

Lorsque les deux gènes chimériques s'expriment dans la même cellule, si une interaction entre les deux protéines a lieu, elle entraîne la mise en présence du domaine d'activation transcriptionnelle et du gène rapporteur, du fait de la fixation du domaine de liaison à l'ADN à son site situé sur le gène rapporteur. La transcription de ce dernier est activée, et on peut donc observer une augmentation de son produit d'expression. Dans le système décrit dans le brevet US

5283173, FIELDS et SONG ont plus particulièrement exploité les propriétés de GAL4, un activateur de la transcription chez Saccharomyces cerevisiae .

GAL4 active la transcription par l'ARN polymerase II (PolII) de gènes codant pour des enzymes impliqués dans le métabolisme du galactose. Cette protéine comporte 2 domaines fonctionnellement indépendants, et physiquement séparables : un domaine de liaison à l'ADN, représenté par le domaine N-terminal (acides aminés 1-147) qui se lie à des séquences spécifiques de l'ADN (UASQ, pour Upstream Activating Séquence pour le Galactose), et un domaine d'activation transcriptionnelle représenté par le domaine C-terminal (acides aminés 768-881) , qui active la transcription par la PolII.

Deux types de protéines hybrides peuvent ainsi être produits à partir de GAL4 : l'un contient le domaine GAL4 (1-147) fusionné à une première protéine-test, l'autre contient le domaine GAL4 (768-881) fusionné à une deuxième protéine-test. Si les 2 protéines-tests sont capables d'interagir, elles rapprochent les deux domaines

de GAL4, et déclenchent la transcription du gène rapporteur (par exemple le gène lacZ codant pour la β-galactosidase d ' E. coli . ) .

Il est possible de tester simultanément plusieurs protéines dans le but de rechercher leurs interactions avec une protéine donnée. Par exemple la protéine dont on recherche les partenaires est fusionnée au domaine de liaison GAL4(1-147) et elle est testée contre une banque de protéines fusionnées au domaine activateur GAL4 (768-881) .

De nombreux perfectionnements ont été apportés à la technique initialement utilisée par FIELDS et SONG : par exemple un système de clonage dans des phages λ convertibles ultérieurement en plasmides par recombinaison de sites lox, a été développé ; un second gène rapporteur, constitué par un marqueur d'auxotrophie, le gène HIS3 (impliqué dans le métabolisme de l'histidine) , a été utilisé en combinaison avec le gène lacZ, afin d'éliminer plus efficacement les faux-positifs [DURFEE et al., Gènes & Development, 7, 555-569, (1993)] .

Des variantes de cette technique ont également été proposées : ainsi, l'aspect non-exclusif de 2 interactions d'une protéine A avec 2 autres protéines B et C peut être démontré par la différence d'activation transcriptionnelle entre un système comprenant uniquement les 2 hybrides B et C respectivement fusionnés à GAL4-(1- 147) et GAL4- (758-881) , et un système comprenant les 2 hybrides B et C ainsi que la protéine A non-fusionnée mais simplement surexprimée, et qui forme un intermédiaire entre B et C [LEGRAIN and CHAPON, SCIENCE, 262, 108-110, (1993) ] .

Une technique dérivée, dénommée système simpie-hybride, permet de détecter des protéines se fixant sur des fragments d'ADN (par exemple des promoteurs ou des fragments impliqués dans la replication de l'ADN) . Dans ce cas, on utilise uniquement les

protéines hybrides codées par une banque d'ADNc fusionnés à GAL4- (768-881) . Cette banque est introduite dans des cellules contenant un gène rapporteur [HIS3 ou lacZ) placé en aval du fragment d'ADN étudié [WANG and REED, NATURE, 364, 121-126, (1993) ; LI and HERSKOWITZ, SCIENCE, 262, 1870-1874, (1993)] .

