野外からの採取と系統の確立
 野外から採取した緑藻をCarbenicillin(50μg/ml)� �りの25%デットメル液(0.25g KNO ₃ , 0.175g KH ₂ PO ₄ , 0.075g K ₂ HPO ₄ , 0.075g MgSO ₄ ・7H ₂ O, 0.025g NaCl, 0.01g CaCl ₂ ・7H ₂ Oに水道水を加えて滅菌)に移植したのち弱光� ��、25℃で2週間静置培養した。静置培養した� ��料を滅菌水で10倍に希釈したのちVoltexで10分 間攪拌した。希釈した試料をさらに段階的に 10倍希釈したもの(100倍、1000倍、10000倍、100000 倍希釈)を作成した。
 それらの希釈試料50μlをCarbenicillin(50μg/ml)入 りベネッケ寒天培地(0.2g NH ₄ NO ₃ , 0.1g CaCl ₂ , 0.1g KH ₂ PO ₄ , 0.1g MgSO ₄ ・7H ₂ O, 15gアガロースを水道水1Lに溶解したもの)10  mlに懸濁したのち、ペトリディッシュに注� �して凝固した。弱光下、25℃で培養して増殖 してきたコロニーから、大きいもの、緑の濃 いものを採取し増殖用斜面培地(グルコース15  g、NaNO ₃  2 g、MgSO ₄ ・7H ₂ O 0.2 g、CaCl ₂ ・2H ₂ O 0.05 g、クエン酸鉄アンモニウム0.02 g、K ₂ HPO ₄  0.8 g、KH ₂ PO ₄  0.2 g、酵母エキス 1g、A-5溶液 1250μl 、寒� �� 15gを1Lの水道水に溶解したもの)に移し、25 ℃で5日暗培養した後、コロニーの育成が良� �なものを選択して14℃で保存した。

培地
 増殖用培地は以下のものを使用した。
斜面培地:グルコース15 g、NaNO ₃  2 g、MgSO ₄ ・7H ₂ O 0.2 g、CaCl ₂ ・2H ₂ O 0.05 g、クエン酸鉄アンモニウム 0.02 g、K ₂ HPO ₄  0.8 g、KH ₂ PO ₄  0.2 g、酵母エキス 1g、A-5溶液 1250 μl、寒� �� 15gを1Lの水道水に溶解したもの。
液体培地:斜面培地から、寒天を除いたもの� �用いた。

 上記方法により、30の分離株を得た。こ� �30株について、25 ℃、暗黒下で5日間振盪培� ��し、1、4、5日目に細胞ペレットについて、� ��の濃さ、細胞量を相対評価した。増殖性、� ��の濃さは、各株でかなり異なった。増殖能� ��、クロロフィル量、活性酸素消去能を測定� ��、その全て(特に活性酸素消去能において)� �高い値を示す株を単離し、JOO5株と命名した� ��この株は、独立行政法人産業技術総合研究� �� 特許生物寄託センターに、2006年12月11日付 で寄託され、受託番号FERM P-21127が付された� �、2008年2月12日付けで国際寄託に移管が申請� ��れ、受託番号FERM BP-10949(受領番号FERM ABP-109 49)が付された。

 J005株の菌学的性質を以下に示す。

形態と染色性
 単細胞で、球形、2.8~3.9 × 3.2~4.2μmの大き� �である。細胞内にカップ状の葉緑体を1個、� ��レノイド1個を持つ。ルテニウムレッドで赤 色に染まる。

増殖
(1)生育温度20~40℃。生育pH 5~9、最適pH は7.2� �ある。
(2)無性生殖による細胞分裂で2~6個の娘細胞を 形成して増殖する。
(3)明培養で、光合成をおこない独立栄養で増 殖するが、暗培養下、グルコースを炭素源と した従属栄養でも増殖する。
(4)光合成のみの増殖よりも、従属栄養で培養 するほうが、はるかに増殖がよい。
(5)通常のクロレラは、暗培養で増殖させると クロロフィルの産生量がおちて、緑色が退色 するが、この株は、暗培養増殖でも、明培養 下で増殖したものと、緑色の濃さに遜色がな く、クロロフィルの産生量が落ちないのが特 徴である。

分類
 形態的な特徴、染色性、増殖様式、DNA分析� ��ら、J005株はChlorella vulgarisに分類される。
 DNA解析の結果、J005株は、公知のどの株とも 異なることから、新規の株であると判断した 。

