Complejos bicíclicos cis de platino (II) con actividad anticancerosa

La presente invención se refiere a nuevos complejos bicíclicos cis de platino (II) de 1 ,4-diaminas que poseen diferente grado de funcionalización, así como a su procedimiento de preparación y a su uso para el tratamiento y/o prevención del cáncer.

ESTADO DE LA TéCNICA ANTERIOR

Uno de los fármacos anticancerosos más ampliamente utilizados es el cis- (diamina)d¡cloroplat¡no(ll) o cisplatino, cis-[PtCl2(NH ₃ ) ₂ ]. La actividad citotóxica de este compuesto fue observada por primera vez por Rosenberg en 1969. Se sabe que cuando el cisplatino se administra a un paciente esta sustancia se distribuye en el organismo y alcanza Ia célula diana sin sufrir ninguna modificación estructural. Sin embargo, cuando el cisplatino entra en Ia célula, se hidroliza rápidamente para dar lugar a las especies tis- [PtCI(H2θχNH ₃ ) ₂ ] ⁺ , debido a que Ia concentración de iones cloruro en el interior de Ia célula (aproximadamente 3 mM) es más baja que Ia concentración de iones cloruro en el medio extracelular (aproximadamente 100 mM). El aducto de platino cargado positivamente es una molécula con una electrofilia incrementada respecto al correspondiente compuesto neutro y reacciona con nucleófilos presentes en el interior de Ia célula tales como Ia nucleobase guanina del ADN, en Ia posición N-7, o las proteínas con grupos azufrados. El cisplatino puede sufrir una segunda hidrólisis en el interior de Ia célula, Ia cual permite al fármaco unirse al ADN formando aductos cis bifuncionales. De entre los diferentes modos de conexión entre el ADN y el cisplatino, las uniones intracatenarias a través de dos bases de guanina vecinas, parece ser una etapa clave en el mecanismo de acción de este fármaco, ya que Ia distorsión producida en Ia estructura helicoidal del ADN puede inducir Ia muerte celular por apoptosis. Así, el cisplatino es un agente alquilante citotóxico bifuncional que reacciona con el ADN para producir enlaces inter e intracatenarios los cuales alteran los procesos de replicación y transcripción del ADN celular y causan Ia detención del ciclo celular en Ia fase G2.

Actualmente, el cisplatino se usa con frecuencia para el tratamiento de algunos tipos de cáncer, tales como el cáncer de ovario, pulmón o tumores

testiculares (cf. Y. P. Ho et al., Med. Res. Rev. 2003, vol. 23, p. 633). Sin embargo, las células cancerosas desarrollan varios mecanismos de resistencia al fármaco. Algunos ejemplos de estos mecanismos son: a) Ia inactivación del fármaco mediante su interacción con los restos azufrados de proteínas y péptidos; b) Ia disminución de Ia absorción del fármaco por parte de Ia célula o c) los mecanismos de reparación del ADN. Además, el uso clínico del cisplatino genera problemas de nefro- y neuro-toxicidad Io que limita Ia dosis de administración a los pacientes. Por las razones anteriormente mencionadas, es de gran interés encontrar nuevos complejos de platino (II) que superen los problemas de resistencia cruzada al cisplatino y que sean más eficientes y menos tóxicos que los fármacos actualmente usados en Ia oncología clínica.

EXPLICACIóN DE LA INVENCIóN

Los inventores han encontrado nuevos agentes antitumorales con relevante actividad citotóxica. Estos compuestos han mostrado ser potentes inhibidores de las células cancerosas frente a varias líneas celulares tumorales, especialmente aquéllas correspondientes a cánceres ginecológicos, resistentes y no resistentes al cisplatino. Cabe mencionar que algunos de estos nuevos compuestos son entre cuatro y cinco veces más activos que el cisplatino y que son capaces de evitar Ia resistencia desarrollada por las células cancerígenas contra el cisplatino.

Así, un primer aspecto de Ia presente invención es el proporcionar un compuesto de fórmula (I), o sus sales farmacéuticamente aceptables, o sus solvatos, incluyendo cualquier estereoisómero o mezcla de estereoisómeros,

R,

(I)

donde: Ia línea discontinua representa un enlace simple o doble; X es un birradical que se selecciona del grupo formado por N, O, S, y -(Ch^) _n -; n es un entero de 1 a 3; Ri es un radical independientemente seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, (Ci-C ₄ )-alcox¡lo, fenoxilo, fenil-(CH2) _r -O, y un radical derivado de los anteriormente mencionados con anillos bencénicos, a través de una mono-, di- o tri-sustitución en sus anillos bencénicos; siendo los sustituyentes un radical seleccionado independientemente del grupo formado por halógeno, (C _r C ₄ )-alqu¡lo, (C ₁ -C ₄ )- alcoxilo y halógeno; R ₂ y R' ₂ son un radical independientemente seleccionado entre el grupo formado por hidrógeno, hidroxi, (CrC ₄ )-alcoxilo, fenoxilo, fenil-(CH ₂ ) _r -O, y O-Gp, y un radical derivado de los anteriormente mencionados con anillos bencénicos, a través de una mono-, di- o tri- sustitución en sus anillos bencénicos; siendo los sustituyentes un radical seleccionado independientemente del grupo formado por halógeno, (CrC ₄ )- alquilo, (CrC ₄ )-alcoxilo y halógeno; r es un entero de 1 a 4; Gp es un grupo protector de alcoholes; R ₃ y R' ₃ son independientemente un halógeno o alternativamente R ₃ y R' ₃ tomados conjuntamente son un birradical seleccionado del grupo que consiste en -OCO-(CH2) _m -COO-, (C ₃ -C ₇ )- cicloalcano-1 ,1-dicarboxilato y (C- ₃ -C ₇ )-c¡cloalcano-1 ,2-dicarboxilato; y m es un entero de 0 a 4.

El Gp puede ser cualquier acetal tal como un acetónido i.e. 1 ,1- metilmetilendioxi; éteres, tales como los éteres metílico, etílico, isopropílico, fenílico o bencílico o esteres tales como acetato, benzoato u oxalato. El grupo protector se puede introducir y eliminar por métodos conocidos en el estado de Ia técnica (cf. TW. Greene and P.G.M. Wuts. Protective Groups in Orqanic Svnthesis, third EditionWiley-Interscience, (1999)). Las condiciones específicas dependen del grupo protector utilizado.

Los complejos forman un metalaciclo de siete miembros entre un átomo de platino (II) y un sistema de 1 ,4-d¡aminas, dando lugar a complejos os cuadrado-planos. Los estereocentros presentes en las moléculas pueden existir en Ia configuración R o S.

En una realización particular, los compuestos de fórmula (I) tienen Ia fórmula (Ia) ₁ donde R-i, R ₂ , R'2. R3, R'3 y X tienen el mismo significado que se ha mencionado anteriormente.

