Chitinosanase

Die vorliegende Erfindung betrifft ein als Chitinosanase bezeichnetes Chitosan- abbauendes Enzym aus dem Pilz Alternaria alternata, das spezifisch die glykosidische Bindung GICNAC-GICN im Chitosan spaltet, DNA Sequenzen die dieses Enzym kodieren, Vektoren und Wirtszellen mit dieser DNA Sequenz, die Herstellung dieses Enzyms, sowie dessen Verwendung zur Spaltung von Chitosan.

Hintergrund der Erfindung Chitosan ist ein lineares Co-Polymer aus Glukosamin (GIcN, D) und N-Acetyl- Glukosamin (GIcNAc, A). Chitosan wird kommerziell aus Chitin, einem vollständig acetylierten GlcNAc-Polymer hergestellt, entweder durch partielle De-N-Acetylierung oder durch vollständige De-N-Acetylierung und anschließende partielle Re-N- Acetylierung. In beiden Fällen erhält man aufgrund der chemischen Verfahrensweise partiell acetylierte Chitosane mit einer zufälligen Verteilung der Acetylreste entlang der linearen Grundkette.

Chitin AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA DA 100 %

PolyGlukosamin DDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD DA 0 % Chitosan (z.B.) DDDAADDDADAADAAADDAADDAAADDADDDADAAA DA 50 % Die Polymere können entweder physikalisch, chemisch oder enzymatisch depolymerisiert werden. Die physikalische Depolymerisation erfolgt durch Ultraschallbehandlung, ihre Spezifität hinsichtlich der Frage, an welcher Stelle das Polymer fragmentiert wird, ist noch unbekannt. Die chemische Depolymerisation erfolgt normalerweise rein zufällig (zufällige saure Hydrolyse) oder, wenn unter genau definierten Bedingungen gearbeitet wird, hinter jedem „A" (partielle saure Hydrolyse) oder hinter jedem „D" (oxidative Deaminierung), wobei die D-Einheit zur Anhydro-Mannose (M) deaminiert wird. Für das obige Chitosan ergäbe sich : zuf. saure Hydr. DDDA ADD DAD AADA AAD DA ADDA AA DDA D DDA DA AA part. saure Hydr. DDDA A DDDA DA A DA A A DDA A DDA A A DDA DDDA DA A A oxid. Deamin. M M M AAM M M AM AAM AAAM M AAM M AAAM M AM M M AM AAA

Die enzymatische Depolymerisation kann entweder mit Chitinasen (nachfolgend "Chitin.") oder mit Chitosanasen (nachfolgend "Chitos.") erfolgen. Alle Chitinasen spalten zwischen „AA", manche zusätzlich auch zwischen „AD" oder „DA". Alle

Chitosanasen spalten zwischen „DD", manche zusätzlich auch zwischen „DA" oder „AD". Für das obige Chitosan ergäbe sich :

Chitin. AA DDDA ADDDADA ADA A ADDA ADDA A ADDADDDADA A A

Chitin. AA/AD DDDA A DDDA DA A DA A A DDA A DDA A A DDA DDDA DA A A Chitin. AA/ DA DDD A ADDD AD A AD A A ADD A ADD A A ADD ADDD AD A A A Chitos. DD D D DAAD D DADAADAAAD DAAD DAAAD DAD D DADAAA

Chitos. DD/DA D D D AAD D D AD AAD AAAD D AAD D AAAD D AD D D AD AAA Chitos. DD/AD D D DAA D D DA DAA DAAA D DAA D DAAA D DA D D DA DAAA Die Bereitstellung einer Chitosanase mit solch einer definierten Substratspezifität wäre höchst wünschenswert.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Es wurde ein Chitosan-abbauendes Enzym aus dem Pilz Alternaria alternata isoliert und charakterisiert und festgestellt, dass dieses Enzym eine bisher nicht beschriebene Substratspezifität aufweist, die es eindeutig von den bisher bekannten Chitinasen und Chitosanasen unterscheidet. Das gefundene Enzym hat eine absolute Spezifität für die Spaltung von „AD". Es handelt sich demnach weder um eine typische Chitinase, die als gemeinsame Eigenschaft die Fähigkeit aufweisen, „AA" zu spalten, noch um eine typische Chitosanase, da diese alle „DD" spalten können. Das Enzym definiert also eine neue Klasse von Chitosan-hydrolysierenden Enzymen, die wir hier als „Chitinosanasen" (Chitinos.) bezeichnen. Als Abbauprodukte des obigen Chitosans ergäben sich :

Chitinos. AD DDDAA DDDA DAA DAAA DDAA DDAAA DDA DDDA DAAA

Bereits dieses sehr begrenzte Beispiel zeigt: die verschiedenen Methoden ergeben recht unterschiedliche Produktmischungen. Tatsächlich ist die Vielfalt noch größer, da die Spezifitäten der Enzyme vereinfacht dargestellt sind. So wurde außer Acht gelassen, dass auch die Zuckereinheit neben der eigentlichen Spaltstelle entscheidend sein kann (so spaltet z.B. menschliches Lysozym „AAA" in „AA A"), das die Spezifitäten oft nicht absolut sondern nur partiell sind, und dass viele Enzyme eine Mindestoligomerlänge benötigen, um dieses als Substrat zu akzeptieren (so spalten die meisten Chitinasen „AAAA" in zwei Moleküle „AA" oder in je ein Molekül „A" und „AAA", die Produkte dieses Abbaus, also das Trimer „AAA" und das Dimer „AA", können aber nicht weiter gespalten werden). Auffallend ist, dass alle Produktmischungen, egal ob sie chemisch oder enzymatisch mit Chitinasen

oder Chitosanasen hergestellt werden, durch eine hohe Komplexität des Produktgemischs gekennzeichnet sind.