 以下の実施例2~9においてJ005株につき、増 殖能力、クロロフィル含有量、活性酸素消去 能、痴呆抑制作用、抗ストレス作用および遺 伝子配列を調べた。

増殖能力
 上記30株のうち、特に優れた増殖性を示す3� ��(J001株、J008株、J009株と命名)とJ005株につい� ��増殖能力を測定した。クロレラ各株をslant� �ら液体培地に移した後、暗所にて一晩振盪� �培養した。1.0 × 10 ⁷ /mlに液体培地で調整し、25℃170rpmで暗所にて� ��盪培養し、24h毎に一部を採取して、細胞数� ��カウントし、細胞濃度を算定した。

 振盪培養時における培養時間と細胞数の� ��を以下に示す(グラフを図1に示す)。

 上記測定結果から、72時間後の増殖率を計� �すると、J005株が33.4倍、J009株が17.3倍、J008株 が13.9倍、J001株が12.7倍であった。これにより 、上記各株が、暗培養下において、25℃・3日 間程度で十分に培養が可能な、増力能力の優 れた株であることが分かった。特にJ005株は� �れた増殖率を示した。
 なお、この結果は三角フラスコ内での振盪� ��養によるものであり、培地の濃度を濃くし� ��タンク培養を行った場合は、さらにかなり� ��殖率が高くなることが期待できる。

クロロフィル量の測定
 上記30株のうち、特に緑色の濃い2株(J008株� �J009株)と J005株について、以下の手順により 、クロロフィル量を測定した。

1)クロロフィルの抽出
 秤量したクロレラ乾燥末を乳鉢に入れ、5倍 量(重量)の石英砂を加えて、均一になるよう� ��かき混ぜた。これに、50mMリン酸緩衝液、pH7 .5を加えて湿らせ、粉砕した。
 緩衝液の4倍量のメタノールを粉砕しながら 徐々に加えていき(80%メタノール抽出)、上清� ��メスフラスコに入れた。さらに粉砕しなが� ��80%メタノール(50mMリン酸緩衝液、pH7.5)を加� �て抽出し、上清をメスフラスコに加えた。� �の抽出操作を再度行った後、同様に同量の� �セトンによって抽出し、メタノール抽出液� �加えた。
2)クロロフィルの測定
 Arnonらの方法(藻類研究法、西澤一俊・千原� ��雄 編集、共立出版、1979年)に従い、次式を 用いて算出した。
 全クロロフィル量(μg/ml)=25.5×650nm吸光度測� �値+4.0×665nm吸光度測定値

 上記式で算出した、抽出液中の全クロロフ� ��ル量(μg/ml)から、クロレラ藻体乾燥重量1g当 たりの全クロロフィル量(mg/g)を次式により求 めた。
クロレラ藻体乾燥重量1g当たりの全クロロフ� ��ル量(mg/g)
=抽出液中の全クロロフィル量(μg/ml)í1000×抽� ��液量(ml)í藻体乾燥重量(g)
 結果を図2にまとめる。

 図2に示すように、J005株、J008株、J009株は 、暗培養において全クロロフィル含有量が乾 燥重量で30mg/g以上であり、暗培養においても 多量のクロロフィルを生産した。

活性酸素消去能の測定
 実施例3の3株(J005株、J008株、J009株)と任意に 選び出した1株(J006株と命名)について、活性� �素消去能を測定した。
 各株について暗培養を行い、100℃で5分の熱 処理を行ったのち凍結乾燥を行った。従来製 品である市販のクロレラ製剤A及びB(従来製品 A及び従来製品B)と凍結乾燥した上記のクロレ ラ株を水で懸濁したのち超音波破細装置を用 いて処理した。遠心後に上清を回収してBCAア ッセイキット(PIERCE社製)を用いて総蛋白量を� ��定した。これらの上清を純水で希釈して、� ��んぱく質0.1mgを含む20マイクロリットルの溶 液とし、その活性酸素消去能を高水溶性ホル マザン生成するテトラゾリウム塩を用いたNBT 法を用いて測定した。
 また、リコンビナントSOD蛋白(Wako純薬製)を� ��水で溶解し、500 pg/ml、250 pg/ml、125 pg/ml、6 2.5 pg/ml、31.25 pg/ml、16.125 pg/ml、8 pg/ml、4 pg /ml、2 pg/ml、1 pg/ml、0.5 pg/ml、0.25 pg/ml、0.125  pg/ml、0 pg/mlの濃度の溶液を用いて、NBT法で 活性酸素消去能を測定し標準曲線を作成して SODへの換算を行った。
 測定結果を図3(活性酸素除去率)および図4(SO D換算値)に示す。