Des stratégies apparentées ont également été mises au point pour identifier les séquences d'ADN auxquelles se lie une protéine donnée [WILSON et al., SCIENCE, 252, 1296-1300, (1991)] , ou pour sélectionner des mutations fonctionnelles dans des domaines protéiques se liant à l'ADN [WILSON et al., Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 90, 9186-9190, (1993)] .

La limitation majeure de ce système tient à ce que la protéine dont on recherche les partenaires ne doit pas présenter d'activité activatrice de la transcription PolII. Cette limite interdit donc l'étude par cette technique des activateurs PolII physiologiques (impliqués dans des mécanismes de régulation de la transcription PolII, pathologiques ou normaux) , et, d'une manière générale, des protéines qui, fortuitement, possèdent des propriétés d'activation. Or, de telles propriétés ne sont pas rares : l'activation de la transcription PolII par des protéines qui ne sont pas des activateurs PolII physiologiques a été signalée; il a également été montré que 1% des fragments génomiques d ' E. coli engendrés aléatoirement par digestion par Sau3A, lorsqu'ils sont fusionnés au domaine codant pour GAL4 (1-147) , codent pour des peptides qui activent la transcription PolII [MA et PTASHNE, Cell . , 51, 113-119, (1987)] .

Les Inventeurs ont entrepris la mise au point d'un système ne possédant pas cette limitation. Dans ce but, ils ont eu l'idée de rechercher une méthode basée sur l'utilisation du système PolIII. Cependant, pour parvenir à un système double- hybride basé sur l'utilisation de la polymerase III, il

fallait d'une part identifier des facteurs de transcription du système PolIII utilisables dans ce but, et d'autre part disposer de gènes rapporteurs appropriés. Le système PolIII transcrit des gènes "de ménage", dont les produits (ARNt, ARNr 5S, ARN U6, etc..) sont nécessaires aux fonctions de base (traduction, épissage, etc..) de toute cellule active. Le fonctionnement du système PolIII nécessite la présence de différents facteurs de transcription, assurant un positionnement correct de la polymerase III. Par exemple, la transcription des gènes des ARNt fait intervenir tout d'abord un facteur dénommé TFIIIC ou τ qui se fixe sur des séquences intragéniques dénommées bloc A et bloc B. La fixation de τ sur le bloc B fait intervenir la sous-unité τl38 et sa fixation sur le bloc A, la sous-unité τ95. Une fois fixé, τ permet ensuite le recrutement d'un autre facteur, dénommé TFIIIB, à proximité du site d'initiation de la transcription. A son tour, TFIIIB permet le recrutement et le positionnement de la polymerase III sur le gène.

Dans le cas du gène de l'ARN U6 (dénommé SNR6) , le promoteur PolIII comprend un bloc A intragénique, un bloc B en aval du signal de terminaison de la transcription du gène, et une boîte TATA en position -30. Une succession d'étapes analogue à celle décrite pour les gènes des ARNt permet d'initier la transcription de SNR6. Ces étapes sont schématisées sur la Figure 1. La sous-unité τl38 du facteur τ se fixe d'abord sur le bloc B (1), puis la sous-unité τ95 sur le bloc A (2) . La fixation de τ permet de recruter TFIIIB par l'intermédiaire de la sous-unité τl31 (3) . Le rôle précis des autres sous-unités (τ50, τ60 et τ91) n'a pas encore été établi. TFIIIB, qui est composé des sous-unités de 70 kD (70) , 90 kD (90) et de la TBP (TATA-binding protein, protéine se fixant sur la boîte TATA) se positionne en amont de SNR6 (4) et permet ensuite le recrutement de la

polymerase PolIII (5) . La liaison de τl38 sur le bloc B de SNR6 constitue donc une des premières étapes de 1 ' activation transcriptionnelle de ce gène. Une mutation du bloc B (délétion des bases +238 et +239 par rapport au site d'initiation de la transcription de SNR6) qui abolit cette liaison empêche la transcription du gène SNR6 [BROW et GUTHRIE, Gène & Developement 4, 1345-1356 (1990) ; BURNOL et al., Nature, 362, 475-477, (1993)] .