Um dies zu veranschaulichen und die Produkte der unterschiedlichen Methoden besser vergleichen zu können, sollen die oligomeren Produkte nach Größe sortiert werden: zuf. saure Hydrol.D DA DA AA AA DAD ADD DDA DDA AAD DDDA ADDA AADA part. saure Hydr. AAAAAAAAA DA DA DA DDA DDA DDA DDDA DDDA DDDA oxid. Deamin. M M M M M M M M M MAMAMAM AAM AAM AAM AAA AAAM AAAM Chitin. AA A A A A ADA DDDA ADDA ADDA ADDDADA ADDADDDADA

Chitin. AA/AD AAAAAAAAA DA DA DA DDA DDA DDA DDDA DDDA DDDA Chitin. AA/DA AAAAAAAAAAADADAD DDD ADD ADD ADD ADDD ADDD Chitos. DD D D D D DAD DAAD DAAD DAAAD DADAAA DADAADAAAD

Chitos. DD/DA D D D D D D D D D DADADAD AAD AAD AAD AAA AAAD AAAD Chitos. DD/AD D D D D D D D D D DA DA DA DAA DAA DAA DAAA DAAA DAAA Chitin os. AD DDA DAA DDDAA DDDA DDDA DDAA DAAA DAAA DDAAA

Es fällt auf, dass bei fast allen Verfahren sehr kleine Produkte auftreten und diese auch oft überwiegen. Eine Ausnahme bildet hier die Chitinosanase. Hinzu kommt, dass nur bei Verwendung der hochspezifischen Enzyme, die nur einen Bindungstyp, sei es „AA", „DD" oder „AD", spalten, auch größere Oligomere entstehen. Es scheint jedoch, dass für spezifische Interaktionen mit Proteinen (z.B. Enzymen, Rezeptoren, etc.) und damit für biologische Aktivitäten, eine Mindestgröße von vier, eher fünf Zuckerresten notwendig ist, so dass gerade größere Oligomere von biotechnologischem und biomedizinischem Interesse sind.

Betrachtet man die entstandenen Oligomere genauer, so fällt auf, dass sich die Produkte der partiellen sauren Hydrolyse ebenso wie die Produkte der Chitinase AA/AD mit der Formel D _n A beschreiben lassen, die der Chitinase AA/DA mit der Formel AD _n , es handelt sich also in diesen drei Fällen um Glukosaminoligomere mit einer einzigen Acetylgruppe, die entweder am reduzierenden oder am nicht- reduzierenden Ende sitzt. Die Produkte der oxidativen Deaminierung entsprechen der Formel A _n M, die der Chitosanasen DD/DA und DD/AD den Formeln A _n D, und DA _n , es handelt sich in diesen drei Fällen also um N-Acetyl-Glukosaminoligomere, denen eine Acetylgruppe entweder am reduzierenden oder am nicht-reduzierenden Ende fehlt. Die Produkte der zufälligen sauren Hydrolyse zeigen keinerlei

Regelmäßigkeit, die der Chitinase AA und der Chitosanase DD lediglich das Vorhandensein von A- bzw. D-Resten an beiden Enden der Kette, auch in diesen beiden Fällen ist aber das Vorhandensein und die Verteilung von A- und D-Resten in der Mitte der Oligomere fast zufällig (außer dass bei den Produkten der Chitinase AA nur einzelne A-Reste und bei denen der Chitosanase DD nur einzelne D-Reste vorkommen).

Im Gegensatz dazu liefert die Chitinosanase partiell acetylierte Oligomere der Formel D _n A ₁₇₁ , bei denen alle D-Reste am nicht-reduzierenden Ende, alle A-Rest am reduzierenden Ende als Block auftreten. Solche Oligomere lassen sich mit keinem bisher bekannten Verfahren möglicherweise mit Ausnahme einer sehr aufwendigen chemischen Synthese herstellen. Die Erfindung betrifft somit

(1) eine Chitinosanase, die aus dem Pilz Alternaria alternata erhältlich ist und die: (a) spezifisch die glykosidische Bindung GICNAC-GICN (A-D) im Chitosan spaltet, (b) ein mittels SDS-PAGE bestimmtes relatives Molekulargewicht von etwa 18 kDa besitzt,

(c) ein pH-Optimum bei etwa pH 4 besitzt und

(d) ein Temperatur-Optimum bei etwa 70 ⁰ C besitzt;

(2) eine Chitinosanase, insbesondere eine bevorzugte Ausführungsform von der Chitinosanase (1), die

(a) mit einer Aminosäuresequenz, die eines oder beide der in SEQ ID NO: 1 und 2 gezeigten Proteinfragmente aufweist,

(b) ein Sequenzhomologes von (a) ist, das eine ähnlichkeit von wenigstens 80% zu der Sequenz (a) aufweist, (c) ein Fragment von (a) oder (b) ist, das wenigstens 10 zusammenhängende Aminosäurereste der Sequenz (a) oder (b) aufweist, oder (d) ein Derivat von (a), (b) oder (c) ist;

(3) eine DNA Sequenz, die eine Chitinosanase nach (1) oder (2) codiert;

(4) ein Vektor, der eine DNA Sequenz nach (3) enthält; (5) eine Wirtszelle, die mit dem Vektor nach (5) transformiert/transfiziert ist und/oder die DNA Sequenz nach (3) aufweist;