 図3で示すように、活性酸素除去率は、従 来製品Aでは27%、従来製品Bでは16.5%であった� �に対して、J005株では66.23%であった。これをS OD蛋白の活性酸素消去能に換算すると、従来� ��品Aでは10.0pg/ml、従来製品Bでは0.11pg/mlであ� �のに対して、J005株では51.6 pg/mlと従来製品� �約5倍以上の活性を示し、培養クロレラ株中� ��最も活性酸素消去能が高かった。

 なお、J005株、J008株、J009株はいずれも、� ��施例3において全クロロフィル含有量が乾燥 重量で30mg/g以上と高値であったが、活性酸素 消去能については、J008株は活性酸素除去率� �20%未満であり、クロロフィル含有量と活性� �素消去能が相関しないことが分かった。

 以下、活性酸素消去能の高いクロレラを� ��実際に動物に経口投与した場合の生理活性� ��調べる実験を行った。

クロレラ成分含有飲料水の作成
 クロレラ培地(組成は[0023]に記載)を用いて� �ロレラを培養して、培養後、遠沈(3000 rpm 10 分)したのち水で再懸濁した。100℃で5分加熱� ��理したのちに凍結乾燥をおこなった。乾燥� ��たクロレラあるいは従来品のクロレラ製剤� ��水を加えて懸濁したのち超音波破砕装置を� ��いて菌体を破砕処理した。その後4℃で一晩 静置したのちに上清を回収した。上清中の総 蛋白濃度をBCAアッセイ法で定量したのちに0.0 3mg/mlの総蛋白濃度になるように水で希釈した 。作成工程の模式図を図5にしめす。

老化促進マウスを用いた新規クロ レラ株の活動活性にたいする影響
 14週齢の老化促進マウスSamP8マウス(SamP8マウ スは生後16週齢くらいから脳血管の障害を基� ��として脳組織の病理学的変性をきたし、そ� ��結果として、学習能力・記憶能力が顕著に� ��下してくる)に対して、普通飲料水、J005株� �有飲料水(0.03mg/ml総蛋白量)、従来製クロレラ 成分含有飲料水(0.03mg/ml総蛋白量)を与えた群� ��作成して、以下の項目について検討した。� ��の実験プロトコールについては図6に示す。 活動性の指標としてはオープンフィールドテ ストを行い、20分間の総移動距離を用いた。
 オープンフィールドテストでは、40cm×30cmの 箱の底面に10cm四方の区画を描いたフィール� �の中にマウスを投入し、その環境における� �定時間内での移動距離(移動区画数)によって 活動性を計測することができる。

 マウス投入後1分間の移動区画数を20分間� ��定した。そして1分ごとの移動距離(移動区� �数)をグラフにまとめたのが図7である。さら にそのグラフを20分間での移動距離(移動区画 数)にまとめたものが図8である。

 図7、図8に示されるとおりJ005株を含む飲� ��水を4ヶ月間飲ませた群では、20分間の移動� ��離が普通飲料水を飲ませていた群に比較し� ��有意に向上していた。一方、従来製品Aにお いては、普通飲料水と有意な差はみられなか った。それらの結果より、従来のクロレラ製 剤には認められなかったマウスの老化抑制作 用がJ005株を摂取することによって得られる� �とが解った。

老化促進マウスを用いたストレス 対応性テスト1
 オープンフィールドテストにおいては、尻� ��を捕まれて新しい環境に移動させられた瞬� ��に、マウスは最大の不安・恐怖を感じ、そ� ��後感情が安静してから新しい環境の探索を� ��始する。不安・恐怖の程度が低いと、マウ� ��の感情はすぐに安定するので、装置投入後� ��期から活発な移動を行うが、不安・恐怖が� ��い場合には、感情の安定に長時間を要する� ��めに、最大限に移動行動を行うようになる� ��での時間が長くなる。すなわち、移動量の� ��寡が、マウスの活動性や探索傾向の度合い� ��表すのに対して、移動量の時間経過による� ��化率は、マウスの不安・恐怖を示すと考え� ��れる(文献:マウス表現型解析プロトコール  秀潤社 および、Takahashi A, Kato K, Makino J,  Shiroishi T, Koide T. Multivariate analysis of tempor al descriptions of open-field behavior in wild-derived  mouse strains. Behav Genet. 2006 Sep;36(5):763-74.)� �そこで、マウスの不安・恐怖の程度を検証� �るために、実施例5の実験結果に基づいて、� ��ウス投入後0-5分間および15-20分間における� �動区画総数を計算し、以下の式で不安指数� �定義して検討したものを図9に示す。
 不安指数=(15-20分間の移動区画総数)í(0-5分� �の移動区画総数)