Lors de travaux précédents, les Inventeurs ont démontré qu'il était possible de rétablir la transcription du gène SNR6 en insérant à 1 ' intérieur du bloc B muté ^" de SNR6 des séquences UASQ, et en utilisant un facteur de transcription chimérique, GAL4- (1-147) -τl38 résultant de la fusion du domaine de liaison GAL4- (1-147) et de τl38 [MARSOLIER et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 91, 11938-11942, (1994)] . Ce mécanisme de transcription est schématisé à la Figure 2. Ces expérimentations avaient été effectuées en présence d'un gène SNR6 de type sauvage, afin de produire des transcrits en quantité suffisante pour assurer la viabilité cellulaire .

Les Inventeurs ont constaté que la transcription du gène SNR6 muté, par l'intermédiaire de la protéine de fusion GAL4- (1-147) -τl38 pouvait fournir suffisamment de transcrits pour permettre aux cellules de croître sans la présence du gène SNR6 de type sauvage.

En effet, les Inventeurs ont introduit des plasmides comprenant le gène SNR6 sans bloc B et avec séquences UASQ, ainsi que des plasmides comprenant la construction GAL4- (1-147) -τl38, dans la souche de levure yMCM616.

Dans l'exposé de la présente Invention l'expression "sans bloc B", doit être comprise comme signifiant "sans bloc B fonctionnel" capable de reconnaître τl38. yMCM616 est un dérivé de la souche YPH500α,

[SIKORSKI et HIETER, Genetics, 122, 19-27, (1989)] , dont

le gène SNR6 chromosomal a été muté, et qui survit avec un gène de type sauvage SNR6 porté par un plasmide URA3. Cette souche ne pousse pas en présence d'acide 5-fluoro- orotique, qui est métabolisé en un composé toxique par le produit du gène URA3 [BOEKE et al . , Molecular and General Genetics, 197, 345, (1984)] .

De même, les transformants de yMCM616 comprenant la construction GAL4- (1-147) -τl38 seule, ou bien la construction GAL4- (1-147) -τl38 et des gènes SNR6 sans bloc B et sans séquences UASQ ne poussent pas en présence d'acide 5-fluoro-orotique (5-FOA) .

Or, les Inventeurs ont constaté qu'en revanche, les transformants yMCM616, comprenant la construction GAL4- (1-147) -τl38 et le gène SNR6 sans bloc B et avec séquences UASQ, sont capables de pousser en présence d'acide 5-fluoro-orotique, c'est-à-dire de perdre le plasmide URA3 portant le gène SNR6 sauvage, ce qui montre que la présence du gène SNR6 de type sauvage n'est pas nécessaire pour la viabilité cellulaire de ces transformants .

Les Inventeurs ont eu 1 ' idée de rechercher si ce processus d'activation de la PolIII par l'intermédiaire de GAL4- (1-147) -τl38 pouvait permettre la détection d'interactions protéine/protéine. Dans ce but, deux couples de protéines nucléaires de la levure (facteurs de clivage PRP) , dont les interactions ont été préalablement démontrées dans le système double-hybride PolII [LEGRAIN et al., Gènes & Development, 7, 1390-1399, (1993) et LEGRAIN et CHAPON, Science, 262, 108-110, (1993)] , à savoir les couples PRP9/PRP21 et PRP11/PRP21, ont été utilisés.

Des plasmides respectivement dénommés GAL4-(1- 147)-PRP9, et GAL4- (1-147) -PRP11, et comprenant la totalité des séquences codant pour PRP9 ou pour PRP11, fusionnées à la séquence codant pour les 147 aminoacides N-terminaux de GAL4, ont été construits. De même, un

plasmide (τl38-PRP21) a été construit, qui comprend la totalité de la séquence codante de τl38 fusionnée à la région codante de PRP21.

