SONDES PYRENIQUES MIMANT LE CHOLESTEROL

L'invention concerne des sondes membranaires mimant les propriétés physiques du cholestérol, et l'utilisation de ces sondes au sein de membranes plasmiques naturelles afin de caractériser grâce à une réponse photophysique l'organisation collective des lipides de la membrane.

L'étude de l'organisation fonctionnelle des membranes biologiques est aujourd'hui une problématique d'un grand intérêt [I]. Les approches expérimentales proposant des avancées dans ce domaine sont basées sur des extractions sélectives à froid de sous-ensembles membranaires résistants à l'action de certains tensio-actifs [2] appelés « rafts ». Les résultats de ces expériences sont fort critiquables car les échantillons extraits pourraient correspondre à des regroupements réalisés lors de l'extraction de microdomaines membranaires insolubles appartenant peut-être à des membranes cellulaires différentes [3]. Ainsi, toute corrélation entre fonction et composition initiale des membranes est impossible et aucune organisation structurale des molécules ne peut être générée sans ambiguïté par ces approches biochimiques. La seule certitude qu'elles apportent est que les membranes forment des assemblages multi-moléculaires composites, ayant des propriétés physiques moyennes différentes, qui induisent des spécificités d'activation pour les systèmes protéiques membranaires qu'elles renferment. Ainsi, les membranes ne sont pas uniquement des barrières entre l'extérieur et l'intérieur des cellules, car grâce au polymorphisme des lipides et au rôle particulier des stérols, un regain d'intérêt s'y focalise avec l'introduction entre autre de la notion de « rafts » lipidiques [4] sous-ensembles de la membrane plasmique qui participent à la modulation des fonctions de signalisation réalisées par les protéines surfaciques cellulaires.

Sur membranes modèles, les propriétés des phases enrichies en cholestérol ou celles des phases riches en phospholipides constitués d'acides gras insaturés sont connues et documentées [5-8]. En quelques mots, les zones « rafts » seraient des zones lipidiques membranaires plus épaisses que les zones fluides de type liquide désordonnée notées Id ou la. Ces zones « rafts » correspondraient à des ^' zones de phases lipidiques « liquide ordonnée » notées lo, contraintes rotationnellement et

conformatiomellement, composées de forts pourcentages en cholestérol et lipides à chaînes grasses saturées, et ayant une mobilité translationnelle réduite d'un facteur 2 à 3 par rapport aux zones lipidiques la. Il est à noter que ces états d'organisation lipidiques de type la étaient jusqu'à ces dernières années reconnus comme les seuls pouvant exister parmi les différents types d'organisations lipidiques. Cette description statique des membranes doit être complétée par le fait que ces différentes zones membranaires « raft » et non « raft » ont leurs constituants en échange permanent. Cette dynamique translationnelle de la majorité des constituants membranaires est une des caractéristiques générales des membranes. L'ensemble de ces données fait qu'à ce jour, il n'existe pas de méthode permettant d'établir pour une membrane plasmique naturelle donnée, le taux de phase Io et la. Or, la connaissance de ces valeurs ou d'une grandeur qui leur serait proportionnelle renseignerait sur l'importance de ces « rafts » au sein d'une membrane : suivant le type cellulaire, ces « rafts » pourraient représenter de 20 à 60% de la surface totale d'une membrane plasmique ! [9]. De plus, il est admis que certaines fonctions se réalisent spécifiquement dans des zones « raft » et d'autres réciproquement dans des zones non « raft » [1, 4], alors que les protéines membranaires participant à ces fonctions sont retrouvées dans les deux types de zones [10]. Cette problématique sur l'organisation fonctionnelle des machineries plurimoléculaires assurant les fonctions essentielles à la vie de toute cellule a fait naître la notion de transducisome, c'est à dire des sous ensembles membranaires qui seraient des « plateaux techniques optimisés » où se réaliserait une fonction donnée. Leur bonne connaissance est un des enjeux majeurs de la biologie cellulaire moderne.

Enfin, pour compléter cette description biologique du transducisome, il faut ajouter les propriétés conformationnelles des protéines transmembranaires lors de la réalisation de leur fonction. Elles introduisent un lien logique avec les propriétés de phase des lipides énumérées précédemment. En effet, des changements conformationnels de ces protéines transmembranaires sont observés lors de la réalisation de leur fonction: Les travaux de Salamon et coll. sur la rhodopsine [11] ou sur le récepteur δ aux opioïdes [12], mettent en évidence qu'une protéine transmembranaire peut changer de 10% son épaisseur apparente lors de la liaison d'un agoniste et ne rien modifier à ce paramètre de structure lors de la liaison d'un antagoniste. Ce changement d'épaisseur pourrait être corrélé soit :

(i) à des variations par tri moléculaire de la distribution latérale des constituants membranaires [13, 14] et regrouper ainsi des constituants de la membrane d'une épaisseur adéquate avec celle de la protéine dans une conformation fonctionnelle donnée et ceci afin de minimiser un mésappariement hydrophobe entre protéine et lipides,

(ii) à l'induction d'une migration de cette protéine vers des zones plus épaisses

(« rafts ») après liaison de l'agoniste et de la protéine G (dans le cas des exemples de Salamon et al. [11, 12] ), car ce changement conformationnel lors de la signalisation cellulaire par ces RCPG (Récepteurs Couplés aux Protéines G) implique une augmentation de l'épaisseur de ces derniers [11,

12].

