MATRIZ CROMATOGRÁFICA, MÉTODO E SEUS USOS

Domínio técnico

A presente divulgação diz respeito ao desenvolvimento de uma nova fase estacionária para a separação de ácidos nucleicos [ácido ribonucleico ácido desoxirribonucleico genómico (ADNg), de preferência em que a fração de ARN compreende ARN de baixo peso molecular (ARNbp) e ARN ribossomais (ARNr)] no contexto de cromatografia preparativa, utilizando uma matriz cromatográfica, de preferência uma matriz macroporosa, em particular uma matriz de um polímero metacrílico epoxilado, modificada com 1-metilimidazol, após ligação do 3-cloropropiltrimetoxisilano como braço espaçador. Como resultado do processo de imobilização, forma-se o líquido iónico (LI) cloreto de 1-metilimidazólio que atua como ligando multimodal. Em particular, o LI cloreto de 1-metilimidazólio apresenta na sua estrutura um anel aromático que pode estabelecer interações hidrofóbicas, e, adicionalmente, apresenta também um centro de carga positiva com o contra-ião cloreto permitindo troca aniónica com espécies carregadas negativamente. Desta forma, o LI cloreto de 1-metilimidazólio é definido como um ligando multimodal. A caracterização da matriz cromatográfica por Ressonância Magnética Nuclear (RMN) no estado sólido com aquisição de um espectro de ¹³ C através de polarização cruzada com rotação no ângulo mágico (CPMAS) e análise elementar, bem como a determinação do ponto de carga zero (PCZ), comprovou a correta funcionalização da fase estacionária com o LI. No que diz respeito ao seu comportamento cromatográfico, a separação do ARNbp e do ADNg, ou a separação do ARNbp, ARNr e ADNg, presentes num lisado bacteriano foi atingida com sucesso em condições que promovem predominantemente interações eletrostáticas, apresentando esta matriz uma elevada capacidade dinâmica de ligação, robustez, especificidade e reprodutibilidade. De uma forma geral, esta nova matriz cromatográfica apresenta uma vasta aplicabilidade, não só para a obtenção de ARN para fins terapêuticos, como também de diagnóstico, ou para aplicações em biologia molecular.

Estado da arte

[0001] Os nucleótidos apresentam características biológicas e químicas peculiares, desempenhando desta forma papéis importantes em áreas distintas da bioquímica, biologia, e medicina. Ao longo de várias décadas, pensou-se que o ARN atuava como um simples intermediário entre o ADN e as proteínas, não tendo por isso despertado grande interesse por parte dos investigadores. No entanto, este cenário tem-se vindo a reverter uma vez que a intensificação da investigação nas funções do ARN levou a que este fosse reconhecido como regulador de um vasto conjunto de processos biológicos, tornando-o atualmente um importante alvo tanto em investigação fundamental, como aplicada [1]. Por outro lado, o ARN começa a assumir também um papel importante na indústria (bio)farmacêutica, dado o elevado potencial que estes apresentam como biofármacos para o tratamento de diversas doenças humanas [1].

[0002] Atualmente, os estudos conduzidos no sentido de determinar a estrutura e função do ARN, ou o estabelecimento de terapias baseadas em ARN requerem, geralmente, elevadas quantidades do ARN alvo com integridade, pureza e atividade biológica [2]. De facto, independentemente do método utilizado para a preparação do ARN e da sua aplicação final, geralmente é necessário utilizar métodos de separação do ARN, tendo em vista a remoção dos contaminantes. Em particular, para a produção de ARN com potencial aplicação farmacêutica, este tem que ser obtido segundo boas práticas de fabrico (GMP), sendo necessário que o método de separação permita que o ARN cumpra os requisitos exigidos pelas agências reguladoras, nomeadamente, a Food and Drug Administration (FDA), a Agência Europeia do Medicamento (EMA), e a Organização Mundial de Saúde (WHO) [1]. Os métodos mais utilizados para a purificação de ARN incluem eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante, e diferentes estratégias cromatográficas tais como cromatografia líquida de alta resolução de emparelhamento de iões, de fase reversa, ou de exclusão molecular [2]. De uma forma geral, estes métodos apresentam diversas desvantagens, nomeadamente, são métodos relativamente dispendiosos, muito laboriosos, o ARN é recuperado com níveis de pureza distantes dos desejados e parcialmente desnaturado devido às condições experimentais utilizadas [1, 2]. A cromatografia de afinidade com aminoácidos imobilizados como ligandos, incluindo arginina histidina, tem permitido ultrapassar alguns destes obstáculos [2]. Idealmente, o suporte cromatográfico mais adequado para a separação e purificação de ARN deverá apresentar diversas características, nomeadamente, elevada seletividade, especificidade e capacidade de ligação, elevada estabilidade mecânica e química, e estar acessível a um baixo custo [2]. As matrizes para cromatografia preparativa de ácidos nucleicos têm sido desenvolvidas através da imobilização de ligandos em diversos suportes incluindo agarose, dextrano, metacrilatos, poliestireno, sílica, entre outros [1]. Estas encontram-se disponíveis comercialmente numa forma pré-empacotada ou são empacotadas no laboratório em colunas de vidro ou de polipropileno pelos próprios investigadores. Por outro lado, foram também recentemente reportadas estratégias cromatográficas baseadas em monolitos para a separação de ARN.

[0003] O estado da arte na purificação de ARN para as mais diversas aplicações engloba, como descrito, a utilização de matrizes cromatográficas, que podem ser regeneradas e utilizadas repetidas vezes, virtualmente para amostras obtidas via transcrição in vitro, síntese química, ou produzidas recombinantemente. Paralelamente, e recorrendo ao empacotamento de colunas descartáveis de cromatografia de troca aniónica, encontram-se também disponíveis comercialmente diversos kits para o isolamento de ADN genómico a partir de bactérias, nomeadamente: "Bacterial genomic miniprep kit ^® " (Sigma-aldrich, St Louis, MO, Estados Unidos da América), "PureLink ^® Microbiome DNA Purification kit" (ThermoFischer Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos da América), "Wizard ^® Genomic DNA Purification Kit" (Promega, Madison, Estados Unidos da América), "Genomic-tip 20/G ^® " (Qiagen, Hilden, Alemanha), "Quick-DNA™ Microprep Plus Kit ^® " (Zymo Research, Irvine, Estados Unidos da América), entre outros. Por outro lado, existem também kits comerciais para o isolamento de ARN total a partir de bactérias: "Total RNA bactéria Purification kit ^® " (Sigma-aldrich, St Louis, MO, Estados Unidos da América), "PureLink ^® RNA Mini kit" (ThermoFischer Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos da América), "SV Total RNA Isolation System ^® " (Promega, Madison, Estados Unidos da América), "RNeasy ^® Mini Kit" (Qiagen, Hilden, Alemanha), "Quick-RNA ^® Fungal/Bacterial RNA Microprep" (Zymo Research, Irvine, Estados Unidos da América), entre outros. No entanto, pelo menos o "Quick-RNA ^® Fungal/Bacterial RNA Microprep" (Zymo Research, Irvine, Estados Unidos da América) não permite a separação do ARN ribossomal de outros ARN bacterianos.

[0004] A tendência no desenvolvimento de novas estratégias de separação do ARN tem sido a implementação e/ou desenvolvimento de novos ligandos cromatográficos mais seletivos, robustos e reprodutíveis [1]. Desta forma, surgem os Lis, sais que se apresentam no estado líquido a temperaturas baixas - inferiores a 100 °C -, que são exclusivamente compostos por iões, especificamente catiões orgânicos grandes e assimétricos, combinados com aniões orgânicos ou inorgânicos [3, 4]. Em geral, estes compostos não são inflamáveis, e apresentam uma volatilidade negligenciável, o que os torna uma excelente alternativa aos solventes orgânicos convencionais, permitindo diminuir a pegada ambiental e o custo de diferentes processos. Além disso, apresentam elevada estabilidade química, térmica e eletroquímica, o que reforça a ideia de que estes compostos são geralmente considerados seguros e benignos para o ambiente [4].

[0005] Os Lis são geralmente descritos como designer solvents, visto que devido ao número de combinações possíveis dos seus iões, as suas propriedades podem ser otimizadas e ajustadas, permitindo a síntese de compostos que se adequam a diferentes aplicações específicas [3]. De facto, estes têm sido utilizados para a dissolução de uma vasta variedade de materiais, para substituir solventes tóxicos e voláteis [4]. As diversas características benéficas dos Lis levaram a que estes fossem também aplicados em processos cromatográficos, visando melhorar, virtualmente, qualquer separação.

[0006] Especificamente, os Lis podem ser utilizados em cromatografia líquida de formas distintas [4], nomeadamente: como aditivos em fases móveis, como ligandos em fases estacionárias, ou atuando eles próprios como fases estacionárias em cromatografia.

[0007] Em particular, têm sido utilizados diferentes padrões de imobilização para o desenvolvimento de fases estacionárias contendo Lis, nomeadamente: imobilização ou co-imobilização do LI através dos seus catiões ou aniões [5]. Estas fases estacionárias têm sido predominantemente obtidas através de matrizes cromatográficas compostas por sílica, ou monolitos, nas quais os Lis são imobilizados.

[0008] U ma característica comum aos trabalhos previamente reportados é que estes foram aplicados no domínio da cromatografia analítica, isto é, tinham por base a separação e/ou quantificação dos diferentes analitos. Por outro lado, não existe qualquer documento que reporte a utilização de fases estacionárias com Lis imobilizados como ligandos para a separação de diferentes classes de ácidos nucleicos, provenientes do mesmo extrato bacteriano.

[0009] Até ao momento, foram patenteados diferentes métodos envolvendo Lis para a síntese de polinucleótidos [US20050106685], solubilização e preservação de ácidos nucleicos [EP1736542 Al], para aumentar a sensibilidade e eficiência da amplificação de ácidos nucleicos a partir de materiais biológicos [US9598726 B2], ou para a purificação de ácidos nucleicos [US8101744 B2]. A invenção [US8101744 B2] compreende o isolamento e purificação de ácidos nucleicos (ADN de sémen de arenque, ADN do timo de vitela, ou ARN isolado a partir de leveduras de fermento de padeiro) envolvendo a adsorção do ácido nucleico a um suporte sólido (composto por sílica gel, fibras de vidro, fibras de quartzo, e celite, ou substratos minerais do grupo que compreende óxidos de metais, ou óxidos de metais mistos como a alumina, titânia, ou zircónia) na presença de uma solução aquosa de um LI, em que este facilita a ligação do ácido nucleico ao suporte sólido.

Sumário

[0010] É objetivo da presente divulgação apresentar uma nova matriz cromatográfica baseada na funcionalização de um novo suporte macroporoso com o LI cloreto de 1-metilimidazólio (MP- SilPrMImCI), utilizando como braço espaçador o 3-cloropropiltrimetoxisilano, tendo em vista a sua aplicação no domínio da cromatografia preparativa, isto é, na separação de ARNbp de ADNg, ou na separação ARNbp, ARNr e ADNg, com elevada eficiência, especificidade, robustez e seletividade.