(Ia)

En una realización preferida, los compuestos de fórmula (I), son aquéllos donde X es O o un radical seleccionado entre metileno, etileno y propileno.

En otra realización preferida, los compuestos de fórmula (I) son aquéllos donde R ₃ y R' ₃ son ambos cloro o iodo.

En otra realización preferida, los compuestos de fórmula (I) son aquéllos donde R ₃ y R' ₃ tomados conjuntamente son un dicarboxilato de uno de los siguientes diácidos: ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico y ácido ciclobutano-1 ,1-dicarboxílico.

En otra realización preferida, los compuestos de fórmula (I) son aquéllos donde Ri es hidrógeno o metoxilo.

En otra realización preferida, los compuestos de fórmula (I) son aquéllos donde R ₂ y R' ₂ son independientemente seleccionados entre hidrógeno, hidroxilo, metoxilo, fenoxilo, benciloxilo y un acetónido.

Los compuestos más preferidos son aquéllos seleccionados entre los de Ia siguiente lista: (1) cis-(((3-aminometil-biciclo[2.2.1]hept-5-en-2-il)metilamina) diclorido) platino (II);

(2) cis-(((3-aminometilbicilo[2.2.1]hept-2-il)-metilamina)diclor ido) platino (II);

(3) cis-(((3-aminometil-7-oxabiciclo[2.2.1]hept-5-en-2-il)metila mina) dichlorido)platino (II);

(4) cis-(((3-aminometil-7-oxabicyclo[2.2.1]hept-2-il)metilamina) diclorido) platino (II);

(5) c¡s-(((3-aminomet¡l-b¡c¡clo[2.2.2]oct-5-en-2-¡l)metilam ¡na)diclor¡do) platino (II); y

(6) cis-(((3-am¡nometil-biciclo[2.2.2]oct-2-yl)metilam¡na)d¡c lor¡do) platino (II).

Los compuestos de Ia presente invención se pueden obtener a partir de una serie de 1 ,4-diaminas bicíclicas mediante Ia reacción de Diels-Alder entre fumaronitrilo y/o maleonitrilo como dienófilo y un dieno adecuado tal como furano, metoxifurano u otros furanos C-2 funcionalizados, ciclopentadieno, ciclohexadieno, cicloheptadieno o dienos sustituidos.

La introducción de los grupos R ₂ y R' ₂ se logra mediante funcionalización del doble enlace C5-C6, del cicloaducto precursor, via dihidroxilación con RuO ₄ , seguido de derivatización del diol resultante en Ia forma de un éter (mediante reacciones S _N 2 con los haloalcanos correspondientes), en Ia forma de un acetal (por reacciones con Ia cetona correspondiente, p.ej. acetona, en presencia de una cantidad de catalizador de un ácido) o en forma de un éster por reacción con el cloruro de ácido correspondiente o un anhídrido de ácido en presencia de una base p.ej. piridina o trietilamina como captador de ácido.

Los compuestos de fórmula (I) donde Ia línea discontinua es un enlace simple, se pueden preparar a partir de cicloaductos intermedios correspondientes por hidrogenación en presencia de un catalizador, por ejemplo, Pd/C. Los nitrilos se pueden reducir con LiAIH ₄ en un disolvente apropiado tal como éter dietílico o tetrahidrofurano (THF) para dar las diaminas correspondientes.

Finalmente las 1 ,4-diaminas se pueden hacer reaccionar con K ₂ PtCI ₄ , PtCI ₂ u otros reactivos de Pt(II) en un disolvente apropiado, por ejemplo, en etanol/agua 1 :1 para dar lugar a los complejos de cis-platino correspondientes (cf. Fig.1 ). Mediante este proceso las 1 ,4-diaminas se coordinaron al platino dando lugar a los correspondientes complejos de platino con un rendimiento cercano al 70%.

Se ha evaluado Ia actividad antiproliferativa y las relaciones estructura- actividad de los compuestos de Ia presente invención. Se han ensayado las

cinéticas de Ia interacción con glutation, Io cual ha mostrado los excelentes factores de resistencia observados para los nuevos complejos de platino.

Los ensayos de citotoxicidad se realizaron frente a líneas celulares cancerosas, sensibles (A2780) y resistentes (A2780cisR) al cisplatino. Se observó una excelente citotoxicidad para Ia mayor parte de estos complejos, incluso mucho mayor que Ia del cisplatino como fármaco de referencia. Cabe mencionar que todos los complejos nuevos evaluados presentan mejores factores de resistencia que el cisplatino frente a Ia línea celular cancerosa A2780cisR.

Así, según otro aspecto de Ia presente invención se proporciona un compuesto como se ha definido anteriormente para uso como anticancerígeno.

La presente invención también está relacionada con el uso de los compuestos de Ia presente invención para Ia preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico del cáncer en un mamífero, incluyendo al ser humano. Preferiblemente, los tipos de cáncer frente a los cuales los compuestos de Ia presente invención pueden ser especialmente activos se seleccionan entre los del siguiente grupo: cáncer de ovario, cáncer de mama, leucemia, cáncer de pulmón y cáncer testicular.

Los compuestos de Ia presente invención se pueden usar de Ia misma manera que otros agentes terapéuticos conocidos. Así, se pueden usar solos o en combinación con otros compuestos bioactivos adecuados.

La invención también está relacionada con un método de tratamiento y/o profilaxis de un mamífero, incluyendo el ser humano, que padece o es susceptible de padecer un cáncer, en particular uno de los cánceres mencionados anteriormente, dicho método comprende Ia administración a dicho paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de los compuestos de Ia presente invención, junto con excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.

Otro aspecto de Ia presente invención está relacionado con una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de los

compuestos de Ia presente invención, junto con cantidades apropiadas de excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.

El tratamiento quimioterapéutico del cáncer que deriva de esta invención es una nueva aproximación a Ia terapia oncológica y tiene Ia ventaja de ser útil para el tratamiento de varios tipos de cáncer.

A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. El resumen de esta solicitud se incorpora aquí como referencia. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.

BREVE DESCRIPCIóN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 resume Ia ruta sintética para Ia preparación de los complejos bicíclicos del cis platino (II). En Ia FIG. 1 Ia ruta sintética se ha particularizado para Y = Cl como ligando lábil.