(6) ein Verfahren zur Herstellung und einer Chitinosanase nach (1) oder (2), umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle nach (5) und Isolieren der Chitinosanase aus den kultivierten Wirtszellen und/oder aus der Kulturlösung;

(7) eine Enzymzusammensetzung oder pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine Chitinosanase nach (1) oder (2);

(8) ein Verfahren zum Abbau von Chitosan, umfassend die Umsetzung des Chitosans mit einer Chitinosanase nach (1) oder (2), mit einer Wirtszelle nach (5) oder mit einer Enzymzusammensetzung nach (7) und Isolieren der Chitosanabbauprodukte;

(9) Chitosanabbauprodukte erhältlich nach einem Verfahren nach (8);

(10) die Verwendung einer Chitinosanase nach (1) oder (2) oder einer Enzymzusammensetzung nach (7) zur Herstellung eines Wundverbands; und (11) ein Verfahren zur Wundbehandlung umfassend Aufbringen eines Wundverbandes, die eine Chitinosanase nach (1) oder (2) und ein (partiell acetyliertes) Chitosan enthält, auf die Wunde eines Patienten.

Kurzbeschreibung der Figuren Fig. 1 : Aufreinigung der Chitinosanase. Fig. Ia : FPLC-Chromatogramm (Säule: Mono S; Probe: konzentriertes Medium von A. alternata (0,1% w/v); Puffer: 50 mM Na-Acetat pH 4; Flussrate 0,25 ml/min; Elution : 0-1 M NaCI; Fraktionen : 1 ml); Fig. Ib: Dot-assay der FPLC-Fraktionen (Substrat: Chitosan DA 64 %); Fig. Ic: SDS- PAGE (12%) der Fraktion 10 mit (A) Coomassie-Färbung und (B) Zymogramm (Substrat: Chitosan DA 64 %).

Fig. 2: pH-Optimum (A), Temperatur-Optimum (B) und Temperatur-Stabilität (C) der Chitinosanase. A: verwendete Puffer (jeweils 50 mM) : pH 1,5-2,5: Glycin/Cl, pH 3,0-7,0: Citrat/Phosphat, pH 8,0-9,0. Tris/Cl, pH 9,0-11,0: Carbonat; Inkubation : 2 h bei 60 ⁰ C; B: Inkubation : 2 h in 50 mM Na-Acetat pH 4,3; C: Lagerung bei 4°C (Quadrate), 37°C (Kreise), 60 ⁰ C (Dreiecke) oder 80 ⁰ C (Trapeze); Inkubation : 2 h bei 60 ⁰ C in 50 mM Na-Acetat pH 4,3. In allen Experimenten wurde Chitosan DA 66 % als Substrat verwendet.

Fig. 3: Substratspezifität der Chitinosanase. Enzym : 4,5 pkat gereinigte Chitinosanase; Substrat: 20 μg Chitosan des jeweiligen DA bzw. Glykol-Chitin (für DA 100 %); Inkubation : 15 h bei 37°C in 50 mM Na-Acetat pH 4,3.

Fig. 4: Massenspektren der Produkte des Chitinosanase-Abbaus von Chitosanen mit unterschiedlichem DA (%). Inkubation : 4.5 pkat gereinigte Chitinosanase; 15 h bei 37°C in 20 mM Na-Acetat pH 4.3; Analyse: MALDI-TOF-MS; Produkte sind mit DxAy bezeichnet; x = Anzahl GIcN, y: Anzahl GIcNAc.

Fig. 5: NMR Analyse der Chitinosanase-Produkte. Inkubation : 50 pkat gereinigte Chitinosanase, 24 h bei 37°C in 50 mM Citrat pH 4,3; Analyse: 400 MHz ¹ H-NMR. Zum Vergleich wurde ein partiell Säure-hydrolysiertes Chitosan analysiert (oben). Fig. 6: TLC Analyse der Chitinosanase-Produkte. Substrat: vollständig deacetyliertes Tetramer, GIcN ₄ = D ₄ (oben), vollständig acetyliertes Hexamer, GIcNAc ₆ = A ₆ (unten); Inkubation : 50 pkat gereinigte Chitinosanase, 0-240 min bzw. über Nacht (ü.N.) bei 37°C in 50 mM Citrat pH 4.5; Analyse: Laufmittel 28% Ammoniak/Pro- pan-l-ol (1 : 2, v/v); Färbung : Ninhydrin (GIcN) bzw. Anilin-Diphenylamin (GIcNAc); als Kontrolle wurde das Substrat ohne Enzym über Nacht inkubiert (c), als Standards dienten die jeweiligen Oligomere und Monomere (s).

Fig. 7: Tatsächliche (experiment) und erwartete relative Häufigkeit des vollständig acetylierten Dimers (A ₂ ) als Produkt des Chitinosanaseabbaus eines Chito- sanpolymers mit DA 66% unter der Annahme unterschiedlich starker Nebenaktivitäten für die Spaltung der Bindung GIcNAc→GIcNAc.

Sequenzprotokoll (freier Text)

SEQ ID NOs: 1 und 2 Chitinosanasefragmente

Detaillierte Beschreibung der Erfindung Die Chitinosanase gemäß Aspekt (1) der Erfindung besitzt die folgenden Eigenschaften :

Sie spaltet spezifisch die glykosidische Bindung GICNAC-GICN (A-D) im Chitosan. „Spezifisch" im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass keine Nebenaktivität bezüglich der Spaltung DD bzw. nur eine geringfügige Nebenaktivität (d.h.< 4% ) bezüglich der Spaltung AA vorliegt (siehe Fig. 3 und 7). Die Spezifität der erfindungsgemäßen Citosanase für die Spaltung von A-D ist daher größer als 95%, vorzugsweise größer als 98%.