A preparação da matriz cromatográfica MP-SilPrMImCI englobou duas etapas principais, de acordo com a Fig. 1: 1) Funcionalização da matriz cromatográfica, de preferência uma matriz macroporosa, em particular uma matriz de um polímero metacrílico epoxilado, obtida comercialmente (Toyopearl ^® AF- Epoxy-650M, Tosoh Biosciences, GmbH, Greisheim, Alemanha) com 3-cloropropiltrimetoxisilano (MP- SilPrCI), seguida da 2) Funcionalização da matriz cromatográfica, de preferência uma matriz macroporosa, em particular uma matriz de um polímero metacrílico epoxilado funcionalizada com 3- cloropropiltrimetoxisilano obtida em 1), com 1-metilimidazol, levando à formação do LI cloreto de 1- metilimidazólio que atua como ligando cromatográfico multimodal, obtendo-se desta forma a matriz cromatográfica utilizada para os ensaios cromatográficos de separação - (MP-SilPrMImCI). Ambas as reações descritas nas etapas 1) e 2) foram conduzidas em refluxo num solvente inerte - tolueno -, durante 24 h, tendo sido utilizada a trietilamina como catalisador. A matriz preparada foi amplamente caracterizada por um conjunto de técnicas complementares, nomeadamente: - por ¹³ C CPMAS, análise elementar, e determinação do PCZ, para confirmar a funcionalização com o LI; - e por Microscopia Eletrónica de Varrimento, para avaliar o impacto quer da funcionalização, quer da etapa de regeneração na morfologia da matriz sintetizada. Sempre que se justificou e a título comparativo, para além da matriz MP-SilPrMImCI, também se caracterizaram as matrizes macroporosa comercial (MP), e MP- SilPrMImCI após vários ciclos de regeneração com soluções aquosas de hidróxido de sódio (NaOH) e ácido clorídrico (HCI). Foram conduzidos estudos preliminares para avaliar o comportamento cromatográfico da matriz MP-SilPrMImCI descrita nesta divulgação, no que diz respeito à sua capacidade para ligar uma amostra de ARN, de preferência uma amostra de ARNbp, obtida por extração de uma cultura bacteriana pelo método de tiocianato de guanidina/fenol/clorofórmio. A injeção e ligação da amostra de ARN, de preferência uma amostra de ARNbp, em condições de elevada concentração de sulfato de amónio [(NH ₄ ) ₂ S0 ₄ ] foi realizada no sentido de explorar predominantemente interações hidrofóbicas. Após a aplicação de um gradiente por passos com uma concentração decrescente de (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ verificou-se que as espécies de ARN não eluíram no momento em que se procedeu à diminuição da força iónica da fase móvel; no entanto, o acoplamento de um segundo passo de eluição com o aumento da força iónica recorrendo a cloreto de sódio (NaCI) levou a que as espécies de ARN eluíssem. Este comportamento é típico de uma matriz multimodal em que se estabelecem diferentes tipos de interações entre o ligando e a biomolécula alvo. Por outro lado, e usando uma abordagem diferente, a matriz cromatográfica apresentou igualmente capacidade para ligar o ARN, de preferência ARNbp, em condições que favorecem principalmente interações eletrostáticas, isto é, com ligação em condições de baixa força iónica e eluição através do aumento da concentração de NaCI. Comprovou-se também que a matriz preparada apresenta elevada seletividade, dada a capacidade para separar ARN de ADN, de preferência para separar ARNbp de ADNg, utilizando um gradiente por passos com uma concentração crescente de NaCI. De acordo com esta estratégia cromatográfica, o ARN, de preferência ARNbp, é obtido no pico 1 que corresponde ao passo de ligação, tratando-se por isso de um processo de cromatografia negativa que apresenta duas vantagens primordiais: 1) a utilização de uma concentração mais baixa de sal, que além de diminuir a pegada ambiental do processo cromatográfico, também contribui para a diminuição do efeito negativo que o sal apresenta na manutenção da estabilidade e integridade do ARN, 2) a diminuição do tempo de residência da amostra no sistema cromatográfico, o que também contribui para a manutenção da estabilidade desta biomolécula. Além da separação de ARNbp e ADNg, a matriz MP-SilPrMImCI também apresentou a seletividade necessária para separar ARNbp, ARNr e ADNg em condições que favorecem interações eletrostáticas, confirmando assim sua elevada seletividade na separação de ácidos nucleicos de lisados bacterianos mais complexos. [0011] De uma forma geral, a matriz MP-SilPrMImCI descrita nesta divulgação demonstrou elevada versatilidade, podendo o LI cloreto de 1-metilimidazólio atuar como ligando multimodal num processo cromatográfico de separação de ácidos nucleicos que se caracteriza pela elevada eficiência, especificidade, robustez, e elevada capacidade dinâmica de ligação.

[0012] A presente divulgação diz respeito a uma matriz cromatográfica que compreende:

um suporte sólido poroso,

um espaçador ligado covalentemente ao suporte sólido poroso,

um ligando multimodal ligado covalentemente ao espaçador, e

em que o ligando multimodal é capaz de ligar um ácido nucleico.

[0013] Numa forma de realização, a densidade de ligando multimodal, em particular a densidade do ligando multimodal imobilizado, no suporte sólido poroso pode variar entre 0,01 e 2 mmol de ligando multimodal/g de suporte sólido poroso, de preferência entre 0,5 e 1 mmol de ligando multimodal/g de suporte sólido poroso, ainda de maior preferência 0,726 mmol de ligando multimodal por g de suporte sólido poroso.

[0014] Numa forma de realização, a razão molar ligando multimodahespaçador pode ser de 1:1.

[0015] Numa forma de realização, o ligando multimodal é um líquido iónico, por exemplo, um líquido iónico selecionado de uma família de catiões imidazólios, catiões pirídinios, catiões piperídinios, catiões amónios quaternários ou catiões fosfónios quaternários, de preferência combinados com aniões orgânicos e inorgânicos.

[0016] Numa forma de realização, o líquido iónico pode ser selecionado de uma família de catiões imidazólio combinados com um anião inorgânico, de preferência e para obter melhores resultados o líquido iónico é o cloreto de 1-metilimidazólio.

[0017] Numa forma de realização, o espaçador pode ser selecionado do seguinte grupo: (3- cloropropil)trimetoxisilano, (3-cloropropil)trietoxisilano, (3-aminopropil)trimetoxisilano, (3- mercaptopropil)trimetoxisilano, (N,N-dimetilaminopropil)trimetoxisilano ou [3-(2- aminoetilamino)propil]trimetoxisilano, de preferência o espaçador é (3-cloropropil)trimetoxisilano.

[0018] Numa forma de realização e para obter melhores resultados o espaçador pode ser (3- cloropropil)trimetoxisilano e o líquido iónico pode ser cloreto de 1-metilimidazólio.

[0019] Numa forma de realização, o suporte sólido poroso pode ser um polímero, de preferência um polímero funcionalizado com grupos epóxi, ainda de mais preferência um polímero de meta acrilato funcionalizado com grupos epóxi, sendo que o referido polímero pode ter um tamanho de partícula entre 40 e 90 miti, e um tamanho médio de poro de 1000 Á, sendo que estes tamanhos são determinados por técnicas que são familiares ao perito na área, como por exemplo por microscopia eletrónica de varrimento.

[0020] Numa forma de realização, o ácido nucleico pode ser o ácido nucleico pode ser ARN e/ou ADN genómico, de preferência em que o ARN pode compreender ARN de baixo peso molecular e/ou ARN ribossomal.

[0021] A presente divulgação também diz respeito a um kit para separação ou diagnóstico de ácidos nucleicos em que o referido kit compreende a matriz cromatográfica agora divulgada.

[0022] A presente divulgação diz ainda respeito a um método para isolar ácidos nucleicos de uma amostra em que o método compreende os seguintes passos:

contactar a amostra com a matriz cromatográfica aqui descrita;

eluir separadamente os ácidos nucleicos da amostra.

[0023] Numa forma de realização, a amostra pode ser uma amostra de um lisado bacteriano que pode compreender ARN e ADN genómico, de preferência em que o ARN pode compreender ARN de baixo peso molecular e/ou ARN ribossomal.

[0024] Numa forma de realização, o passo de eluir separadamente os ácidos nucleicos pode compreender eluir separadamente ARN de baixo peso molecular e ADN genómico, de preferência em que o passo de eluir separadamente os ácidos nucleicos compreende eluir separadamente ARN de baixo peso molecular e/ou ARN ribossomal e/ou ADN genómico.

[0025] Numa forma de realização, o passo de eluir separadamente os ácidos nucleicos da amostra pode ser realizado com aumento da força iónica usando um tampão com Tris-HCI 10 mM pH=8 e NaCI 1M e seguindo um gradiente por passos.

[0026] Numa forma de realização, o passo de eluir separadamente os ácidos nucleicos da amostra pode compreender eluir o ARN de baixo peso molecular com Tris-HCI 10 mM pH=8 e NaCI 0,3 M - 0,4 M de NaCI, de preferência 0,38 M de NaCI.

[0027] Numa forma de realização, o passo de eluir separadamente os ácidos nucleicos da amostra pode compreender em eluir o ADN genómico com Tris-HCI 10 mM pH=8 e NaCI 0,5 M - 1M de NaCI, de preferência 1M de NaCI.

[0028] Numa forma de realização, o passo de eluir separadamente os ácidos nucleicos da amostra pode ser realizado com diminuição da concentração de 2M de (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ em Tris-HCI lOmM, pH 8, seguindo um gradiente por passos.

[0029] Numa forma de realização, a amostra pode ser uma amostra de um lisado bacteriano que pode compreender ARN de baixo peso molecular, ADN genómico e ARN ribossomal. [0030] Numa forma de realização, o passo de eluir separadamente os ácidos nucleicos pode compreender eluir separadamente ARN de baixo peso molecular, ADN genómico e ARN ribossomal.

[0031] Numa forma de realização, o passo de eluir separadamente os ácidos nucleicos da amostra pode ser realizado com aumento da força iónica usando um tampão com Tris-HCI 10 mM pH=8 e NaCI 1M e seguindo um gradiente por passos.

[0032] Numa forma de realização, o passo de eluir separadamente os ácidos nucleicos da amostra pode compreender eluir o ARN de baixo peso molecular com Tris-HCI 10 mM pH=8 e NaCI 0,3 M - 0,39 M de NaCI, de preferência 0,38 M de NaCI.

[0033] Numa forma de realização, o passo de eluir separadamente os ácidos nucleicos da amostra pode compreender em eluir o ADN genómico com Tris-HCI 10 mM pH=8 e NaCI 0,4 M - 0.45 M de NaCI, de preferência 0.41 M de NaCI.

[0034] Numa forma de realização, o passo de eluir separadamente os ácidos nucleicos da amostra pode compreender em eluir o ARN ribossomal com Tris-HCI 10 mM pH=8 e NaCI 0,46 M - 1 M de NaCI, de preferência 0.5 M de NaCI.

[0035] A presente divulgação também diz respeito a um método para preparar a matriz cromatográfica aqui descrita, sendo que o referido método compreendeo os seguintes passos:

ligar covalentemente um espaçador a um suporte sólido poroso;

ligar covalentemente um ligando multimodal ao espaçador do passo anterior.

[0036] Numa forma de realização do método para preparar a matriz cromatográfica aqui descrita, o líquido iónico pode ser selecionado de uma família de catiões imidazólios, catiões pirídinios, catiões piperídinios, catiões amónios quaternários ou catiões fosfónios quaternários, de preferência combinados com aniões orgânicos e inorgânicos, de preferência o liquido iónico é selecionado de uma família de catiões imidazólio combinados com um anião inorgânico, em particular o líquido iónico é cloreto de 1-metilimidazólio.

[0037] Numa forma de realização do método para preparar a matriz cromatográfica aqui descrita, o espaçador pode ser selecionado do seguinte grupo: (3-cloropropil)trimetoxisilano, (3- cloropropil)trietoxisilano, (3-aminopropil)trimetoxisilano, (3-mercaptopropil)trimetoxisilano, (N,N- dimetilaminopropil)trimetoxisilano ou [3-(2-aminoetilamino)propil]trimetoxisilano, em particular o espaçador é (3-cloropropil)trimetoxisilano.

[0038] Numa forma de realização do método para preparar a matriz cromatográfica aqui descrita, o espaçador é (3-cloropropil)trimetoxisilano e o líquido iónico é cloreto de 1-metilimidazólio. [0039] Numa forma de realização do método para preparar a matriz cromatográfica aqui descrita, o suporte poroso sólido é um polímero , de preferência um polímero funcionalizado com grupos epóxi, ainda de mais preferência um polímero de meta acrilato funcionalizado com grupos epóxi em que o polímero metacrílico epoxilado tem um tamanho de partícula entre 40 e 90 miti, e um tamanho médio de poro de 1000 Á.

[0040] Esta divulgação diz ainda respeito ao uso da matriz cromatográfica aqui num processo cromatográfico para isolar e/ou purificar e/ou separar ácidos nucleicos, de preferência para separar ARN do ADN genómico, ainda de maior preferência ARNbp, ARNr e ADNg.

