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Patent Searching and Data


Title:
CHITOSAN NANOFIBRES CONTAINING BIOACTIVE COMPOUNDS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2016/191895
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to self-assembled nanofibres of chitosan and bioactive compounds, which can be used as nutraceuticals or drugs. The bioactive compounds suitable for the nanofibres of the invention are molecules of a low molecular size with acid or lactone groups, aromatic rings and hydroxyls, such as small polyphenols and mixtures thereof. The nanofibres of the invention are absorbed, without degradation, at the level of the small intestine, containing and protecting the bioactive compounds until they reach the various target organs. The nanofibres also cross the blood-brain barrier, allowing the compounds to reach the brain where they act as a controlled release system. If the bioactive compounds are neuroprotectors, such as antioxidants, the nanofibres of the invention can be used to treat or prevent neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease and amyotrophic lateral sclerosis (ALS), as well as she strokes and other diseases related to aging or associated with oxidative stress. The invention also relates to the method for obtaining the nanofibres, which comprises mixing chitosan with the bioactive compounds and allowing self-assembly. The invention further relates to the dosage form containing the nanofibres of the invention, particularly for oral administration, such as tablets, coated tablets, powders, capsules, syrups, or others.

Inventors:
ZUÑIGA ELISA (CL)
MUÑOZ PABLO (CL)
RUBILAR OSVALDO (CL)
Application Number:
PCT/CL2016/050030
Publication Date:
December 08, 2016
Filing Date:
June 04, 2016
Export Citation:
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Assignee:
FUND COPEC UNIV CATÓLICA (CL)
UNIV DE VALPARAISO (CL)
International Classes:
A61K31/722; A61P9/10; A61P25/14; A61P25/16; A61P25/28
Foreign References:
US20060051423A12006-03-09
Other References:
KIM, S. ET AL.: "The inhibition of glioma growth in vitro and in vivo by a chitosan/ellagic acid composite biomaterial", BIOMATERIALS, vol. 30, 5 June 2009 (2009-06-05), pages 4743 - 4751, XP026501314
KIM, S.: "Chitosan/Ellagic acid composite materials for local cáncer therapy.", A DISSERTATION PRESENTED FOR THE GRADÚATE STUDIES COUNCIL, December 2009 (2009-12-01), XP055502559, Retrieved from the Internet
LA PRENSA AUSTRAL: "Biotex ganó proyecto para extender sus productos químicos al ámbito medicinal", PULSO ECONÓMICO, pages 10 - 16, XP055502560, Retrieved from the Internet
See also references of EP 3305303A4
Attorney, Agent or Firm:
ALBA PROFESIONALES et al. (CL)
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Claims:
REIVINDICACIONES

1. Nanofibra de quitosano autoensamblada CARACTERIZADA porque comprende:

a. quitosano de un tamaño molecular entre 70 y 500 KDa y grado de desacetilación entre 65 y 90%,

b. compuestos bioactivos de tamaño molecular menor a 0,5 KDa, que presenten grupos ácidos o lactonas, anillos aromáticos e hidroxilos;

sin uniones covalentes entre ambos.

2. Nanofibra de quitosano de la reivindicación 1 CARACTERIZADA porque los compuestos bioactivos se escogen entre ácido gálico, quercetina, ácido elágico, ácido ascórbico (Vitamina C), otros ácidos hidroxicinámicos, tales como cafeico, clorogénico, cumárico, ferúlico, sinápico; otros ácidos hidroxibenzoicos, tales como protocatéquico, vainíllico, siríngico, rosmarínico; los flavonoles, kaempferol, miricetina, isoramnetina, entre otros y sus mezclas.

3. Nanofibra de quitosano de la reivindicación 1 CARACTERIZADA porque los compuestos bioactivos tienen capacidad antioxidante.

4. Nanofibra de quitosano de la reivindicación 3 CARACTERIZADA porque los antioxidantes son una mezcla de ácido gálico, querceitina y/o ácido elágico.

5. Nanofibra de quitosano de la reivindicación 1 CARACTERIZADA porque el quitosano tiene un tamaño molecular de polidispersión baja.

6. Nanofibra de quitosano de la reivindicación 1 CARACTERIZADA porque el quitosano tiene un tamaño molecular entre 80 y 300 KDa.

7. Nanofibra de quitosano de la reivindicación 1 CARACTERIZADA porque el quitosano tiene quitosano tiene un grado de desacetilación entre un 75 y un 85%.

8. Método para formar las nanofibras de la reivindicación 1 CARACTERIZADO porque comprende mezclar una solución de quitosano con una solución de compuestos bioactivos de bajo tamaño molecular, que presenten grupos ácidos o lactonas, anillos aromáticos e hidroxilos en una proporción de entre 3:1 hasta 4:1, agitar vigorosamente y permitir la formación espontánea de las nanofibras de la invención.

9. Método de acuerdo con la reivindicación 8 CARACTERIZADO porque la solución de quitosano tiene una concentración de entre 0,5 a 1,5% m/v y la solución de compuestos bioactivos tiene una concentración de entre 0,1 a 1,5% m/v.

10. Composición farmacéutica o nutracéutica CARACTERIZADA porque comprende las nanofibras de quitosano descrita en la reivindicación 1.

11. Composición farmacéutica o nutracéutica de la reivindicación 10 CARACTERIZADA porque las nanofibras de la invención actúa como un sistema de liberación controlada de los compuestos bioactivos.

12. Composición farmacéutica o nutracéutica de la reivindicación 10 CARACTERIZADA porque está en una forma farmacéutica para la administración oral, tales como comprimido, comprimido recubierto, polvo, cápsula, jarabe u otro.

13. Uso de la composición farmacéutica o nutracéutica de la reivindicación 10 CARACTERIZADO porque sirve para administrar los compuestos bioactivos en distintos órganos.

14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13 CARACTERIZADO porque sirve para administrar los compuestos bioactivos al cerebro.

15. Uso de acuerdo con la reivindicación 14 CARACTERIZADO porque sirve para administrar compuestos antioxidantes al cerebro.

16. Uso de acuerdo con la reivindicación 15 CARACTERIZADO porque sirve para prevenir o tratar enfermedades neurodegenerativas.

17. Uso de acuerdo con la reivindicación 16 CARACTERIZADO porque las enfermedades neurodegenerativas son Alzheimer, Parkinson, Huntington o Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA).

18. Uso de acuerdo con la reivindicación 14 CARACTERIZADO porque sirve para prevenir o tratar accidentes cerebrovasculares.

Description:
NANOFIBRAS DE QUITOSANO CONTENEDORAS DE COMPUESTOS BIOACTIVOS

MEMORIA DESCRIPTIVA

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a nanofibras de quitosano autoensambladas contenedoras de compuestos bioactivos, biodegradables y seguras, útiles como nutracéuticos o fármacos.

Estas nanofibras se absorben principalmente a nivel de intestino delgado y atraviesan la barrera hematoencefálica aumentando la biodisponibilidad de los compuestos bioactivos en distintos órganos, incluyendo el cerebro, donde actúa como un sistema de liberación controlada (SLC). Las nanofibras que contienen compuestos bioactivos antioxidantes son especialmente útiles en el tratamiento o prevención de enfermedades neurodegenerativas, tales como las enfermedades de Alzheimer, Parkinson, Huntington, Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA); así como accidentes cerebrovasculares y otras enfermedades relacionadas con el envejecimiento o asociadas a un estrés oxidativo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Como indicamos, la invención se refiere a nanofibras constituidas por quitosano como contenedor de compuestos bioactivos, donde la nanofibra es autoensamblada, biodegradable, actúa como sistema de liberación controlada (SLC) y es útil como nutracéutico o fármaco.

El primer componente de las nanofibras es el quitosano, que es un polisacárido lineal compuesto de unidades p-(l->4)-D-glucosamina y β-(1->4)- N-acetil-D-glucosamina distribuidas al azar. Comercialmente, se produce por desacetilación de la quitina, un polisacárido estructural presente en hongos, en el exoesqueleto de crustáceos e insectos, que es el biopolímero natural más abundante después de la celulosa.