Sie besitzt ein mittels SDS-PAGE bestimmtes relatives Molekulargewicht von etwa 18 kDa (vorzugsweise 18kDa) sowie für die spezifische Spaltung von A-D ein pH- Optimum bei etwa pH 4 (vorzugsweise bei pH 4) und ein Temperatur-Optimum bei etwa 70 ⁰ C (vorzugsweise bei 70 ⁰ C).

Die Chitinosanase gemäß Aspekt (1) der Erfindung ist vorzugsweise ein Enzym, das aus dem Alternaria alternata Stamm CCT 2816 der Coleςäo de Culturas Tropical, Brazil (hinterlegt gemäß dem Budapester Vertrag als DSM 22279) erhältlich ist.

Die bevorzugte Chitinosanase nach Aspekt (2) der Erfindung besetzt eine Aminosäuresequenz, die eines oder beide der Proteinfragmente von SEQ ID NO: 1 und 2 umfasst.

Die Sequenzhomologen der Chitinosanase nach Aspekt (2) weisen gemäß der Erfindung eine ähnlichkeit von wenigstens 80%, vorzugsweise von wenigstens 90%, noch bevorzugter von wenigstens 95% und am bevorzugsten von wenigstens 98% auf. Hierbei sind konservative Austausche von einzelnen oder mehreren zusammenhängenden Aminosäureresten, die Deletion von einzelnen oder mehreren zusammenhängenden Aminosäureresten und die Addition/Einfügung von einzelnen Aminosäureresten oder mehreren zusammenhängenden Aminosäureresten umfasst. Fragmente von der Chitinosanase von Aspekt (2) oder von den Sequenzhomologen weisen gemäß der Erfindung wenigstens 10 zusammenhängende Aminosäurereste der Ausgangssequenz auf. Derivate von der Chitinosanase Aspekt (2) bzw. von den Sequenzhomologen oder von den Fragmente derselben umfassen gemäß der Erfindung sowohl Kondensationsprodukte mit anderen funktionellen Protein- oder Peptidstrukturen (z. B. anderen Enzymen, Antikörpern, Sekretionsproteinen, Sequenzen zur Reinigung des Enzyms usw., die direkt oder über einen Linker mit der Chitinosanase verknüpft sein können), als auch mit niedermolekularen organischen Resten (z. B. C- und N- terminalen Resten, Schutzgruppen, Markern usw.) mit Festphasen (z. B. Mikrotiterplatten, Beads usw.).

Die DNA Sequenz gemäß Ausführungsform (3) umfasst sowohl DNA als auch RNA Sequenzen. Ebenfalls umfasst sind Variationen der Sequenzen, die eine Homologie von wenigstens 80%, vorzugsweise wenigstens 90%, besonders bevorzugt wenigstens 98% zu der Ausgangssequenz aufweisen.

Der Vektor gemäß Ausführungsform (4) der Erfindung ist unter anderem ein Transfektionsvektor, der neben der Sequenz noch weiter funktionelle Sequenzen wie Promotoren, Selektionsmarkersequenzen usw. enthalten kann. Bei der Wirtszelle nach Aspekt (5) der Erfindung, die mit dem Vektor nach Aspekt (4) transformiert/transfiziert ist und/oder die DNA Sequenz nach Aspekt (3) aufweist, handelt es sich um eine Eukaryontenzelle (Pilz, Hefe, Säugerzelle usw.) oder Prokaryontenzelle (E. coli usw.).

Das Verfahren zur Herstellung einer Chitinosanase nach Aspekt (6) umfasst das Kultivieren einer wie vorstehend definierten Wirtszelle und Isolieren der Chitinosanase aus den kultivierten Wirtszellen und/oder aus der Kulturlösung. Das

Verfahren kann weiterhin geeignete Aufreinigungsschritte und/oder Umsetzungen der zunächst erhaltenen Chitinosanase umfassen.

Die Enzymzusammensetzung nach Aspekt (7) der Erfindung kann - in Abhängigkeit mit dem Anwendungsgebiet der Zusammensetzung - nicht nur weitere Enzyme (wie Glukosaminidase) sondern auch Hilfsstoffe wie Stabilisatoren, Puffer usw. enthalten. Das Verfahren zum Abbau von Chitosan nach Aspekt (8) umfasst die direkte Umsetzung des Chitosans mit einer Chitinosanase nach Aspekt (1) oder (2) der Erfindung oder mit einer Enzymzusammensetzung nach Aspekt (7) der Erfindung. Alternativ kann auch eine Wirtszelle nach Aspekt (5) der Erfindung eingesetzt werden, die die Chitinosanase in situ erzeugt. Neben der Chitinosanase der vorliegenden Erfindung können weitere Enzyme eingesetzt werden. Das Verfahren umfasst weiterhin die Aufreinigung der erzeugten Abbauprodukte und den Modifikationen wie nachfolgend beschrieben. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Aspekt (7) der Erfindung kann ein Bestandteil eines Wundverbandes sein. In solch einem Wundverband ist vorzugsweise neben der efindungsgemäßen Chitosanase noch ein (partiell acetyliertes) Chitosan enthalten.