Descrição das Figuras

[0041] Para uma mais fácil compreensão da divulgação juntam-se em anexo as figuras, as quais, representam realizações preferenciais da divulgação que, contudo, não pretendem limitar o objeto da mesma.

[0042] Fig. 1: Procedimento geral para a funcionalização da matriz cromatográfica, de preferência uma matriz macroporosa, em particular matriz de um polímero metacrílico epoxilado (Toyopearl ^® AF-Epoxy- 650M, Tosoh Biosciences, GmbH, Greisheim, Alemanha) com o líquido iónico cloreto de 1- metilimidazólio.

[0043] Fig. 2: Espectro de RMN CPMAS de ¹³ C da matriz cromatográfica de preferência uma matriz macroporosa, não funcionalizada (MP), e da matriz cromatográfica de preferência uma matriz macroporosa, funcionalizada com o líquido iónico cloreto de 1-metilimidazólio (MP-SilPrMImCI), em que qualquer uma das matrizes macroporosas é uma matriz de um polímero metacrílico epoxilado.

[0044] Fig. 3: Registo do PCZ das suspensões da matriz cromatográfica não funcionalizada (MP) de preferência uma matriz macroporosa não funcionalizada, e da matriz cromatográfica funcionalizada, de preferência uma matriz macroporosa funcionalizada, com o líquido iónico cloreto de 1-metilimidazólio (MP-SilPrMImCI) a diferentes valores de pH, em que qualquer uma das matrizes macroporosas é uma matriz de um polímero metacrílico epoxilado.

[0045] Fig. 4: Análise elementar da matriz macroporosa não funcionalizada (MP), da matriz macroporosa funcionalizada com o líquido iónico cloreto de 1-metilimidazólio (MP-SilPrMImCI), e da mesma matriz após 5 ciclos de regeneração com soluções aquosas de hidróxido de sódio e ácido clorídrico, respetivamente.

[0046] Fig. 5: Imagens de microscopia eletrónica de varrimento: A) Matriz macroporosa (MP) de preferência uma matriz cromatográfica não funcionalizada; B) Matriz macroporosa funcionalizada, de preferência uma matriz cromatográfica funcionalizada com o líquido iónico cloreto de 1-metilimidazólio (MP-SNPrMlmCI). As imagens foram recolhidas com duas ampliações distintas, 250 e 2000 x, em que qualquer uma das matrizes macroporosas é uma matriz de um polímero metacrílico epoxilado.

[0047] Fig. 6: Perfis cromatográficos da retenção de uma amostra de ARN de baixo peso molecular nas matrizes cromatográficas macroporosas, funcionalizada (MP-SilPrMImCI) e não funcionalizada (MP) com o líquido iónico cloreto de 1-metilimidazólio, em que qualquer uma das matrizes macroporosas é uma matriz de um polímero metacrílico epoxilado. A) Eluição foi realizada a lmL/min através de um gradiente por passos através do aumento da concentração de cloreto de sódio de 0 (10 mM Tris-HCI, pH 8) para 1M, em Tris-HCI 10 mM a pH 8, de acordo com o representado na linha a vermelho. B) Eluição foi realizada a lmL/min através de um gradiente por passos com uma concentração decrescente de sulfato de amónio (2M) para 0 M, isto é, Tris-HCI 10 mM, pH 8. Efetuou-se um segundo passo de eluição através do aumento da concentração de cloreto de sódio para 1M, em Tris-HCI lOmM a pH 8, de acordo com o representado na linha a vermelho. A amostra de ARN de baixo peso molecular de Escherichia coli foi obtida por extração com o método de fenol-clorofórmio, tendo-se injetado em cada ensaio 40 microgramas de ARN de baixo peso molecular.

[0048] Fig. 7: A) Perfil cromatográfico da separação de ADN genómico e ARN de baixo peso molecular com a matriz cromatográfica funcionalizada, de preferência matriz macroporosa funcionalizada, com o líquido iónico cloreto de 1-metilimidazólio (MP-SilPrMImCI). A eluição foi realizada a lmL/min através de um gradiente por passos com uma concentração crescente de cloreto de sódio, em Tris-HCI lOmM a pH 8, de acordo com o representado na linha a tracejado. A amostra de lisado contendo ADN genómico e ARN de baixo peso molecular de Escherichia coli foi obtida recorrendo ao método tiocianato de guanidina, tendo-se injetado em cada ensaio 40 microgramas de amostra. B) Representação esquemática da eletroforese em gel de agarose com análise das frações recolhidas da matriz cromatográfica MP-SilPrMImCI, de preferência matriz macroporosa MP-SilPrMImCI. M - Marcador de pesos moleculares de ácidos nucleicos; S - Amostra de lisado injetada na matriz cromatográfica, de preferência matriz macroporosa; 1 - Primeiro pico cromatográfico recolhido, que representa o ARN de baixo peso molecular; 2 - Segundo pico cromatográfico recolhido, que representa o ADN genómico.

[0049] Fig. 8: A) Perfil cromatográfico da separação de ARNbp, ARNr e ADNg com a matriz cromatográfica, de preferência matriz macroporosa, funcionalizada com líquido iónico cloreto de 1- metilimidazólio líquido iónico (MP-SilPrMImCI). Eluição efetuada a 1 mL/min por um aumento na concentração de cloreto de sódio, em 10 mM Tris-HCI pH 8, como representado na linha tracejada. A amostra de lisado de Escherichia coli compreendendo ARNbp, ARNr e ADNg foi preparada recorrendo ao método de tiocianato de guanidina, tendo sido injetados 40 microgramas de ácidos nucleicos. B) Representação esquemática de uma eletroforese em gel de agarose com a análise das frações coletadas da matriz macroporosa MP-SilPrMImCI em que M representa o marcador de peso molecular de ácidos nucleicos; S representa a amostra do lisado injetada na matriz macroporosa/cromatográfica; 1 representa o primeiro pico cromatográfico a ser recolhido, e que corresponde ao ARNbp; 2 representa o segundo pico cromatográfico a ser recolhido, e que corresponde ao ADNg; 3 representa o terceiro pico cromatográfico a ser recolhido, e que corresponde ao ARNr.

[0050] Fig. 9: Avaliação da reprodutibilidade da matriz macroporosa funcionalizada com o líquido iónico cloreto de 1-metilimidazólio (MP-SilPrMImCI), de preferência matriz cromatográfica funcionalizada com o líquido iónico cloreto de 1-metilimidazólio (MP-SilPrMImCI). A) Procedimento geral realizado para avaliação da reprodutibilidade que englobou a repetição de dez ensaios cromatográficos, intercalados com passos de regeneração com soluções aquosas de hidróxido de sódio e ácido clorídrico. B) Perfis cromatográficos dos dez ensaios realizados, encontrando-se representados por cores diferentes. A eluição foi realizada a lmL/min através de um gradiente por passos com uma concentração crescente de cloreto de sódio, em Tris-HCI lOmM a pH 8, de acordo com o representado na linha a tracejado. A amostra de lisado contendo ADN genómico e ARN de baixo peso molecularde Escherichia coli foi obtida por extração recorrendo ao método de tiocianato de guanidina, tendo-se injetado em cada ensaio 40 microgramas de amostra. C) Representação esquemática da eletroforese em gel de agarose com as frações recolhidas da matriz macroporosa, de preferência cromatográfica, MP- SilPrMImCI nos ensaios um, quatro, sete, e dez. S - Amostra de lisado injetada na matriz macroporosa, de preferência cromatográfica; 1 - Primeiro pico cromatográfico recolhido; 2 - Segundo pico cromatográfico recolhido.

[0051] Fig. 10: Determinação da capacidade dinâmica de ligação (mg/mL matriz) da matriz macroporosa, de preferência cromatográfica, funcionalizada com o líquido iónico cloreto de 1- metilimidazólio (MP-SilPrMImCI) para diferentes biomoléculas, nomeadamente, a proteína albumina sérica bovina, ADN plasmídeo pcDNA3 flag p53 (Addgene, Cambridge, Estados Unidos da América) e ARN de baixo peso molecular. Os ensaios de capacidade foram realizados a um caudal de lmL/min, com soluções de albumina sérica bovina a 2mg/mL, ADN plasmídico p53 a 50pg/mL, e ARN de baixo peso molecular a 50pg/mL A albumina sérica bovina foi adquirida comercialmente, o ADN plasmídico p53 foi obtido através de um kit comercial, e a amostra de ARN de baixo peso molecular foi obtida após extração com o método de tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio.

Descrição geral

A presente divulgação engloba a preparação de uma nova matriz cromatográfica multimodal com o LI cloreto de 1-metilimidazólio, obtida por imobilização de 1-metilimidazol numa fase estacionária macroporosa e utilizando como braço espaçador o 3-cloropropiltrimetoxisilano, bem como a sua aplicação na separação de ARN de baixo peso molecular de ADN genómico ou na separação do ARNbp, ARNr e ADNg. A estrutura do LI, nomeadamente com a presença de diferentes grupos funcionais, permite que se estabeleçam múltiplas interações com as biomoléculas, podendo ser favorecidas interações hidrofóbicas ou eletrostáticas, mediante as condições de operação. A sua preparação envolve a imobilização do 3-cloropropiltrimetoxisilano numa matriz macroporosa, em particular uma matriz de um polímero metacrílico epoxilado, seguido da reação com 1-metilimidazol de forma a obter a matriz funcionalizada com o LI cloreto de 1-metilimidazólio. A separação de ARN de baixo peso molecular do ARN ribossomal do ADN genómico foi realizada em condições que promovem maioritariamente interações eletrostáticas, envolvendo a injeção da amostra com NaCI 0,38M (em Tris-HCI 10 mM, pH 8), seguida da eluição com NaCI 1M (em Tris-HCI 10 mM, pH 8) através de um gradiente por passos, um passo com 0.41 M NaCI e outro passo com 0.5 M NaCI sendo o ARN de baixo peso molecular, o ADN genómico e o ARN ribossomal recuperados com elevada pureza nos picos 1, 2 e 3, respetivamente. Esta matriz apresentou elevada robustez e reprodutibilidade, bem como uma elevada capacidade dinâmica de ligação para diferentes biomoléculas, assumindo especial relevância na preparação de ARN para fins terapêuticos, de diagnóstico ou para aplicações gerais em biologia molecular.

[0052] A presente divulgação distancia-se de todos os trabalhos reportados até ao momento, apresentando desta forma um caráter inovador não só devido à matriz cromatográfica preparada, como à aplicação a que se destina, nomeadamente: 1) o LI cloreto de 1-metilimidazólio foi utilizado como ligando multimodal imobilizado numa matriz macroporosa comercial, em particular uma matriz de um polímero metacrílico epoxilado; 2) a matriz macroporosa, de preferência a matriz cromatográfica, em particular a matriz polimérica de metacrílico epoxilado, funcionalizada com cloreto de 1-metilimidazólio foi utilizada para a separação de ácidos nucleicos provenientes de um extrato bacteriano, num contexto de cromatografia preparativa; 3) utilizou-se como braço espaçador o 3-cloropropiltrimetoxisilano.