 普通飲料水を与えた群と比較して、J005株 成分を含む飲料水を与えた群では不安指数が 有意に低下していた。また従来クロレラ製剤 (従来製品A)成分を含む飲料水を与えていた群 では普通飲料水と比較してむしろ不安指数が 上昇するという結果が得られた。

老化促進マウスを用いたストレス 対応性テスト2
 マウスは新しい環境に置かれた場合、移動� ��動の減少とともに脱糞数が増加することが� ��られている。すなわち脱糞数が多い個体は� ��安度が高く環境への順応性に劣ると考えら� ��ている。そこで、普通飲料水、J005成分含有 飲料水、従来クロレラ製剤(従来製品A)成分含 有飲料水を飲ませた3群についてマウス投入� �20分間の脱糞数を数えて比較検証した結果を 図10に示す。

 普通飲料水を与えた群と比較して、J005株 を含む飲料水を与えた群では有意に脱糞数が 低下していた。また従来製品A成分を含む飲� �水を与えていた群では普通飲料水と比較し� �むしろ脱糞数が上昇するという結果が得ら� �た。

老化促進マウスを用いた痴呆抑制 に対する効果の検討
 普通飲料水、J005成分含有飲料水、従来クロ レラ製剤(従来製品A)成分含有飲料水を4ヶ月� �飲ませた老化促進マウスSamP8マウスについて 、以下に記載する装置とプロトコールを用い て、受動回避学習テストを行い、新規クロレ ラ株の痴呆に対する抑制効果について検討し た。結果を図11に示す。

 受動的回避学習とは、「ある行動を行わな� ��こと」によって嫌な刺激を回避する学習の� ��称である。その中でもっとも一般的なもの� ��ステップスルー式受動回避テストである。� ��のテストでは、明るい部屋と暗い部屋が小� ��な穴で連結した装置を用いる。
 マウスを明るい部屋に入れると、マウスは� ��能的に明室を嫌って暗室に逃げ込もうとす� ��。そこで電気刺激によるショックを与える� ��電気ショックを与えた10分後そして24時間後 に同じ実験を行うと、痛みを記憶しているマ ウスは暗い部屋に入ろうとしないが、忘れて しまったマウスは暗い部屋に入る。この実験 では明るい部屋にとどまる時間で学習・記憶 能力を評価する。本研究では、電気刺激装置 としてトキワサイエンス社製のCUY21を用いた� ��刺激は、電圧125V 電流0.01A 刺激時間100msec� �行い、また300秒を超えて暗室に入らなかっ� �場合はそこで実験終了とした(cut off time 300  sec)。

 電気刺激後10分においても24時間において も、J005株含有飲料水を与えられた群では、� �通飲料水あるいは従来クロレラ製剤(従来製� ��A)成分含有飲料水を与えられた群と比べて� �憶の持続時間が有意に延長していた。