La quitina y el quitosano conforman una familia de biopolímeros con diferentes grados de desacetilación, es este parámetro el que hace la diferencia entre estar en presencia de quitina o quitosano propiamente tal, definiendo a este último como un producto con un grado de desacetilación de la quitina mayor al 60%.

El quitosano es distinto de otros polisacáridos comúnmente disponibles, debido a la presencia de nitrógeno como un grupo amino protonado (-NH3 + ) en su estructura molecular, lo que le confiere carga positiva y una capacidad de formación de complejos polielectrolíticos. La naturaleza catiónica del polímero le permite ser soluble en agua o formar sales con grupos de carga negativa, como carboxilatos o hidroxilos (hidroxilatos). Además, puede formar geles entrecruzados con materiales poliméricos que presenten cargas aniónicas (Bhattarai et al., 2010, Chitosan-based hydrogels for controlled, localized drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, 62, 83-99). Es un excipiente excelente, porque no es tóxico, es estable, biodegradable y se puede esterilizar. Estas propiedades hacen también del quitosano un material muy versátil con una amplia aplicación en los campos de la biomedicina y la biotecnología. Razones por las cuales los inventores lo escogieron para desarrollar las nanofibras de la invención.

En el estado del arte encontramos muchas nanoaplicaciones de quitosano, tanto como nanofibras o como nanopartículas, que contienen fármacos, células, proteínas, ácidos nucleicos, y otras moléculas. Los sistemas más comunes descritos en las patentes y/o en los artículos científicos incluyen la derivatización del quitosano y/o la interacción con otros polímeros de carga aniónica para producir entrecruzamiento entre varias cadenas de quitosano.

La derivatización del quitosano implica una síntesis química dirigida, donde en un primer lugar se adicionan grupos reactivos, como por ejemplo: tri-fosfato y glutaraldehído, a los grupos funcionales de las moléculas de quitosano, para luego entrecruzarlo covalentemente, en un patrón determinado, y formar diversas nanoestructuras contenedoras de compuestos bioactivos. Al realizar este tipo de síntesis orgánica, se deben emplear solventes orgánicos, los que muchas veces son incompatibles con aplicaciones biomédicas. Pese a que tanto los entrecruzantes como los solventes pueden estar en pequeñas proporciones, son altamente tóxicos, por lo que se deben extraer del producto final y debe acreditarse que el producto está libre de estos compuestos, lo que encarece los costos de producción de los mismos.

Las nanofibras de la invención resuelven este problema técnico, dado que no comprenden uniones covalentes entre el quitosano y los compuestos bioactivos, por lo que no requieren la formación de derivados, ni se producen por síntesis orgánicas, por lo que las nanofibras de la invención son seguras para aplicaciones en fármacos y nutracéuticos, ya que no contienen ningún residuo tóxico. Las nanofibras de la invención, comprenden quitosano y compuestos bioactivos, estos últimos corresponden a moléculas de tamaño molecular bajo que presentan grupos ácidos, lactonas, anillos aromáticos, hidroxilos, tales como polifenoles pequeños y sus mezclas, donde la mayoría de los compuestos bioactivos de estas características presentan capacidad antioxidantes y/u otras actividades biológicas.

A pesar del indiscutible impacto beneficioso de los compuestos bioactivos con capacidad antioxidante en la dieta, tales como los contenidos naturalmente en frutas y verduras, esto no siempre es suficiente para la prevención o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas u otras relacionadas con el envejecimiento. El principal motivo es la baja biodisponibilidad de los antioxidantes, tales como polifenoles, desde la dieta, ya que para que un polifenol u otro antioxidante logre ser biodisponible, debe primero resistir el medio fuertemente ácido del estómago, la degradación enzimática del tracto gastrointestinal (TGI) y la degradación metabólica de la variada microbiota que habita el TGI (Scheepens et al., 2010, Improving the oral bioavailability of beneficial polyphenols through designed synergies. Genes Nutr. 5, 75-87) que incluso pueden ser responsable de la destrucción de su naturaleza química, y por ende, de su bioactividad. La concentración plasmática máxima en humanos raramente sobrepasa 1 μΜ después del consumo de 10-100 mg de un único compuesto polifenólico. Existe gran cantidad de literatura que muestra los efectos beneficiosos de los antioxidantes tanto de origen natural como sintético para el organismo humano, y en particular, para el sistema nervioso central (SNC) y algunas de sus enfermedades. Sin embargo, para lograr una concentración suficiente para producir algún efecto en el cerebro, los compuestos consumidos deben también superar la barrera hematoencefálica (BHE), la que protege y aisla al cerebro y a la médula espinal del resto del cuerpo. La BHE es muy selectiva al paso de moléculas, impidiendo la entrada de más del 95% de moléculas xenobióticas y casi la totalidad de péptidos pequeños y proteínas.

Esta barrera limita el uso de los compuestos antioxidantes, y de muchas otras drogas, como potenciales agentes terapéuticos, ya que para alcanzar las concentraciones adecuadas en el cerebro se requiere administrar o consumir dosis muy altas, con el riesgo de una sobredosis que se puede traducir en una actividad pro-oxidante en otros órganos (Rahal et al., 2014, Oxidative Stress, Prooxidants, and Antioxidants: The Interplay. BioMed Research International). Para solucionar estas dificultades los inventores han desarrollado las nanofibras de la invención, un sistema conformado con moléculas de quitosano que se autoensamblan en forma de nanofibras cuando la molécula de quitosano interacciona con los grupos funcionales presentes en los compuestos bioactivos, actuando como nanocontenedores de liberación controlada de estos compuestos bioactivos.

Sorprendentemente, estas nuevas nanofibras presentan una mayor biodisponibilidad, se absorben sin degradarse a nivel de intestino delgado y son capaces de atravesar la barrera hematoencefálica y de liberar controladamente los compuestos bioactivos en los órganos, por ejemplo, los antioxidantes en el cerebro. Por esta razón el sistema de nanofibras de la invención es útil para la obtención de un medicamento o una composición nutracéutica que sirva para la administración de compuestos bioactivos, tales como antioxidantes, y de este modo prevenir o tratar enfermedades neurodegenerativas u otras relacionadas con el envejecimiento o el estrés oxidativo. Esta nanofibra es especialmente útil en el tratamiento y prevención de enfermedades neurodegenerativas, tales como las enfermedades de Alzheimer, Parkinson, Huntington, Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA); así como accidentes cerebrovasculares y otras enfermedades relacionadas con el envejecimiento o asociadas a un estrés oxidativo.

En el estado del arte encontramos numerosas publicaciones que divulgan el uso de quitosano en nanopartículas, nanofibras y como parte de sistemas de liberación controlada, incluso en sistemas de liberación controlada que atraviesan la BHE, no obstante ninguno anticipa las nanofibras de la invención.

Por ejemplo, la publicación internacional WO 2006/062 506 Al se refiere a un liposoma recubierto por quitosano para la entrega de compuestos antioxidantes. Los antioxidantes están en una preparación proliposomal recubierta por quitosano y la liberación controlada está dada por una capa entre el quitosano y la preparación con los compuestos activos. La capa de liberación sostenida es hidroxipropilmetilcelulosa, polietilenglicol o etilcelulosa. Como puede apreciarse, no es la interacción quitosano-antioxidante la fundamental en esta composición y adicionalmente no es una nanocomposición.

Otra publicación que divulga la liberación controlada de compuestos activos desde quitosano es la solicitud US 2010/0093661 Al, donde se divulga un conjugado de quitosano vía formación de un enlace amidídico con una droga que presente un grupo ácido, el que se hace reaccionar primero para obtener un haluro de ácido, un éster, un anhidro u otro producto intermediario, para la reacción final con el quitosano que produzca la formación de un conjugado. Como explicamos anteriormente, esto corresponde a una derivatización química del quitosano y no se relaciona con la nanofibra de la invención.

