本発明のマイクロビーズアレイ用チップに おいて、プローブが固定されたマイクロビー ズはマイクロ流路内に注入され、その内の適 当な中間領域に複数本直線部分が配列される 。その結果、マイクロビーズアレイが形成さ れる。この為に、少なくとも一つのマイクロ 流路の下流部において、前記溶液が流れる隙 間を有するように、マイクロ流路形成体の片 面の表面に形成された溝の内部に突出して突 起部〔図1(4)〕が設けられ、それによって形� �されたダム構造によって、先頭のマイクロ� �ーズの移動を阻止して後続のマイクロビー� �が連なって複数個整列して貯留させること� �出来る。

更に、基板面に貼着されるマイクロ流路形 成体に設けられた溝(マイクロ流路)の上流部� ��び下流部にあたる位置には、溶液の注入口� ��図1(5)〕及び排出口〔図1(6)〕として機能す� �貫通孔が夫々設けられており、それらを介� �てマイクロビーズと、測定対象の被検物質� �を含む溶液とをマイクロ流路内に流すこと� �出来る。このような貫通孔はマイクロ流路� �構成に応じて、それぞれ、複数個設ける〔� �1(a)〕ことも可能である。このような構造を� ��するマイクロ流路内に配置されて成るマイ� ��ロビーズアレイの概略を図1に示す。

マイクロビーズアレイ用チップを構成する マイクロ流路形成体の大きさ及び形状は、使 用目的及び基板の大きさ等を考慮してと当業 者が適宜決めることができ、通常、一辺10~50m mの略四角状で、厚さが2~5mm、例えば、20mmx20mm 、厚さ2mmである。

又、マイクロビーズ配列用のマイクロ流路 の形状・大きさ等も使用目的等を考慮して適 宜決めることが出来るが、マイクロビーズの 直径よりは多少大きくする必要がある。従っ て、通常、マイクロ流路形成体の片面に設け られた溝の幅5~100μm、高さ(深さ)5~100μm、例え ば、幅及び高さ共に6.5μm(直径5μmのマイクロ� ��ーズ使用)とすることができる。

又、溝に設けられた突起部によって形成され るダム構造によりマイクロ流路内に形成され るプローブが固定されたマイクロビーズアレ イの一端が堰き止められるので、該突起部の 幅及び高さはマイクロ流路のそれらよりも小 さく、且つ、マイクロビーズを堰き止める一 方で、マイクロビーズを含む溶液は流すこと が出来るだけの大きさを有している必要があ る。
従って、通常、突起部は幅2~90μm、高さ5~100μm 、及び、長さ10~100μm、例えば、幅2.5μm、長さ 10μm、高さ6.5μmとすることができる。又、注� ��口及び排出口として機能する貫通孔の直径� ��、マイクロビーズの大きさ等も考慮して、� ��常、0.5~2mmである。

マイクロ流路(溝)の構成はマイクロビーズ� ��送入過程及びマイクロビーズの数・配列等� ��考慮して当業者が適宜決めることが出来る� ��例えば、マイクロ流路が複数あり、互いに� ��なくとも一つのジャンクションで連通され� ��いる構成(図2)、及び、該マイクロ流路形成� ��の片面に形成された溝(マイクロ流路)が注� �口から排出口に到るまで一本の溝から成り� �該一本の溝が中間領域において蛇行して前� �複数の直線部分を有するように形成されて� �る構成(図3)とすることができる。

又、マイクロ流路の上流側及び/又は中間� �域において、蛍光顕微鏡の同一視野の領域� �で、直線部分が複数本の互いに並行に観察� �能に形成され、各ダム構造の下流部におい� �一つに合流し、それが一つの共通の貫通孔(� ��出口)に連通させるようにすることも可能で ある〔図1(a)〕。この場合、各直線部分毎に� �なるプローブが固定されたマイクロビーズ� �それぞれ注入され、蛍光顕微鏡下の同一視� �領域内で観測できるように、隣り合う直線� �分に異なるプローブが固定されたマイクロ� �ーズが配列されることになる。この場合は� �注入時に、一つの直線部分には同じプロー� �が固定されたマイクロビーズが一列に並ぶ� �うに、マイクロシリンジポンプまたは光ピ� �セットで時間的に切り替えて、マイクロビ� �ズと溶液とを注入するか、又は、個別に異� �るプローブが固定されたマイクロビーズを� �意しておき、マイクロシリンジポンプまた� �光ピンセットでコントロールして一斉に注� �する。