La FIG. 2 ilustra los resultados de los estudios cinéticos de Ia interacción de los complejos de platino con glutatión. Se representa el % de acoplamiento (A) platino (Pt)-glutation (GSH) frente al tiempo en horas.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 : Preparación de b¡ciclof2.2.1]hept-5-en-2.3-d¡carbonitrilo (1 )

En condiciones anhidras, se disolvió fumaronitrilo (1.0 g, 13.1 mmol) en etanol absoluto (15 mL) y se añadió, gota a gota, ciclopentadieno (1.2 mL, 13.9 mmol). Después de haber completado Ia adición, se enfrió Ia mezcla de reacción en un baño de hielo y agua y, al cabo de 30 min de agitación, se redujo el volumen de etanol a Ia mitad, a vacío. Se mantuvo Ia solución obtenida a 4 ⁰ C en Ia oscuridad durante 3 días, obteniéndose un precipitado sólido de color blanco que fue filtrado (1.70 g). Rendimiento = 73%, IR (KBr)

3080, 2990, 2950, 2244. EM (Cl, NH ₃ , %) 145 (1 , IVH-H ⁺ ), 162 (88, IVH-NH ₄ ⁺ ), 163 (10, M+NH ₄ ⁺ +H ⁺ ).

Ejemplo 2: Preparación de 7-oxabiciclor2.2.nhept-5-en-2.3-dicarbonitrilo (2)

En condiciones anhidras, se disolvió fumaronitrilo (1.0 g, 12.8 mmol) en furano (20 ml_, 275 mmol). Se calentó Ia mezcla a reflujo y después de 19 horas se enfrió y se filtró para aislar el producto (2) como un sólido blanco. Las aguas madres se refluyeron durante 30 horas, aislándose una nueva porción del producto (2) por filtración (total: 1.48 g). Rendimiento = 81 %. P.F. = 113-114 ⁰ C (furano). IR (KBr) 3100, 2961 , 2925, 2244, 1559. EM (Cl, NH ₃ , %) 102 (100, M-2(CH-CN)+N ₂ H ₇ ⁺ ), 103 (33, M-2(CH-CN)+N ₂ H7 ⁺ +H ⁺ ), 164 (9, M+NH ₄ ⁺ +H ⁺ ), 181 (56, M+N ₂ H ₇ ⁺ ).

Ejemplo 3: Preparación de 1-metoxi-7-oxabiciclo[2.2.11hept-5-en-2.3- dicarbonitrilo (3a) v (3b)

Se disolvió fumaronitrilo (550 mg, 7 mmol) en etanol absoluto (5 ml_) y después se añadió 2-metoxifurano de una sola vez y bajo nitrógeno. La mezcla de reacción se agitó durante cuatro días a temperatura ambiente y se filtró obteniendo 1.2 g de un sólido blanco constituido por una mezcla de diastereoisómeros: (3a) (1 R*, 2R*. 3R*, 4S*) (70 %) y (3b) (1 R*, 2S ^* , 3S*, 4S*) (30 %). El producto (3b) se separó mediante cristalización fraccionada en una mezcla de cloroformo y etanol. Después de Ia purificación mediante cromatografía en columna de Ia mezcla se obtuvo el producto (3a) puro. Se obtuvieron así mismo cristales adecuados de (3a) para realizar análisis mediante difracción de rayos X. Rendimiento = 83%.

(3a): P. F. = 124-126 ⁰ C (CHCI3/etanol 6/4). IR (film) 3099, 2988, 2968, 2954, 2857, 2250, 1584, 1455, 1330, 1273, 1171 , 1086, 1073, 1048, 984, 951 , 932.

(3b): IR (film) 3099, 2988, 2968, 2954, 2857, 2250, 1584, 1455, 1330, 1273, 1171 , 1086, 1073, 1048, 984, 951 , 932. EM (Cl, NH ₃ , %): 78 (3, M-C ₅ H ₆ O ₂ ), 99 (83, M-C ₂ H-2CN), 177 (51 , M+H ⁺ ), 194 (100, M+NH ₄ ⁺ ).

Ejemplo 4: Preparación de biciclor2.2.21oct-5-en-2.3-dicarbonitrilo (4)

Bajo condiciones anhidras se disolvió fumaronitrilo (1.0 g, 13.1 mmol) en etanol absoluto (10 ml_) y se añadió 1 ,3-ciclohexadieno (2.5 ml_) gota a gota. Una vez completada Ia adición, Ia mezcla de reacción se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente, al cabo de las cuales se añadió, de una sola vez, BF ₃ -Et ₂ O (5 μl_). Después de 36 horas se evaporó el disolvente a vacío y el producto se purificó mediante columna de cromatografía usando mezclas de hexano y acetato de etilo de polaridad creciente como eluyentes. El producto (4) se aisló mediante elución con hexano-acetato de etilo 60:40

(1.31 g). Rendimiento = 42%. IR (KBr) 3060, 2952, 2876, 2244. EM (Cl, NH ₃ , %) 176 (92, IvH-NH ₄ ⁺ ), 193 (100, IvRN ₂ H ₇ ⁺ ).

Ejemplo 5: Preparación de biciclo[3.2.21non-8-en-6.7-dicarbonitr¡lo (5)

En un tubo de Pyrex se disolvió fumaronitrilo (400 mg, 5.13 mmol) en tolueno anhidro (5 ml_). En otro matraz se disolvió cicloheptadieno (500 mg, 5.10 mmol) en tolueno anhidro (2 ml_) y se añadió vía cánula sobre Ia disolución anterior de fumaronitrilo. Completada Ia adición se añadió BF ₃ -Et ₂ O (3 μl_). El tubo de Pyrex se purgó con nitrógeno, se cerró herméticamente y se calentó a 80 ⁰ C. Después de varios días Ia reacción se detuvo (control por cromatografía). El disolvente se evaporó a vacío y el crudo de reacción se purificó mediante columna de cromatografía, usando mezclas de hexano/acetato de etilo de polaridad creciente como fase móvil. El compuesto (5) se aisló con hexano/acetato de etilo 80:20 (91 mg).

Rendimiento = 18%. IR (film) 3050, 2934, 2865, 2242, 1674, 1447, 1095, 816. EM (Cl, NH ₃ , %) 208 (27, MH-N ₂ H ₇ ⁺ ), 190 (100, M+NH ₄ ⁺ ).

Ejemplo 6: Procedimiento general para Ia hidroqenación de nitrilos bicíclicos.

Este procedimiento se ejemplifica para Ia reacción de hidrogenación del sustrato (1) con objeto de obtener el biciclo [2.2.1] heptano-2,3- dicarbonitrilo (6).

Bajo atmósfera de argón, se añadió una solución del sustrato (1) (263 mg, 1.8 mmol) en THF (10 mL) sobre 60 mg de Pd/C (10 % en masa) como catalizador. Se añadieron otros 12 mL de THF y el matraz de reacción se

purgó mediante cinco ciclos de vacío/hidrógeno. El sistema se agitó vigorosamente bajo atmósfera de hidrógeno durante 15 horas a temperatura ambiente. Después, Ia mezcla de reacción se sometió a sonicación en un baño de ultrasonidos con objeto de desorber el producto retenido por el paladio y el carbón, procediéndose posteriormente a Ia filtración a través de Celite. El disolvente se evaporó a vacío, obteniéndose el producto (6) en forma de sólido blanco (189 mg). Rendimiento = 99%. P.f. = 80-82 ⁰ C (THF). IR (Film, v, cm ^'1 ): 2960-2885 (Csp ³ -H, st), 2242 (C≡N, st), 1457, 1306, 841. EM (Cl, NH ₃ , %) 164 (55, IvHNH ₄ ⁺ ), 167 (66, IvRN ₂ H ₇ -CH ₂ ), 182 (100, M+N ₂ H ₇ +H ⁺ ).