La publicación US 2006 051423 Al, indica que posee un sistema de transporte de drogas al cerebro, basado en quitosano, donde las drogas pueden ser antioxidantes, unidas covalentemente al quitosano; adicionalmente el sistema está recubierto por almidón, alginato o sus mezclas. Por lo tanto, la materia del US 2006 051423 Al no anticipa la nanofibra de la invención.

Una publicación que a prior] aparece como la más cercana a la presente invención es de Pérez Quiñones (2012, Carbohydrate Polymers, 88,1373-1377) Self-assembled nanoparticles of glicol chitosan - Ergocalciferol succinate conjúgate, for controlled reléase; no obstante, el autoensamblamiento de las partículas se produce nuevamente por la formación de un enlace covalente amida entre el hemisuccinato de ergocalciferol activado por una carboimida, con el grupo amino del quitosano. Por lo que esta publicación no anticipa la nanofibra de la invención, donde no se forman enlaces covalentes, sino como veremos más adelante, existen interacciones de puentes de hidrógeno entre los componentes.

Finalmente, la publicación de Pasanphan y Chirachanchai (2010, Conjugation of gallic acid onto chitosan: An approach for green and water-based antioxidant, Carbohydrate Polymers, 72, 169- 177) también divulga la conjugación de quitosano con el ácido gálico activado por una carbodimida. Nuevamente, se refieren a uniones por formación de enlaces covalentes, y por tanto, no anticipa la nanofibra de la invención.

Es decir, no existe en e! arte previo ningún documento que por sí mismo o en combinación con oíros, anticipe la invención. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Esquema de formación de nanofibras autoensambladas contenedoras de compuestos bioactivos de la invención. Se observa el polímero de quitosano (Q) que en presencia de los compuestos bioactivos (CB) forma la nanofibra de la invención (NF).

Figura 2. Esquema de representación de interacciones presentes en un sistema quitosano/ácido gálico estabilizada por puentes de hidrógeno en círculos discontinuos (— ) e interacciones iónicas en círculos continuos ( ).

Figura 3. Imágenes de Microscopía de Fuerza Atómica (MFA): perfil superficial de quitosano de tamaño molecular promedio 120 ±3,9 KDa y grado de desacetilacion entre 80 y 85% (A) y de nanofibras contenedoras de antioxidantes de la invención (B - escala μιτι y C - escala nm).

Figura 4. Esquema de funcionamiento de las nanofibras contenedoras de antioxidantes de la invención, como sistemas de liberación controlada, la nanofibra de la invención (NF), ante estímulos (E ) químicos como cambios en la acidez (pH), o biológicos como enzimas (Enz.) liberan los compuestos bioactivos (CB) al medio.

Figura 5. Curva de elución de quitosano tratado según el ejemplo 1.2, donde se depolimeriza y desacetila el quitosano, (línea negra) y de quitosano comercial (línea gris) en Sepharose 4B-CL. La flecha indica la fracción de quitosano tratado con menor polidispersión.

Figura 6. Viabilidad celular neuronas hipocampales 24 horas después de la exposición a diferentes concentraciones de peróxido de hidrógeno (10, 50, 100, 200, 500 μΜ) durante 1 h. * Significancia estadística respecto al control sin tratamiento con peróxido (p < 0,05).

Figura 7. Viabilidad neuronal de cultivos hipocampales, pre-incubados 24 h con el vehículo o con AOX a concentraciones de 0,001, 1, 10, 100, 150 y 200 μΜ, determinada 24 h después de la exposición de los cultivos a 50 μΜ de peróxido de hidrogeno por 1 h. * Significancia estadística respecto al control sin tratamiento con peróxido (p < 0,05). •Significancia estadística respecto al grupo tratado con peróxido (p < 0,05).

Figura 8. Viabilidad neuronal de cultivos hipocampales, pre-incubados 24 horas con el vehículo o con NF, donde las concentraciones asociadas a NF se refieren al contenido de AOX en las nanofibras de la invención, a concentraciones de 0,001, 1, 10, 100, 150 y 200 μΜ determinada 24 h después de la exposición de los cultivos a 50 μΜ de H2O2 por 1 h. * Significancia estadística respecto al control sin tratamiento con peróxido (p < 0,05). · Significancia estadística respecto al grupo tratado con peróxido (p < 0,05).■ Significancia estadística entre los grupos tratados con NF, con y sin peróxido. Figura 9. Gráfico de comparación de ácido gálico biodisponible en cerebro después de 14 días de suministro de la misma concentración de AOX, la primera barra corresponde a animales con suministro de sólo la mezcla AOX (gris claro, AOX) y la segunda barra corresponde a animales con suministro de antioxidantes contenidos en las nanofibras de la invención (gris oscuro, NF).

Figura 10. Zona CAI del hipocampo evaluada en los ejemplos.

Figura 11. Rebanadas de hipocampo (zona CAI) marcadas con un anticuerpo que detecta oxidación de ADN (anti- 8-hidroxiguanosina, 8-OHG) (fila A) y contratinción del núcleo (Hoechst) (fila C) y ambas (fila B) en animales jóvenes de 3 meses, envejecidos de 18 meses y envejecidos de 18 meses con dieta suplementada con nanofibra por 50 días.

Figura 12. Plasticidad sináptica inducida por estimulación tetánica en rebanadas de hipocampo de ratas envejecidas en tres condiciones de alimentación por 50 días: dieta estándar o control (CT), alimentación suplementada con 200 μΐ de una mezcla de antioxidantes con una concentración total de 3,9 mg/mL (ácido gálico, ácido elágico y quercetina) (AOX) y alimentación suplementada con 200 μΐ de suspensión de nanofibras de la invención contenedoras de una mezcla de antioxidantes con una concentración total de 3,9 mg/mL (ácido gálico, ácido elágico y quercetina) (NF). A) Trazas representativas de los potenciales de campo evocados en cada condición. Los valores entre paréntesis indican el número de rebanadas y el número de animales utilizados. B) Efecto de la nanofibra en la LTP en neuronas del área CAI, inducido por trenes de estimulación de alta frecuencia (TBS) en las fibras aferentes de CA3 (colaterales de Shaffer) en hipocampo de ratas envejecidas. Los resultados se presentan como promedio ± error estándar. * indica diferencia significativa con respecto al control. Estadística p <0,05 evaluada con el test de student.

Figura 13. Espectro de RMN 1 H del ácido gálico, en D 2 0, a pD 3 y 37°C.

Figura 14. Espectro de RMN 1 H del ácido ascórbico, en D 2 0, a pD 3 y 37°C.

Figura 15. Gráfico de relación entre los desplazamientos (ppm) de la señal de ácido gálico en el sistema qu ¡tosa no-gálico y la acidez del medio.

Figura 16. Espectro de RMN 1 H del sistema quitosano- ácido ascórbico, en D 2 0, a pD 5, y 37 °C.

Figura 17. Gráfico del desplazamiento señales de los núcleos de hidrógeno del ácido ascórbico en el sistema quitosano ascórbico unidos a los carbonos (a) C 4 , (b) Cs y (c) C e.

Figura 18. Espectro de RMN 1 H del sistema quitosano-ácido ascórbico, en D 2 0 a pD 1, y 37 °C. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Como ya se ha anticipado, la invención se refiere a nanofibras de quitosano y compuestos bioactivos, donde estos compuestos bioactivos son de tamaño molecular bajo y presentan grupos ácidos o lactonas, anillos aromáticos y/o hidroxilos. Donde el quitosano y los compuestos bioactivos se estructuran formando nanofibras a través de una primera interacción de los grupos iónicos de las moléculas e interacciones hidrofóbicas, para estabilizarse mayoritariamente por formación de puentes de hidrógeno entre el quitosano y los compuestos bioactivos, formulándose un nuevo sistema de liberación controlada de los compuestos bioactivos que son nanocontenidos en este sistema. Los compuestos bioactivos que cumplen con estas características muchas veces tienen actividad biológica, especialmente capacidad antioxidante.