[0053] A presente divulgação diz respeito à preparação de uma nova matriz cromatográfica utilizando o LI cloreto de 1-metilimidazólio como ligando multimodal, bem como à sua aplicação no contexto de cromatografia preparativa, nomeadamente, na separação de ácidos nucleicos provenientes de um lisado bacteriano. A preparação da matriz MP-SilPrMImCI englobou duas etapas principais: 1) Ligação covalente do braço espaçador 3-cloropropiltrimetoxisilano (Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, Geel, Bélgica) à matriz macroporosa comercial Toyopearl ^® AF-Epoxy-650M (Tosoh Biosciences GmbH, Greisheim, Alemanha), obtendo-se desta forma a matriz MP-SilPrCI; 2) Reação da matriz MP-SilPrCI com 1-metilimidazol (Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, Geel, Bélgica) para formar o ligando multimodal cloreto de 1-metilimidazólio à superfície da matriz MP. O processo de síntese da matriz encontra-se descrito na Fig. 1, bem como todos os detalhes experimentais em que as reações foram conduzidas. A caracterização da matriz cromatográfica MP-SilPrMImCI foi realizada recorrendo a diferentes técnicas com o intuito de confirmar que o LI se encontrava imobilizado, ou se o processo de funcionalização induziu alterações em diferentes parâmetros morfológicos da matriz. Para tal, empregaram-se as seguintes técnicas: ¹³ C CPMAS, análise elementar, determinação do PCZ e microscopia eletrónica de varrimento (SEM). Os resultados obtidos demonstram que o LI foi corretamente imobilizado na matriz preparada. No entanto, e apesar de não se terem detetado alterações significativas na morfologia das esferas da matriz funcionalizada em comparação com a matriz macroporosa comercial, em particular uma matriz de um polímero metacrílico epoxilado, verificou-se que a matriz funcionalizada apresentava algumas esferas deformadas, o que se deve aos dois processos de síntese, filtração e secagem. A regeneração da matriz cromatográfica é um procedimento geralmente utilizado em cromatografia preparativa para sanitização da própria matriz e remoção de todo o tipo de espécies que se vão acumulando e que não são eluídas nos sucessivos ensaios. Neste trabalho em particular, reveste-se de especial importância, na medida em que é também importante para repor o contra-ião cloreto que constitui o LI cloreto de 1-metilimidazólio. Assim, efetuou-se também uma caracterização da matriz após diversos ciclos de utilização e regeneração e, de uma forma geral, não se verificaram alterações significativas relativamente à matriz MP-SilPrMImCI recém sintetizada. A base lógica para a escolha do LI cloreto de 1-metilimidazólio como ligando cromatográfico prende-se com a sua estrutura que compreende um anel aromático hidrofóbico, e um centro de carga positiva com um contra-ião cloreto. Desta forma, os ácidos nucleicos - biomoléculas carregadas negativamente devido aos grupos fosfato, e moderadamente hidrofóbicas devido, principalmente, às bases azotadas -, interagem através de múltiplas interações não covalentes, nomeadamente interações hidrofóbicas, ou eletrostáticas, ou ambas simultaneamente. No entanto, as diferentes classes de ácidos nucleicos apresentam uma densidade de carga diferente, bem como um diferente grau de exposição das bases azotadas, o que poderá resultar em comportamentos de ligação e eluição distintos em cromatografia. Este fato foi explorado com o objetivo de proceder ao isolamento e separação do ARN e ADN, de preferência separação de ARNbp, ARNr e ADNg, a partir da sua eluição em condições de diferente força iónica. De facto, o desenvolvimento de novas estratégias cromatográficas baseadas na aplicação de novos ligandos com seletividade, especificidade, robustez e capacidade de ligação melhoradas para a purificação do ARN continua a suscitar um elevado interesse na indústria (bio)farmacêutica, nomeadamente, para obtenção de ARN de elevada pureza, estabilidade e qualidade adequadas à sua aplicação terapêutica, em diagnóstico, ou em procedimentos de biologia molecular. Em particular, de forma a evitar respostas imunológicas e outros efeitos adversos, a quantidade de ADNg que pode estar presente em amostras de ARN, destinadas para aplicações terapêuticas ou em métodos de diagnóstico deverá ser reduzida, à semelhança dos critérios definidos pelas agências reguladoras para os biofármacos tal como o ADNp. Por outro lado, a presença de ADNg também influencia negativamente a exatidão dos resultados obtidos em diferentes técnicas de biologia molecular conduzidas com ARN. Estes diferentes fatores enfatizam a importância do desenvolvimento de novos métodos de purificação de ARN.

[0054] De uma forma global, o procedimento para a obtenção da matriz cromatográfica M P-SilPrMImCI e a sua aplicação na separação de ARN e ADNg, de preferência ARNbp, ARNr e ADNg, incluem as seguintes etapas:

1. Preparação da matriz cromatográfica macroporosa Toyopearl ^® AF-Epoxy-650M (Tosoh Biosciences GmbH, Greisheim, Alemanha) com o LI cloreto de 1-metilimidazólio como ligando cromatográfico, utilizando como braço espaçador o 3-cloropropiltrimetoxisilano;

2. Caracterização da matriz cromatográfica sintetizada através de diferentes técnicas: 1) ¹³ C CPMAS, análise elementar, e determinação do PCZ para confirmar a correta funcionalização da matriz com o ligando - Figs 2, 3 e 4; 2) Microscopia eletrónica de varrimento para avaliar se o processo de funcionalização induz alterações na morfologia da matriz, representada na Fig. 5;

3. Obtenção da amostra de ácidos nucleicos a partir da cultura de Escherichia coli (E. coli) DH5a, tendo em vista a sua posterior aplicação em ensaios de separação na matriz MP-SilPrMImCI. O crescimento bacteriano foi efetuado em condições experimentais específicas, enquanto o lisado bacteriano contendo ARNbp e ADNg, ou ARNbp, ARNr e ADNg, resultou da aplicação do método de lise baseado no tiocianato de guanidina, enquanto as amostras de ARNbp foram obtidas através do método de tiocianatod e guanidina-fenol-clorofórmio, mediante protocolos previamente descritos e otimizados;4. Avaliação do efeito da funcionalização da matriz MP com o LI cloreto de 1-metilimidazólio na capacidade de retenção de ARN , de preferência ARNbp, e caracterização do mecanismo de interação. Estes ensaios foram realizados em colunas descartáveis, nas quais se empacotaram individualmente a matriz MP e MP- SilPrMImCI e se efetuaram ensaios de ligação e eluição em condições que promovem maioritariamente interações eletrostáticas. A recuperação do ARN, de preferência ARNbp, foi promovida pelo aumento da força iónica na fase móvel, associada ao aumento da concentração de NaCI. Nestes ensaios, utilizou-se uma amostra de ARN, de preferência ARNbp, obtida através do método de tiocianato de guanidina- fenol-clorofórmio. Como demonstrado na Fig. 6A, verificou-se que a matriz MP não tem a capacidade para reter o ARN, de preferência ARNbp, ao contrário da matriz MP-SilPrMImCI, confirmando desta forma que o ligando cromatográfico cloreto de 1-metilimidazólio é o responsável pela interação com a biomolécula. Por outro lado, efetuaram-se ensaios em condições que promovem predominantemente interações hidrofóbicas, especificamente com a utilização de uma fase móvel de elevada força iónica como condição de ligação e com a diminuição da força iónica por decréscimo da concentração de (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ (em Tris-HCI lOmM, pH 8) através de um gradiente por passos, para eluição. No entanto, após aplicação desta primeira condição de eluição com Tris-HCI lOmM, pH 8, verificou-se que a maioria das espécies de ARN, de preferência ARNbp, permaneciam adsorvidas à matriz, sendo apenas eluídas com um segundo passo de eluição com NaCI 1M (em Tris-HCI lOmM, pH 8). Estas observações indicam que a interação ligando-biomolécula estabelecida não se deve unicamente a um tipo de interação, resultando sim da conjugação de várias. Desta forma, dependendo das condições experimentais utilizadas, é possível explorar o carácter multimodal da matriz MP-SilPrMImCI em que interações diferentes parecem ocorrer simultaneamente;

5. Separação do ARN, de preferência ARNbp, do ADNg por cromatografia multimodal, utilizando a matriz cromatográfica MP-SilPrMImCI. Os resultados obtidos no ponto 4) da presente secção, onde se reportou que a matriz MP-SilPrMImCI apresenta um comportamento multimodal capaz de estabelecer diferentes tipos de interações com biomoléculas, estão de acordo com a estrutura do ligando cromatográfico. De facto, o cloreto de 1-metilimidazólio apresenta um anel aromático, que exibe: 1) elevada hidrofobicidade, tornando possível o estabelecimento de interações hidrofóbicas; 2) um centro de carga positiva, permitindo o estabelecimento de interações eletrostáticas com biomoléculas carregadas negativamente, atuando desta forma como trocador aniónico com o cloreto inicialmente presente como contra-ião. No entanto, devido ao impacto negativo da utilização de elevadas concentrações de sal no ambiente, a separação entre ARN, de preferência ARNbp, e ADNg na matriz MP-SilPrMImCI foi realizada em condições que favorecem predominantemente interações eletrostáticas. Após sucessivas otimizações, desenvolveu-se uma estratégia que permite a separação de ARN, de preferência ARNbp, de ADNg, sendo o ARN, de preferência ARNbp, recuperado no passo de ligação num estado de elevada pureza, como demonstrado na Fig. 7. Este processo é tipicamente designado por cromatografia negativa, uma vez que a biomolécula de interesse é recuperada na condição de ligação, o que se torna vantajoso na manutenção da estabilidade do ARN, visto que além do tempo de residência no sistema ser inferior, é recuperado com uma concentração de sal inferior;

6. Separação de ARNbp, ARNr e ADNg por cromatografia multimodal utilizando a matriz cromatográfica MP-SilPrMImCI. Conforme destacado no ponto 4, embora a matriz MP-SilPrMImCI seja capaz de estabelecer diferentes tipos de interações com biomoléculas, o uso de concentrações elevadas de sal geralmente aplicadas para promover interações principalmente hidrofóbicas tem um impacto negativo no ambiente. Portanto, a separação de ARNbp, ARNr e ADNg foi realizada em condições que promovem principalmente interações eletrostáticas, a saber, um gradiente crescente de NaCI. Após sucessivas otimizações, foi desenvolvida uma estratégia que permite a separação de ARNbp, ARNr e ADNg, onde ARNbp, ADNg e ARNr são recuperados com elevada pureza nos picos 1, 2 e 3, respectivamente, de acordo com a Fig. 8.

7. Avaliação da reprodutibilidade da matriz MP-SilPrMImCI na separação de ARN, de preferência ARNbp, e ADNg. Avaliou-se o comportamento cromatográfico da matriz descrita nesta divulgação após diversos ciclos de ensaios cromatográficos, intercalados com processos de regeneração; 8. Determinação da capacidade dinâmica de ligação da matriz cromatográfica MP-SilPrMImCI para diferentes biomoléculas. Determinou-se, individualmente, a capacidade dinâmica de ligação para 3 biomoléculas distintas, a proteína albumina sérica bovina (BSA), ADN plasmídíco (ADNp), e ARN, de preferência ARNbp, utilizando-se para o efeito soluções das referidas biomoléculas com concentrações de 2mg/mL, 50pg/mL, e 50pg/mL, respetivamente. Para tal, procedeu-se ao equilíbrio do suporte cromatográfico com Tris-HCI lOmM (pH 8), injetaram-se as respetivas soluções de cada biomolécula (dissolvidas em Tris-HCI lOmM, pH 8), e, por último, procedeu-se à eluição das biomoléculas retidas através do aumento da concentração de NaCI (em Tris-HCI lOmM, pH 8) por um gradiente por passos. A determinação dos valores da capacidade dinâmica de ligação para a BSA, ADNp e ARNbp foi realizada a 10 e 50% do valor da capacidade máxima.