Ejemplo 7: Preparación de 7-oxab¡cicloí2.2.1lheptano-2.3-dicarbonitrilo (7)

La obtención del compuesto (7) a partir de (2) se llevó a cabo utilizando H ₂ (Pd/C), siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 6. Rendimiento =

67%. P.F. = 116-117 ⁰ C (hexano/ acetato de etilo 3/7). IR (film) 2998, 2962,

2927, 2889, 2246, 1468, 1177, 1038, 1017, 928, 905 843. EM (Cl, NH ₃ , %) 91

(46, M-CH ₂ OH-CN), 100 (100, M-2CN+4H), 104 (50, M-CN-H ₂ O), 117 (M-

CH2OH).

Ejemplo 8. Preparación de 1-metoxi-7-oxab¡ciclo[2.2.11heptano-2.3- dicarbonitrilo (8)

La reacción para obtener los diastereoisómeros 8a (1 R*, 2R*, 3R*, 4S*) y 8b (1 R*, 2S*, 3S*, 4S*) se llevó a cabo siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 6, partiendo del precursor (3).

(8a): Rendimiento = 99%. IR (film) 2962, 2856, 2366, 1465, 1320, 1264, 1189, 1150, 1032, 965. EM (Cl, NH ₃ , %) 178 (1 , M ⁺ ), 196 (100, M+NH ₄ ⁺ ).

(8b): Rendimiento = 99%. P.F. = 114-117 ⁰ C (hexano/acetato de etilo 75/25). IR (film) 2962, 2856, 2366, 1465, 1320, 1264, 1189, 1150, 1032, 965.

Ejemplo 9: Preparación de biciclof2.2.21octano-2.3-dicarbonitrilo (9)

La obtención de (9), a partir de (4) se llevó a cabo siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 6. Rendimiento = 99%. P. F. = 171-173 ⁰ C (THF). IR

(film) 2952, 2875, 2246, 1457, 1347, 1301 , 1248, 1026, 911. EM (Cl, NH ₃ , %) 178 (100, IVH-NH ₄ ⁺ ).

Ejemplo 10: Procedimiento general de reducción de los nitrilos a diaminas.

Este procedimiento se ejemplifica para Ia transformación del dinitrilo (1) en Ia 1 ,4-diamina (10). Así, el dinitrilo (1) (963 mg, 6.7 mmol) se disolvió en éter dietílico (30 ml_) y se añadió gota a gota a una suspensión de LiAIH ₄ (1.02 g, 26.8 mmol) en éter (10 mL). Después de dos horas de agitación a temperatura ambiente, el exceso de hidruro se destruyó mediante adición cuidadosa de agua (2 mL) gota a gota, seguida de adición de hidróxido de sodio al 30 % (4 mL) y finalmente agua (5 mL). La suspensión se filtró y el disolvente se eliminó a vacío, obteniendo el (3-aminometil-biciclo[2.2.1]hept- 5-en-2-il)-metilamina QO) como un aceite amarillo (788 mg). Rendimiento = 92 %. IR (film) 3286, 3056, 2959, 2871 , 1576. EM (Cl, NH ₃ , %) 134 (2, M- NH ₄ ⁺ ), 153 (100, M+H ⁺ ), 154 (10, M+2H ⁺ ).

Ejemplo 11 : Preparación de (3-aminometil-7-oxa-bic¡clo| ^' 2.2.1 ^' |hept-5-en-2-iD- metilamina (11 )

La obtención de (H) a partir de (2) se llevó a cabo siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 10, pero usando THF (3 mL para 1.4 mmol de sustrato) como disolvente. La diamina (H) se aisló mediante cromatografía en columna (77 mg, eluyendo con EtOH /NH3 80:20). Rendimiento = 36 %. IR (film) 3349, 3320, 3200, 3100, 3075, 2990, 2921 , 2880, 1574. EM (Cl, NH ₃ , %) 155 (100, M+H ⁺ ), 156 (12, M+2H ⁺ ), 157 (5, M+3H ⁺ ), 172 (4, M+NH ₄ ⁺ ), 309 (5, 2M+H ⁺ ).

Ejemplo 12: Preparación de (3-aminometil-b¡c¡clor2.2.21oct-5-en-2-ih- metilamina (12)

La obtención de (12) a partir de (4) se llevó a cabo siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 10. Rendimiento = 88%. IR (film) 3291 , 3040, 2938, 2867, 1576. EM (Cl, NH ₃ , %) 167 (100, M+H ⁺ ).

Ejemplo 13: Preparación de (7-aminometil-biciclor3.2.21non-8-en-6-il)- metilamina (13)

La obtención de (13) a partir de (5) se llevó a cabo siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 10. Rendimiento = 47%. IR (film) 3284 (N-H, st), 3031 , 2921 , 1574, 1462, 1383, 1325. EM (Cl, NH ₃ , %) 181 (100, M+H ⁺ ).

Ejemplo 14: Obtención de las diaminas bicíclicas hidrogenadas. Preparación de (3-am¡nometil-biciclor2.2.nhept-2-il)-metilam¡na (14)

Las aminas saturadas se obtuvieron mediante una de las siguientes metodologías (ver FIG. 1 ): a) Reducción de los correspondientes dinitrilos saturados (6) a (9), para obtener las diaminas (14) a (17) siguiendo un procedimiento sintético similar al del ejemplo 6; b) Hidrogenación catalítica de las diaminas insaturadas (10), (H) o (12), para obtener las correspondientes diaminas saturadas (14), (15) y (17), respectivamente, siguiendo un procedimiento sintético similar al descrito en el ejemplo 6.

Obtención del producto (14): a) A partir del sustrato (10), Rendimiento = 97 %; b) A partir del sustrato (6), Rendimiento = 94%. IR (film) 3322, 2948, 2875, 1564. EM (Cl, NH ₃ , %) 155 (100, M+H ⁺ ), 172 (10, M+NH ₄ ⁺ )

Ejemplo 15: Preparación de (3-aminometil-7-oxa-biciclor2.2.πhept-2-il)- metilamina (15)

Se obtuvo aplicando un procedimiento análogo al del Ejemplo 6 a partir del sustrato (H). Rendimiento = 87 %. Se obtuvo aplicando un procedimiento análogo al del Ejemplo 14 a partir del sustrato (7). Rendimiento = 24%. IR (film) 3250, 3150 (N-H, st), 2965, 2921 , 1655. MS (Cl, %) 138 (13, M-NH ₄ ⁺ ), 157 (100, M+H ⁺ ), 158 (11 , M+2H ⁺ ), 167 (4).