Los inventores han demostrado que las nanofibras de la invención se absorben sin degradarse en el intestino delgado y atraviesan la barrera hematoencefálica, por lo que son especialmente útiles para entregar compuestos bioactivos neuroprotectores al cerebro, como SLC y, por lo tanto, se puede utilizar en el tratamiento o prevención de enfermedades neurodegenerativas, tales como Alzheimer, Parkinson, Huntington, Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA); así como accidentes cerebrovasculares y otras enfermedades relacionadas con el envejecimiento o asociadas a un estrés oxidativo.

El efecto beneficioso de los antioxidantes se relaciona a la capacidad de mantener en equilibrio las especies oxidantes en un organismo, ya que un aumento de ellas se traduce en un Estrés Oxidativo (EO), asociado a daño celular y tisular y la causa de diversas patologías. En particular, el cerebro es un órgano susceptible al EO debido a los siguientes fenómenos: a) contiene altos niveles de ácidos grasos insaturados, que son vulnerables a la oxidación, b) este órgano consume grandes cantidades de oxígeno (alrededor del 20% del total utilizado por el organismo), c) las concentraciones de antioxidantes endógenos son relativamente más bajas en el cerebro en comparación a otros tejidos, d) el cerebro contiene altas concentraciones de metales de transición como el Cu + y Fe 2+ que son catalizadores clave de los daños inducidos por oxidación (Circu y Aw, 2010, Reactive oxygen species, cellular redox systems, and apoptosis. Free Radie. Biol. Med. 48, 749-762).

Las nanofibras de la invención, al permitir entregar los compuestos bioactivos al cerebro, reducirían el EO y sus daños asociados en este órgano tan esencial.

Las nanofibras de la invención resuelven otro problema técnico. Recientemente, se ha comprobado que compuestos reconocidos por su acción antioxidante pueden ser pro-oxidantes a altas concentraciones; es decir, producen el efecto absolutamente contrario. Por esta razón, aumentar las dosis de antioxidantes proveídas en fármacos a las personas puede ser poco seguro e incluso tóxico. Las nanofibras de la invención actúan como sistema de liberación controlada, liberando lentamente los compuestos bioactivos, como los antioxidantes, a concentraciones en las que se mantienen sus propiedades beneficiosas.

Los inventores han encontrado que, sorprendentemente, al combinar quitosano de un tamaño molecular entre 70 y 500 KDa y un grado de desacetilación de entre un 65 a 90%, con compuestos bioactivos de tamaño molecular bajo que presenten grupos ácidos, lactonas, anillos aromáticos o hidroxilos, tales como polifenoles de tamaño molecular bajo, inferior a 0,5 KDa, se forma espontáneamente la nanofibra de la invención, donde el quitosano actúa como nanocontenedor de los compuestos activos protegiéndolos desde el intestino hasta los órganos, incluyendo el cerebro. Una vez en los órganos la nanofibra de la invención se degrada lentamente, ya sea por cambios de acidez o por acción enzimática, liberando los compuestos activos contenidos.

Es altamente beneficioso que el quitosano a utilizar para obtener las nanofibras de la invención tenga un tamaño menos disperso, si bien las nanofibras se forman con muestras de quitosano de tamaños moleculares entre 70 y 500 KDa, se prefieren quitosanos de tamaños moleculares menores, especialmente entre 80 y 300 KDa, y muy especialmente entre 100 y 200 KDa. Preferentemente, el quitosano de la invención debe tener un grado de desacetilación de entre 65 a 90%, más especialmente entre 75 a 85% y muy especialmente entre 80 a 85%.

En un segundo aspecto, la invención también se refiere al método de obtención de la nanofibra, el que comprende mezclar quitosano de un tamaño molecular entre 70 y 500 KDa con los compuestos bioactivos y permitir el autoensamble de la misma, como se esquematiza en la Figura 1. Este método comprende mezclar una solución de quitosano en concentraciones de entre 0,5 a 1,5% m/v con una solución de compuestos bioactivos en concentraciones de entre 0,1 a 1,5% m/v, donde la proporción entre ambas soluciones es desde 3:1 hasta 4:1.

La proporción en masa entre ambos componentes es desde 75-85% de quitosano y de 15 a 25% de compuestos bioactivos.

Como indicamos los compuestos bioactivos útiles para las nanofibras de la invención deben tener un tamaño molecular bajo, ésto es un tamaño inferior a los 0,5 KDa, especialmente bajo los 0,4 KDa y muy especialmente bajo los 0,3 KDa. Dentro de los compuestos que cumplen con las condiciones indicadas, de tener un tamaño molecular bajo y presentar grupos ácidos, lactonas, anillos aromáticos o hidroxilos, y que por lo tanto pueden formar las nanofibras de la invención, se encuentran el ácido gálico, quercetina, ácido elágico, ácido ascórbico (Vitamina C); ácidos hidroxicinámicos, tales como cafeico, clorogénico, cumárico, ferúlico, sinápico; ácidos hidroxibenzoicos, tales como protocatéquico, vainíllico, siríngico, rosmarínico; los flavonoles kaempferol, miricetina, isoramnetina, entre otros y sus mezclas.

En una realización preferida los compuestos bioactivos corresponde a una mezcla de los antioxidantes ácido gálico, ácido elágico y quercetina. En una realización especialmente preferida, la mezcla comprende de 0,001 a 0,005 % m/v de ácido elágico, de 0,01 a 0,1 % m/v de quercetina y de 0,1 a 1% de ácido gálico.

Los inventores han realizado diversos estudios con las realizaciones preferidas de la invención. Por ejemplo, se desarrollaron nanofibras de quitosano con una mezcla de ácido gálico, ácido elágico y quercetina, comprobando su acción neuroprotectora tanto in vitro - en cultivos de neuronas - e in vivo - en modelo de rata. En el modelo in vivo los resultados muestran que se potenció la biodisponiblidad de los antioxidantes en el cerebro, ya que al suministrar la nanofibra de la invención se obtuvo una concentración de los antioxidantes más de 7 veces mayor que la obtenida al proveer solamente los antioxidantes, ver ejemplo 3.2. Por otro lado, las nanofibras actuaron como un sistema de liberación controlada que además aumentó la estabilidad de los compuestos bioactivos neuroprotectores (antioxidantes) frente a procesos metabólicos de degradación, aumentando su tiempo de actividad en el cerebro.

Los quitosanos disponibles comercialmente pueden no reunir las condiciones necesarias para formar las nanofibras de la invención. Por ejemplo, encontramos quitosanos comerciales de tamaño molecular alto (por ej. 575 KDa) y un grado de desacetilación medio (por ej. 67,3 %). En este caso se puede someter el quitosano a un tratamiento alcalino para lograr las condiciones preferidas para la realización de las nanofibras de la invención.

Una vez obtenido quitosano de tamaño molecular entre 70 y 500 KDa y de un grado de desacetilación entre 65 y 90%, éste se mezcla con los compuestos bioactivos en las proporciones indicadas permitiendo el autoensamblamiento de la nanofibra de la invención, lo que se explica por interacciones iónicas, hidrofóbicas y de puentes de hidrógeno entre ambos componentes de la nanofibra. Esto se confirmó por estudios de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de las nanofibra de la invención, los que sugieren que las nanofibras se estabilizarían a través de interacciones (o puentes) de hidrógeno. Por ejemplo, en la Figura 2 se muestra un esquema de las interacciones presentes en un sistema quitosano/ácido gálico donde los puentes de hidrógeno se muestran en círculos discontinuos (— ) y las interacciones iónicas se muestran en círculos continuos ( ).

La presencia de los compuestos bioactivos, permite el autoensamblamiento del quitosano, conformándose la nanofibra de la invención. Los estudios microscópicos permiten postular que los compuestos bioactivos quedan incluidos dentro de las nanofibras. En la Figura 3 se muestran imágenes de Microscopía de Fuerza Atómica (MFA) de: quitosano, imagen (A) en las condiciones preferidas para la realización de las nanofibras de la invención y de las nanofibras de la invención, después de permitir el autoensamble del quitosano en presencia de compuestos bioactivos, en este caso una mezcla de ácido gálico, ácido elágico y quercetina; en la imagen B se observan las nanofibras a una escala μιτι y en la imagen C en escala nm.