En relation avec cette problématique les inventeurs ont conduit dans le passé des études sur membranes naturelles sur le récepteur aux opioïdes hMOR et ont montré une modulation de sa fonctionnalité par les lipides (cholestérol) de la membrane plasmique quand il est exprimé dans des cellules eucaryotes

(Saccharomyces Cerevisiae SC [15] ou cellules d'Ovaires d'Hamster Chinois (CHO) [16] ). Ainsi l'induction par la composition membranaire d'un état « quasi auto constitutif » pour ce RCPG, capable de lier la protéine G sans la liaison de l'agoniste a été établi. Les inventeurs ont également utilisé une molécule commerciale dérivée du cholestérol: le l-pyrèneméthyl-3β -hydroxy-22, 23-bisnor-5-cholate (Py-CO2-Chol) et ont montré[17] que cette sonde incorporée par construction dans des liposomes est capable de rendre compte de la distribution latérale du cholestérol [16, 17]. De plus, il a également été montré que cette sonde est un révélateur sensible de l'état de phase moyen des membranes modèles dans lesquelles elle est insérée. Les extrêmes seraient une membrane où les lipides sont dans un état de phase de type la (membrane caractérisée par une faible épaisseur) d'une part ou une membrane dont l'état de phase des lipides est de type Io (membrane à forte épaisseur) d'autre part. Ainsi, par des mesures en fluorescence stationnaire du rapport des bandes 1 et 3 du spectre de fluorescence du monomère du fluorophore pyrène, il est possible de remonter à une caractérisation de l'état de phase moyen [16]. Cette propriété est caractéristique du pyrène non substitué [18]. Elle est perdue avec les phospholipides à pyrène [19] et retrouvée avec les composés de la famille Py-Chol.

Cependant, cette sonde commerciale, le Py-CO2-Chol, pose un problème de possibilité de marquage des membranes plasmiques naturelles. Sa faible solubilité dans les lipides membranaires comparée à celle du cholestérol (7% au lieu de 68% dans le DMPC) en est la cause. La liaison de jonction ester entre les groupements pyrène et cholestérol (de nature polaire) coupant les parties hydrophobes de ce composé, pourrait être responsable de ce fait [17]. L'invention apporte une solution à l'impossibilité d'effectuer ce type de mesures sur cellules vivantes avec des molécules fluorescentes commerciales mimant le cholestérol.

Par ailleurs, cette approche en fluorescence stationnaire de la compartimentation des membranes naturelles a été complétée par des mesures des paramètres caractéristiques de la dynamique des constituants membranaires: les expériences de SPT (Single Particle Tracking) [21-23] ou de FRAPrv (Fluorescence

Recovery after photobleaching at variable radius) [24, 25] ont prouvé l'existence de structurations dynamiques latérales de taille submicrométrique, et ceci in situ sur cellules. Ces deux approches dynamiques sont complémentaires (observations individuelles en SPT ou analyse d'un comportement collectif en FRAPrv). Ainsi : i) Par SPT les déplacements de récepteurs hMOR individuels, à la surface de cellules NRK, ont mis en évidence un mode de diffusion translationnelle de hMOR combinant un mode de diffusion confinée superposé à une marche aléatoire du confinement. [21-22]. ii) Une analyse statistique approfondie des résultats a permis de développer un modèle théorique explicatif des confinements observés et des interactions qui pourraient les générer [21-22]. Il introduit un nouveau type de confinement sans barrière, uniquement imposé par les interactions entre entités membranaires. iii) La notion de transducisome et de sa spécificité d'évolution ainsi que son importance surfacique sur un type de cellule ont été démontrées par FRAPrv sur de cellules HEK et pour la fonction des RCPG à la neurokine [25]. L'invention a principalement pour but de fournir des sondes moléculaires pouvant s'insérer efficacement dans les membranes biologiques des cellules in vivo, notamment par le biais de méthyl-β-cyclodextrines, et qui par leur réponse sont capables de rendre compte, des variations de distributions latérales moyennes des constituants membranaires.

A ce titre, les inventeurs sont parvenus à synthétiser de nouveaux composés mixtes à partir de cholestérol et de pyrène, ayant à la jonction entre le cholestérol et le pyrène un groupement cétone ou méthylénique, avec un bras de liaison de longueur variable.

De manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que non seulement les composés pyrène-cétone-cholestérol et pyrène-méthylénique-cholestérol sont d'excellents révélateurs de l'état de phase moyen des lipides, de par leurs propriétés de fluorescence, mais aussi que la propension de ces composés à une insertion dans les membranes naturelles est remarquable.

L'invention a principalement pour objet les composés ci-après dénommés pyrène-cholestérol, de formule générale (I) :

dans laquelle X représente un groupe CH ₂ ou un atome d'oxygène et n est un nombre entier de 2 à 10, notamment de 2 à 6.

L'invention concerne plus particulièrement un composé de formule générale (I) dénommé pyrène-cétone-cholestérol, de formule (4) suivante :

(4)

L'invention a plus particulièrement pour objet encore un composé de l'invention de formule générale (I) dénommé pyrène-méthylénique-cholestérol, de formule (7) suivante :

L'invention concerne également l'utilisation d'un composé pyrène-cholestérol de formule (I) défini précédemment, ou d'une combinaison de ces composés pyrène- cholestérol; pour l'étude de l'organisation fonctionnelle des membranes biologiques, et de ses changements sous l'effet de stimuli extérieurs, tels que la température, la pression, l'ajout d' agent extrinsèque modifiant la concentration d'un lipide contenu initialement dans lesdites membranes biologiques, ou l'ajout d'un produit déterminé.

Par « organisation fonctionnelle des membranes biologiques » pour une fonction biologique donnée, on entend les paramètres lipidiques caractéristiques de la structure de la membrane comme l'état de phase des lipides (liquide ordonné Io ou liquide désordonné Id) et/ou de distribution latérale des constituants de la membrane qui participent à l'optimisation de la fonction biologique donnée.