マイクロ流路が溶液を注入する際の操作を より容易にするために、複数のマイクロ流路 が上流部において互いに、例えば、扇状に広 がり、各マイクロ流路に連通する複数の注入 口は、例えば、互いに2~5mm程度の間隔を有す� ��ように設計することが出来る〔図1(a)〕。又 、注入口及び排出口である貫通孔に適当な長 さのマイクロチューブ等の細管を接続するこ とによって、溶液の注入及び排出が容易とな る(図4)。

通常、蛇行構造を有するマイクロ流路の中 間領域が100~1000μmの長さ、例えば、約500μmを� ��する。又、マイクロ流路の中間領域全体は� ��この部分に配列されるマイクロビーズに固� ��されたプローブと被検物質との反応領域が� ��微鏡プラットフォームに対応可能となる(顕 微鏡視野領域内に配置される)ように微小で� �ることが好ましい。例えば、その縦横が夫� �、40~1000μmの長さ、例えば、100μm四方内に収� ��るような大きさであることが好ましい。

マイクロメートルおよびナノメートル加工 により上記のようなマイクロ流路を設けるこ とが可能な限り、マイクロ流路形成体に使用 する透明な材質に特に制限はなく、当業者に 公知の任意のものを適宜選択することが可能 である。その代表例として、フォトリソグラ フィーによる加工が可能な紫外および可視光 感受性高分子、鋳造加工可能なPDMS(ポリジメ� ��ルシロキサン)に代表される透明シリコンゴ ム類、射出成形可能なPMMA(ポリメチルメタク� ��レート)等の熱可塑性樹脂、及び、ナノメー トルサイズの構造を転写するナノインプリン トに適応可能なCOP(シクロオレフィンポリマ� �)等の熱可塑性樹脂および光硬化樹脂等の樹� ��フィルムを挙げることが出来る。更に、各� ��プラスチック、ガラス、及び、石英等の材� ��も使用することが出来る。

PDMSはシリコンエラストマーの一種である。� �明性が極めて高く、光学的特性に優れてお� �、広い波長領域、特に、可視光領域での吸� �が極めて小さく、蛍光検出に適している。� �た、鋳型法を用いることによりナノからミ� �ロンオーダーの任意の微細構造を有するマ� �クロ構造体の微細加工が容易である。更に� �PDMS自体が、ガラス及びアクリル樹脂等のプ� ��スチックに対する良好な吸着性及び剥離性� ��有しており、微細加工を施されたPDMS部材に これら素材から成る基板を貼着させることに より、マイクロ流路やチャンバーを容易に形 成することが可能である。更に、PDMSは弾力� �に優れ、生体適合性材料でもある。
又、COP(シクロオレフィンポリマー)は光学用� ��目的とした、透明性、低複屈折性、耐熱性� ��低吸湿性を兼ね備えた樹脂として開発、製� ��化が進んでいる樹脂であり、携帯電話のカ� ��ラ部のレンズや光ピックアップ用レンズの� ��料として利用されている。特に近年熱転写� ��ノインプリント技術によってCOP樹脂にナノ� ��ートルおよびマイクロメートルサイズの任� ��の微細構造を構築することが可能となって� ��る。さらに、蛍光観察において問題となる� ��家蛍光も石英と同程度なため、顕微鏡下で� ��蛍光観察にも適している。

本発明で使用するマイクロ流路形成体はそ の材質等に応じて当業者に公知の任意の方法 で容易に製造・加工することが出来る。基板 面に溝を形成する方法としては、例えば、微 細加工用ドリル、ブロード等を用いて機械的 切削加工法により溝部分を取り除く方法、フ ォトリソグラフィー、電子ビームリソグラフ ィー等の電離放射線リソグラフィーまたはAFM リソグラフィー、物理的、化学的エッチング により、溝部分を取り除く方法等、あるいは 、これらの方法を組み合わせて用いることに よって、マイクロ流路形成体上に溝を直接的 に形成することが出来る。更に、こうした方 法で作製した所望の溝構造と反転する凸部構 造を有する鋳型を用いて、該空間構造を転写 することにより、間接的に溝を形成すること も可能であり、例えば、鋳型を用いた射出成 形、もしくは高温でのプレスモールド等を用 いることができる。特に、素材としてPDMSを� �いる場合には、PDMSは鋳型に対する追従性が� ��いので、鋳型を用いて形成する方法が特に� ��ましい。一度鋳型を作製すると、製造コス� ��を下げ、簡便かつ安価に大量のマイクロビ� ��ズアレイを生産できる。