Los inventores realizaron un estudio completo de las nanofibras contenedoras de antioxidantes como sistema de liberación controlada (SLC), el que se realizó a través de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) sometiendo los sistemas a estímulos de pH, aumentando la acidez, encontrándose que en ambientes fuertemente ácidos los compuestos bioactivos y el quitosano se comportan en forma independiente (ausencia de interacciones) demostrando su funcionamiento como sistemas de liberación respondedora a estímulos químicos (cambios de acidez) lo que se esquematiza en la Figura 4. Además, se debe considerar la existencia de componentes biológicos, como es la presencia de enzimas en el cerebro u otros órganos capaces de degradar el quitosano, que permitiría la liberación controlada de los compuestos bioactivos in vivo.

De acuerdo a lo anterior, las nanofibras contenedoras de compuestos bioactivos, tales como antioxidantes, en base a quitosano de la invención presentan una mayor biodisponibilidad de los antioxidantes en el cerebro y liberarán a estos últimos en función de los estímulos que disminuyan las interacciones que se formen entre ellos, condicionando su velocidad de liberación y generando sistemas de liberación controlada que aumentan la seguridad e inocuidad en su potencial uso como neuroprotector y/o neuroregenerador a nivel cerebral.

Evidentemente, las nanofibras de la invención pueden ser utilizadas para suministrar compuestos bioactivos a todo el organismo, en los distintos órganos. No obstante, dado que una de las ventajas de la invención es que permite traspasar la BHE, es que los ejemplos se centran en el cerebro. En este órgano las nanofibras de la invención pueden utilizarse, al ser suministradas como composición farmacéutica o nutracéutica, para prevenir o tratar enfermedades neurodegenerativas, tales como Alzheimer, Parkinson, Huntington, Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) y otras relacionadas. Así como para prevenir o tratar accidentes cerebrovasculares.

Las nanofibras de la invención pueden incorporarse en una composición farmacéutica o nutracéutica, junto con excipientes de formulación y eventualmente en combinación con otros principios activos. Dadas las características de las nanofibras de la invención, que se absorben a nivel de intestino delgado sin degradarse, convenientemente se pueden formular composiciones farmacéuticas apropiadas para administración oral, tales como comprimidos, comprimidos recubiertos, polvos, cápsulas, jarabes u otros. No obstante, esto no es limitativo y se entiende que las nanofibras de la invención pueden formularse en cualquier tipo de forma farmacéutica existente en el estado de la técnica. Adicionalmente, las nanofibras de la invención pueden mezclarse con alimentos o bebidas. Evidentemente, las composiciones farmacéuticas o nutracéuticas pueden ser administradas tanto a humanos como a animales, según se requiera.

Como se indicó y se demuestra en los ejemplos, en los órganos objetivos las nanofibras de la invención actúan como sistema de liberación controlada de los compuestos bioactivos que contiene, al comenzar el des-ensamble de la nanofibra y/o la biodegradación del quitosano.

La invención puede ser comprendida de mejor manera a la luz de los ejemplos incluidos a continuación, los que son meramente ilustrativos de realizaciones preferidas de la invención y no deben ser considerados como limitaciones de la misma.

EJEMPLOS.

1. Elaboración de nanofibras de la invención

1.1 Preparación de la mezcla de compuestos bioactivos a nanocontener.

Se preparó una solución de 25 mg de ácido elágico, 45 mg de quercetina y 700 mg de ácido gálico para 100 mL de una solución acuosa de etanol al 75% v/v. Se agitó a temperatura ambiente hasta disolución completa de los compuestos.

La estructura de estos compuestos se muestra a continuación:

Acido eíágico

Quercetina

1.2 Procedimiento de obtención de nanofibras de quitosano y antioxidantes

La mezcla para formar nanofibras se realizó volcando 75 mL de una solución acuosa de quitosano de tamaño molecular de 121±3,9 KDa y un grado de desacetilación de 85%, al 1% m/v sobre 25 mL de la solución obtenida en el punto 1.1. Se agitó enérgicamente y se almacenó a 4 °C.

En estas condiciones los polifenoles interaccionan con el quitosano a través de interacciones iónicas (grupo carboxilo de los antioxidantes y grupo amino del polisacárido) cambiando su estructura tridimensional para favorecer las interacciones hidrofobicas entre los anillos aromáticos de los polifenoles y la cadena hidrocarbonada de la glucosamina, formándose espontáneamente las nanofibras de la invención y se estabilizan finalmente por puentes de hidrógeno.

1.3 Caracterización morfológica de las nanofibras obtenidas en el punto anterior a través de Microscopía de Fuerza Atómica (MFA)

1.3.1 Elaboración de membranas para estudios de fase sólida

Para la obtención de membranas a partir de la suspensión de nanofibras obtenida en el punto anterior (1.2) se esparcieron 6 mL de la solución en una placa Petri de 10 cm de diámetro. Este volumen es suficiente para recubrir la superficie lisa de la placa de policarbonato. Luego se secó en estufa de cultivo a 50 °C por 6 h.

1.3.2 Caracterización de membranas de nanofibras por MFA

Las membranas resultantes en el punto anterior se analizaron por Microscopía de Fuerza Atómica (MFA) para su caracterización morfológica. Esta técnica proporcionó imágenes tridimensionales que permitieron cuantificar la profundidad y morfología de las muestras, corroborando la formación de nanofibras (Figura 3). La Figura 3 A muestra el perfil superficial del quitosano apto para formar nanofibras de la invención, en este caso es de un tamaño molecular de 121±3,9 KDa. Las Figuras 3 B y 3 C muestran las nanofibras de la invención obtenidas en el ejemplo 1.1, donde la imagen 3 B está a una escala μιτι y la imagen 3 C está a una escala nm.

2. Efecto de neuroprotección de las nanofibras de la invención in vitro sobre neuronas hipocampales de rata

2.1 Cultivo primario de hipocampo de rata:

Se utilizaron cerebros de embriones de ratas de 18 días. Los hipocampos extraídos se colocaron en solución salina de Hanks modificada (mHBSS, por su nombre en inglés: Hank's buffer salt solution) y se lavaron tres veces para luego agregar tripsina (0,25%). Luego de este tratamiento, los hipocampos se lavaron con mHBSS y se transfirieron a medio MEM (Medio Esencial Mínimo) suplementado con 10% de suero de caballo (HS), disgregándose con pipeta Pasteur. La suspensión celular se colectó por centrifugación a baja velocidad (2000 x g, x 20 s) a temperatura ambiente. El sobrenadante fue guardado y el pellet se disgregó nuevamente con una pipeta Pasteur de punta muy fina. Se realizó otra centrifugación a baja velocidad (2000 x g, x 20 s) a temperatura ambiente. El sobrenadante que contiene las células en suspensión se juntó con el sobrenadante anterior y las células viables se contaron usando azul de Tripán (0,2%). Posteriormente, las neuronas se sembraron en placas de cultivo en MEM suplementado con 10% HS. Luego que las neuronas hipocampales se adhirieron a la placa, se les cambió de medio por un medio Neurobasal con el suplemento de cultivo B27, manteniéndose en cultivo por catorce días.

2.2 Estudios in vitro en neuronas hipocampales de rata.

Las neuronas hipocampales de rata obtenidas en el punto 2.1 se emplearon para evaluar el efecto neuroprotector de las nanofibras de la invención.

Inicialmente, se evaluó el porcentaje de viabilidad celular de dichas neuronas hipocampales expuestas a diferentes concentraciones de peróxido de hidrógeno (10, 50, 100, 200, 500 μΜ) durante 1 h. El peróxido de hidrógeno (H2O2) en condiciones biológicas, es un compuesto altamente oxidante.