Ces différents plasmides ont été introduits dans la souche yMCM616 en même temps qu'un plasmide comprenant le gène SNR6 dépourvu de bloc B, avec ou sans séquence UASQ.

Les Inventeurs ont ainsi constaté que la présence des trois types de plasmides, (à savoir un plasmide portant la construction X138-PRP21, un plasmide portant la construction GAL4- (1-147) -PRP9 ou GAL4- (1- 147) -PRP 11, et un plasmide portant le gène SNR6 sans bloc B et avec des séquences UASQ) est nécessaire pour permettre aux transformants de croître en présence d'acide 5-fluoro-orotique . En revanche, aucune croissance cellulaire n'est observée quand l'un des plasmides GAL4- (1-147) -PRP9/11 ou τl38-PRP21 manque ou quand les gènes SNR6 dépourvus de bloc B sont également dépourvus des séquences UASQ. Les Inventeurs ont obtenu des protéines chimériques résultant, l'une de la fusion de GAL4- (1-147) avec une protéine membre d'un couple d'interaction, et l'autre de la fusion de τl38 avec l'autre membre dudit couple d'interaction, et ont constaté que l'interaction entre ces deux protéines de fusion reproduisait l'activité du facteur de transcription GAL4- (1-147) -τl38. Le système de transcription ainsi obtenu est schématisé à la Figure 3 .

En outre, l'efficacité de la transcription par ce système permet d'obtenir suffisamment de transcrits pour assurer la viabilité cellulaire, et donc de pratiquer un test de sélection basé sur la viabilité des cellules.

La présente Invention a pour objet une protéine chimérique résultant de la fusion d'un polypeptide constituant un activateur de la transcription

PolIII, avec un polypeptide constituant un membre d'un couple d'interaction protéine/protéine.

Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, le polypeptide constituant un activateur de la transcription par la polymerase PolIII est une sous-unité d'un facteur de transcription PolIII ou une sous-unité de la polymerase PolIII elle-même, ou représente au moins une partie de l'une de ces sous- unités . Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, le polypeptide constituant un activateur de la transcription par la polymerase PolIII, est choisi dans le groupe constitué par les sous-unités du facteur TFIIIC (τl38, X131, etc ..) , et les polypeptides représentant une partie desdites sous-unités.

La présente Invention a également pour objet un gène codant pour une protéine chimérique telle que définie ci-dessus, ainsi qu'un vecteur recombinant portant ledit gène. La présente Invention a également pour objet un couple de protéines chimériques comprenant une première protéine chimérique telle que définie ci-dessus, et une seconde protéine chimérique résultant de la fusion d'un polypeptide capable de se lier à une séquence d'ADN spécifique, avec un polypeptide constituant l'autre membre du couple d'interaction protéine/protéine mentionné ci-dessus.

Différents polypeptides capables de se lier à une séquence d'ADN spécifique, sont utilisables pour construire cette seconde protéine chimérique ; à titre d'exemples non-limitatifs, on citera : le domaine 1-147 de GAL4, qui reconnaît spécifiquement les séquences UASQ ; le domaine de fixation de LexA [BRENT and PTASHNE, Cell, 43, 729-736, (1985)] ou celui du récepteur humain de 1 ' oestrogène [LE DOUARIN et al . Nucleic Acidε Research, 23, 876-878, (1995)] , etc ..