クロレラ28S rRNA遺伝子配列の解析
 クロレラJ005株から、ISOPLANT(ニッポンジーン )を用いたベンジルクロライドによる抽出法� �よりゲノムDNAを調製した。次に、NCBI GeneBank に記載されているクロレラの28Sリボソーマル RNA遺伝子の配列(AB237692)に基づき、オリゴヌ� �レオチドプライマーS1 (5'-tcgacctgagctcaggcaag-3') 、および、プライマーAS1(5'-tggcccacttggagctctca-3' )プライマーS2 (5'-gctggagctcgtttcagtcg-3')、および 、プライマーAS2(5'-gctcgggtagaccaccgaca-3')合成し� �。これらのS1+AS1およびS2+AS2プライマーペア� �用い、上記のように、それぞれの藻体から� �製したゲノムDNA(約0.5μg)を鋳型として、Qiagen MasterMixPCR Kit(Qiagen 社製)を用いてPCR反応を行 った。PCR反応は、まず、95℃で15分間、次い� �94℃で1分間、50℃で1分間、さらに72℃で1分30 秒間保温した後、94℃で1分間、次いで50℃で1 分間、さらに72℃で1分間30秒を1サイクルとす る保温を30サイクル行なった。PCR産物をアガ� ��ースゲル電気泳動してエチジウムブロマイ� ��で染色した結果、いずれのサンプルにおい� ��もS1+AS1プライマーペアを用いた場合は約1100 bpのS2+AS2プライマーペアを用いた場合は約1000 bpのDNA断片が検出された。これらの断片を含� ��ゲル部分をそれぞれ切り出した後、QIAquick  Gel Extraction Kit(キアゲン)を用いゲル部分か� �DNAを回収した。回収されたDNA(約1.0 μg)をTA� �ローニング法によってpGEM-T Easy Vector (プロ メガ社製)に挿入した。大腸菌株HB101に形質導 入したのち大腸菌株をTB培地で増殖し、大腸� ��内のプラスミドDNAをQiagen Maxi EndoFree plasmid  purification Kitを用いて,回収した。回収した� ��ラスミドDNAをテンプレートとして,NCBI GeneBa nkに記載されているクロレラの28Sリボソーマ� ��RNA遺伝子の配列(AB237692)に基づきシーケンス 用のプライマーを6本合成した(Seq1-Seq6)を設計 した。Seq1(5'-gaacttaagcatatcaataa-3')、Seq2(5'-gaaagatg aaaagaactttg-3')、Seq3(5'-gtggcaaacccatgaagcgc-3')、Seq4(5 '-cgaatgattagaggctcagg-3')、Seq5(5'-gtgcgaggtccccatgagta-3' )、Seq6(5'-atcgaatcattcggagatag-3')。ABI PRISM DyeTermin ator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (パーキン エルマー・ジャパン)によってシークエンス� �ンプルを調製し、これをDNAシーケンサー PRI ZM310にかけて塩基配列を解析した。得られた2 8SリボソーマルRNA遺伝子の塩基配列を既報の� ��ロレラ属緑藻の28SリボソーマルRNA遺伝子の� ��基配列と比較した。

 28SリボソーマルRNA遺伝子の塩基配列を解� ��した結果、J005株は配列番号1に示す塩基配� �を有していた。

 [結論]
 実施例2ないし4から、本発明にかかるクロ� �ラ属J005株が、暗培養下においても非常に高� ��増殖力、クロロフィル生産力及び活性酸素� ��去能を示すことが分かった。また、実施例5 および8から、従来のクロレラ製剤と比較し� �、全身的老化のみならず脳の老化を顕著に� �制することが、実施例6および7から、ストレ ス対応性を向上させることが分かった。

[考察]
 上記実施例において、J005株成分を含有する 飲料水を摂取したSamP8マウス群では、普通飲� ��水あるいは従来製クロレラ製剤成分を含有� ��る飲料水を摂取したSamP8マウス群に比較し� �顕著に学習能力・記憶力が増強した(SamP8マ� �スは生後16週齢くらいから脳血管の障害を基 盤として脳組織の病理学的変性をきたし、そ の結果として、学習能力・記憶能力が顕著に 低下してくる)。さらにJ005株の成分は、精神� ��安定させ、環境ストレスから生体を防御す� ��効果も示した。
 この理由として、活性酸素消去能力が高い� ��ロレラに含まれる成分が、脳血管の障害抑� ��に働いたか、または神経細胞に直接あるい� ��神経膠細胞に働いて神経細胞の減少や変性� ��抑制し、その結果として、脳の神経細胞の� ��少や変性が抑えられて学習能力や記憶力の� ��持につながったことが考えられる。また、� ��神を安定させる効果につながったものと考� ��られる。
 したがって、活性酸素消去能が高いクロレ� ��を有効成分として含む組成物は、ヒトを含� ��哺乳動物の痴呆症あるいは認知症を予防ま� ��は軽減するため、脳・神経疾患、高度脳機� ��障害、記憶力・記銘力異常を予防、治療ま� ��は改善するため、ヒトを含む哺乳動物に対� ��るアンチエイジング効果を得るため、もし� ��は、ヒトを含む哺乳動物のストレスあるい� ��不安を緩和するための、医薬あるいは健康� ��品として有用であると考えられる。

寄託された生物材料 
(1)寄託機関の名称・あて名
 名称:独立行政法人産業技術総合研究所 特� ��生物寄託センター
 あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1  中央第6(郵便番号305-8566) 
(2)寄託された微生物
 クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)J005
  原寄託日:2006年12月11日
  国際寄託への移管請求日:2008年2月12日
  受託番号 FERM BP-10949     
  (原国内受託番号 FERM P-21127)