Chitosanabbauprodukte gemäß Aspekt (9) der Erfindung die mittels der erfindungsgemäßen Chitinosanase erzeugt werden, unterscheiden sich von allen oben dargestellten Oligomeren erheblich. Sie sind dadurch charakterisiert, dass sie beliebig viele A- und D-Reste enthalten können, jedoch sind alle D-Reste stets auf der Seite des nicht-reduzierenden Endes, alle A-Reste auf der des reduzierenden Endes konzentriert. Die Formel der Produkte lautet demnach D _n A ₁₇₁ . Es handelt sich also um partiell acetylierte Chitosanoligomere mit einer blockweisen Verteilung der Acetylreste, mit einem Glukosaminoligomer-Block am nicht-reduzierenden Ende und einem N-Acetyl-Glukosaminoligomer-Block am reduzierenden Ende. Im Gegensatz zu allen anderen größeren Oligomeren ist daher die Architektur jedes Oligomers mit der Bestimmung von n und m eindeutig beschrieben. Diese beiden Werte lassen sich mittels Massenspektroskopie einfach bestimmen. Daraus folgt auch, dass sich die Produkte des Chitinosanase-Abbaus, im Gegensatz zu denen aller anderen Verfahren, relativ einfach aufreinigen lassen. In einem ersten Schritt können die Oligomere über eine Größenausschluss-Chromatographie nach ihrem Polymerisationsgrad getrennt werden. Wir konnten bereits in der Vergangenheit zeigen, dass sich bei diesem Verfahren selbst vollständig deacetylierte Glukosaminoligomere D _n von den um einen Rest kleineren vollständig

acetylierten N-Acetyl-Glukosaminoligomeren A _{n- 1} sauber trennen lassen. Die einzelnen Oligomergemische lassen sich dann in einem zweiten Schritt über eine Kationenaustausch-Chromatographie nach ihrer Ladungsdichte, und demnach nach der Anzahl der vorhandenen Acetylreste trennen. Im ersten Schritt werden also z.B. die Tetramere DDDA, DDAA und DAAA von den Pentameren DDDDA, DDDAA, DDAAA und DAAAA getrennt, im zweiten Schritt die drei Tetramere bzw. die vier Pentamere jeweils voneinander. Dies ist das erste Verfahren, dass die Produktion solcher partiell acetylierter Chitosanoligomere mit genau bekannter Architektur ermöglicht. Solche Oligomere könnten einerseits interessante und neue Bioaktivitäten aufweisen, da davon ausgegangen wird, dass die biologische Aktivität nicht nur vom Polymerisationsgrad (degree of polymersation, DP) und dem Acetylierungsgrad (degree of acetylation, DA), sondern auch von dem Verteilungsmuster der Acetylreste (pattern of acetylation, PA) abhängt. Zum anderen könnten sie aber auch benutzt werden, um durch Polymerisation partiell acetylierte Chi- tosanpolymere mit bekanntem Acetylierungsmuster zu erhalten. Diese könnten z.B. so aufgebaut sein, dass sie durch bestimmte körpereigene Enzyme in definierte Produkte abgebaut werden, oder auch durch solche Enzyme nicht abbaubar sind. Es ließe sich also so zum einen die Abbaurate kontrollieren und damit die Verbleibzeit im Körper oder Gewebe, zum anderen könnten biologisch aktive Oligomerprodukte gezielt freigesetzt werden.

In diesem Zusammenhang ist anzumerken, dass kürzlich das erste menschliche Enzym mit chitosanolytischer Aktivität beschrieben wurde (s. Doktorarbeit von Christian Gorzelanny; Westfälische-Wilhelms Universität Münster, Deutschland), die humane Chitotriosidase spaltet Chitin und partiell acetylierte Chitosane sequenzspezifisch zwischen zwei acetylierten Resten (sie ist also eine Chitinase des AA-Typs). Daraus folgt zwingend, dass sowohl die Abbaurate als auch die Quantität und Qualität der erzeugten Abbauprodukte eines partiell acetylierten Chitosans, das z.B. als Bestandteil eines Wundverbandes verwendet wird, vom PA des Chitosans abhängig sind. Gleichzeitig haben wir gezeigt, dass die entstehenden Abbauprodukte pro-inflammatorische Aktivität besitzen und somit die Wundheilung positiv unterstützen können.

Das Wissen um die Substratspezifität der humanen Chitotriosidase eröffnet Aussichten auf ein gezieltes Engineering partiell acetylierter Chitosane mit bekannten DP, DA und PA. Ein solches Chitosan könnte so designed werden, dass

es im Körper eines Patienten eine vorhersagbare Abbaurate aufweist und dabei mit bekannter Kinetik bestimmte bioaktive Chitosanoligomere freisetzt. Verfahren zu Produktion von Chitosanen mit definiertem, nicht- zufallsgemäßem PA sind aber bisher nicht bekannt (bei den gängigen chemischen Verfahren zur Herstellung partiell acetylierter Chitosane erhält man zufallsgemäße PA). Mit Hilfe der hier beschriebenen Chitinosanase lassen sich Chitosan-Oligomere mit nicht- zufallsgemäßem (sondern blockweisem) PA herstellen. Diese könnten in einem zweiten Schritt gezielt polymerisiert werden, um so Chitosan-Polymere mit regelmäßigem PA und damit genau definierten Abbauprodukten im Zielgewebe herzustellen.