本発明のマイクロビーズアレイ用チップを 構成する基板として使用する透明な材質は、 本発明のマイクロビーズアレイを用いる検出 方法に使用する測定手段・装置等に応じて、 公知の物質から当業者が適宜選択することが でき、例えば、ガラス、石英、プラスチック 、又はPDMS等の透明シリコンゴム類に代表さ� �る合成樹脂等を挙げることができる。

又、基板面にマイクロ流路形成体を貼着さ せる際には、プラズマエッチング装置等を用 いて基板表面を酸素で処理するとより強固な 接着が可能となる。又、マイクロ流路形成体 としてPDMSを用いた場合は、適当な洗剤を用� �てガラス等の基板から有機物、ゴミなどを� �り除けば接着剤なしで貼着させることが可� �となる。

 本発明のマイクロビーズアレイに使用さ� ��るマイクロビーズ直径はマイクロ流路の大� ��さ等に応じて当業者が適宜きめることがで� ��、通常、4~90μm、好ましくは4~10μm、例えば� �約5μmである。尚、既に記載したように、標� ��物質からの蛍光の測定に際して全反射照明� ��同様の効果を得るためには、マイクロビー� ��の直径を、マイクロビーズ固定用のマイク� ��流路の高さ(深さ)及び幅より僅かに小さく� �てマイクロビーズとマイクロ流路の隙間が� �さくすることが好ましい。又、一度に使用� �るマイクロビーズの総数は、被検物質の種� �及びマイクロ流路の長さ等に応じて当業者� �適宜きめることができ、通常、10~250個の範� �、例えば100個程度のマイクロビーズを使用� �ることが可能である。本発明のマイクロビ� �ズアレイで使用可能なマイクロビーズは市� �されており、当業者に公知の任意の材質、� �えば、ポリスチレン等で構成され、適当な� �法で製造することが出来る。

マイクロビーズに固定化されるプローブは 、被検物質と特異的に認識して結合し得る物 質であり、被検物質に応じて、当業者が適宜 選択することが出来る。例えば、DNA等の各種 核酸分子及びオリゴヌクレオチド等のその断 片、抗原・抗体等のタンパク質及びペプチド 類、脂質及び糖類、または薬剤等の低分子化 合物等を挙げることが出来る。これらは血液 等の体液及び細胞・組織等から適当な抽出又 は精製方法によって調製されたもの、又は、 自然界及び環境から取得されたもの、更には 、各種の合成物質であっても良い。ここで、 異なるプローブがぞれぞれ固定された複数種 のマイクロビーズを使用することによって、 複数種の被検物質を同時に測定することも可 能である。

或いは、検査対象と結合可能なプローブが固 定されたマイクロビーズと、検査対象と結合 しないプローブが固定されたマイクロビーズ とが、マイクロビーズアレイ用チップのマイ クロ流路の直線部分に隣り合って配列させる ことも可能である。
尚、プローブ分子は、プローブ及びマイクロ ビーズ等の種類に応じて、物理的吸着法、共 有結合、静電結合及びイオン結合等の化学的 固定化法、生物学的特異結合等の担体結合法 、架橋法、高分子物質で包み込む包括法等の 、当業者に公知の任意の方法で行なうことが 出来る。更に、適当なリンカー分子を介して マイクロビーズに結合させることも出来る。 尚、プローブの固定化に際して、必要に応じ て、適宜、紫外線照射、化学架橋剤によるク ロスリンク形成、マイクロビーズ表面のブロ ッキング、洗浄等の処理を行うことが出来る 。

 尚、マイクロ流路への各種溶液の送入及� ��排出は、当業者に公知の適当な供給手段及� ��回収手段を用いて行なうことが出来る。こ� ��よう手段の例として、例えば、ガラス製シ� ��ンジ、プラスチックシリンジ、マイクロピ� ��ッター、フッ化エチレン樹脂チューブ・シ� ��コンチューブ、塩ビチューブ、ペリスタポ� ��プ、プランジャーポンプ、マイクロシリン� ��ポンプ、またはこれらの適当な組み合わせ� ��挙げることが出来る。

 本発明のマイクロビーズアレイは、上記� ��マイクロビーズアレイ用チップの注入口か� ��プローブが固定されたマイクロビーズを含� ��溶液を上記の方法で送入し、排出口から溶� ��を排出することによって、マイクロ流路内� ��適当な構造を有する中間領域に該マイクロ� ��ーズを配列させることによって容易に作製� ��ることが出来る(図4、図5)。