Descrição detalhada

[0055] A presente divulgação diz respeito ao desenvolvimento de uma nova matriz cromatográfica, obtida através da funcionalização de uma fase estacionária macroporosa comercial com o LI cloreto de 1-metilimidazólio (MP-SilPrMImCI), tendo em vista a separação entre ARN, de preferência ARNbp, e ADNg provenientes de um extrato bacteriano. A preparação desta matriz cromatográfica e a subsequente aplicação em processos de separação de ácidos nucleicos, compreendem as seguintes etapas:

[0056] 1. Funcionalização da matriz cromatográfica macroporosa Toyopearl ^® AF-Epoxy-650M (Tosoh Biosciences GmbH, Greisheim, Alemanha) com o LI cloreto de 1-metilimidazólio (Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, Geel, Bélgica), de acordo com o descrito na Fig. 1. Inicialmente, procedeu-se à ligação covalente do braço espaçador - 3-cloropropiltrimetoxisilano - (Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, Geel, Bélgica), à matriz cromatográfica comercial. Assim, preparou-se uma suspensão de 5g da matriz macroporosa (MP) em 60 mL de tolueno, à qual se adicionaram 5 mL de 3-cloropropiltrimetoxisilano, e 0,5 mL de trietilamina, utilizada como catalisador da reação. Esta suspensão foi mantida em refluxo durante 24 h sob agitação mecânica (550 rotações por minuto - rpm). Após este período, a suspensão foi deixada arrefecer até à temperatura ambiente, procedendo-se posteriormente à separação do sólido por filtração e subsequente lavagem com diversos solventes, nomeadamente: tolueno, etanol-água (1:1), água bidestilada e metanol. O sólido foi seco a 60 °C durante 24h, obtendo-se a matriz MP com o braço espaçador (MP-SilPrCI), a qual foi seca a vácuo durante 24 h a 60 °C. De seguida, procedeu-se à reação da matriz MP-SilPrCI com o 1-metilimidazol, tendo em vista a obtenção da matriz MP funcionalizada com o LI cloreto de 1-metilimidazólio. A uma suspensão de 5 g da matriz MP com o espaçador (MP-SilPrCI) em 60 mL de tolueno foram adicionados 5 mL de 1-metilimidazol. Esta suspensão foi mantida em refluxo durante 24h sob agitação magnética, em particular 550 rpm. Após este período, o sólido foi filtrado e lavado com metanol, água destilada e metanol, sendo de seguida seco a 60 °C, obtendo-se desta forma a matriz cromatográfica funcionalizada com o LI (MP-SilPrMImCI).

[0057] Numa forma de realização, procedeu-se à caraterização da matriz cromatográfica MP- SilPrMImCI por ¹³ C CPMAS, análise elementar, determinação do PCZ e microscopia eletrónica de varrimento. A caraterização da matriz por ¹³ C RMN foi realizada à temperatura ambiente com uma sonda VTN a operar a 100.6 MHz, tendo-se utilizado as seguintes configurações em CPMAS RMN ¹³ C, de forma a maximizar a razão sinal-ruído: Vi ¹³ C = 55 kHz; recycle delay, 4 s; tempo de contacto, 1-2 ms; NS = lk; vR = 12 kHz. A sequência SPINAL-64 decoupling foi utilizada durante a aquisição dos dados experimentais. De acordo com a Fig. 2, através da comparação dos espectros de RMN obtidos de ¹³ C no estado sólido para a matriz funcionalizada (MP-SilPrMImCI) e não funcionalizada (MP), verifica-se a presença de picos com desvios químicos entre 120 e 130 ppm e entre 35 e 40 ppm no espectro correspondente à matriz MP-SilPrMImCI, e que não estão presentes no espectro da matriz MP. O sinal com desvio químico a 37 ppm corresponde ao grupo metilo como cadeia alquílica lateral do catião imidazólio enquanto os sinais a 120-130 ppm são característicos dos átomos de carbono aromáticos, presentes no anel aromático do imidazólio. De uma forma geral, estes resultados confirmam a correta funcionalização da matriz cromatográfica, de preferência matriz macroporosa, com o LI cloreto de 1- metilimidazólio, visto que estes desvios químicos não se verificam no espectro correspondente à matriz MP-SilPrCI. A análise elementar foi realizada para determinar quantitativamente o conteúdo em carbono, hidrogénio e azoto nas matrizes MP e M P-SilPrMImCI. Para tal, utilizou-se o equipamento TruSpec 630200-200 e aproximadamente 2 mg de cada amostra. Adicionalmente, definiu-se a temperatura da estufa de combustão em 1075 °C, a temperatura pós-combustão em 850 °C, e utilizou- se o método de absorção por infravermelho para quantificação de carbono e hidrogénio, enquanto a condutividade térmica foi selecionada para o azoto. De acordo com os resultados descritos na Fig. 3, verifica-se que a matriz MP apresentou um conteúdo em carbono, hidrogénio e azoto (em percentagem mássica, %) de 46,16, 6,60 e 0 %, respetivamente. Por outro lado, a matriz funcionalizada MP- SilPrMImCI apresenta uma % mássica em carbono, hidrogénio e azoto de 46,27, 6,85 e 2,03 %, respetivamente, sendo que o azoto é exclusivamente proveniente do LI cloreto de 1-metilimidazólio, indicando que a matriz foi corretamente funcionalizada. Adicionalmente, efetuou-se a análise elementar da matriz MP-SilPrMImCI após 5 ensaios cromatográficos, intercalados com 5 ciclos de regeneração com soluções aquosas de NaOH e HCI e lavagem com água bidestilada, tendo-se observado que o conteúdo em carbono e hidrogénio foi semelhante à matriz MP e MP-SilPrMImCI não regenerada. No entanto, obteve-se um valor ligeiramente inferior para o conteúdo em azoto, em comparação com a matriz MP- SilPrMImCI não regenerada, o que poderá indicar que após diversos ciclos de utilização, poderá ocorrer a quebra da ligação covalente de algumas moléculas de ligando, traduzindo-se numa ligeira co-eluição do ligando. Tendo em vista a determinação do PCZ da matriz MP e da matriz MP-SilPrMImCI, registaram- se os valores de PCZ das suspensões destes materiais em água destilada, a diferentes valores de pH (ajustados com soluções de HCI e NaOH 0,1 M). Verificou-se que as matrizes MP e MP-SilPrMImCI apresentam um PCZ nulo a valores de pH de aproximadamente 3,7 e 8,7, respetivamente, o que uma vez mais confirma a correta funcionalização da matriz MP com o LI cloreto de 1-metilimidazólio.

[0058] Numa forma de realização, verificou-se por microscopia eletrónica de varrimento que a funcionalização da matriz MP com o LI não induziu alterações significativas na sua morfologia, de acordo com a Fig. 5.

[0059] Numa forma de realização, foi executada a obtenção da amostra de ácidos nucleicos a partir de um processo fermentativo de Escherichia coli DH5a. O crescimento celular bacteriano foi realizado em frascos erlenmeyer num meio de cultura adequado (12g/L triptona, 24g/L extrato de levedura, 4mL/L glicerol, 0,017M KH ₂ P0 ₄ , 0,072M K ₂ HP0 ₄ ) sob condições específicas de rotação orbital (250 rpm), e temperatura (37 °C) e utilizando um período de fermentação de 2 horas com o objetivo de maximizar a produção de ARNbp, ARNr, ADNg e 7 horas para a produção de ARNbp e ADNg. De seguida, a obtenção de uma amostra de lisado bacteriano contendo ARN, de preferência ARNbp, e ADNg ou ARN, de preferência ARNbp e ARNr foi realizada após a aplicação de um processo de lise celular e recuperação de ácidos nucleicos. Inicialmente, efetuou-se a lise celular recorrendo à solução que contém o sal tiocianato de guanidina, à qual se seguiram um passo de concentração com isopropanol, um passo de lavagem com etanol, e um passo de solubilização com água bidestilada tratada com 0,05 % dietil pirocarbonato (DEPC), constituindo esta a amostra de ácidos nucleicos que foi aplicada para os estudos de separação na matriz cromatográfica funcionalizada.

[0060] Numa forma de realização, a avaliação do efeito da funcionalização da matriz MP com o LI cloreto de 1-metilimidazólio na retenção de uma amostra de ARN, de preferência ARNbp, e caracterização do mecanismo de interação foram realizadas. Estudaram-se os perfis de ligação às matrizes M P e M P-SilPrMImCI de uma amostra de ARN, de preferência ARNbp, isolada a partir de um extrato bacteriano utilizando o método de extração baseado no tiocianato de guanidina-fenol- clorofórmio. Para a realização destes ensaios, empacotaram-se individualmente 2 mL das matrizes MP e MP-SilPrMImCI hidratadas em colunas descartáveis de polipropileno (Econo-Pac ^® , Bio-rad, Califórnia, USA). De seguida, efetuaram-se ensaios em condições experimentais que favorecem predominantemente interações eletrostáticas, mais concretamente, procedeu-se ao equilíbrio das matrizes cromatográficas supracitadas com tampão Tris-HCI lOmM pH 8, injetou-se a amostra de ARN, de preferência ARNbp, no mesmo tampão de equilíbrio e, finalmente, eluíram-se as espécies de ARN retidas através do aumento da força iónica, isto é, da concentração de NaCI para 1M (em Tris-HCI lOmM, pH 8) utilizando um gradiente por passos. Recolheram-se amostras das frações obtidas durante a ligação da amostra, e durante a eluição, mediu-se a absorvência a 260 nm (A ₂₆ o), e traçaram-se os respetivos cromatogramas, representados na Fig. 6A. De facto, verifica-se que na matriz não funcionalizada - MP ocorreu apenas uma ligação residual das espécies de ARN, indicado pela absorvência a A ₂₆₀ aproximadamente nula, quando se aumentou a concentração de NaCI no tampão de eluição para 1M. Por outro lado, na matriz MP-SilPrMImCI, obteve-se o perfil contrário, isto é, uma A ₂₆ o aproximadamente nula no passo de ligação - Tris-HCI lOmM pH 8 - tendo-se verificado um aumento significativo da A ₂₆₀ com o tampão de eluição - NaCI 1M em Tris-HCI lOmM pH 8, indicando que a totalidade das espécies de ARN interagiram com a matriz. Desta forma, comprova-se que o LI cloreto de 1-metilimidazólio efetivamente atua como ligando cromatográfico, sendo este a espécie responsável pela interação com os ácidos nucleicos, visto que a matriz macroporosa não modificada apresenta uma capacidade negligível para ligar o ARN de baixo peso molecular.

[0061] Tendo em vista a caracterização das interações envolvidas na adsorção do ARN, de preferência ARNbp, à nova matriz descrita nesta divulgação, efetuaram-se ensaios cromatográficos em condições experimentais distintas das anteriormente referidas, que favorecem predominantemente interações hidrofóbicas. Para tal, equilibraram-se inicialmente as matrizes MP e MP-SilPrMImCI com 2M (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ (em Tris-HCI lOmM, pH 8), injetou-se a amostra de ARN, de preferência ARNbp, no mesmo tampão de equilíbrio e, finalmente, eluíram-se as espécies de ARN retidas através da diminuição da força iónica para Tris-HCI lOmM, recorrendo a um gradiente por passos. À semelhança do descrito anteriormente, recolheram-se frações dos passos de ligação e eluição, e determinou-se a A ₂₆₀ . De acordo com a Fig. 6B, após o primeiro passo de eluição com Tris-HCI lOmM pH 8, observou-se que a maioria das espécies de ARN, de preferência ARNbp, permaneciam retidas na matriz. Desta forma, optou-se por efetuar um segundo passo de eluição com NaCI 1M (em Tris-HCI lOmM, pH 8), tendo-se verificado que as espécies de ARN, de preferência ARNbp, efetivamente eluíram, de acordo com os valores da A ₂₆ o, registados na Fig. 6B. O comportamento cromatográfico exibido pela matriz MP-SilPrMImCI nestas condições experimentais é, tipicamente, característico de matrizes multimodais, isto é, fases estacionárias em que se estabelece mais do que um tipo de interação entre a biomolécula e o ligando cromatográfico. Desta forma, caracterizou-se o comportamento cromatográfico da matriz MP-SilPrMImCI descrita nesta divulgação, que atua maioritariamente como um trocador aniónico em condições que favorecem predominantemente interações eletrostáticas, mas que no geral apresenta um comportamento multimodal, nomeadamente devido às características estruturais do LI cloreto de 1-metilimidazólio como ligando.