Für diese Polymerisation bieten sich prinzipiell zwei mögliche Verfahren an, entweder auf chemischem oder auf enzymatischem Weg. Die chemische Synthese von partiell acetylierten Chitosanoligomeren steckt zwar noch in den Kinderschuhen, ist aber prinzipiell möglich. Der Aufwand ist jedoch schon für die Synthese von Dimeren gewaltig, und er steigt mit der Kettenlänge wahrscheinlich überproportional. Gleichzeitig gehen durch die Vielzahl der benötigten Verfahrensschritte die Ausbeuten stark zurück. Eine Alternative könnte die enzymatische Polymerisation liefern. Allerdings ist kein Enzym bekannt, dass solche Oligomere in der Natur produzieren würde. Die Synthese scheint hier immer über die Polymerisation von N-Acetyl-Glukosamin zu Chitinoligomeren oder Polymeren zu gehen, die dann partiell de-N-acetyliert und gegebenenfalls depolymerisiert werden. Es ist aber bekannt, dass viele chitinolytischen Enzyme eine Glykosyltransferase- Nebenaktivität besitzen. Sie können also nicht nur glykosidische Bindungen spalten, sondern auch Zuckerreste auf andere übertragen. Es bietet sich an, zu versuchen, die hier beschriebene Chitinosanase zu nutzen, um in der Rückreaktion eine Polymerisation zu erreichen. Gegebenenfalls könnte die Rate dieser Rückreaktion durch gezieltes Protein-Engineering verbessert werden.

Für die Chitosanabbauprodukte gemäß Aspekt (9) der Erfindung, d.h. für die Chito- san-Oligomeren mit definiertem PA, z.B. blockweisem PA bei den Produkten der Chitinosanase, ergeben sich folgende Anwendungsbereiche:

- Wundheilung ohne Narben (wichtig v.a. bei Patienten mit Neigung zu Keloid- bildung, Verbrennungen);

- pro- oder anti-Wachstumsfaktor-Aktivität (z.B. bezüglich Angiogenese: pro-angio- genetisch wichtig bei Wundheilung, anti-angiogenetisch wichtig bei Bekämpfung von Tumoren oder der feuchten Makuladegeneration);

- pro/anti-inflammatorisch (beides z.B. wichtig bei Wundheilung, insbesondere bei chronischen Wunden wie bei bettlägerigen oder Diabetes-Patienten); und

- antitumor-Wirkung.

Diese Anwendungen sind analog für die Chitinosanasen nach Aspekt (1) und (2) bzw. die pharmazeutische Zusammensetzung nach Aspekt (7) der Erfindung möglich, nämlich dann wenn die Abbauprodukte in-situ aus Enzym und Chitosan diirekt erzeugt werden, d.h. die pharmazeutische Zusammensetzung beide genannten Komponenten enthält. Dies trifft insbesondere für die Wundbehandlung zu (s. Aspekte (10) und (11) der Erfindung). Für die oben skizzierten Designer-Chitosane sind folgende Anwendungsbereiche zu erwägen : Designer-Chitosane werden immer dann sinnvoll sein, wenn man die Spezifität der chitosanolytischen Enzyme in einem Zielgewebe kennt (z.B. Chitotriosidase, Acidic Mammalian Chitinase AMCase oder Lysozym beim Menschen, aber auch entsprechende Enzyme bei z.B. Nutztieren oder in Nutzpflanzen). In dem Fall kann man ein maßgeschneidertes Chitosan produzieren, mit bekannter Verweildauer bzw. Umsatzrate, mit bekannter Kinetik, Quantität und Qualität bekannter bioaktiver oder inaktiver Abbauprodukte etc. Designer-Chitosane könnten auch spezifische physiko-chemische Eigenschaften haben, die z.B. für die Bildung oder Stabilität von Nanopartikeln, Hydrogelen, Filmen, Lösungen oder für die Beschichtung von Oberflächen, z.B. Elektroden, Implantaten, entscheidend sein können.

Die Herstellung eines „engineered designer chitosan with inbuilt digestibility in human tissues" kann wie folgt erfolgen :

- Chitosan-Polymer mit mittlerem DA mit Chitinosanase hydrolysieren; - Produkte über GPC autrennen;

- Dimer- (DA) und Tetramer- (DAAA DDAA DDDA)-Fraktion selektionieren;

- Tetramer-Fraktion über CEC weiter aufreinigen, DAAA selektionieren;

- Dimere und Tetramere über reverse Chitinosanase-Reaktion polymerisieren : DADADADADADADADADADADAAADADADADADADADADAAADADADADADADADADA DADADAAADADADADADADADADAAADADADADADADADADADADADADADADA Produkt nach Lysozym-Abbau (in vitro oder in vivo) :

DADADADADADADADADADADAA DP 23

ADADADADADADADADAA DP 18

ADADADADADADADADADADADAA DP 24

ADADADADADADADADAA DP 18

ADADADADADADADADADADADADADADA DP 29

über das Mischungsverhältnis der beiden Oligomere während der Polymerisation kann der mittlere DP der Lysozym-Produkte eingestellt werden, da jedes Tetramer eine Schnittstelle einbaut. Der mittlere DA aller Produkte ist 50%, mit regelmäßigem PA.

Soll der DP auch genau eingestellt werden, so muss die Polymerisation in mehreren Schritten ausgeführt werden :

- Dimer polymerisieren, über GPC z.B. DP 6 (Hexamer) selektionieren : DADADA - Hexamer und obiges Tetramer im Verhältnis 1/1 polymerisieren, über GPC DP 10

(Dekamer) selektionieren : DADADADAAA und DAAADADADA;

- Dekamer mit Chitinase B von Serratia marcescens inkubieren (exo-Chitinase, die vom reduzierenden Ende her AA-Dimere abspaltet) : DADADADA, AA und DAAADADADA - über GPC Dekamer selektionieren : DAAADADADA

Dekamer polymerisieren : ...DAAADADADADAAADADADADAAADADADA...

Dieses Polymer wird durch Lysozym in Dekamere gespalten:

...DAA ADADADADAA ADADADADAA ADADADA...