La présente Invention a aussi pour objet un procédé de détection des interactions entre deux protéines, lequel procédé est caractérisé en ce que l'on introduit, dans une même cellule-hôte, les séquences d'ADN suivantes :

- une séquence d'ADN (a) , dont au moins une partie constitue un gène rapporteur transcrit par la polymerase III ; et au moins une partie constitue un site de liaison reconnu par une séquence polypeptidique capable de se fixer à l'ADN ,-

- une séquence d'ADN (b) , dont au moins une partie constitue un premier gène chimérique, comprenant une séquence codant pour un polypeptide constituant un activateur de la transcription par la polymerase PolIII, fusionnée avec une séquence codant pour un polypeptide susceptible de constituer un membre d'un couple d'interaction protéine/protéine ;

- une séquence d'ADN (c) , dont au moins une partie constitue un second gène chimérique, comprenant une séquence codant pour le polypeptide qui reconnaît le site de liaison porté par la séquence (a) , fusionnée avec une séquence codant pour un polypeptide susceptible de constituer le second membre dudit couple d'interaction protéine/protéine ; en ce que l'on met ladite cellule-hôte en culture, dans des conditions autorisant l'expression du gène rapporteur porté par la séquence (a) et en ce que l'on détecte l'expression dudit gène rapporteur, dans la cellule-hôte ou dans sa descendance, par tous moyens appropriés .

Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, le gène rapporteur transcrit par la polymerase III est le gène SNR6.

D'autres gènes PolIII peuvent également être utilisés comme gènes rapporteurs, pour autant que leur expression entraîne l'apparition d'un phénotype

observable. Il peut s'agir par exemple des gènes d'ARNt, et en particulier, des gènes suppresseurs de codons de terminaison de traduction.

Ce (s) gène (s) rapporteur(s) peu (ven) t se trouver sur des plasmides centromériques ou multicopie, ou être intégré (s) dans les chromosomes de la cellule- hôte.

Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la présente Invention le site de liaison reconnu par une séquence polypeptidique capable de se fixer à l'ADN est une séquence UASQ , et le polypeptide qui reconnaît ledit site de liaison est le domaine 1-147 de GAL4.

D'autres associations séquence polypeptidique- site de liaison sont également utilisables, comme par exemple le domaine de fixation de LexA ou celui du récepteur humain de l'oestrogène, cités ci-dessus, ; ces polypeptides sont utilisés en association avec leurs séquences-cibles d'ADN respectives (opérateurs LexA et EREs, éléments de réponse au récepteur de l'oestrogène) . Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, le polypeptide constituant un activateur de la transcription par la polymerase PolIII, est la sous-unité τl38 du facteur TFIIIC.

Selon encore un autre mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, la cellule-hôte utilisée est de préférence une cellule de levure (Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe . . . ) .

La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé conforme à l'Invention.

Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1 : Souches et plasmides :

La souche yMCM616 est identique à la souche FTY115 décrite par MARSOLIER et al. [Gènes & Development, 9, 410-422, (1995)], à l'exception du fait qu'elle comprend non pas le plasmide pRS314-U6, mais le plasmide centromérique URA3 pRS316-U6, portant la région du gène SNR6 qui s'étend entre les bases -140 à + 314 par rapport au site de départ de la transcription. Le plasmide pRS316-U6 a été obtenu à partir du plasmide d'origine URA3 pRS316, qui a été décrit par. SIKORSKI et HIETER, [Genetics, 122, 19-27, (1989)] . La région (-140 ,- +314) de SNR6 a été clonée entre les sites Kpnl et Sacl de pR316 pour donner pR316-U6.

Cette construction est schématisée à la Figure 4 (CEN : séquences centrométriques de levure ; URA3 : gène codant pour l'orotidine-5' -phosphate décarboxylase qui est impliquée dans la biosynthèse de l'uracile).

Le génotype de, la souche yMCM616 est : α, ura3-52, lys2-801 ^{a bre} , ade2-101 ^ocnre , trpl-Δ63, his3- Δ200, Ieu2-Δl. Par ailleurs, le gène chromosomal SNR6 sauvage de la souche initiale a été remplacé par un gène SNR6 mutant dont le bloc B a été inactivé par la délétion des bases 238-239 (à partir du site d'initiation de la transcription) [MARSOLIER et al., Gènes & Development, vol. 9, 410-422, (1995)] .