Ejemplo 16: Preparación de 2.3-bis(aminometil)-1-metox¡-7- oxabiciclor2.2.nheptano. (diastereoisómeros (16a) (1 R*. 2R*. 3R*. 4S*) v (16bU1 R ^* . 2S ^* . 3S ^* . 4S ^* )

Se obtuvo aplicando un procedimiento análogo al del Ejemplo 14 a partir a partir de (8a) y/o (8b). Rendimiento = 42%

(16a): IR (film) 3288, 2925, 1567, 1466, 1387, 1310, 1223, 1191, 1144, 1028, 978. EM (Cl, NH ₃ , %) 170 (56, M-NH ₂ ), 187 (100, M+H ⁺ ).

(16b): IR (film) 3288, 2925, 1567, 1466, 1387, 1310, 1223, 1191, 1144, 1028, 978. EM (Cl, NH ₃ , %) 170 (56, M-NH ₂ ), 187 (100, M+H ⁺ ).

Ejemplo 17: Preparación de (3-aminomet¡l-b¡c¡clo[2.2.2 ^" |octano-2-il)- metilamina (17)

Se obtuvo aplicando un procedimiento análogo al del Ejemplo 6 a partir a partir de (12). Se obtuvo aplicando un procedimiento análogo al del Ejemplo 14 a partir de (9). Rendimiento = 93 % Rendimiento = 81%. IR (film): 3290, 2950, 2860, 1650, 1550. EM (Cl, NH ₃ %) 169 (100, M+H ⁺ ).

Ejemplo 18: Preparación de 5.6-dihidrox¡b¡ciclo| ^" -2.2.11-heptano-2.3- dicarbonitrilo. (diastereoisómeros (18a) MS*. 2S ^* . 3S ^* . 4R ^* . 5R ^* . 6S ^* ) v 18b (1S*. 2S*. 3S ^* . 4R*. 5S*. 6R*))

El sustrato (1) (250 mg, 1.7 mmol) se disolvió en una mezcla de acetona/éter 8:2 (6 ml_). A esta disolución se añadió tetraóxido de osmio (16 mg) en agua (1 mL) y a continuación H ₂ O ₂ al 35 % (0.8 ml_) a 0 ⁰ C. La solución resultante se agitó en Ia oscuridad durante 6 horas. La mezcla de reacción se concentró a sequedad a vacío para obtener un sólido marrón, el cual fue sometido a columna de cromatografía usando mezclas de hexano y acetato de etilo de polaridad creciente. El diol (18a) (183 mg) se eluyó con hexano/acetato de etilo 3/7 y su diastereoisómero (18b) (38 mg) con hexano/acetato de etilo 35/65. Rendimiento = 57%.

(18a): P.f. = 137-138 ⁰ C (hexano/acetato de etilo 7/3). IR (film): 3423 (OR-H, st), 2983-2948 (Csp ³ -H, st), 2248 (C≡N, st), 1268, 1083, 1026.92: 3417 (OR- H, st), 2948 (Csp ³ -H, st), 2246 (C=N, st), 1457, 1420, 1331, 1308, 1182, 1088, 1032, 1005, 957. EM (Cl, NH ₃ , %) 109 (23, M-2CN-OH), 178 (100, M).

(18b): IR (film): 3423 (OR-H, st), 2983-2948 (Csp ³ -H, st), 2248 (O-N, st), 1268, 1083, 1026.92: 3417 (OR-H, st), 2948 (Csp ³ -H, st), 2246 (CsN, st), 1457, 1420, 1331, 1308, 1182, 1088, 1032, 1005, 957. EM (Cl, NH ₃ , %) 109 (23, M-2CN-OH), 178 (100, M).

Ejemplo 19: Preparación de ñS*. 2S*. 4R*. 6R*. 8S*. 9S*)-4.4-dimetil-3.5- dioxatriciclor5.2.1.0 ^{2 6} 1decano-8.9-d¡carbonitrilo (19)

A una disolución del diol (18a) (60 mg, 0.34 mmol) en acetona anhidra (6 ml_) se añadieron 2,2-dimetoxipropano (1 ml_, 8.2 mmol) y ácido β-toluensulfónico (10 mg). La mezcla se calentó a reflujo durante 3 horas y se agitó a temperatura ambiente durante una hora adicional. Después Ia mezcla de reacción se concentró a sequedad, se disolvió con acetato de etilo (7 ml_) y Ia solución orgánica resultante se lavó con disolución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (2 ml_) y solución saturada de cloruro de sodio (2 ml_). La fase orgánica resultante se secó sobre sulfato de magnesio anhidro y se concentró a sequedad, obteniéndose 64 mg de (19). Rendimiento = 87%. P.F.= 162-163 ⁰ C (acetato de etilo). IR (film) 2991 , 2952, 2937, 2913, 2246, 1465, 1382, 1272, 1208, 1169, 1158, 1075, 1050, 864. EM (Cl, NH ₃ , %) 190 (9, M-CH ₂ -CH ₃ H-H ⁺ ), 203 (100, M-CH ₃ ), 219 (6, M+H ⁺ ), 236 (9, M+NH ₄ ⁺ ).

Ejemplo 20: Preparación de MS*. 2S*. 4R*. 6R*. 8S*. 9S*)-8.9- bis(aminometil)- 4.4-dimet¡l-3.5-dioxatriciclo[5.2.1.0 ^2t6 ]decano. (20)

La obtención del compuesto (20) a partir de (19) se llevó a cabo siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 10. Rendimiento = 75%. IR (film) 3348, 3274, 3172, 2979, 2937, 1654, 1561 , 1382, 1374, 1316, 1270, 1208, 1164, 1044. EM (Cl, NH ₃ , %) 152 (5, M-C(CH ₃ J ₂ -CH ₂ NH ₂ ), 183 (5, M-C(CH ₃ J ₂ ), 227 (82, M+H ⁺ ).