[0062] Numa forma de realização, a separação do ARN, de preferência ARNbp, do ADNg por cromatografia multimodal, utilizando a matriz cromatográfica MP-SilPrMImCI foi analisada. De acordo com a estrutura do ligando cromatográfico imobilizado na matriz funcionalizada - o LI cloreto de 1- metilimidazólio -, verifica-se que este exibe um anel aromático, que: 1) apresenta elevada hidrofobicidade, tornando possível o estabelecimento de interações hidrofóbicas; 2) apresenta igualmente um centro de carga positiva, permitindo o estabelecimento de interações eletrostáticas com biomoléculas carregadas negativamente. Em particular, os ácidos nucleicos apresentam na sua constituição grupos fosfato carregados negativamente, e bases azotadas de carácter hidrofóbico, o que possibilita a sua interação com matrizes cromatográficas por interações eletrostáticas e hidrofóbicas, respetivamente. A cromatografia multimodal explora diferentes tipos de interações entre o ligando imobilizado na fase estacionária e a biomolécula alvo, em que a cooperatividade destas interações geralmente conduz a um aumento da seletividade e especificidade do processo cromatográfico. No entanto, através da escolha apropriada das condições experimentais de ligação e eluição, a matriz poderá também operar em modo único, permitindo desta forma explorar predominantemente um tipo de interações, tornando as matrizes mais versáteis para qualquer separação. O mecanismo de interação entre uma amostra de ARN, de preferência ARNbp, e a matriz MP-SilPrMImCI foi caracterizado no ponto 4) desta secção, podendo ser estabelecidas predominantemente interações eletrostáticas, interações hidrofóbicas ou múltiplas interações (eletrostáticas, hidrofóbicas, pontes de hidrogénio, interações catião-p, e forças de van der Waals), mediante as condições experimentais empregues. No entanto, o elevado potencial de eutrofização do (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , conjugado com o facto de ser obtido a partir de fontes não-renováveis, leva a que a utilização de elevadas concentrações deste reagente tenha um impacto negativo no ambiente, motivo este que levou a explorar maioritariamente o carácter de trocador aniónico da matriz preparada para a separação dos ácidos nucleicos. Desta forma, empacotou-se uma coluna cromatográfica (Ge Healthcare, Uppsala, Suécia) de 10 mm diâmetro e 26 mm de altura com 2 mL da matriz MP-SilPrMImCI hidratada, realizaram-se os ensaios cromatográficos no sistema ÃKTA Avant sob o controlo do software Unicom 6 (Ge Healthcare, Uppsala, Suécia) que permite recolher automaticamente as diferentes frações, e controlar em tempo real diversos parâmetros, tais como a condutividade, a absorvência, e o pH. Adicionalmente, utilizou-se uma coluna termostatizada, tendo-se definido como temperatura de operação a temperatura ambiente - 25 °C. Inicialmente, utilizou-se uma amostra de lisado bacteriano constituída por ARNbp e ADNg e após a realização de diferentes ensaios, a estratégia otimizada consistiu no equilíbrio da matriz MP-SilPrMImCI com NaCI 0,380M (em Tris-HCI lOmM, pH 8), seguido do aumento da concentração de NaCI para 1M através de um gradiente por passos, obtendo-se desta forma 2 picos cromatográficos, representados na Fig. 7-A por 1 e 2, respetivamente. As amostras representadas por 1 e 2 foram recolhidas separadamente, concentradas e dessalinizadas utilizando concentradores vivaspin (5000 MWCO, Sartorius, Gottingen, Alemanha), e finalmente analisadas num gel de agarose a 1 % (m/v), contendo GreenSafe Premium (Nzytech, Lisboa, Portugal) a uma concentração de 0,014pL/mL de gel de agarose. Os resultados obtidos encontram-se descritos na Fig. 7B, onde é possível observar na amostra inicial - fração S - duas bandas que correspondem a espécies distintas de ácidos nucleicos, nomeadamente, o ADNg com peso molecular superior, e o ARN, de preferência ARNbp, com peso molecular inferior. Por outro lado, verifica-se que no pico 1 elui o ARN, de preferência ARNbp, enquanto no pico 2 elui apenas o ADNg, o que vem confirmar que a estratégia cromatográfica implementada e desenvolvida com a matriz MP-SilPrMImCI permite uma separação efetiva do ARN, de preferência ARNbp, do ADNg, provenientes da lise de um extrato bacteriano. Esta estratégia é designada por cromatografia negativa, visto que a biomolécula de interesse, neste caso o ARN, de preferência ARNbp, é recuperada no pico 1 - passo de ligação -, enquanto os demais contaminantes interagem com a matriz, sendo recuperados posteriormente. Assim, este processo cromatográfico apresenta duas vantagens inequívocas, além da biomolécula de interesse ser recuperada com uma concentração de NaCI mais reduzida, o tempo de residência no sistema cromatográfico é muito inferior, o que contribui para a manutenção da sua estabilidade, um fator que assume especial relevância por o ARN se tratar de uma biomolécula altamente instável e suscetível de degradação por ribonucleases. Posteriormente, uma amostra de lisado bacteriano mais complexo, composta por ARNbp, ARNr e ADNg, foi aplicada na matriz MP-SilPrMImCI. Após experiências sucessivas, a estratégia de purificação otimizada consistiu no equilíbrio da matriz MP-SilPrMImCI com NaCI 0,380 M (em Tris-HCI 10 mM pH 8), ao qual se seguiram dois passos de eluição através de um gradiente por passos tendo em vista o aumento na concentração de NaCI para 0,41 M e 0,5 M (em Tris-HCI a 10 mM, pH 8). Como resultado, além do pico correspondente às espécies que não ligaram à matriz, foram obtidos 2 picos cromatográficos adicionais, os quais estão representados na Fig. 8A por 1, 2 e 3, respectivamente. As amostras representadas por 1, 2 e 3 foram tratadas como descrito anteriormente e analisadas por eletroforese em gel de agarose. Os resultados obtidos encontram-se representados na Fig. 8B, e é possível observar 4 bandas principais na amostra inicial - Fracção S - que correspondem a espécies distintas de ácidos nucleicos, nomeadamente a banda de maior peso molecular que corresponde ao ADNg, as 2 bandas com peso molecular intermediário que correspondem ao ARNr e a quarta banda que corresponde ao ARNbp e que apresenta o menor peso molecular. Por outro lado, verificou-se que os ácidos nucleicos altamente purificados foram eluídos em picos distintos, a saber, ARNbp no pico 1, ADNg no pico 2 e ARNr no pico 3, confirmando assim que a estratégia cromatográfica implementada e desenvolvida com a matriz MP-SilPrMImCI permite uma separação eficaz de ARNbp, ARNr e ADNg, presentes num extrato bacteriano.

[0063] Numa forma de realização, a avaliação da reprodutibilidade da matriz MP-SilPrMImCI na separação do ARN, de preferência ARNbp, do ADNg foi realizada da seguinte forma. Efetuaram-se 10 ensaios cromatográficos em 5 dias diferentes, não consecutivos, designadamente nos dias 1, 2, 5, 7, e 9, tendo sido intercalados com um processo de regeneração que compreende o contacto da matriz cromatográfica com uma solução aquosa de NaOH 0,2M, água bidestilada, HCI 0,5M, e água bidestilada, de acordo com o esquema presente na Fig. 9A. Os cromatogramas correspondentes aos 10 ensaios efetuados encontram-se representados na Fig. 9B, sendo que a análise por eletroforese em gel de agarose dos picos obtidos nos ensaios 1, 4, 7 e 10 corresponde à Fig. 9C. De uma forma geral, verificou- se que a matriz cromatográfica MP-SilPrMImCI é robusta e reprodutível, tendo sido o ARN, de preferência ARNbp, recuperado no pico 1 num estado de elevada pureza em todos os ensaios efetuados. No entanto, verifica-se que com o aumento do número de ensaios cromatográficos realizados, o ADN genómico é obtido no pico 2 ligeiramente contaminado com ARN, de preferência ARNbp. Contudo, apesar de se observar uma ligeira diminuição dos níveis de recuperação de ARN de baixo peso molecular no pico 1, não foram detetadas quaisquer alterações na sua pureza.

[0064] Numa forma de realização, a determinação da capacidade dinâmica de ligação da matriz cromatográfica MP-SilPrMImCI foi determinada da seguinte forma. A capacidade dinâmica de ligação para uma determinada biomolécula assume um papel preponderante na caracterização e avaliação de um processo cromatográfico, sendo definida como a quantidade máxima de biomolécula que se liga ao suporte sob determinadas condições de operação. Determinou-se, individualmente, a capacidade de ligação para 3 biomoléculas distintas, a proteína albumina sérica bovina (BSA), ADN plasmídíco (ADNp), e ARNbp, utilizando-se para o efeito soluções das referidas biomoléculas com concentrações de 2mg/mL, 50pg/mL, e 50pg/mL, respetivamente. O processo cromatográfico levado a cabo para a determinação da capacidade dinâmica de ligação consistiu: 1) no equilíbrio da matriz cromatográfica com Tris-HCI lOmM (pH 8), de forma a permitir a ligação de cada uma das diferentes espécies, 2) na injeção das respetivas soluções de cada biomolécula (dissolvidas em Tris-HCI lOmM, pH 8), e, por último, 3) na eluição das biomoléculas retidas através do aumento da concentração de NaCI (em Tris-HCI lOmM, pH 8) por um gradiente por passos. A determinação dos valores da capacidade dinâmica de ligação para a BSA, ADNp e ARN total foi realizada a 10 e 50% do valor da capacidade máxima, encontrando-se os valores reportados na Fig. 10.

Exemplo de aplicação 1:

[0065] Numa forma de realização, a determinação da retenção de uma amostra de ARN, de preferência ARNbp, na matriz MP-SilPrMImCI em condições cromatográficas distintas, e caracterização do mecanismo de interação foi realizada como se descreve de seguida.

[0066] A matriz cromatográfica descrita nesta divulgação foi obtida a partir da matriz comercial macroporosa Toyopearl ^® AF-Epoxy-650M, na qual se imobilizou numa primeira instância um braço espaçador, e de seguida se ligou ao braço espaçador o 1-metilimidazol, ocorrendo desta forma a formação do ligando multimodal cromatográfico. Inicialmente, tendo em vista a ligação covalente do braço espaçador à matriz comercial, preparou-se uma suspensão de 5 g da matriz MP em 60 mL de tolueno à qual se adicionaram 5 mL de 3-cloropropiltrimetoxisilano e 0,5 mL de trietilamina (com a função de catalisar a reação). Após 24h em refluxo e sob agitação magnética a suspensão foi arrefecida, o sólido isolado por filtração e lavado com tolueno, etanol/água (1:1), água destilada e, finalmente, com metanol. Obtém-se desta forma a matriz com o espaçador designada por MP-SilPrCI. De seguida, procedeu-se à reação da MP-SilPrCI com o 1-metilimidazol para se obter a MP funcionalizada com o LI cloreto de 1-metil-imidazólio. A uma suspensão de 5g da matriz MP com o espaçador (MP-SilPrCI) em 60 mL de tolueno foram adicionados 5 mL de 1-metilimidazol. Esta suspensão foi mantida em refluxo durante 24h sob agitação magnética (550 rpm). De seguida, o sólido foi filtrado e lavado com metanol, água destilada e metanol e seco a 60 °C, obtendo-se assim a matriz cromatográfica funcionalizada com o LI (MP-SilPrMImCI).

[0067] A matriz cromatográfica funcionalizada com o LI (MP-SilPrMImCI) foi caracterizada utilizando técnicas distintas: ¹³ C CPMAS, análise elementar, determinação do PCZ, e SEM. No que diz respeito à análise por RMN-CPMAS, utilizaram-se configurações específicas de forma a maximizar a razão sinal- ruído: i ¹³ C = 55 kHz; recycle delay, 4 s; tempo de contacto, 1-2 ms; NS = lk; vR = 12 kHz. Os espectros de ¹³ C CPMAS das matrizes MP e MP-SilPrMImCI encontram-se representados na Fig. 2, tendo-se verificado a presença de picos com desvios químicos nos intervalos 120-130 e 35-40 ppm no espectro da matriz MP-SilPrMImCI, que não se encontram presentes na matriz MP. Se por um lado, o sinal com desvio químico a 37 ppm se deve ao grupo metilo presente como cadeia alquílica do imidazólio, os sinais a 120-130 ppm são característicos dos átomos de carbono aromáticos, unicamente presentes no anel aromático do imidazólio. Adicionalmente, efetuou-se também a análise elementar das matrizes MP e MP-SilPrMImCI para determinar quantitativamente o conteúdo em carbono, hidrogénio e azoto presente nas mesmas, de acordo com a Fig. 3. De uma forma geral, foi detetado azoto na matriz MP- SilPrMImCI, que não estava presente na matriz macroporosa comercial, corroborando os resultados obtidos por ¹³ C CPMAS sobre a correta funcionalização da matriz preparada. A carga superficial das matrizes MP e MP-SilPrMImCI também foi avaliada, através da determinação do PCZ a diferentes valores de pH. Como representado na Fig. 4, verificou-se que o pH ao qual as matrizes apresentam um PCZ, respetivamente, 3,7 e 8,7, para as matrizes MP e MP-SilPrMImCI, devendo-se esta alteração à presença do LI cloreto de 1-metilimidazólio. Finalmente, após a análise da Fig. 5 verificou-se por microscopia eletrónica de varrimento que a funcionalização da matriz MP com o LI não induziu alterações dignas de registo na sua morfologia.