D'autre part, un gène SNR6 sans bloc B et avec séquences UAS _Q , similaire à la construction "B block-UAS _Q template" décrite par MARSOLIER et al., [Proc Natl. Acad. Sci. USA, 91, 11938-11942, (1994)] mis à part le fait qu'il est dépourvu de l'insertion de 24 pb à la position +73, a été clone entre les sites Apal et Sacl du plasmide centromérique LEU2, pRS315 [SIKORSKI et HIETER, Genetics, 122, 19-27, (1989)] Cette construction est schématisée à la Figure 5 (CEN : séquences centrométriques de levure ; LEU2 : gène codant pour la

β-isopropylmalate déshydrogénase impliquée dans la synthèse de la leucine) .

En outre, le gène SNR6 sans bloc B et dépourvu de séquences UASQ du plasmide pRS314-U6 décrit par MARSOLIER et al. [Gènes & Development, 9, 410-422, (1995)], a été recloné entre les sites Apal et Sacl du plasmide centromérique pRS315.

Des plasmides respectivement dénommés GAL4- (1-147) -PRP9, et GAL4- (1-147) -PRP11, et dérivés de pMA424 ont été précédemment décrits [LEGRAIN et al. , Gènes & Development, 7, 1390-1399, (1993) ; LEGRAIN et CHAPON, Science, 262, 108-110, (1993)] . Ces plasmides contiennent une construction comprenant la totalité de la séquence codant pour PRP9 ou pour PRP11, fusionnée aux 147 aminoacides N-terminaux de GAL4. Ces constructions sont schématisées à la Figure 6 (ADH1-PRO : région promotrice de la transcription du gène de levure ADH1 codant pour une alcool déshydrogénase ; ADH1-TER : région terminatrice de la transcription du gène ADH1 ,- 2μ : séquences de replication autonome dérivées du plasmide de levure 2μ ; HIS3 : gène codant pour l'imidazoleglycérol- phosphate déshydrogénase impliquée dans la synthèse de 1'histidine) .

D'autre part, la construction X138-PRP21 constituée par la totalité de la séquence de τl38 [LEFEBVRE et al. Proceedings of the National Academy of Science USA, 89, 10512-10514, (1992)] fusionnée à la région codante de PRP21, a été obtenue comme suit :

La séquence de τl38 a été clonée à partir du plasmide dénommé pOLlOl (fourni par Olivier LEFEBVRE, C.E.A-Saclay, Gif-sur-Yvette) . pOLlOl a été obtenu comme suit : le plasmide pOL45 décrit par LEFEBVRE et al. , [Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 89, 10512-10516 (1992)] qui contenait la séquence de tl38 avait été modifié pour éliminer l'intron du gène (LEFEBVRE et al., 1992, déjà cité) . Ce plasmide pOL45

modifié a été ultérieurement mutagénisé par mutagénèse dirigée [KUNKEL et al., Methods in Enzymology, 154, 367- 382, (1987)] : des sites BamHI ont été introduits, l'un, juste devant le codon d'initiation de τl38, l'autre, juste devant les codons de terminaison, pour donner pOLlOl. Le fragment BamHI de pOLlOl comprenant la totalité de la séquence codante de τl38 a ensuite été clone dans le vecteur pBluescript SK (BSSK, Stratagène) de manière à ce que le site Kpnl de BSSK soit localisé à l'extrémité 5' de τl38. Le plasmide résultant est dénommé BSSK-X138.