Die besondere Substratspezifität führt auch zur Produktion besonderer Produkte, nämlich partiell acetylierter Chitosanoligomere mit einer genau definierten, blockweisen Verteilung der Acetylreste. Bisher gab es kein Verfahren, mit dem solche Oligomere, die potentiell hochinteressante biologische Aktivitäten aufweisen oder auch als Ausgangssubstanzen für die Synthese neuartiger Polymere mit definierbaren Eigenschaften einsetzbar sind, hergestellt werden könnten. Der Alternaria alternata Stamm CCT 2816 der Coleςäo de Culturas Tropical wurde am 11.02.2009 bei der DSMZ, Deutsche Gesellschaft für Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, unter der Bezeichnung DSM 22279 gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt. Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert. Diese schränken die Erfindung jedoch in keiner Weise ein.

Beispiele

Beispiel 1 : Reinigung und Charakterisierung der Chitinosanase

Anzucht des Pilzes: Die Anzucht von Alternaria alternata (Stamm CCT 2816, Coleςäo de Culturas Tropical, Brazil) als Dauerkultur erfolgte auf mit Agar

verfestigtem sterilem MA Medium (Malt Extrakt 2%, Agar 2 %). Die Kultivierung erfolgte zunächst für eine Woche bei 28°C und wechselnden Lichtverhältnissen (12 h hell, 12 h dunkel), die zu einer Sporulation des Pilzes führte. Danach wurden die Platten im Kühlschrank gelagert. Eine Auffrischung erfolgte alle 3 bis 4 Monate. Langfristige Aufbewahrung wurde mit MA-Agar gefülltem Schrägröhrchen, die mit Myzel angeimpft und nach einer kurzen Wachstumsperiode mit sterilem Paraffinöl überschichtet wurden, gewährleistet.

Um eine Vorkultur in Flüssigmedium zu erhalten, wurde MA-Medium ohne Agar mit 2 % Pepton und 2 % Glucose versetzt. Dann wurden zwei bis drei 0,5 cm ² große Stücke der Alternaria- Dauerkultur in 50 ml des Flüssig-MA-Mediums gegeben und für fünf Tage bei 28 ⁰ C in Dunkelheit inkubiert. Mit dieser Vorkultur wurden acht Kolben (je 500 ml) angeimpft und wiederum für 5 bis 7 d bei 28 ⁰ C in Dunkelheit inkubiert. Anreicherung : Die Ernte des Kulturmediums erfolgte durch Zentrifugation bei 13.000 rpm. Der überstand wurde vorsichtig abgenommen und mittels Vakuumfiltration über einen Membranfilter (Porengröße 0,45 μm) vom restlichen Myzel befreit. Das Volumen des Mediums wurde bestimmt und für die Ultrafiltration eingesetzt. Die Ultrafiltration wurde in einer Ultrafiltrationszelle (Fassungsvolumen 500 ml) mit einem Druck von 3 bar durchgeführt. Die dabei verwendete Membran besaß ein Ausschlussmolekulargewicht von 10 kDa. Das Kulturmedium von Alternaria alternata wurde so von ca. 4 I auf 100 ml ankonzentriert. Anschließend wurden die 100 ml in einem Spitzkolben gefriergetrocknet und der trockne Rückstand wurde in 10 ml destilliertem Wasser aufgenommen und für die Gelfiltration eingesetzt. Diese erfolgte mittels PD 10 Säulen. Die PD-10 Säulchen wurden zuerst mit 4x4 ml Na-Acetat- Puffer (50 mM, pH 4,0) äquilibriert und je 2,5 ml des Kulturmediumkonzentrats wurden auf die Säule aufgetragen und nach dem Einsickern mit 3,5 ml Na-Acetat- Puffer eluiert. Mit diesem Eluat wurden anschließend die enzymatischen Messungen und die Proteinbestimmung durchgeführt. Aufreiniqunq : Die Aufreinigung der Chitinosanase erfolgte mit Hilfe der FPLC nach dem Prinzip der Kationenaustauschchromatographie. Die Fraktionen wurden mittels eines dot-assays auf chitosanolytische Aktivität getestet, aktive Fraktionen wurden gepoolt und elektrophoretisch auf ihre Reinheit getestet (Fig. 1). Eigenschaften der Chitinosanase: Das gereinigte Enzym wurde durch die Bestimmung des relativen Molekulargewichts mittels SDS-PAGE (Fig. IC), des pH- Optimums, des Temperatur-Optimums, der Temperatur-Stabilität (Fig. 2) sowie der

Substratspezifität für Chitosane mit unterschiedlichem Acetylierungsgrad (Fig. 3) charakterisiert. Das relative Molekulargewicht betrug 18 kDa. Das pH-Optimum lag bei pH 4 und das Temperatur-Optimum bei 70 ⁰ C. Nach einer Woche bei 37°C war noch 90 % der Enzymaktivität vorhanden, selbst nach vierwöchiger Lagerung bei dieser Temperatur ließ sich noch die Hälfte der Aktivität nachweisen. Chitosane mit mittlerem Acetylierungsgrad (DA) erwiesen sich als die geeignetsten Substrate. Die Produkte des Chitinosanase-Abbaus verschiedener Substrate wurden mittels Massenspektrometrie (Fig. 4) und NMR (Fig. 5) analysiert. Chitosan mit niedrigem DA lieferten Chitosanoligomere mit nur einem einzigen Acetylrest. Mit zu- nehmendem DA des Substrats traten vermehrt auch Produkte mit mehreren Acetylresten auf. Alle Produkte trugen eine acetylierte Einheit am reduzierenden Ende.