Des exemples connus d'agents extrinsèques susceptibles de moduler la concentration en un lipide donné des membranes biologiques, sont des composés de la famille des cyclodextrines qui déplètent spécifiquement les membranes en certains lipides ou d'autres agents lipophiles extrinsèques qui par insertion modulent la fluidité membranaire (rigidification ou fluidification).[26] L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée d'un composé pyrène-cholestérol de formule (I) dans le cadre de la mise en œuvre d'une méthode de détection, et, le cas échéant, de mesure de la polarité ou la perméabilité des membranes biologiques, de la concentration d'un ou de plusieurs constituants de ces membranes, et ainsi l'invention permet de rendre compte des changements de l'organisation spatiale et collective des constituants de ces membranes biologiques induits par ces facteurs extrinsèques.

Des exemples de constituants des membranes dont la présence peut être détectée ou la concentration mesurée selon l'invention sont le cholestérol ou des récepteurs membranaires couplés aux protéines G (RCPG) lors du déclanchement de leur signalisation par un ligand. Par « organisation spatiale et collective des constituants des membranes biologiques » on entend le type de phase lipidique moyen représentatif des états de phase de la membrane avant et après activation de RCPG par l'agent extrinsèque.

L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée d'un composé pyrène-cholestérol de formule (I) ci-dessus, dans le cadre de la mise en œuvre d'une méthode de détection, et, le cas échéant, de mesure photophysique des effets de produits déterminés sur les membranes biologiques, ladite méthode étant appliquée :

- au criblage de produits bioactifs susceptibles d'être des agonistes ou des antagonistes de récepteurs présents dans des membranes cellulaires ou à la surface de ces membranes, lesdits produits bioactifs étant susceptibles d'être utilisés pour la préparation de médicaments destinés au traitement de pathologies dans lesquelles interviennent lesdits récepteurs ;

- au diagnostic in vitro de pathologies à partir de cellules de patients à l'aide de produits déterminés utilisés en tant que marqueurs de ces pathologies, notamment de cellules susceptibles d'être sensibles à un produit déterminé utilisé en tant que marqueur, et dont l'effet sur ces cellules est caractéristique d'une pathologie,

- au contrôle de l'orientation de l'indication thérapeutique d'un médicament comprenant un produit bioactif tel que défini ci-dessus, par détermination in vitro de l'effet agoniste ou antagoniste de ce médicament sur les cellules du patient susceptibles d'être traité par ce médicament ; avantageusement, cette méthode de contrôle permet d'orienter le médecin vers un traitement personnalisé le plus adapté possible à un patient déterminé, avec un produit bioactif ainsi sélectionné. Des exemples de produits bioactifs susceptibles d'être criblés grâce à l'invention sont des ligands agonistes ou antagoniste de RCPG. Ces derniers étant préalablement surexprimés dans les membranes plasmiques des cellules biologiques.

Des exemples de pathologies contre lesquelles peuvent être préparés des médicaments à partir des produits bioactifs criblés selon l'invention sont toutes les

pathologies dont l'agent responsable est un récepteur membranaire de la famille des RCPG (60% des cibles pharmacologiques actuelles).

Selon un mode de réalisation préférée des utilisations susmentionnées d'un composé pyrène-cholestérol de formule (I) selon l'invention, les membranes biologiques sont choisies parmi le groupe constitué de vésicules, de liposomes unilamellaires, de liposomes multilamellaires, de bicouches ou de multicouches lipidiques supportées, de membranes cellulaires extraites ou de membranes cellulaires de cellules vivantes.

Par « multicouches lipidiques supportées » on entend des membranes modèles correspondant à la superposition de une, deux ou plusieurs bicouches lipidiques et qui sont des modèles membranaires performants pour les études et mesures photophysiques.

Avantageusement, les membranes cellulaires susmentionnées sont celles des cellules eucaryotes suivantes : CHO (cellule d'ovaire d'hamster chinois), HEK (cellule endothéliale humaine de rein), NRK (cellule endothéliale de rein de rat) AEB (cellule endothéliale aortique bovine), AEH (cellule endothéliale .aortique humaine), SHY5Y (neuroblastome), 3T3, cultures primaires de neurones, de fibrobastes, ou issues d'autres organes ou tissus.

L'invention a également pour objet un procédé pour l'étude de l'organisation fonctionnelle des membranes biologiques, et la mise en œuvre d'une méthode de détection, et, le cas échéant, de mesure des effets de stimuli extérieurs, tels que la température, la pression, la modulation par un agent extrinsèque de la concentration en un lipide contenu initialement dans lesdites membranes biologiques, ou l'ajout d'un produit déterminé influençant l'organisation desdites membranes biologiques, caractérisé en ce qu'il comprend :

- une étape d'incorporation d'un composé de formule (I) défini ci-dessus, ou d'une association de plusieurs de ces composés, dans lesdites membranes biologiques,

- le cas échéant l'application de stimuli extérieurs tels que définis ci-dessus, sur lesdites membranes, étape sautée pour les mesures de référence, . - l'application sur lesdites membranes biologiques d'un rayonnement de longueur d'onde λ _ex caractéristique de l'absorption du pyrène, λ _ex étant compris entre 330 irai et 350 nm,

- la mesure de l'intensité du rayonnement de fluorescence émis par lesdites membranes biologiques à la longueur d'onde d'émission de 375 à 385 nm,

caractéristique de la bande d'émission 1 du pyrène, cette intensité étant fonction de la polarité de la membrane,

- la mesure de l'intensité d'au moins un des deux rayonnements de fluorescence émis par lesdites membranes biologique entre 390 nm et 425 nm, caractéristiques des bandes d'émission 3 et 4 du pyrène, cette intensité étant fonction de la quantité de pyrène, et donc de composés selon l'une des revendications 1 à 3, dans lesdites membranes,

- la détermination du rapport entre l'intensité de la bande 1 et celle de la bande 3 et/ou 4, à savoir des rapports I ₁ ZI ₃ et/ou I ₁ ZI ₄ , - la corrélation entre le rapport mesuré lors de l'étape précédente, et le niveau de polarité desdites membranes qui est fonction de leur épaisseur, donnant ainsi une indication sur le type d'organisation fonctionnelle moyenne de ces membranes et de son évolution sous l'effet d'un stimuli extérieur.