La séquence de PRP21 a été clonée à partir du plasmide dénommé pPL247 (ce plasmide a été fourni par Pierre LEGRAIN, Institut Pasteur, Paris) . Brièvement, pPL247 a été obtenu comme suit : Un fragment d'ADN a été dérivé par PCR à partir du gène PRP21. Ce fragment comprend la séquence codante de PRP21 encadrée en 5' par un site BamHI introduit en -8 par rapport au codon d'initiation, et en 3' par un site EcoRI, suivi d'un site BamHI introduits 26 pb après le codon de terminaison. Ce fragment d'ADN digéré par BamHI a été clone dans le site BamHI de pMA424

[LEGRAIN et al., Gènes & Development, 7, 1390-1399,

(1993)] . Le site BamHI en 3' de PRP21 a été ultérieurement éliminé, et le fragment BamHI-Pstl du plasmide contenant la séquence de PRP21 a été clone dans le vecteur pBluescript SK ^" (BSSK, Stratagène) , pour donner pPL247.

Le site unique BamHI de pPL247 situé à l'extrémité 5' de PRP21, a été ouvert, pourvu d'extrémités franches, et religué de manière à pouvoir ultérieurement mettre PRP21 en phase avec τl38.

Le plasmide pPL247 ainsi modifié a été ensuite digéré par Spel et EcoRV, et le fragment résultant, contenant PRP21, a été inséré entre les sites Spel et Notl pourvu d'extrémités franches, de BSSK-X138. Un fragment EcoRI comprenant la construction X138-PRP21, a

ensuite été introduit dans le site EcoRI du plasmide pYcDE-2. Le plasmide pYcDE-2 a été fourni par B.D. HALL, University of Washington, Seattle, USA. Ce plasmide dérive du plasmide pMAC561 [McKNIGHT et McCONAUGHY Proc.Natl.Acad.Sci USA, 80, 4412-4416 (1983)] par délétion d'un fragment SphI comprenant la partie amont du promoteur du gène ADH1 , qui se trouve ainsi réduit à un fragment EcoRI-SphI, ce qui le rend réellement constitutif. La construction résultant de l'insertion du fragment chimérique X138-PRP21, dans le site EcoRI du plasmide pYcDE-2 est schématisée à la Figure 7

(ADH1-PRO : région promotrice de la transcription du gène de levure ADH2 ; CYCl-TER : région terminatrice de la transcription du gène de levure CYCl codant pour l'iso-1- cytochrome c ; 2μ : séquences de replication autonome dérivées du plasmide de levure 2μ ; TRP1 : gène codant pour une enzyme impliquée dans la synthèse du tryptophane) . EXEMPLE 2 : ACTIVATION DE LA TRANSCRIPTION PAR UN SYSTEME DOUBLE-HYBRIDE POLIII CONFORME A L'INVENTION

Les plasmides contenant les constructions :

- GAL4 - ( 1 - 147 ) -τl38 ;

- X138 - PRP21 , et GAL4 - ( 1 - 147 ) - PRP9 , ou GAL4 - ( 1 - 147 ) - PRP11 ; ont été introduits dans la souche yMCM616 en même temps que les plasmides contenant les gènes SNR6 dépourvus de bloc B, et avec ou sans séquence UAS _Q . Les clones transformants sont sélectionnés sur des milieux minimum dépourvus d'uracile, de leucine, d'histidine ou de tryptophane (selon les gènes marqueurs portés par les plasmides) et sont ensuite étalés sur milieu complet en présence d'acide 5-fluoro-orotique.

La présence des trois types de plasmides, (à savoir un plasmide portant X138-PRP21, un plasmide portant GAL4- (1-147) -PRP9 ou 11, et un plasmide portant le gène

SNR6 dépourvu de bloc B et comprenant des séquences UAS _Q ) est nécessaire pour permettre aux transformants de croître en présence d'acide 5-fluoro-orotique. Aucune croissance cellulaire n'est observée quand l'un des plasmides GAL4- (1-147) -PRP9/11 ou X138-PRP21 manque, ou quand les gènes SNR6 dépourvus de bloc B sont également dépourvus des séquences UASQ.