より具体的には、マイクロビーズアレイ用 チップの注入口から検査対象と結合可能なプ ローブが固定された第1のマイクロビーズ複� �個含む溶液を注入し、排出口から溶液を排� �させながら、所定マイクロ流路の直線部分� �前記第1のマイクロビーズを流し込んで前記� ��出部で先頭のマイクロビーズを停止させて� ��後続のマイクロビーズを複数個一列に配列� ��せる段階と、前記マイクロ流路の直線部分� ��隣り合ったマイクロビーズ直線部分に、前� ��第1のマイクロビーズとは異なるプローブが 固定された第2のマイクロビーズを複数個含� �溶液を注入口から注入し、前記第1のマイク� ��ビーズ列に隣り合う所定マイクロ流路直線� ��分に、前記第2のマイクロビーズを複数個一 列に配列させる段階を少なくとも1度行うこ� �によって、本発明のマイクロビーズアレイ� �作製することができる。

例えば、マイクロシリンジポンプを用いて 溶液を送入し、排出口の孔に繋げたチューブ から溶液を吸引することによって排出するこ とができる。溶液を流す速度(吸引速度)はマ� ��クロビーズアレイの構造等に応じて、適当� ��設定することが出来、例えば、20~200μL/hと� �ることができる。

 その際に、適当なレーザー(例えば、Nd:YAG レーザー:波長1064nm)を用いる光ピンセットに� ��りマイクロビーズをソーティングすること� ��可能である。即ち、光ピンセットがオフ状� ��ではマイクロビーズはマイクロ流路を直進� ��ているが、ジャンクションにおいて光ピン� ��ットをオン状態にすることによってこのマ� ��クロ流路を流れている1個のマイクロビーズ を捕捉し、該流路と連通する別のマイクロ流 路にこの捕捉したマイクロビーズを導入する ことが可能である(図6、図7)。

更に、例えば、当業者に公知のナノリット ルレベルでの制御が可能な油圧式の超微量分 取装置を用いて、例えば、マイクロタイター 内の溶液中からマイクロビーズを一個ずつ吸 い上げ、マイクロビーズアレイ用チップの注 入口からマイクロビーズを一個一個送入する ことも可能である(図8、図9)。

本発明のマイクロビーズアレイに形成され たマイクロ流路に試料溶液を導入することに よって、該マイクロ流路内に配列されたマイ クロビーズに固定化されたプローブと特異的 に結合する被検物質が含まれている場合には 、被検物質がプローブを介してマイクロビー ズに固定され、その結果、該被検物質を検出 することが出来る。ここで、試料溶液は生物 の細胞・組織・器官、水若しくは土壌等の自 然界から抽出又は分離されたもの、又は、人 工的に製造された物等に由来し、当業者に公 知の適当な方法・手段によって適宜前処理等 を施して調製されたものである。この場合に 、測定の対象となる被検物質には、当業者に 公知の任意の方法で、蛍光物質、酵素、及び ビオチン等の適当な化合物で標識しておくこ とが好ましい。或るいは、標識抗体のような 二次反応体をマイクロ流路に導入して、結合 した被検物質に更に、このような二次反応体 を結合させた後に測定することも可能である 。尚、既に記載したように、マイクロビーズ 固定用のマイクロ流路の高さ(深さ)に近い直� ��を有するマイクロビーズを使用する場合に� ��、被検物質とプローブとの反応後にマイク� ��ビーズに結合しなかった被検物質をマイク� ��流路から洗浄等によって除去しなくても、� ��反射照明と同様の効果によって、プローブ� ��結合した蛍光物質の蛍光強度を実質的に測� ��することが可能である。

尚、本発明のマイクロビーズアレイを使用 する被検物質の分析・測定は、抗原抗体反応 、核酸分子同士のハイブリダイゼーション、 その他の分子間の特異的な反応等の当業者に 公知の任意の測定原理で実施することが出来 る。尚、本発明の検出方法で測定可能な被検 物質に特に制限はなく、実施例に記載のズギ 花粉特異的IgE等の自然界由来の天然物、生体 由来の各種生理活性物質及び代謝物質等、並 びに、人工合成物質等の任意の物質を挙げる ことが出来る。

 以下、実施例を参照して本発明を説明す� ��。尚、本発明の技術的範囲はこれら実施例� ��記載に限定されるものではなく、これら記� ��に基づき当業者が適宜変更・修正したもの� ��本発明に含まれる。