En todas las condiciones utilizadas se observaron cambios en la viabilidad celular respecto a la condición control sin H2O2, los porcentajes de viabilidad respecto a la condición basal fueron 69,45±6; 44,33±4; 29,06±3; 19,59±6 y 15,81±5 respectivamente, para las citadas concentraciones de H2O2. A todas las concentraciones, la disminución en la viabilidad fue significativa con respecto a la condición control (p<0,05, n = 4). Estos resultados se muestran en la Figura 6.

Para las pruebas subsiguientes se decidió utilizar una concentración de peróxido de hidrógeno de 50 μΜ por una hora ya que la viabilidad neuronal disminuye cerca de un 50% en esta condición, 24 horas después de la incubación con H2O2.

2.2.1 Efecto protector de una mezcla de antioxidantes frente a daño oxidativo por H2O2.

Se evalúo el efecto neuroprotector de la mezcla de antioxidantes (AOX), para lo cual las neuronas obtenidas en el punto 2.1 se incubaron por 24 horas en un medio suplementado con la mezcla de antioxidantes obtenida en el ejemplo 1.1. Se comparó la viabilidad neuronal respecto al control (incubado con el vehículo sin antioxidantes) a concentraciones de 0,001, 1, 10, 100, 150 y 200 μΜ de AOX, antes y después de la exposición de los cultivos a una concentración de 50 μΜ de H2O2, durante lh de incubación.

Los resultados se muestran en la Figura 7, donde se aprecia que:

- en la condición control el H2O2 disminuye la viabilidad celular a menos del 50%;

- en todas las concentraciones de AOX, sin H2O2, no fue posible evidenciar diferencias significativas respecto al control;

- el efecto protector de AOX es estadísticamente significativo sólo a concentraciones de 100 y 150 μΜ.

2.2.2 Efecto protector de las nanofibras de la invención frente a daño oxidativo por H2O2.

Se evalúo el efecto neuro protector de las nanofibras de la invención (NF), para lo cual las neuronas obtenidas en el punto 2.1 se incubaron por 24 horas en un medio suplementado con las nanofibras de la invención obtenidas en el ejemplo 1.2. Se comparó la viabilidad neuronal respecto al control (incubado con el vehículo sin nanofibras) con nanofibras que contienen concentraciones de 0,001, 1, 10, 100, 150 y 200 μΜ de AOX, antes y después de la exposición de los cultivos a una concentración de 50 μΜ de H2O2, durante 1 hora de incubación.

Los resultados se muestran en la Figura 8, donde como se indicó las concentraciones NF se refieren al contenido de AOX en las nanofibras de la invención; se aprecia que:

- en la condición control el H2O2 disminuye la viabilidad celular a menos del 50%;

- en ausencia de H202 se observa una disminución en la viabilidad celular en los cultivos con bajas concentraciones de NF (0,001, 1 y 10 μΜ), no obstante dicha disminución no es estadísticamente significativa;

- en la concentración de 200 μΜ de NF, sin H2O2, se aprecia un aumento significativo de la viabilidad neuronal respecto al control; - en todas las concentraciones de nanofibra, frente a la injuria por peróxido de hidrógeno presentaron aumentos significativos de la viabilidad neuronal (p<0,05) con respecto al control con 50 μΜ de H2O2.

Estos resultados demuestran que las nanofibras de la invención proporcionan una mejor protección frente al estrés oxidativo que los antioxidantes libres, es decir, no contenidos en las nanofibras en cultivos in vitro.

3. Determinación de la biodisponibilidad de antioxidantes en extractos de cerebros de animales

3.1 Estudios in vivo de biodisponibilidad

Los estudios de biodisponibilidad in vivo se llevaron a cabo en ratas hembras Sprague dawley (n=9), de 350 g de masa promedio aproximadamente, de 14 meses de edad.

Los animales tuvieron un período de 14 días de administración de 200 μΐ de suspensión de nanofibras contenedoras de una mezcla de antioxidantes con una concentración total de 3,9 mg/mL (ácido gálico, ácido elágico y quercetina) para el grupo tratado con la nanofibra de la invención (NF), una solución de los polifenoles ácido gálico, ácido elágico y quercetina en la misma concentración total de 3,9 mg/mL para el grupo control antioxidantes (AOX).

Todas las ratas se mantuvieron en un ambiente entre 23-24 °C y una humedad relativa del 50%, agua y pellet normales de alimentación ad libitum, sometiéndose a ciclos circadianos de 12:12 horas/luz: oscuridad. No se observaban cambios morfológicos notorios o conductas erráticas.

3.2 Estudio de biodisponibilidad

Terminado el período de suministro de antioxidantes (AOX) o las nanofibras de la invención (NF), se esperan 18 horas para la obtención de los cerebros y la extracción de los antioxidantes para su posterior identificación y cuantificación. La determinación de la cantidad de antioxidantes en los tejidos cerebrales de rata se realizó, previa perfusión (sacarosa 110 mM, NaCI 60 mM, KCI 3 mM, NaH 2 P0 4 1,25 mM, NaHCOs 28 mM, D-glucosa 5mM, CaCI 2 0,5 mM, MgCI 2 7mM y 95% 0 2 /5% C0 2 ), para desplazar indicios de sangre en el cerebro y disminuir la temperatura cerebral. Luego se procedió al congelamiento de las muestras de cerebro y se pulverizaron en un mortero de cerámica previamente enfriado con nitrógeno líquido. Se extrajeron los tejidos pulverizados con 10 mL de metanol preenfriado a -20 °C y los homogeneizados de cerebro se centrifugaron a 7500 x g por 20 minutos. El sobrenadante se sometió a secado a través de una corriente de nitrógeno (N 2 (g)). Las muestras se reconstituyeron con 2 mL de agua destilada ultra pura (previamente filtradas en membranas de 0,22 μιτι) y se fraccionaron a través de una columna de fase reversa C-18 preparativa (columnas de Sílica Sep - Pak - Waters). A continuación, se separaron los antioxidantes en neutros y ácidos, según la metodología descrita por Kim y Lee (2002, Extraction and Isolation of Polyphenolics, Current Protocols in Food Analytical. Unidad 1-1.2).

Las fracciones obtenidas (antioxidantes neutros y antioxidantes ácidos) se reconstituyeron con 5 mL de metanol, para luego ser analizadas por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC, por su sigla en inglés) en un cromatógrafo acoplado a detector con arreglo de diodos (HPLC-DAD), con las siguientes condiciones: volumen de inyección 50 μΐ, temperatura 30° C, longitud de onda del detector 272 nm para ácido gálico y 376 nm para quercetina, fase móvil en polaridad ascendente: solvente A: ácido acético al 1% v/v y solvente B: metanol y columna HPLC Inertsil ODS-3 C 4,6 ID x 150 mm (5 μιτι).

Se establece una relación lineal entre la cantidad de antioxidante y su área de respuesta por cromatografía líquida. Para el ácido gálico las medidas se realizaron en el máximo de absorción (272 nm) de este compuesto, encontrándose una respuesta lineal entre 11,2 - 112,0 μg/mL, con un coeficiente de correlación lineal de 0,9993, lo que indica que el espectro corresponde a este compuesto.

Se utilizó ácido gálico como marcador de biodisponibilidad en el cerebro, ya que de los 3 compuestos utilizados es el que se puede extraer más eficientemente y normalmente es utilizado para este propósito. Por lo tanto, la evaluación de la biodisponibilidad se realiza en relación al contenido cerebral de ácido gálico, que resulta ser 7,6 veces mayor en los ratones tratados con las nanofibras de la invención en relación a los animales tratados con el control de antioxidantes (AOX). Los resultados se presentan en la Figura 9. El análisis de ANOVA muestra que la diferencia encontrada entre los grupos tratados sólo con antioxidantes (AOX) y con nanofibras (NF) es significativa con p<0,05 (p- 0,038).

Estos análisis demuestran que las nanofibras de la invención aumentan significativamente la biodisponibilidad de los antioxidantes en el cerebro al ser suministradas vía oral, respecto al suministro de la misma cantidad de antioxidantes libres, no contenidos en las nanofibras.