Vollständig acetylierte Chitin-Oligomere ebenso wie vollständig de- acetylierte Glukosamin-Oligomere wurden auch bei ausgiebiger Inkubation durch die Chitinosanase nicht abgebaut (Fig. 6). Das Enzym kann demnach glykosidische Bindungen zwischen zwei acetylierten oder zwischen zwei de-acetylierten Resten nicht hydrolysieren. Da alle Produkte einen acetylierten Rest am reduzierenden Ende tragen, kann man schließen, dass die Chitinosanase die glykosidische Bindung GICNAC-GICN, nicht aber die Bindung GICN-GICNAC spalten kann. Die massenspektrometrische Analyse der Produkte bestätigt diese Schlussfolgerung. So treten niemals vollständig acetylierte oder vollständig deacetylierte Produkte auf. Beim Abbau eines Chitosans mit niedrigem DA treten ausschließlich Produkte mit einem einzigen Acetylrest auf. Mit zunehmendem DA des Substrats entstehen auch höher acetylierte Oligomere mit nur einem einzigen deacetylierten Rest. Die vollständig deacetylierten bzw. vollständig acetylierten Bereiche der jeweiligen Produkte werden offenbar nicht weiter abgebaut.

Die Spezifität der Spaltung belegt auch ein Vergleich der experimentellen MS- Spektren (Fig. 4) mit den virtuellen MS-Spektren eines Computerprogramms („Chitosan-Hydrolysator"), das eine sequenzspezifische Hydrolyse eines virtuellen Chitosans mit beliebigem DP und DA (und zufallsmäßiger Verteilung PA der Acetylreste) durchführen und ein theoretisches MS-Spektrum der Produkte erstellen kann. Nimmt man eine 100%ige Spezifität für die Spaltung der Bindung GIcNAc→GIcN an, so sind die erhaltenen virtuellen Spektren nahezu identisch mit den experimentell erhaltenen (dabei ist zu berücksichtigen, dass die MS-Analyse nur bedingt quantitativ belastbare Daten liefert, da unterschiedliche Oligomere

unterschiedliche „response factors" aufweisen). Die geringste Nebenaktivität für eine Spaltung der Bindung GIcN→GIcN würde zu einem Abbau der höhermolekularen D _n Ai-Produkte des Abbaus eines Chitosans mit DA 10% führen; eine solche Nebenaktivität kann also sicher auch für polymere Substrate ausgeschlossen werden. Eine Nebenaktivität für die Bindung GIcNAc→GIcNAc würde sich am ehesten beim Abbau eines hochacetylierten Chitosans bemerkbar machen, sie würde zur Produktion des vollständig acetylierten Dimers (A ₂ ) führen, das bei einer absoluten Spezifität für die Bindung GIcNAc→GIcN nicht in messbarer Menge zu erwarten ist. Bereits bei einer Nebenaktivität von 4 % sollte der A ₂ -Peak deutlich auftauchen, während er bei einer Nebenaktivität von 2 % noch nicht sichtbar würde (Fig. 7). Tatsächlich findet sich im experimentell ermittelten Massenspektrogramm ein sehr kleiner Peak bei der relativen Masse m/z von 447 (= A ₂ ). Dies ist das einzige Indiz für das Vorhandensein einer solchen Nebenaktivität; dabei ist allerdings zu bedenken, dass die Quantifizierung der Dimere aufgrund der ver- wendeten Matrix im MALDI-MS-Verfahren unsicher ist, es kann sich hier genauso gut auch um ein Artefakt der Matrix handeln. Es kann aber festgehalten werden, dass A ₂ als Produkt, wenn überhaupt, dann mit deutlich niedrigerer Häufigkeit auftritt als bei einer Nebenaktivität von 4 % zu erwarten wäre. Mit Sicherheit ist also die Chitinosanase auch bei der Spaltung von partiell acetylierten Chitosanpolymeren hochgradig spezifisch für die Spaltung der Bindung GIcNAc→GIcN, möglicherweise ist diese Spezifität auch wirklich absolut.

Beispiel 2 : Sequenzierung :

Um die Chitinosanase aus Alternaria alternata mit Trypsin zu verdauen, wurde diese wie oben beschrieben bis zu den MonoS-Fraktionen aufgereinigt, anschliessend ankonzentriert und mittels SDS-PAGE aufgetrennt. Um sicher zu gehen, dass es sich bei dem Protein um die Chitinosanase handelte, wurde einem Teil des Geles eine Chitinosanase Aktivitätsfärbung unterzogen. Daraufhin wurde die Chitinosanase-Bande direkt aus dem Gel ausgeschnitten und tryptisch verdaut. Die Peptide wurden mit Acetonitril aus dem Gel extrahiert und mittels LC-MS aufgetrennt bzw. sequenziert. Es wurden folgende Peptidsequenzen identifiziert: NLKVLLSIGGWSFSANFAGPASSDQK (SEQ ID NO: 1) DLNEDLLATPEK (SEQ ID NO: 2)

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1 Die nachstehenden Angaben betreffen den Mikroorganismus und/ oder anderes biologisches Material, der/das in der Beschreibung genannt ist

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1 -3-1 Name der Hinterlegungsstelle DSMZ DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH

1 -3-2 Anschrift der Hinterlegungsstelle Inhoffenstr . 7B, D-38124 Braunschweig, Germany

1 -3-3 Datum der Hinterlegung 11 . Februar 2009 ( 11 . 02 . 2009) 1 -3-4 Eingangsnummer DSMZ 22279

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