Ejemplo 21 : Preparación de (1 R*. 2R*. 3S*. 4S*. 5S ^* . 6S ^* )-5.6- b¡s(am¡nomet¡nbiciclor2.2.11heptano-2.3-d¡ol. (21 )

El compuesto (20) (52 mg, 0.28 mmol) se disolvió en 2M HCI (4 ml_). La mezcla se agitó durante 80 min y se añadió NaOH 3.5 M (3.5 ml_) para neutralizar el medio ácido. La mezcla de reacción se concentro a sequedad y el sólido marrón resultante se disolvió en metanol y Ia solución resultante se filtró a través de alúmina y Celite, obteniéndose 287 mg de un sólido que fue purificado mediante columna de cromatografía usando mezclas de etanol y amoníaco como eluyentes. El producto (21) (7 mg) se eluyó con etanol/amoníaco 75:25 y 70:30. Rendimiento = 18%. IR (film) 33280 (N-H, OR-H, St), 2925-2840 (Csp ³ -H, st), 1684, 1654, 1576, 1561 , 1507, 1459, 1322, 1082. EM (Cl, NH ₃ , %) 78 (100, M-2H ₂ O-2CH2NH ₂ -CH ₂ ), 90 (9, M- 2H ₂ O-2CH ₂ NH ₂ ), 104 (40, M^H ₂ O-CH ₂ NH ₂ -CH ₂ ), 119 (12, M-OH-H ₂ O-2NH ₂ ), 136 (16, M-2OH-NH ₂ ), 187 (9, M+H+ ).

Ejemplo 22: Preparación de cis-(F(3-aminometil-bic¡clof2.2.1]hept-5-en-2-¡l)- metilaminaldiclorojplatinodl), (22).

Se añadió una solución de Ia diamina (10) (81 mg, 0.53 mmol) en etanol (5 mL) a una solución de K ₂ PtCU (220 mg, 0.53 mmol) en agua (5 mL). La mezcla de reacción se agitó en Ia oscuridad durante 24 horas y posteriormente se filtró a través de una placa de vidrio sinterizado (tamaño de por 10-16 μm). El precipitado amarillo resultante se lavó sucesivamente con agua, etanol, acetona y diclorometano y se secó a vacío obteniendo 200 mg del producto (22) (0.48 mmol). Rendimiento = 91 %. P.f. = 240-242 ⁰ C. IR (KBr) 3440, 3250, 3210, 3120 (N-H, st), 3075, 2957, 2873, 1601 , 1454 cm ^"1 . E.M. (MALDI-TOF, m/z): 345.7 (M-2CI-H). E. Anal.: N (6.70 %), C (25.80 %), H (3.82 %). Caled para C9H16N2CI2Pt: N (6.70 %), C (25.85 %), H (3.86 %).

Ejemplo 23: Preparación de c¡s-(f(3-aminomet¡l-7-oxab¡cicloí2.2.nhept-5-en- 2-il)-metilaminaldicloro)platino(ll) (23).

Siguiendo el mismo procedimiento que el descrito en el ejemplo 22, Ia diamina (H) se transformó en el complejo de platino (23). Rendimiento = 44%. P.F. = 230-232 ⁰ C. IR (KBr) 3459, 3226, 3150 (N-H, st), 2950, 2886, 1593, 1456 cm ^"1 . E.M. (FAB (+), m/z): 502 (M-2CI+NBA), 537 (M-CI+NBA). E.

Anal.: N (6.16 %), C (23.15 %), H (3.87 %). Caled para C ₈ H ₁₄ ON ₂ CI ₂ Pt: N (6.66 %), C (22.85 %), H (3.33 %).

Ejemplo 24: Preparación de cis-{[(3-aminomet¡l-biciclo[2.2.21oct-5-en-2-¡l)- metilamina]dicloro)platino(ll) (24).

Siguiendo el mismo procedimiento que el descrito en el ejemplo 22, Ia diamina (12) se transformó en el complejo de platino (24). Rendimiento = 72%. P.F. = 245-247 ⁰ C. IR (KBr) 3444, 3220, 3210 (N-H, st), 3130, 3050, 2940, 2873, 1597, 1456 cm ^"1 . E.M. (MALDI-TOF, m/z): 359.9 (M-2CI-H). E. Anal.: N (6.13 %), C (27.61 %), H (4.57 %). Caled para C ₁₀ H ₁₈ N ₂ CI ₂ Pt: N (6.48 %), C (27.8 %), H (4.16 %).

Ejemplo 25: Preparación de cis-f (7-aminomet¡l-biciclor3.2.21non-8-en-6-il)- metilaminaldicloroplatino (II). (25).

La diamina (13) (38 mg, 0.21 mmol) se disolvió en etanol absoluto (2 mL). Por otro lado, se disolvió K ₂ PtCI ₄ (89 mg, 0.21 mmol) en agua (4 mL). Esta segunda disolución se añadió, gota a gota, a Ia primera solución y Ia mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 5 h. Se formó un precipitado amarillo pardo que se filtró y lavó, obteniendo 57 mg del producto (25). Rendimiento = 61%. P.F. = 247-249 ⁰ C (agua/ etanol). IR (KBr, v, cm ^'1 ): 3448, 3220, 3131 , 3035, 2929, 2861 , 1599, 1383, 1207, 1036. EM [FAB(+), NBA, m/z]: 489 (M-CI+DMSO+H ⁺ ). E. Anal. Hallado: C (32.19 %), H (5.14 %), N (6.20 %). Caled, para C ₁₁ H ₂₀ CI ₂ N ₂ Pt (446): C (29.60 %), H (4.52 %), N (6.28 %).

Ejemplo 26: Preparado de cis-{f(3-aminometil-biciclo[2.2.11hept-2-il)- metilamina1dicloro}platino(ll) (26).

Siguiendo el mismo procedimiento que el descrito en el ejemplo 22, Ia diamina (14) se transformó en el complejo de platino (26). Rendimiento = 71%. P.F. = 179-182 °C. IR (KBr) 3432, 3255, 3222, 3125 (N-H, st), 2948, 2875, 1603, 1452, 1383 cm ^"1 . E.M. (MALDI-TOF, m/z): 414 (M-7H), 385 (M- Cl), 348 (M-2CI-H), 345 (M-2CI-4H). E. Anal.: N (6.29 %), C (25.93 %), H (4.54 %). Caled para C ₉ H ₁₈ N ₂ CI ₂ Pt: N (6.66 %), C (25.71 %), H (4.28 %).

Ejemplo 27: Preparación de cis-{[(3-aminometil-7-oxabicicloí2.2.1lhept-2-il)- metilam¡na]d¡cloro}platino (II) (27).

Siguiendo el mismo procedimiento que el descrito en el ejemplo 22, Ia diamina (15) se transformó en el complejo de platino (27). Rendimiento = 24%. P.F. = 248-250 ⁰ C. IR (KBr) 3492, 3270, 3226, 3150 (N-H, st), 2969, 2900, 1589, 1456 cm ^'1 . E.M. (MALDI-TOF ₁ m/z): 351 (M-2CI-H), 386 (M-Cl). E. Anal.: N (6.31 %), C (23.46 %), H (4.25 %). Caled para C ₈ H ₁₆ ON ₂ CI ₂ Pt: N (6.63 %), C (22.75 %), H (3.79 %).