Pour l'analyse quantitative des transcrits SNR6 produits par le système double-hybride, les transformants contenant les constructions GAL4- (1-147) -PRP9/11 et X138-PRP21 ont été repiqués plusieurs fois sur milieu 5-FOA, et ont de ce fait perdu le plasmide URA3 contenant le gène SNR6 sauvage. Leurs transcrits SNR6 proviennent donc exclusivement de la transcription du gène SNR6 sans bloc B mais avec les séquences UAS _Q par l'intermédiaire des 2 hybrides.

Plusieurs clones ont été analysés de la sorte pour chaque combinaison de constructions.

La quantité de transcrits SNR6 produits a été quantifiée par transfert d'ARN, comme décrit précédemment [MARSOLIER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 11938-11942, (1994)], en utilisant le transcrit du gène SNR31 en tant que contrôle interne. Le Tableau I ci-dessous représente le pourcentage de transcrits SNR6 produits par rapport à la souche yMCM616 portant seulement le gène de type sauvage SNR6 sur le plasmide pRS316, qui représente 100%.

TABLEAU I

CONSTRUCTIONS QUANTITE DE TRANSCRITS (%)

GAL4- (1-147) -X138 90%

GAL4- (1-147) -PRP9 + X138- 62% PRP21

GAL4- (1-147) -PRP11 + X138- 71% PRP21

Ces résultats montrent que le système double- hybride conforme à l'Invention permet d'obtenir un niveau de transcription élevé, représentant la production de 60 à 70% des transcrits produits par le gène SNR6 sauvage possédant un bloc B intact.

EXEMPLE 3 : COMPARAISON DU SYSTEME D'ACTIVATION DOUBLE-HYBRIDE POLIII CONFORME A L'INVENTION AVEC UN SYSTEME D'ACTIVATION DOUBLE-HYBRIDE POLII Les taux d'expression obtenus avec les deux systèmes d'activation : UASQ-lacZ (double-hybride PolII) et UAS_.- SNR6 (double-hybride PolIII conforme à l'invention) ont été comparés à ceux obtenus avec l'activateur "sauvage" de chacun des deux systèmes. Pour UASQ-lacZ, les résultats reproduits dans le Tableau II ci-dessous sont ceux rapportés par MA and PTASHNE, [Cell, 48, 847-853 (1987)] pour l'activateur sauvage et l'activateur chimère PolII, et par LEGRAIN et al. [Nucleic Acids Research, 22, 3241-3242, (1994)] pour le système double-hybride PolII; le taux d'expression est déterminé par la mesure de l'activité β-gal.

Pour UASQ-SMRfj, le taux d'expression est déterminé par la mesure du pourcentage de transcription.

Les résultats sont représentés dans le Tableau II ci-dessous :

TABLEAU II

Ces résultats montrent que dans le cas des molécules chimère où la partie activatrice des 2 systèmes

(respectivement GAL4- (768-881) pour PolII, et xl38 pour

PolIII) est fusionnée directement au domaine de liaison

GAL4- (1-147) , et où ces deux domaines sont donc fortement fixés par liaison covalente, on obtient un niveau d'expression (que l'on fixe arbitrairement à 100%), plus ou moins comparable au niveau obtenu avec les activateurs et les gènes sauvages (190% pour PolII avec lacZ et 110% pour PolIII avec SNR6) .

En revanche, lorsque la liaison entre la partie activatrice et le domaine de liaison à l'ADN est constituée par l'interaction entre PRP21, et PRP9 ou PRP11, le comportement des 2 systèmes PolII et PolIII se différencie fondamentalement. En effet, avec le système d'activation PolII (UASQ-lacZ), on obtient un taux d'expression mesuré par une activité β-gal de 40-60 U [LEGRAIN et al., 1994)] qui est relativement peu important, (seulement 4-6% de l'activité obtenue avec

GAL4- (1-147) -GAL4- (768-881) ) . Au contraire, on obtient pour le gène UASQ-SJtfRfJ, et avec la même interaction faible PRP21-PRP9/11, un taux de transcription correspondant à 70-80% de celui obtenu avec GAL4- (1-147) -X138.