[0068] A amostra de ARN, de preferência ARNbp, necessária para a determinação dos perfis de retenção na matriz sintetizada foi obtida através de um procedimento que compreende duas etapas: 1) acumulação de biomassa por fermentação de Escherichia coli DH5a num meio de cultura adequado (12g/L triptona, 24g/L extrato de levedura, 4mL/L glicerol, 0,017M KH ₂ P0 ₄ , 0,072M K ₂ HP0 ₄ ) sob condições específicas de rotação orbital (250 rpm), e temperatura (37 °C) durante 7 horas; e 2) isolamento de ARN, de preferência ARNbp, a partir do extrato bacteriano utilizando o método de extração baseado no tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio. [0069] Numa forma de realização, para avaliar a capacidade da matriz preparada na retenção de uma amostra de ARN, de preferência ARNbp, empacotaram-se 2 mL da matriz numa coluna descartável de polipropileno (Econo-Pac ^® , Bio-rad, Califórnia, USA). De seguida, efetuaram-se ensaios em condições experimentais distintas: 1) usando um gradiente baseado no aumento da concentração de NaCI, favorecendo predominantemente interações eletrostáticas; 2) usando um gradiente baseado na diminuição da concentração de (NH ₄ ) ₂ 50 ₄ , onde as interações hidrofóbicas são preferencialmente estabelecidas. Para a realização do ensaio 1, equilibrou-se inicialmente a matriz cromatográfica com tampão Tris-HCI lOmM pH 8, injetou-se a amostra de ARN, de preferência ARNbp, no mesmo tampão de equilíbrio e, finalmente, eluíram-se as espécies de ARN retidas através do aumento da força iónica, isto é, da concentração de NaCI para 1M (em Tris-HCI lOmM, pH 8) utilizando um gradiente por passos. Recolheram-se amostras dos passos de ligação e de eluição, determinou-se a A ₂₆₀ , e traçou-se o cromatograma correspondente. De acordo com a Fig. 6A, verifica-se uma A ₂₆₀ aproximadamente nula no passo de ligação - Tris-HCI lOmM pH 8 -, tendo-se verificado um aumento significativo da A ₂₆₀ com o tampão de eluição - NaCI 1M em Tris-HCI lOmM, pH 8 -, indicando que quase a totalidade das espécies de ARN interagiram com a matriz.

[0070] Numa forma de realização, para explorar maioritariamente interações hidrofóbicas entre o ligando e a amostra de ARN, de preferência ARNbp, equilibrou-se inicialmente a matriz cromatográfica com (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 2M em Tris-HCI lOmM, pH 8, injetou-se a amostra de ARN, de preferência ARNbp, no mesmo tampão de equilíbrio e, finalmente, eluíram-se as espécies de ARN retidas através da diminuição da concentração de (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ para Tris-HCI lOmM, pH 8, em modo de gradiente por passos. À semelhança do descrito anteriormente, recolheram-se amostras e determinou-se a A ₂₆₀ para traçar o cromatograma, de acordo com a Fig. 6B. Efetivamente, após a eluição com Tris-HCI lOmM, pH 8, verificou-se que a maioria das espécies de ARN permaneciam retidas na matriz, o que levou a que se efetuasse uma segunda eluição com NaCI 1M (em Tris-HCI lOmM, pH 8). Com este passo de eluição, verificou-se que as espécies de ARN, de preferência ARNbp, eluíram. A partir deste ensaio, é possível inferir que se estabeleceram múltiplas interações entre o ARN, de preferência ARNbp, e o ligando cromatográfico cloreto de 1-metilimidazólio, incluindo interações eletrostáticas e hidrofóbicas. Este comportamento é característico de matrizes cromatográficas multimodais onde se estabelecem múltiplas interações.

[0071] De uma forma geral, a matriz MP-SilPrMImCI descrita nesta divulgação apresenta a capacidade para reter ARN. Esta atua essencialmente como um trocador aniónico em condições que favorecem predominantemente interações eletrostáticas, mas apresenta um comportamento multimodal mais evidenciado em condições que favorecem maioritariamente interações hidrofóbicas. Assim, o LI cloreto de 1-metilimidazólio apresenta-se como um ligando multimodal. Exemplo de aplicação 2:

[0072] Numa forma de realização, a separação de ARN, de preferência ARNbp, de ADNg por cromatografia multimodal, utilizando a matriz MP-silPrMImCI foi realizada como se descreve de seguida.

[0073] Numa forma de realização, a matriz cromatográfica descrita nesta divulgação foi obtida a partir da matriz comercial macroporosa Toyopearl ^® AF-Epoxy-650M, na qual se imobilizou numa primeira instância um braço espaçador, e de seguida se ligou ao braço espaçador o 1-metilimidazol, ocorrendo desta forma a formação do ligando cromatográfico. Inicialmente, tendo em vista a ligação covalente do braço espaçador à matriz comercial, preparou-se uma suspensão da matriz MP (5g) em tolueno (60 mL), à qual se adicionou 3-cloropropiltrimetoxisilano (5 mL) e trietilamina (0,5 mL), utilizada como catalizador. Após 24h em refluxo e sob agitação magnética, a suspensão foi arrefecida, o sólido isolado por filtração e lavado com tolueno, etanol/água (1:1), água destilada e, finalmente, com metanol. Obtém-se desta forma a matriz com o espaçador designada por MP-SilPrCI.

[0074] De seguida, procedeu-se à reação da MP-SilPrCI com o 1-metilimidazol para se obter a MP funcionalizada com o LI cloreto de 1-metil-imidazólio. A uma suspensão da matriz MP com o espaçador (MP-SilPrCI) (5 g) em tolueno (60 mL), foi adicionado o 1-metilimidazol (5 mL). Esta suspensão foi mantida em refluxo durante 24h sob agitação magnética (550 rpm). Após este período, o sólido foi filtrado e lavado com metanol, água destilada e metanol e seco a 60 °C obtendo-se desta forma a matriz cromatográfica funcionalizada com o LI (MP-SilPrMImCI).

[0075] No que diz respeito à análise por ¹³ C CPMAS RMN-CPMAS, utilizaram-se configurações específicas de forma a maximizar a razão sinal-ruído: Vi ¹³ C = 55 kHz; recycle delay, 4 s; tempo de contacto, 1-2 ms; NS = lk; vR = 12 kHz. Os espectros de ¹³ C CPMAS das matrizes MP e MP-SilPrMImCI encontram-se representados na Fig. 2, tendo-se verificado a presença de sinais com desvios químicos nos intervalos 120-130 e 35-40 ppm no espectro da matriz MP-SilPrMImCI, que não se encontram presentes na matriz MP. Se por um lado, o sinal com desvio químico a 37 ppm se deve ao grupo metilo presente como cadeia alquílica do imidazólio, os sinais a 120-130 ppm são característicos dos átomos de carbono aromáticos, unicamente presentes no anel aromático imidazólio. Adicionalmente, efetuou-se também a análise elementar das matrizes MP e MP-SilPrMImCI para determinar quantitativamente o conteúdo em carbono, hidrogénio e azoto presente nas mesmas, de acordo com a Fig. 3. De uma forma geral, foi detetado azoto na matriz MP-SilPrMImCI, que não estava presente na matriz macroporosa comercial, corroborando os resultados obtidos por ¹³ C CPMAS sobre a correta funcionalização da matriz preparada. A carga superficial das matrizes MP e MP-SilPrMImCI também foi avaliada, através da determinação do PCZ a diferentes valores de pH. Como representado na Fig. 4, verificou-se que o pH ao qual as matrizes apresentam PCZ nulo foi, respetivamente, 3,7 e 8,7, para as matrizes MP e MP- SilPrMImCI, devendo-se esta alteração à presença do LI cloreto de 1-metilimidazólio. Finalmente, por microscopia eletrónica de varrimento, Fig. 5, verificou-se que a funcionalização da matriz MP com o LI não induziu alterações dignas de registo na sua morfologia.

[0076] A amostra de ácidos nucleicos compreende ARN, de preferência ARNbp, e ADNg e provém de um processo fermentativo de Escherichia coli DH5a. Para tal, efetuou-se o crescimento celular bacteriano num meio de cultura adequado (12g/L triptona, 24g/L extrato de levedura, 4mL/L glicerol, 0,017M KH PO , 0,072M K ₂ HP0 ₄ ) sob condições específicas de rotação orbital (250 rpm), e temperatura (37 °C), em particular durante 7 horas. De seguida, efetuou-se a lise bacteriana recorrendo à solução de lise que contém o sal tiocianato de guanidina, à qual se segue um passo de concentração com isopropanol e um passo de lavagem com etanol. Finalmente, procedeu-se à solubilização da amostra com água bidestilada tratada com 0.05 % dietil pirocarbonato (DEPC), constituindo esta a amostra de ácidos nucleicos que contém ARN, de preferência ARNbp, e ADNg, posteriormente empregue nos ensaios de separação. De acordo com o exemplo 1, a matriz MP-SilPrMImCI poderá ser utilizada em condições que favorecem predominantemente interações eletrostáticas ou hidrofóbicas, devido ao seu carácter multimodal. De facto, de acordo com a estrutura do ligando cromatográfico utilizado, o LI cloreto de 1-metilimidazólio, verifica-se que este exibe um anel aromático, que: 1) apresenta elevada hidrofobicidade, tornando possível o estabelecimento de interações hidrofóbicas; 2) apresenta igualmente um centro de carga positiva, permitindo o estabelecimento de interações eletrostáticas com biomoléculas carregadas negativamente, atuando desta forma como trocador aniónico com o contra-ião cloreto inicialmente presente. No entanto, para promover essencialmente interações hidrofóbicas, são usadas elevadas concentrações de (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ e, considerando o elevado potencial de eutrofização do (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , conjugado com o facto de ser obtido a partir de fontes não-renováveis, leva a que a utilização de elevadas concentrações deste reagente aumente muito a pegada ambiental de um processo cromatográfico. Desta forma, explorou-se a capacidade da matriz para estabelecer predominantemente interações eletrostáticas da matriz MP-SilPrMImCI, tendo em vista a separação de ácidos nucleicos. Inicialmente, empacotou-se uma coluna cromatográfica (Ge Healthcare, Uppsala, Suécia) de 10 mm de diâmetro e 26 mm de altura com 2 mL da matriz MP-SilPrMImCI hidratada, e a temperatura de operação na coluna foi definida como 25 °C, controlada com um banho termostatizado; os ensaios cromatográficos foram realizados no sistema ÃKTA Avant sob o controlo do software Unicom 6 (Ge Healthcare, Uppsala, Suécia). Após serem testados diferentes gradientes por passos com forças iónicas distintas, a estratégia otimizada consistiu no equilíbrio da matriz MP-SilPrMImCI com NaCI 0,380M (em Tris-HCI lOmM, pH 8), seguido do aumento da concentração de NaCI para 1M, obtendo-se desta forma 2 picos cromatográficos, representados na Fig. 7-A por 1 e 2, respetivamente. As amostras representadas por 1 e 2 foram recolhidas separadamente, concentradas e dessalinizadas utilizando concentradores vivaspin (5000 MWCO, Sartorius, Gottingen, Alemanha), e finalmente analisadas num gel de agarose a 1 % (m/v), contendo GreenSafe Premium (Nzytech, Lisboa, Portugal) a uma concentração de 0,014pL/mL de gel de agarose. A análise dos picos 1 e 2 por eletroforese em gel de agarose encontra-se na Fig. 7B, que inclui a fração S, a amostra inicial na qual é possível visualizar duas bandas, uma com peso molecular superior e outra com peso molecular inferior que correspondem, respetivamente, ao ADNg e ao ARN, de preferência ARNbp. No que diz respeito aos picos cromatográficos, no pico 1 elui unicamente o ARN, de preferência ARNbp, com uma força iónica inferior, enquanto no pico 2 elui o ADNg. Este processo corresponde tipicamente a um processo de cromatografia negativa, uma vez que a biomolécula de interesse é recolhida no passo de ligação. De facto, esta estratégia apresenta duas vantagens principais: o ARN, de preferência ARNbp, é recuperado com uma concentração de sal mais baixa, apresentando um tempo de residência no sistema inferior, fatores que contribuem para a manutenção da integridade, estabilidade e atividade biológica do ARN.