Avantageusement, le procédé susmentionné est appliqué au criblage de produits bioactifs susceptibles d'être des agonistes ou des antagonistes de récepteurs présents dans des membranes cellulaires ou partiellement insérés dans ces membranes, lesdits produits bioactifs étant susceptibles d'être utilisés pour la préparation de médicaments destinés au traitement de pathologies dans lesquelles interviennent lesdits récepteurs, ledit procédé comprenant : - une étape d'incorporation d'un composé de formule (I) défini ci-dessus, ou d'une association de plusieurs de ces composés, dans lesdites membranes biologiques,

- la mise en présence desdites membranes avec un produit bioactif, ou une banque de produits bioactifs, dans des conditions permettant la. liaison de ces produits avec les récepteurs membranaires, - le cas échéant, une étape de rinçage desdites membranes pour éliminer tout produit bioactif qui ne se serait pas susceptible de se lier avec un récepteur membranaire,

- l'application sur lesdites membranes biologiques d'un rayonnement de longueur d'onde λ _ex caractéristique de l'absorption du pyrène, λ _ex étant compris entre 330 nm et 350 nm,

- la mesure de l'intensité des bandes 1, 3, etZou 4, et la détermination des rapports I ₁ ZI ₃ etZou I ₁ ZI ₄ ,

- la comparaison des rapports I ₁ ZI ₃ etZou I ₁ ZI ₄ , obtenus à l'étape précédente avec les rapports F ₁ ZT ₃ etZou F ₁ ZT ₄ , mesurés en l'absence de produits biόactifs, ce qui

permet de déterminer la nature agoniste ou antagoniste ou antagoniste inverse du ou des produits bioactifs testés, un produit agoniste étant caractérisé par un rapport Ij/I ₃ et/ou I ₁ ZI ₄ respectivement supérieur ou inférieur au rapport F ₁ ZF ₃ et/ou F ₁ ZF ₄ suivant le type desdits récepteurs, un produit antagoniste étant caractérisé par un rapport I ₁ ZI ₃ etZou I ₁ ZI ₄ équivalent respectivement au rapport I' ₁ /1 ^* ₃ et/ou I' ₁ /1 ^* ₄ , un produit antagoniste inverse étant caractérisé par un rapport I ₁ ZI ₃ etZou I ₁ ZI ₄ respectivement inférieur ou supérieur au rapport T ₁ ZI^ et/ou F ₁ ZF ₄ soit un effet inverse à celui d'un produit agoniste.

L'invention concerne plus particulièrement un procédé tel que défini ci-dessus caractérisé en ce qu'il est effectué in vitro sur des cellules eucaryotes, et comprend une étape d'incorporation d'un composé de formule (I) de l'invention, ou d'une association de plusieurs de ces composés, dans les membranes de ces cellules.

Avantageusement, dans les procédés susmentionnés de l'invention, l'étape d'incorporation dans lesdites membranes d'un composé de l'invention, ou de l'association de plusieurs de ces composés, s'effectue au moyen d'un transporteur destiné à échanger le cholestérol, un phospholipide, naturellement présents dans lesdites membranes, avec ledit composé pyrène-cholestérol ou ladite combinaison.

De manière préférée, les procédés définis ci-dessus sont caractérisés ^" en ce que le transporteur est une méthyl-β-cyclodextrine, ou une α-, β-, γ-cyclodextrine. L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé tel que défini ci- dessus, caractérisé en ce que la proportion de composé de formule (I) de l'invention, ou de l'association de plusieurs de ces composés, incorporée dans lesdites membranes représente environ 0,1 à 2 % de la concentration surfacique des lipides présents dans la membrane biologique. L'invention a également pour objet une composition caractérisée en ce qu'elle comprend un composé de formule (I) de l'invention, ou une association de plusieurs de ces composés, en mélange avec un transporteur destiné à échanger le cholestérol ou un phospholipide, naturellement présents dans lesdites membranes avec ledit composé pyrène-cholestérol ou ladite combinaison. De manière préférée, cette composition est caractérisée en ce que le transporteur est une méthyl-β-cyclodextrine, ou une α-, β-, γ-cyclodextrine.

L'invention a également pour objet l'utilisation de la composition définie ci- dessus dans l'étape d'incorporation d'un composé de l'invention, ou d'une association

de plusieurs de ces composés, dans lesdites membranes biologiques, lors de la mise en œuvre d'un procédé tel que défini ci-dessus.

L'invention a également pour objet un procédé de synthèse des composés définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la réaction de la prégnènolone de formule (a) et du dérivé du pyrène de formule (b) dans laquelle n est un nombre entier de 2 à 10, notamment de 2 à 6, en présence de EtOK, EtOH, dans CH ₂ Cl ₂ à une température comprise entre 5°C et 20 ⁰ C et pendant une durée comprise entre 10 et 72 heures, ce qui conduit à l'obtention du composé de formule (1) suivant :

b) la réaction du composé de formule (1) obtenu à l'étape précédente en présence de 1,5 équivalents de Ac ₂ O, de 10 mol % de DMAP, de 1 équivalent de Et ₃ N, dans CH ₂ Cl ₂ pendant 3 heures, ce qui conduit à l'obtention du composé de formule (2) suivant :

c) la réaction du composé de formule (2) obtenu à l'étape précédente en présence de 2 équivalents de TiCl _4, de 1,5 équivalents de Et ₃ SiH, dans CH ₂ Cl ₂ pendant 45 minutes à température ambiante, ce qui conduit à l'obtention du composé de formule (3) suivant :