Ejemplo 28: Preparación de c¡s-{[(3-aminomet¡l-b¡ciclo[2.2.2 ^' |oct-2-¡l)- metilaminaldiclorok>latino(IIU28).

Siguiendo el mismo procedimiento que el descrito en el ejemplo (22), Ia diamina (1_7) se transformó en el complejo de platino (28). Rendimiento = 74%. P.F. = 185-187 ⁰ C. IR (KBr) 3444, 3270, 3222 (N-H, st), 3125, 2934, 2880, 1600, 1456 cm ^'1 . E.M. (MALDI-TOF, m/z): 355.9 (M-2CI-7H). E. Anal.: N (6.16 %), C (27.66 %), H (5.05 %). Caled para C ₁₀ H ₂₀ N ₂ CI ₂ Pt : N (6.45 %), C (27.65 %), H (4.61 %).

Ejemplo 29: Preparación de ((1S*. 2S*. 4R*. 6R*. 8S*. 9S*)-í8.9- bis(am¡nometil)-4.4-dimetil-3.5-dioxatríciclor5.2.1.02.61d ecano-]dicloro} platin (II), (29)

Siguiendo el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 22, Ia diamina (20) se transformó en un complejo de platino (29). Yield = 704 %. Sólido marrón, P.f. = 275 ⁰ C (decomp.) IR (KBr, u, cm ^"1 ): 3504-3260-3220-3130 (N-H, st), 2990-2956 (Csp ³ -H, st), 1654, 1602, 1507, 1459, 1382, 1268, 1210, 1046. MS (MALDI): 531 (100, M-CI+DMSO), 575 (40, M-2CI+2DMSO). HRMS (Electrospray): 513.0576 (91 %), caled, para ¹² C ₁₂ ¹ H ₂₂ ¹⁴ N ₂ ¹⁶ O ₂ ²³ Na ³⁵ CI ₂ ¹⁹⁴ Pt: 513.0577 δ(mDa) = 0.1 ; 514.0598 (100 %); caled, for 1 ² C ₁₂ ¹ H ₂₂ ¹⁴ N ₂ ¹⁶ O ₂ ²³ Na ³⁵ CI ₂ ¹⁹⁵ Pt: 514.0598 δ (mDa) = 0.02; 515.0525 (43 %), caled, para ¹² C ₁₂ ¹ H ₂₂ ¹⁴ N ₂ ¹⁶ O ₂ ²³ Na ³⁵ CI ³⁷ CI ¹⁹⁴ Pt: 515.0548 δ (mDa) = 2.2; 515.0615 (55 %), caled, for ¹² C ₁₂ ¹ H ₂₂ ¹⁴ N ₂ ¹⁶ O ₂ ²³ Na ³⁵ CI ₂ ¹⁹⁶ Pt: 515.0600 δ (mDa) = 1.5; 516.0566 (62 %), caled, for ¹² C ₁₂ ¹ H ₂₂ ¹⁴ N ₂ ¹⁶ O ₂ ²³ Na ³⁵ CI ³⁷ CI ¹⁹⁶ Pt: 516.0569 δ (mDa) = 0.3; 517.0566 (35 %), caled, for 1 ² C ₁₂ ¹ H ₂₂ ¹⁴ N ₂ ¹⁶ O ₂ ²³ Na ³⁵ CI ³⁷ CI ¹⁹⁶ Pt: 517.0570 δ (mDa) = 0.4; 518.0532 (10

%), caled, for ¹² C ₁₂ ¹ H ₂₂ ¹⁴ N ₂ ¹⁶ O ₂ ²³ NaI ³⁷ CI ₂ ¹⁹⁵ Pt: 518.0539 δ (mDa) = 0.8; 519.0610 (11 %), caled, para ¹² Ci ₂ ¹ H ₂₂ ¹⁴ N ₂ ¹⁶ O ₂ ²³ Na ³⁷ CI ₂ ¹⁹⁶ Pt: 519.0541 δ (mDa) = 6.9. Anal. Encontrado: %N= 5.07 %C= 29.87 %H= 4.91. Caled.: %N= 5.69 %C= 29.28 %H= 4.50.

Ejemplo 30. Estudios cinéticos de Ia interacción de los complejos de platino con glutatión.

Uno de los principales mecanismos de resistencia desarrollados por las células cancerosas es el incremento de Ia desactivación de los fármacos mediante el aumento de Ia interacción de los complejos de platino (II) con los grupos azufrados de biomoléculas tales como glutatión, los cuales actúan como buenos nucleófilos, desplazando los átomos de cloro del complejo (u otros ligandos lábiles). El glutatión es una biomolécula capaz de regular Ia actividad de algunos fármacos platinados debido a Ia coordinación del átomo metálico a los grupos tiol.

Para observar si había diferencia entre los nuevos complejos en su interacción con esta biomolécula, se evaluó Ia cinética de unión al glutatión de esta nueva serie de compuestos. La cinética se determinó utilizando espectroscopia ultravioleta midiendo los cambios de absorción a 260 nm (a esta longitud de onda hay una absorción del enlace Pt-tiol y también una absorción del átomo de Pt aislado, sin embargo, este segundo fenómeno presenta un coeficiente de extinción menor). Soluciones acuosas de los complejos de platino se mezclaron con disoluciones de glutatión recientemente preparadas y Ia cinética de reacción se midió durante un periodo de 24 horas para cada compuesto.

Las reacciones de los complejos de platino con glutatión se monitorizaron mediante espectroscopia UV ₁ utilizando un Ultraspec-2100-Pro UV/visible espectrofotómetro con cubetas o celdas de cuarzo de 1 cm de paso óptico. Las soluciones de los compuestos de platino y de glutatión se prepararon en tampón Tris-HCI. Volúmenes adecuados de las soluciones de los complejos y de glutatión se mezclaron para alcanzar una proporción final de 1 :500 (complejo de platino/glutatión), cercana a las condiciones que se alcanzarían en Ia célula, y en estas condiciones se analizaron las muestras para determinar Ia absorbancia a 260 nm. Como blanco se utilizó una solución de

glutatión. Las gráficas de las cinéticas de unión al glutatión, tanto del cisplatino como de los nuevos complejos de platino se ¡lustran en Ia FIG.2.

Los valores del tiempo de semi-reacción (ti _/2 ) obtenidos para los diferentes compuestos se recogen en Ia Tabla 1. En este ensayo, se observaron diferencias entre los complejos evaluados en su interacción con el glutatión. Además, todos los compuestos estudiados produjeron cinéticas de unión más lentas que el cisplatino.

Tabla 1. Tiempo de semi-reacción (ti _/2 ) de Ia cinética de unión platino- glutatión.