[0077] A regeneração de matrizes cromatográficas representa, de uma forma geral, uma forma para remover componentes que permanecem adsorvidos à matriz mesmo após os passos de eluição. Neste caso em particular assume especial relevância porque é necessária para repor o contra-ião do ligando cromatográfico imobilizado - o ião cloreto. Mesmo após vários ciclos de utilização, a matriz MP- SilPrMImCI mantém, em geral, a sua composição atómica (Fig. 3), como também mantém a sua reprodutibilidade (Fig. 9). De facto, apesar de se verificar adsorção não específica das biomoléculas de ARN, ou contactos entre as próprias moléculas de ARN à medida que o número de ensaios realizados aumenta, não é comprometida, no entanto, a pureza do ARN, de preferência ARNbp, recuperado no pico 1. Por último, determinou-se também a capacidade dinâmica de ligação para o ARN, de preferência ARNbp, a 10 e 50 % da capacidade máxima da matriz MP-SilPrMImCI, obtendo-se os seguintes valores, 3,68 e 12,04mg/mL. Em suma, a estratégia reportada para a separação de ARNt de ADNg poderá assumir uma especial relevância na preparação de ARN para aplicações terapêuticas, de diagnóstico ou para aplicações gerais de biologia molecular.

Exemplo de aplicação 3:

[0078] Numa forma de realização, a separação de ARN, de preferência ARNbp, de ADNg por cromatografia multimodal, utilizando a matriz MP-silPrMImCI foi realizada como se descreve de seguida.

[0079] Numa forma de realização, a matriz cromatográfica descrita nesta divulgação foi obtida a partir da matriz comercial macroporosa Toyopearl ^® AF-Epoxy-650M, na qual se imobilizou numa primeira instância um braço espaçador, e de seguida se ligou ao braço espaçador o 1-metilimidazol, ocorrendo desta forma a formação do ligando cromatográfico. Inicialmente, tendo em vista a ligação covalente do braço espaçador à matriz comercial, preparou-se uma suspensão da matriz MP (5g) em tolueno (60 mL), à qual se adicionou 3-cloropropiltrimetoxisilano (5 mL) e trietilamina (0,5 mL), utilizada como catalizador. Após 24h em refluxo e sob agitação magnética, a suspensão foi arrefecida, o sólido isolado por filtração e lavado com tolueno, etanol/água (1:1), água destilada e, finalmente, com metanol. Obtém-se desta forma a matriz com o espaçador designada por MP-SilPrCI.

[0080] De seguida, procedeu-se à reação da MP-SilPrCI com o 1-metilimidazol para se obter a MP funcionalizada com o LI cloreto de 1-metil-imidazólio. A uma suspensão da matriz MP com o espaçador (MP-SilPrCI) (5 g) em tolueno (60 mL), foi adicionado o 1-metilimidazol (5 mL). Esta suspensão foi mantida em refluxo durante 24h sob agitação magnética (550 rpm). Após este período, o sólido foi filtrado e lavado com metanol, água destilada e metanol e seco a 60 °C obtendo-se desta forma a matriz cromatográfica funcionalizada com o LI (MP-SilPrMImCI).

[0081] No que diz respeito à análise por ¹³ C CPMAS RMN-CPMAS, utilizaram-se configurações específicas de forma a maximizar a razão sinal-ruído: Vi ¹³ C = 55 kHz; recycle delay, 4 s; tempo de contacto, 1-2 ms; NS = lk; vR = 12 kHz. Os espectros de ¹³ C CPMAS das matrizes MP e MP-SilPrMImCI encontram-se representados na Fig. 2, tendo-se verificado a presença de sinais com desvios químicos nos intervalos 120-130 e 35-40 ppm no espectro da matriz MP-SilPrMImCI, que não se encontram presentes na matriz MP. Se por um lado, o sinal com desvio químico a 37 ppm se deve ao grupo metilo presente como cadeia alquílica do imidazólio, os sinais a 120-130 ppm são característicos dos átomos de carbono aromáticos, unicamente presentes no anel aromático imidazólio. Adicionalmente, efetuou-se também a análise elementar das matrizes MP e MP-SilPrMImCI para determinar quantitativamente o conteúdo em carbono, hidrogénio e azoto presente nas mesmas, de acordo com a Fig. 3. De uma forma geral, foi detetado azoto na matriz MP-SilPrMImCI, que não estava presente na matriz macroporosa comercial, corroborando os resultados obtidos por ¹³ C CPMAS sobre a correta funcionalização da matriz preparada. A carga superficial das matrizes MP e MP-SilPrMImCI também foi avaliada, através da determinação do PCZ a diferentes valores de pH. Como representado na Fig. 4, verificou-se que o pH ao qual as matrizes apresentam PCZ nulo foi, respetivamente, 3,7 e 8,7, para as matrizes MP e MP- SilPrMImCI, devendo-se esta alteração à presença do LI cloreto de 1-metilimidazólio. Finalmente, por microscopia eletrónica de varrimento, Fig. 5, verificou-se que a funcionalização da matriz MP com o LI não induziu alterações dignas de registo na sua morfologia.

[0082] A amostra de ácidos nucleicos compreende ARN, de preferência ARNbp, ARNr e ADNg e provém de um processo fermentativo de Escherichia coli DH5a. Para tal, efetuou-se o crescimento celular bacteriano num meio de cultura adequado (12g/L triptona, 24g/L extrato de levedura, 4mL/L glicerol, 0,017M KH ₂ P0 ₄ , 0,072M K ₂ HP0 ₄ ) sob condições específicas de rotação orbital (250 rpm), e temperatura (37 °C), em particular durante 2 horas. De seguida, efetuou-se a lise bacteriana recorrendo à solução de lise que contém o sal tiocianato de guanidina, à qual se segue um passo de concentração com isopropanol e um passo de lavagem com etanol. Finalmente, procedeu-se à solubilização da amostra com água bidestilada tratada com 0.05 % dietil pirocarbonato (DEPC), constituindo esta a amostra de ácidos nucleicos que contém ARN, de preferência ARNbp e ARNr, e ADNg, posteriormente empregue nos ensaios de separação.

[0083] De acordo com o exemplo 1, a matriz MP-SilPrMImCI poderá ser utilizada em condições que favorecem predominantemente interações eletrostáticas ou hidrofóbicas, devido ao seu carácter multimodal. De facto, de acordo com a estrutura do ligando cromatográfico utilizado, o LI cloreto de 1- metilimidazólio, verifica-se que este exibe um anel aromático, que: 1) apresenta elevada hidrofobicidade, tornando possível o estabelecimento de interações hidrofóbicas; 2) apresenta igualmente um centro de carga positiva, permitindo o estabelecimento de interações eletrostáticas com biomoléculas carregadas negativamente, atuando desta forma como trocador aniónico com o contra-ião cloreto inicialmente presente. No entanto, para promover essencialmente interações hidrofóbicas, são usadas elevadas concentrações de (NH ) ₂ S0 e, considerando o elevado potencial de eutrofização do (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , conjugado com o facto de ser obtido a partir de fontes não-renováveis, leva a que a utilização de elevadas concentrações deste reagente aumente muito a pegada ambiental de um processo cromatográfico. Desta forma, explorou-se a capacidade da matriz para estabelecer predominantemente interações eletrostáticas da matriz MP-SilPrMImCI, tendo em vista a separação de ácidos nucleicos. Inicialmente, empacotou-se uma coluna cromatográfica (Ge Healthcare, Uppsala, Suécia) de 10 mm de diâmetro e 26 mm de altura com 2 mL da matriz MP-SilPrMImCI hidratada, e a temperatura de operação na coluna foi definida como 25 °C, controlada com um banho termostatizado; os ensaios cromatográficos foram realizados no sistema ÃKTA Avant sob o controlo do software Unicom 6 (Ge Healthcare, Uppsala, Suécia), o qual permite não só a recolha automática das diferentes frações, como também permite monitorizar em tempo real diversos parâmetros tais como a condutividade, absorvância e pH. Após serem testados diferentes gradientes por passos com forças iónicas distintas, a estratégia otimizada consistiu no equilíbrio da matriz MP-SilPrMImCI com NaCI 0,380M (em Tris-HCI lOmM, pH 8), seguido do aumento da concentração de NaCI para 0.41 M e 0.5 M (em Tris-HCI 10 mM, pH 8) através de dois gradientes por passos e obtiveram-se 3 picos cromatográficos, os quais se encontram representados na Fig. 8-A por 1, 2 e 3, respetivamente. As amostras representadas por 1, 2 e 3 foram recolhidas separadamente, concentradas e dessalinizadas utilizando concentradores vivaspin (5000 MWCO, Sartorius, Gottingen, Alemanha), e finalmente analisadas num gel de agarose a 1 % (m/v), contendo GreenSafe Premium (Nzytech, Lisboa, Portugal) a uma concentração de 0,014pL/mL de gel de agarose.

[0084] Os resultados encontram-se na Fig. 8B, e é possível verificar que existem 4 bandas na amostra inicial - Fração S -, as quais correspondem a espécies distintas de ácidos nucleicos, nomeadamente, a banda com peso molecular superior corresponde ao ADNg, as duas bandas com pesos moleculares intermédios correspondem ao ARNr e a banda com peso molecular inferior corresponde ao ARNbp. Por outro lado, verificou-se que o ARNbp elui no pico 1, o gADN no pico 2 e o rARN no pico 3, o que vem confirmar que a estratégia cromatográfica implementada e desenvolvida com a matriz MP-SilPrMImCI permite a separação efetiva de ARNbp, ARNr e ADNg, provenientes de um extrato bacteriano.

[0085] Ainda que na presente divulgação se tenham somente representado e descrito realizações particulares da mesma, o perito na matéria saberá introduzir modificações e substituir algumas características técnicas por outras equivalentes, dependendo dos requisitos de cada situação, sem sair do âmbito de proteção definido pelas reivindicações anexas.

[0086] As realizações apresentadas são combináveis entre si.

[0087] As seguintes reivindicações definem adicionalmente realizações.

Referências:

[1] R. Martins, J.A. Queiroz, F. Sousa, Ribonucleic acid purification, J Chromatogr A (2014), 1355, 1-14.

[2] P. Pereira, J.A. Queiroz, A. Figueiras, F. Sousa, Affinity approaches in RNAi-based therapeutics purification, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sei (2016), 1021, 45-56.

[3] M.G. Freire, A.F.M. Cláudio, J.M.M. Araújo, J.A.P. Coutinho, I.M. Marrucho, J.N.C. Lopes, L.P.N. Rebelo, Aqueous biphasic systems: a boost brought by using ionic liquids, Chem Soc Rev (2012), 41, 4966-4995.

[4] L. Brown, M.J. Earle, M.A. Gílea, N.V. Plechkova, K.R. Seddon, Ionic liquid-chromatography: a new general purpose separation methodology, Top Curr Chem (Cham) (2017), 375 (5), 74.

[5] X. Shi, L. Qiao, G. Xu, Recent development of ionic liquid stationary phases for liquid chromatography, J Chromatogr A (2015), 1420, 1-15.