d) la réaction du composé de formule (3) obtenu à l'étape précédente en présence de MeONa, CH ₂ Cl ₂ pendant 4 heures à température ambiante, conduit au composé de formule (4) suivant :

e) le cas échéant, la réaction du composé de formule (4) obtenu à l'étape précédente en présence de TBDMSCl, d'imidazole, dans GH ₂ Cl ₂ pendant 12 , heures à température ambiante, ce qui conduit à l'obtention du composé de formule (5) suivant:

f) la réaction du composé de formule (5) obtenu à l'étape précédente en présence de 2 équivalents de CH ₂ =PPh ₃ , dans un mélange THF/DMSO, pendant 12 heures à 75°C, ce qui conduit à l'obtention du composé de formule (6) suivant :

g) la réaction du composé de formule (6) obtenu à l'étape précédente en présence de 5 équivalents de TBAF, dans le THF, pendant 12 heures à 65°C, au composé de formule (7) suivant :

Description des figures

La figure 1 représente le marquage des membranes de cellules SH-SY5Y in vivo au moyen de méthyl-β-cyclodextrines chargées en sonde pyrène-cétone- cholestérol. L'insertion peut se faire à plus de 40 % et est fonction du temps de marquage.

La figure 2 représente les spectres de fluorescence réalisés sur cellules SH- SY5Y immobilisées sur support solide (lamelle de silice) après incorporation dans la membrane plasmique, à l'aide de méthyl-β-cyclodextrine, de la sonde pyrène-cétone- cholestérol de formule (4). En trait fin continu noir, les cellules non transfectées par le RCPG μ aux opïoides (hMOP) ; en trait épais pointillé noir, les cellules transfectées par ce dernier ; en trait épais continu gris, l'échantillon précédent sur lequel l'agoniste DAMGO a été ajouté en conditions saturantes.

PARTIE EXPERIMENTALE

Tous les produits chimiques commerciaux sont utilisés tels que reçus. Toutes les réactions sont effectuées sous argon en utilisant la technique standard de Schlenk.

Les données de RMN proton et carbone 13 sont obtenues avec un dispositif Bruker Avance 300. Les spectrogrammes de masse sont obtenus avec un appareil NERMAG R10-10 en conditions d'ionisation chimique avec de l'ammoniac ou du méthane. Les spectres infrarouges sont obtenus sur un spectrophotomètre FTIR Perkin Elmer de série 1600 sous forme de pastilles de KBr et sont indiqués en cm ^"1 . Les points de fusion ne sont pas corrigés.

Synthèse de la (21E)-3β-hydroxy-prégna-5,21-diène-22-(l-pyrényI)-20-one (composé 1)

A une solution de 1-pyrènecarboxaldéhyde (3,2 g, 14 mmol) et de prégnènolone (4 g, 12,64 mmol) dans 30 mL de CH ₂ Cl ₂ sec, on ajoute 15 mL d'éthanol sec puis 25 mL d'une solution d'éthanolate de potassium à 24 % en masse dans de l'éthanol, et la solution est agitée pendant 72 h h +5°C. On ajoute 200 mL d'eau et on extrait les produits organiques avec du CH ₂ Cl ₂ (3 x 100 mL). Les extraits organiques combinés sont rincés avec de la saumure, séchés sur du sulfate de sodium, filtrés et évaporés. La purification par chromatographie flash sur silice G60 (0,040-

0,063 mm), l'élution avec de l'acétate d'éthyle dans du CH ₂ Cl ₂ (2/98) puis avec de l'acétate d'éthyle dans du CH ₂ Cl ₂ (15/85) donnent 6,12g (91%) de composé 1 sous forme d'un solide jaune brillant ; mp: 153°C; TLC (CH ₂ Cl ₂ /Ac0Et 15:85) i?/ 0.5; IR (KBr, cm ^'1 ) 3300m, 2932s, 1676m, 1590s, 1436w, 137Ow, 1352w, 1315w, 1234w, 1192w, 1102m, 1052m, 973w, 848s, 709w; ¹ H RMN (CDCl ₃ ) δ 0.59 (s, 3H), 0.87 (s,

3H), 0.70-2.38 (m, 22H), 2.73 (t, J= 8.7 Hz, IH), 3.42 (sept, J= 4.8 Hz, IH) 3.55 (t, J = 9 Hz, 2H), 5.24 (d, J= 4.8 Hz, IH), 6.87 (d, J = 15.6 Hz, IH), 7.87-8.17 (m, 8H), 8.36 (d, J= 9.3 Hz, IH), 8.58 (d, J= 15.6 Hz, IH), ¹³ C RMN (CDCl ₃ ) δ 200.2, 140.8, 138.0, 132.7, 131.3, 130.7, 130.2, 128.7, 128.6, 128.5, 127.3, 126.3, 126.0, 125.8, 125.0, 124.9, 124.6, 124.0, 122.5, 121.4, 71.7, 62.5, 57.1, 53.5, 50.0, 45.1, 42.3, 39.2,

37.3, 36.5, 32.0, 31.8, 31.6, 24.7, 22.8, 21.1, 19.4, 13.5; MS (CI, NH ₃ ) m/z 529 (100, [M + H] ⁺ ).

Synthèse de la (21E)-3β-acétoxy-prégna-5,21-diène-22-(l-pyrényl)-20-on e (composé 2).

A une solution du composé 1 (1,3 g, 2,46 mmol) dans 20 mL de CH ₂ Cl ₂ , on ajoute successivement de l'anhydride acétique (1 mL, 5,28 mmol), de la A- (diméthylamino)pyridine (30 mg, 246 μmol) et de la triéthylamine (343 μL, 2,46 mmol). La solution obtenue est agitée pendant 3h à température ambiante, puis on ajoute de l'eau (150 mL) et on extrait les produits organiques avec du CH ₂ Cl ₂ (3 x 80 mL). Les extraits combinés sont séchés sur du sulfate de sodium, concentrés sous pression réduite et donnent après chromatographie sur colonne (CH ₂ Cl ₂ / AcOEt 98/2) 1,16 g (83%) de composé 2 sous forme de solide jaune ; mp 99°C; TLC

(AcOEt/CH ₂ Cl ₂ 2:98) R _f 0.9; IR (KBr, cm ^"1 ) 2938s, 1728s, 1676w, 1590s, 1371m, 1242s, 1102m, 1126m, 845s; ¹ H RMN (CDCl ₃ ) δ 0.58 (s, 3H), 0.87 (s, 3H), 1.95 (s, 3H), 0.70-2.36 (m, 21H), 2.71 (t, J = 9 Hz, IH) ₅ 4.52 (m, IH), 5.24 (d, J = 4.8 Hz, IH), 6.85 (d, J= 15.6 Hz, IH), 7.87-8.17 (m, 8H), 8.36 (d, J= 9.6 Hz, IH), 8.56 (d, J = 15.9 Hz, IH); ¹³ C RMN (CDCl ₃ ) δ 200.1, 170.6, 139.6, 137.9, 132.7, 131.3, 130.7,

130.2, 128.7, 128.6, 128.5, 127.3, 126.3, 126.0, 125.8, 125.0, 124.9, 124.6, 124.0, 122.5, 122.4, 73.9, 62.4, 57.0, 49.9, 45.0, 39.1, 38.1, 37.0, 36.6, 31.9, 31.8, 27.8, 24.7, 22.8, 21.5, 21.1, 19.3, 13.5 (seules 39 des 40 résonances attendues sont observées); MS (CI, NH ₃ ) m/z 571 (100, [M + E] ⁺ ). Synthèse de Ia 3β-acétoxy-prégn-5-ène-21-(l-méthyIpyrényl)-20-one

(composé 3)

A une solution glacée du composé 2 (1 g, 1,75 mmol) dans 20 mL de CH ₂ Cl ₂ on ajoute 4,2 mL d'une solution à IM de TiCl ₄ dans du CH ₂ Cl ₂ et on agite la solution brun sombre qui en résulte pendant 10 min. On ajoute de l'Et ₃ SiH (419 μL, 2,63 mmol) d'un seul coup et on chauffe la solution à température ambiante et on l'agite pendant 45 min. La solution est versée dans une solution saturée de NaHCO ₃ et les produits organiques sont extraits avec du CH ₂ Cl ₂ (3 x 80 mL Les extraits combinés sont séchés sur du sulfate de sodium, concentrés sous pression réduite et donnent après chromatographie sur colonne (CH ₂ Cl ₂ ZAcOEt 98:2) 601 mg (60%) du composé 3 sous forme d'un solide jaune pâle ; mp 91°C ; TLC (CH ₂ Cl ₂ /AcOEt 98:2) R _f 0.9; IR (KBr, cm ^"1 ) 2938s, 2902s, 1729s, 1701s, 1456w, 1436w, 1362m, 1246s, 1095w, 1031m, 906w, 845m, 731m; ¹ H RMN (CDCl ₃ ) δ 0.49 (s, 3H), 0.86 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 0.6- 2.4 (m, 20H), 2.77 (t, J= 8.1 Hz, 2H), 3.51 (t, J= 7.5 Hz, 2H), 4.49 (m, IH), 5.23 (d, J

= 4.2 Hz, IH), 7.76-8.14 (m, 9H); ¹³ C RMN (CDCl ₃ ) δ 210.5, 170.5, 139.6, 135.6, 131.4, 130.9, 130.0, 128.5, 127.6, 127.5, 127.3, 126.7, 125.9, 125.1, 125.0, 124.9, 124.8, 123.0, 122.3, 73.8, 63.1, 56.7, 49.7, 46.1, 44.2, 38.8, 38.1, 36.9, 36.5, 31.7, 31.6, 27.7, 27.4, 24.5, 23.0, 21.4, 20.9, 19.2, 13.4 (on observe seulement 39 des 40 résonances attendues); MS (CI, NH ₃ ) m/z 590 (100, [M + NH ₄ ] ⁺ ), 573 (98, [M + H] ⁺ ).

Synthèse de la 3β-hydroxy-prégn-5-ène-21-(l-méthylpyrényl)~20-one (composé 4).

A une solution du composé 3 (600 mg, 1 mmol) dans 10 mL de CH ₂ Cl ₂ on ajoute successivement 5 mL de méthanol sec et 5 mL d'une solution à 30 % en masse de méthanolate de sodium dans du méthanol et on agite la solution pendant 4 h à température ambiante. On ajoute 200 mL d'eau et les produits organiques sont extraits avec du CH ₂ Cl ₂ (3 x 100 mL). Les extraits organiques combinés sont rincés avec de la saumure, séchés sur du sulfate de sodium, filtrés, et évaporés. La purification par chromatographie flash sur silice G60 (0.040-0.063 mm), Pélution avec du CH ₂ Cl ₂ dans de l'AcOEt (85/15) donnent 302 mg (95%) de composé 4 sous forme d'un solide blanc cassé ; mp 199 ⁰ C; TLC (CH ₂ Cl ₂ /Ac0Et 85:15) Bf 0.5; IR (KBr, cm ^"1 ) 3428m, 2930s, 1700s, 1458w, 1436w, 1357w, 1108w, 1054m, 845s, 755s; ¹ H RMN (CDCl ₃ ) δ 0.55 (s, 3H), 0.89 (s, 3H), 0.70-2.24 (m, 19H), 2.40 (t, J- 9 Hz, IH), 2.84 (t, J= 6 Hz, 2H), 3.42 (m, IH) 3.55 (t, J= 9 Hz, 2H), 5.24 (d, J= 4.8 Hz, IH), 7.80-8.18 (m, 9H); ¹³ C RMN (CDCl ₃ ) δ 210.5, 140.7, 135.7, 131.4, 130.9, 130.0, 128.5, 127.6, 127.5,

127.3, 126.8, 125.9, 125.1, 125.0, 124.9, 124.8, 123.0, 121.4, 71.7, 63.2, 56.9, 49.9, 46.1, 44.3, 42.2, 38.9, 37.2, 36.5, 31.8, 31.7, 31.6, 27.4, 24.5, 23.0, 21.0, 19.3, 13.5 (on observe seulement 37 des 38 résonances attendues); MS (CI, NH ₃ ) m/z 548 (100, [M + NH ₄ ] ^"1" ), 531 (17, [M + H] ⁺ ). Synthèse de la 3β-tert-butyldiméthylsilyloxy-prégn-5-ène-21-(l- méthylpyrényl)-20-one (composé 5).

A une solution de composé 4 (200 mg, 377 μmol) et d'imidazole (51 mg, 754 mmol) dans 5 mL de CH ₂ Cl ₂ on ajoute au moyen d'une seringue une solution de chlorure de tert-butyldiméthylsilyle (68 mg, 452 mmol) dans 2 mL of CH ₂ Cl ₂ . Après 12h d'agitation à température ambiante, on ajoute 50 mL d'eau et on extrait les produits organiques avec du dichlorométhane (3 x 50 mL). Les extraits organiques combinés sont rincés avec de la saumure, séchés sur du sulfate de sodium, filtrés, et évaporés. La purification par chromatographie flash sur silice G60 (0.040-0.063 mm),

l'élution avec du dichlorométhane donnent 231 mg (95%) de composé 5 sous forme d'un solide blanc cassé ; mp 100 ⁰ C; TLC (CH ₂ Cl ₂ ) R _f 0.9; IR (KBr, cm ^"1 ) 2929s, 2852s, 1703s, 1461m, 1381m, 1359m, 1250m, 1183w, 1091s, 843s, 773m; ¹ H RMN (CDCl ₃ ) δ 0.00 (s, 6H), 0.47 (s, 3H), 0.60-2.22 (m, 32H), 2.72 (t, J= 7.5 Hz, 2H), 3.39 (m, IH) 3.49 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 5.17 (d, J = 3.9 Hz, IH), 7.73-8.12 (m, 9H); ¹³ C

RMN (CDCl ₃ ) δ 210.4, 141.4, 135.7, 131.4, 130.9, 130.0, 128.5, 127.6, 127.5, 127.3,

126.8, 125.9, 125.1, 125.0, 124.9, 124.8, 123.1, 120.9, 72.6, 63.0, 56.7, 49.9, 46.0, 44.2, 42.8, 38.8, 37.3, 36.5, 32.1, 31.8, 31.7, 27.4, 26.2, 26.0, 25.8, 24.5, 23.0, 21.0, 19.4, 18.3, 13.4, -4.5 (on observe seulement 42 des 44 résonances attendues); MS (CI, CH ₄ ) m/z 645 (100, [M + H] ⁺ ).

Synthèse du 3β-ter^butyldiméthyIsiIyloxy-prégn-5-ène-21-(l- méthylpyrényl)-20-méthylidène (composé 6).

On ajoute 48 mg de NaH (2 mmol) à 3 mL de DMSO sec et la suspension est agitée et chauffée à 65°C jusqu'à ce que tout l'hydrure de sodium soit dissout. La solution est refroidie à température ambiante et on ajoute de bromure de méthyl- triphénylphosphonium (715 mg, 2 mmol) par portions pendant 5 min. La réaction est légèrement exothermique et on agite la solution pendant une durée supplémentaire de 45 min. On ajoute cette solution d'un seul coup à une solution de composé 5 (645 mg, 1 mmol) dans 5 mL de THF et la solution résultante est agitée et chauffée à 7O ⁰ C pendant 12h. Après refroidissement, on ajoute 50 mL d'eau et on extrait les produits organiques avec du dichlorométhane (3 x 50 mL). Les extraits organiques combinés sont rincés avec de la saumure, séchés sur du sulfate de sodium, filtrés, et évaporés. La purification par chromatographie flash sur silice G60 (0.040-0.063 mm), l'élution avec du pentane dans du CH ₂ Cl ₂ (75/25) donnent 514 mg (80%) de composé 6 sous forme d'un solide blanc cassé ; mp 63°C; TLC (pentane/CH ₂ Cl ₂ 75:25) £/0.85; IR (KBr, cm ^{" ι} ) 2928s, 2851s, 1636w, 1460m, 1434m, 1380w, 1249m, 1088s, 888m, 842s, 773m; ¹ H RMN (CDCl ₃ ) δ 0.00 (s, 6H), 0.54 (s, 3H), 0.83 (s, 9H), 0.91 (s, 3H), 0.75-2.30 (m, 32H), 2.47 (m, 2H), 3.40 (m, 3H), 4.85 (s, IH), 5.01 (s, IH), 5.24 (d, J= 6.0 Hz, IH), 7.77-8.20 (m, 9H); ¹³ C RMN (CDCl ₃ ) δ 149.1, 141.6, 136.8, 133.9, 133.6, 131.5, 131.0, 129.8, 128.7, 128.6, 128.5, 128.4, 127.6, 127.3, 127.2, 126.6, 125.6, 125.1,

124.9, 124.7, 123.4, 121.1, 110.1, 72.7, 56.7, 56.3, 50.3, 43.3, 42.9, 39.9, 38.8, 37.4, 36.7, 32.9, 32.3, 32.1, 31.9, 26.0, 24.3, 21.2, 19.5, 18.3, 12.9, -4.5 (on observe

seulement 44 des 45 résonances attendues); MS (CI, NH ₃ ) m/z 660 (10, [M + NH ₄ J ⁺ ), 511 (100).

Synthèse du 3β-hydroxy-prégn-5-ène-21-(l-méthylpyrényl)-20- méthylidène (composé 7). On ajoute 2,5 mL de TBAF (IM) dans du THF à une solution de composé 6

(300 mg, 466 μmol) dans 5 mL de THF sec et on agite la solution et on la chauffe à 65 ⁰ C pendant 12h. Après refroidissement, on ajoute 100 mL d'eau et on extrait les produits organiques avec du dichlorométhane (3 x 50 mL). Les extraits organiques combinés sont rincés avec de la saumure, séchés sur du sulfate de sodium, filtrés, et évaporés. La purification par chromatographie flash sur silice G60 (0.040-0.063 mm), l'élution avec du CH ₂ Cl ₂ dans de l'AcOEt (98/2) donnent 209 mg (85%) de composé 7 sous forme d'un solide blanc cassé ; mp 84 ⁰ C; TLC (CH ₂ Cl ₂ /Ac0Et 98:2) R _f 0.4; IR (KBr, cm ^"1 ) 3364m, 2929s, 1636w, 1458w, 1434w, 1375w, 1182w, 1056m, 888m, 843s, 712w; ¹ H RMN (CDCl ₃ ) δ 0.52 (s, 3H), 0.65-2.25 (m, 32H), 2.3-2.6 (m, H), 3.27-3.44 (m, H), 4.83 (s, IH), 4.99 (s, IH), 5.24 (d, J = 4.5 Hz, IH), 7.75-8.18 (m,

9H); ¹³ C RMN (CDCl ₃ ) δ 149.1, 140.8, 136.8, 131.5, 130.9, 129.8, 128.6, 127.5, 127.3, 127.2, 126.6, 125.8, 125.1, 124.9, 124.7, 123.4, 121.6, 110.1, 71.8, 56.6, 56.3, 50.2, 43.2, 42.3, 39.9, 38.8, 37.3, 36.6, 32.9, 32.3, 31.8, 31.7, 29.7, 26.0, 24.3, 21.1, 19.4, 12.9 (on observe seulement 38 des 39 résonances attendues); MS (CI, NH ₃ ) m/z 546 (38, [M + NHU] ⁺ ), 529 (89, [M + H] ⁺ ), 217 (100).

Chargement des méthyl-β-cyclodextrines par le Pyrène cholestérol (4) ou (7).

A 3ml d'une solution aqueuse de méthyl-β-cyclodextrines à 75mM portée à une température de 75°C, on ajoute progressivement 20μl d'une solution saturée de Pyrène cholestérol (4) ou (7) dissout à saturation dans la DMF (~187,5mM soit lmg/lOμl de DMF) . Laisser agiter 30mn à 75°C puis laisser refroidir. La solution est filtrée sur filtre à 0,22μm et peut être conservée à 4°C plusieurs jours. Elle correspond à 1 Pyrène cholestérol (4) ou (7) pour 60 molécules de méthyl-β-cyclodextrines. Marquage des cellules Des cellules à confluence immobilisées sur lamelle de silice de 22 par 22mm sont placées dans une boîte de pétri de 35mm de diamètre et recouvertes par 1,2 ml d'une solution filtrée à 0.22μm et composée par 15ml de milieu de base (DMEM à 1% de veau fœtal) plus ImI de solution de méthyl-β-cyclodextrines chargées en Pyrène

cholestérol (4) ou (7). L'ensemble est laissé incuber à 37°C entre 1 et 15mn suivant le taux de marquage désiré. Puis le milieu est remplacé à 4 fois par 1,2 ml de PBS Ca-H- Mg++.

Les mesures sont faites soit sur ces préparation ou après avoir remplacé le PBS par DMEM.

Les images sont réalisées sur un microscope axioplanll, de Zeiss grâce à un objectif à immersion d'huile de 63 (Plan-Neofluoar, NA=I, 4) et une caméra CCD (C2400-75i ,Hamamatsu) équipée du système Argus 20 (Hamamatsu) qui soustrait le bruit de fond en directe sur la préparation correspondant au montage suivant : après avoir retourné la lamelle portant les cellules marquées sur une lame munie d' entretoises une chambre dont le volume est voisin de 120μl est ainsi réalisée et remplie de milieu DMEM. Les deux extrémités du montage sont scellées par collage sur les entretoises, les deux autres côtés restent ouverts pour permettre l'introduction d'additif extrinsèques : ligands etc. Les spectres de fluorescence sont réalisés sur ces montages sur un spectrofluorimètre AMESfCO 500. La longueur d'onde d'excitation est 335nm bp 5nm, le spectre d'émission étant enregistré après 370nm bp 4nm et avec une résolution de 0,25 nm par point.

Résultat des mesures des spectres de fluorescence sur neuroblastome SH- SY5Y surexprimant ou n'exprimant pas hMOP et avec ou sans pyrène-cétone- cholestérόl de formule (4)(figure 2)

Par comparaison des spectres en pointillé noir et continu firis qui correspondent au même tapis cellulaire de cellules SH-SY5Y surexprimant. hMOP, on remarque qu'après ajout de l'agoniste DAMGO, alors que les spectres au niveau des bandes 13 et 14 sont inchanfiés, au contraire les bandes II ont des intensités différentes. Ceci indique, à cause de la diminution du spectre représenté en gris, une diminution de la polarité membranaire après ajout de DAMGO. Elle correspond à une augmentation de la quantité de phase Io (c'est à dire une augmentation de l'épaisseur moyenne membranaire ^' ) induite par le récepteur à la suite d'ajout du DAMGO.

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