Compuesto ti/ ₂ (min)

22 333

23 -

24 835

26 887

27 61

28 131

Cisplatino 22

El complejo que posee un puente oxigenado y un doble enlace (23), no presenta ninguna interacción con el glutatión. Este compuesto no mostró ningún incremento en Ia absorción respecto al blanco de referencia, incluso después de repetir cuidadosamente el experimento cinco veces. Así, en este caso particular, fue tan lenta que no pudo ser medida mediante esta técnica debido a Ia oxidación del glutatión con el tiempo.

Las diferencias observadas de los complejos de platino de Ia presente invención con respecto al cisplatino en Ia interacción con glutatión son muy importantes porque son coherentes con los factores de resistencia observados en los estudios antiproliferativos llevados a cabo frente a líneas celulares cancerosas resistentes (ver más adelante). Este hecho es destacable debido a que uno de los mecanismos de resistencia adquirida por

las células cancerosas es el incremento de Ia inactivación de los fármacos mediante reacción con glutatión y metalotionina (A. Eastman et al.; Cáncer CeIIs 1990, vol. 2, pp. 275-280; B. Koberle et al., Curr. Biol. 1999.vol. 9, pp. 273-6; X. Yang et al., J. Cáncer Res. Clin. Oncol. 2004, vol. 130, pp. 423-8).

Ejemplo 31 : Estudios de citotoxicidad

La actividad antiproliferativa de los complejos de platino fue estudiada frente a las líneas cancerosas de ovario humano A2780 y A2780cisR, sensible y resistente al cisplatino respectivamente. El trabajo con líneas celulares cancerosas resistentes al cisplatino se llevó a cabo debido a que Ia resistencia al cisplatino es una de las principales limitaciones del uso de este fármaco en clínica. Por tanto, el valor del factor de resistencia (RF = IC _5O línea celular resistente/IC ₅ o línea celular sensible) es un valor importante para evaluar Ia capacidad de los nuevos compuestos de superar Ia resistencia de las células cancerosas al cisplatino. La línea celular cancerosa resistente estudiada presenta una resistencia adquirida debida a varios factores: Ia disminución del transporte celular, el incremento de Ia reparación de las lesiones de ADN y el incremento de los niveles de glutatión.

El efecto inhibidor de crecimiento de los compuestos investigados se evaluó en el par de líneas de células cancerosas de ovario humano A2780 y A2780cisR (línea patental originaria de un paciente no tratado con cisplatino y línea derivada resistente al cisplatino, respectivamente). Las líneas A2780 y A2780cisR se mantuvieron a 37 ⁰ C en una atmósfera que contenía 10% de CO ₂ y aire humidificado y se hicieron crecer en un medio Dulbecco's Modified Eagle's Médium (DMEM) que contenía un 10% de suero fetal bovino inactivado mediante calor, glutamina 2 mM, 10 μg/mL de insulina, 0.5 μg/mL de hidrocortisona, 2.5 μg/mL de amfotericina B y 50 μg/ mL de gentamicina. Todos los medios de cultivo y reactivos fueron suministrados por Euroclone (Paignton, UK). El efecto de inhibición del crecimiento de los compuestos de platino se evaluó mediante el ensayo de sulforrodamina-B (SRB). Las células se sembraron en una microplaca de 96 pocilios en 100 μL del medio de cultivo adecuado con una densidad celular de 10.000 células por pocilio. Después de sembradas las microplacas se incubaron a 37 ⁰ C durante 24 horas antes de Ia adición de los compuestos. Después de 24 horas, se fijaron in situ varias muestras de cada línea celular con ácido tricloroacético frío

(TCA), con objeto de obtener una medida de Ia población celular en el momento de Ia adición del compuesto. Los complejos de platino evaluados se disolvieron en el medio de cultivo y se diluyeron de forma escalonada hasta alcanzar las concentraciones finales deseadas. A continuación se añadieron diferentes concentraciones de los compuestos en los pocilios por cuadruplicado. Las placas fueron posteriormente incubadas a 37 ⁰ C durante 96 horas. Las células se fijaron in situ mediante adición rápida de 50 μL de ácido tricloroacético frío al 50% (masa/volumen) hasta alcanzar Ia concentración final del 10% y fueron entonces incubadas durante 1 hora a 4 ⁰ C. El sobrenadante se descartó y las placas se lavaron cuatro veces con agua y se secaron con aire. Se añadió solución SRB (100 μL) al 0.4% (masa/volumen) en ácido acético al 1 % a cada pocilio y las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de Ia tinción, el colorante no fijado se eliminó mediante cinco lavados con ácido acético al 1 % y las placas se secaron con aire. El colorante fijado se disolvió en TRIZMA [tris(hidroximetil)aminometano] como base y se leyó Ia absorbancia en un lector automático de placas a 515 nm. La concentración de compuesto capaz de inhibir el crecimiento celular en un 50% (IC _5O ± SD) se calculó a partir de las gráficas semilogarítmicas dosis-respuesta. Los resultados después de 96 horas de incubación de los compuestos con las líneas celulares se recogen en Ia Tabla 2 como valores de IC50.

Tabla 2: Actividad biológica de los compuestos 23, 24, 26, 28 ensayados frente a las líneas celulares sensibles al cisplatino (A2780) y resistentes al cisplatino (A2780cisR). La citotoxicidad de los complejos evaluados relativa al cisplatino fue estimada como Ia relación: IC ₅ Q (cisplatino)/ IC ₅₀ (complejos}

IC ₅₀ IC ₅₀ Citotoxicidad

Factor de

Compuesto (A2780) (A2780cisR) relativa al

Resistencia

(μM) (μM) cisplatino

26 0.3 ± 0.1 2.3 ± 0.2 8.7 1.00

23 0.07± 0.002 0.4 ± 0.007 5.6 4.28

27 1.7± 0.01 19.7± 0.01 11.6 0.18

24 0.12 ± 0.05 0.48 ± 0.2 4.2 2.50

28 0.07 ± 0.005 0.2 ± 0.05 3.5 4.28

Cisplatino 0.3 ± 0.06 4.5 ± 0.7 17.3 1.00

En estas series de complejos se observó que los compuestos 23. 24 y 28 mostraron mucha mejor actividad biológica que el cisplatino. De hecho, los compuestos 23 y 28 son 4.28 veces más activos que el cisplatino y el compuesto 24 es 2.5 veces más activo que este fármaco estándar. El compuesto 26 tiene una actividad similar. Cabe destacar que todos los compuestos evaluados presentan menores factores de resistencia que el cisplatino cuando fueron ensayados frente a líneas celulares resistentes al mismo, mostrando que esta familia estructural de complejos es capaz de superar Ia resistencia al cisplatino desarrollada por Ia línea celular cancerosa A2780cisR.

Todos estos resultados muestran que los complejos de platino bicíclicos de fórmula (I) son fuertemente activos frente a cánceres ginecológicos y también para tratar otros tipos de cáncer como el pulmonar o el testicular entre otros.