3.3 Estudios in vivo de neuroprotección cerebral

Los estudios de neuroprotección cerebral in vivo se llevaron a cabo en ratas macho Sprague dawley (n=ll), de 350 g de masa promedio aproximadamente cada una, de 18 meses de edad.

Los animales de 18 meses de edad o envejecidos tuvieron un período de 50 días de administración de 200 μΐ de suspensión de nanofibras contenedoras de una mezcla de antioxidantes con una concentración total de 3,9 mg/mL (ácido gálico, ácido elágico y quercetina) para el grupo tratado con la nanofibra de la invención, 200 μΐ de suspensión de una mezcla de antioxidantes con una concentración total de 3,9 mg/mL (ácido gálico, ácido elágico y quercetina) para el grupo tratado sólo con los antioxidantes de la invención, mientras que el grupo control recibió una dieta estándar.

Todas las ratas se mantuvieron en un ambiente entre 23-24 °C y una humedad relativa del 50%, agua y pellet normales de alimentación ad libitum, sometiéndose a ciclos circadianos de 12:12 horas/luz: oscuridad. No se observaron cambios morfológicos notorios o conductas erráticas en ninguno de los grupos.

3.3.1 Preparación de rebanadas de hipocampo:

Los hipocampos de ratas machos Sprague dawley envejecidas de 18 meses con y sin administración de nanofibras de la invención y sólo con la mezcla de antioxidantes presentes en las nanofibras (mismos antioxidantes y concentración de ellos), se extrajeron y se colocaron rápidamente en una solución salina de corte conteniendo: sacarosa 110 mM, NaCI 60 mM, KCI 3 mM, NaH 2 P0 4 1,25 mM, NaHC0 3 28 mM, D-glucosa 5 mM, CaCI 2 0,5 mM, MgCI 2 7 mM, ácido ascórbico 0,6 mM y 95% 0 2 /5% C0 2 equilibrando la solución. Se usó un vibrátomo para cortar rebanadas de 400 μιτι, las cuales se transfirieron a una mezcla 1:1 de solución de corte y fluido cerebroespinal artificial (ACSF) compuesto de: NaCI 125 mM, KCI 2,5 mM, NaH 2 P0 4 1,25 mM, NaHC0 3 25 mM, D-glucosa 25 mM, CaCI 2 2 mM y MgCI 2 1 mM, equilibrada también con 95% 0 2 y 5% C0 2 . Las rebanadas se mantuvieron a temperatura ambiente por al menos treinta minutos y luego, se transfirieron a una cámara de registro donde se estabilizaron y perfundieron sólo con ACSF a 32°C durante una hora antes de realizar los experimentos electrofisiológicos.

3.3.2 Registros electrofisiológicos en rebanadas de hipocampo:

Para obtener los datos electrofisiológicos se estimularon simultáneamente cuatro rebanadas de hipocampo, usando dos cámaras de registro independientes, con dos rebanadas por cámara. Las respuestas sinápticas fueron evocadas estimulando las fibras colaterales de Schaffer con pulsos de 0,2 ms aplicados con un electrodo de estimulación bipolar concéntrico y registradas extracelularmente en el stratum radiatum de la zona CAI del hipocampo, la que se muestra en la Figura 10. La respuesta basal se obtuvo por estimulación cada 30 segundos durante 20 minutos, usando una intensidad de corriente que evoca una pendiente del potencial de campo (fEPSP) equivalente a la mitad de la pendiente máxima, hasta la aplicación de un protocolo de estimulación eléctrica que induce una potenciación de largo término (LTP por sus siglas en inglés, Long-term potentiation) en la respuesta sináptica. El protocolo aplicado consiste en un tren de estimulación tetánica de alta frecuencia (TBS: Theta Burst Stimulation) consistente de diez tétanos (bursts) separados por 200 ms (5 Hz). Cada tétano compuesto de cuatro pulsos separados por 10 ms cada uno (100 Hz). La inducción de LTP se realizó con un protocolo de inducción consistente en cuatro trenes de estimulación tetánica de alta frecuencia (4XTBS) aplicados cada 20 s (0,05 Hz).

La LTP, desde su descubrimiento ha sido propuesta como un modelo celular de los procesos que subyacen en el aprendizaje y la memoria. Dos analogías fundamentales sustentan la sugerencia de que la LTP pueda considerase un buen modelo de aprendizaje y memoria: el hecho que la potenciación a largo plazo es un cambio de conectividad duradero que depende de la actividad y que fue descrito en el hipocampo, una estructura relacionada con la memoria.

3.3.3 Registros de oxidación de ADN en rebanadas de hipocampo:

Las rebanadas de hipocampo obtenidas en 3.3.1 se incubaron con un anticuerpo que detecta oxidación de ADN, marcado fluorescentemente en rojo. Los resultados se aprecian en la Figura 11. En la fila superior (A) se muestra la inmunofluorescencia de oxidación de ADN usando un anticuerpo anti- 8-hidroxiguanosina (8-OHG), que detecta oxidación de ADN, en la fila inferior (C) el núcleo neuronal está teñido en azul (contratinción Hoeschst), y al centro se muestra la contra-tinción del núcleo y la inmunofluorescencia de oxidación de ADN (B). Se puede observar claramente que en la región analizada, el daño oxidativo asociado al ADN en animales viejos (18 meses, A) es significativamente mayor que en animales jóvenes (3 meses, A), y que los animales viejos alimentados con una dieta suplementada con nanofibras de la invención (18 meses + NF, A), disminuyen significativamente el daño oxidativo en su ADN.

3.3.4 Efecto de la nanofibra en la plasticidad sináptica en ratas envejecidas

Para este estudio se evaluó LTP inducida por estimulación tetánica en rebanadas de hipocampo de ratas envejecidas en tres condiciones de alimentación por 50 días: dieta estándar o control (CT), alimentación suplementada con 200 μΐ de una mezcla de antioxidantes con una concentración total de 3,9 mg/mL (ácido gálico, ácido elágico y quercetina) (AOX) y alimentación suplementada con 200 μΐ de suspensión de nanofibras de la invención contenedoras de una mezcla de antioxidantes con una concentración total de 3,9 mg/mL (ácido gálico, ácido elágico y quercetina) (NF).

Los resultados se muestran en la Figura 12, donde se aprecia que la LTP inducida por estimulación tetánica en rebanadas de hipocampo de ratas envejecidas con la dieta suplementada con antioxidantes (ENV-AOX) obtiene mejores resultados que las ratas control (ENV-CT), no obstante esta diferencia no es significativa. Por el contrario, los resultados sobre ratas alimentadas con nanofibras (ENV-NF) son aún mejores, en este caso la diferencia sí es estadísticamente significativa respecto al control.

Nuevamente los resultados demuestran que in vivo el efecto de los antioxidantes suministrados oralmente en las nanofibras de la invención es sustancialmente mejor que el de los antioxidantes libres o no contenidos en las nanofibras.

4 Estudio de interacciones de las nanofibras de la invención por RMN

Para evaluar que las interacciones entre el quitosano y los compuestos activos son, como se ha propuesto, interacciones de puentes de hidrógeno, y que por lo tanto las nanofibras de la invención actúan como sistemas de liberación controlada in vivo, se realizaron estudios espectroscopicos de resonancia magnética nuclear (RMN) comparando los antioxidantes (AO) ácido ascórbico y ácido gálico libres y en la nanofibra de la invención, así como el quitosano aislado.

4.1 RMN de antioxidantes aislados.

Se realizan los estudios espectroscopicos de RMN para los antioxidantes ácido ascórbico y ácido gálico libres. En primer lugar, se escogió como AO el ácido gálico, cuya molécula presenta un sólo átomo de hidrógeno, que corresponde a 2 posiciones equivalentes respecto del grupo carboxílico, las que están como únicos átomos de hidrógeno en la fórmula de la Figura 13, los hidrógenos de los grupos hidroxilos se silencian por intercambio isotópico con agua deuterada - D 2 0. El segundo AO estudiado fue el ácido ascórbico o Vitamina C el que se escogió por ser un reconocido antioxidante y porque convenientemente para un estudio de RMN tiene 3 átomos de hidrógeno que pueden ser estudiados, uno en el anillo en la posición C 4 y dos fuera del anillo en las posiciones C5 y C6. Estas posiciones y el espectro de RMN 1 H del ácido ascórbico, se muestran en la Figura 14.

4.2 RMN de antioxidantes en la nanofibra de la invención.

Para este estudio se formaron nanofibras de la invención con ambos antioxidantes por separado. Se mezclan 750 μΐ de quitosano de tamaño molecular de 121±3,9 KDa y un grado de desacetilación de 85% a una concentración de 30 mg/mL sobre 250 μΐ de ácido gálico o de ácido ascórbico a una concentración de 5 mg/mL. Se agita enérgicamente y se permite la formación espontánea de las nanofibras de la invención.

Ambas nanofibras se someten al análisis por espectroscopia de RMN 1 H después de un intercambio isotópico con D 2 0 (agua deuterada), variando el pH/pD entre 5 y 1 con HCI/DCI (ácido clorhídrico deuterado) a 37°C, se usa como referencia la señal del agua (δ 4,75 ppm). En ambos casos estudiados, al registrar el espectro para los antioxidantes en las nanofibras de la invención (NF)-AO a pH neutro, no se observaron las señales nítidas para los AO, lo que implica que las moléculas de AO no estaban libres en la solución, al aumentar la acidez a pD/pH 3 y luego a pD/pH 1 fueron apareciendo las señales características de los protones de AO, para luego presentar desplazamientos similares a los observados en ausencia de quitosano de la invención. El comportamiento de los sistemas quitosano-AO al formar las nanofibras de la invención comprueba la existencia de interacciones entre ambos por puentes de hidrógeno, ya que estas interacciones se modifican al cambiar la acidez de la solución.

4.2.1 RMN de ácido gálico en la nanofibra de la invención

El desplazamiento de las señales de los espectros de RMN 1 H da cuenta de interacciones entre los dos componentes del sistema (quitosano-ácido gálico). La Figura 15 permite relacionar el desplazamiento de las señales del sistema asociados a ácido gálico a los distintos pH estudiados, donde se observa un comportamiento lineal (R 2 = 0,8213) al disminuir la acidez del sistema (Tabla 1), dando cuenta de la existencia de interacciones entre el antioxidante y el quitosano.

Tabla 1. Asignación de la señal del ácido gálico en el sistema quitosano-gálico.

Acidez pH/pD H/ ppm NF Referencia

1 7,28 7,14

3 7,27

5 7^15

En el sistema de la nanofibra de la invención conformado por quitosano y ácido gálico a pD/pH 1, el ácido está bajo su PK a (4,4), por lo que el grupo carboxilato se encuentra mayoritariamente protonado (-COOH), disminuyendo la posibilidad de interacciones iónicas o electrostáticas, pero favoreciendo las interacciones hidrofobicas y de puentes de hidrógeno, siendo estas últimas las que explicarían la interacción más importante entre ambos. La estructura del ácido gálico a pH 4,4, se muestra a continuación:

Equilibrio ácido-base de Ácido gálico en medios acuosos 4.2.2 RMN de ácido ascórbico en la nanofibra de la invención

Por otra parte, para el ácido ascórbico, se registró el espectro de RMN 1 H a pD/pH 5, que se muestra en la Figura 16. A dicha acidez se observó una deformación en las señales de las nanofibras quitosano-ácido ascórbico, donde el protón del C 4 del ácido ascórbico presenta un desplazamiento hacia campo alto (4,91 ppm) mostrando la presencia de una interacción iónica del ascorbato con el grupo amino protonado de la unidad de glucosamina del quitosano, dado que el sistema se encuentra a valores por sobre su pKa (4,2). La estructura del ácido ascórbico a pH 4,2, se muestra a continuación:

Equilibrio ácido-base de Ácido ascórbico en medios acuosos.

En la Tabla 2 se presentan los desplazamientos químicos de las señales del ácido ascórbico en el espectro de RMN 1 H del sistema quitosano- ácido ascórbico a 37°C en D 2 0 y a diferentes pD/pH.

Tabla 2. Asignación de los desplazamientos de las señales de ácido ascórbico en el sistema quitosano-ácido ascórbico.

Asignación Desplazamiento/ppm del Ác. Ascórbico

Protón pD/pH 1 pD/pH 3 pD/pH 5

H 4 del C 4 5,072-5,065 5,056-5,045 5,045-5,095

HsdeI Cs 4,190-4,154 4,188-4,152 4,143-4,174

H 6 del C 6 3,853-3,845 4,862-3,844 3,840-3,855

Los desplazamientos de las señales de los núcleos de hidrógeno del ácido ascórbico a los distintos grados de acidez (Figura 17), mostraron una relación directa entre la acidez del medio en que se encuentra la nanofibra y el desplazamiento a campo bajo del núcleo de hidrógeno del C 4 , corroborando la interacción entre el ácido ascórbico y el quitosano en los sistemas estudiados.

El análisis del desplazamiento del protón del C 4 del anillo de lactona del ácido ascórbico a campo bajo confirma que las interacciones más importantes ocurrirían a través de puentes de hidrógeno de los grupos hidroxilos y carbonilos del anillo de lactona del ácido con los grupos hidroxilos del quitosano, ya que este protón es parte del anillo de la lactona.

Por lo tanto, el efecto más importante del aumento de la acidez se observó en núcleo de hidrógeno del C 4 , dando cuenta de una interacción del antioxidante con el quitosano por la formación de puentes de hidrógeno, y en menor grado por interacciones hidrofóbicas, entre el anillo de lactona del ácido ascórbico y el anillo piranósico de la unidad de glucosamina del quitosano.

Para el estudio de interacciones del sistema quitosano (NF)-ascórbico a pD/pH 5, se estudiaron los desplazamientos de las señales del sistema en relación a los compuestos aislados, observándose una deformación de las señales del quitosano, las que se desplazaron a campo alto en forma coherente a lo observado y a lo descrito por Tian et al. (2009, Synthesis and Evaluation of Chitosan- Vitamin C complex. Indian J Pharm Sci. 71, 371-376). La presencia de interacciones de puente de hidrógeno con el antioxidante explica lo observado, ya que por su parte el ácido ascórbico no está en el sistema de la nanofibra.

En el caso del sistema quitosano-ascórbico a pD/pH 3 se observó la aparición de una señal a campo bajo a 5,03 ppm asignable al protón de C 4 del ácido ascórbico, mostrando una menor interacción con el polisacárido al aumentar la acidez. En el análisis de las interacciones del sistema quitosano- ácido ascórbico a pH 1 (Figura 18) es posible observar las señales del ácido ascórbico cercanas al comportamiento que presentaba en forma aislada.

Los resultados obtenidos muestran que las nanofibras de la invención conforman un sistema de quitosano y antioxidantes estabilizados a través de interacciones (o puentes) de hidrógeno, las cuales desaparecen frente a estímulos químicos, como al aumentar la acidez. Demostrando que la principal interacción que estabiliza la estructura de las nanofibras son las interacciones puentes de hidrógeno, lo que confirma su funcionamiento como sistema de liberación controlada y permite explicar su funcionamiento en condiciones fisiológicas. Los ejemplos precedentes demuestran la reproducibilidad de la invención obteniéndose nanofibras con compuestos bioactivos de tamaño molecular bajo, que presentan grupos ácidos o lactonas, anillos aromáticos e hidroxilos, en este caso ácido ascórbico y ácido gálico y de una mezcla de estos compuestos, en este caso una mezcla de ácido gálico, quercetina y ácido elágico. Asimismo se demuestra la ventaja de las nanofibras respecto de los antioxidantes libres in vitro e in vivo. El alcance de la presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas.