本发明涉及一种高抗逆性拜氏梭菌及其应用， 属于基因工程和发酵工程技术领域。

背景技术

随着化石能源的日益枯竭， 利用可再生的木质纤维质原料 （如玉米芯、 甘蔗渣等）通过 微生物发酵法生产生物能源和生物基化学品， 成为研究的重点和热点之一。 木质纤维原料必 须经过预处理， 得到微生物可发酵的糖， 才能被微生物很好的利用。 然而， 木质纤维原料经 预处理后， 会产生有机酸、 糠醛、 酚类等抑制物， 这些抑制物的除去成本较高、 并对微生物 生长有一定的抑制作用。 因此， 提高微生物的抗逆性尤其重要。

丁醇具有能量密度大、 可与汽油任意比混合、 可直接用于内燃机等优点， 丁醇作为新型 可再生的液体能源， 受到广泛的重视。 利用木质纤维原料发酵制备燃料丁醇， 成为研究的热 点之一。 Thaddeus Ezeji等 （Bioresource Technol. 2008, 99: 5915-5922) 利用拜氏梭菌突变株 BA101 , 以 XAD-4 resin脱毒的玉米芯酸解和酶解糖液为底物发酵� �� 总溶剂产量为 9.30 g/L; 但突变株 BA101不能利用未脱毒的酸解糖液发酵产丁醇。� ��国专利 ZL 201110020102.6报道： 通过粒子束诱变育种得到的拜氏梭菌 ^ Clostridium beijerinckiO IB4对酚类化合物具有较高的 抗逆性，其能以未脱毒的玉米芯酸解糖液作为 碳源，在 2L发酵罐中总溶剂产量和丁醇产量分 别达到了 10.3g/L和 7.1 g L。然而， 郭亭等（J and Microbiol Biotechnol., 2012, 39(3), 401-407) 研究发现， 当玉米芯和甘蔗渣酸解糖液中的酚类化合物的 浓度提升到 1.5 g/L以上时， 拜氏梭 菌 Clostridium bei rinckii IB4基本不生长。 Tomas等（Appl Environ Microbiol, 2003, 69(8): 4951-4965 )在丙酮丁醇梭菌中过表达编码热激蛋白的 raESL基因， 使丁醇对菌体细胞的抑 制作用降低了 85%，并最终使产物浓度提高了 33%。 Thaddeus Ezeji等（Biotechnol Bioeng 2007， 97(6): 1460-1469)研究发现有机酸、 糠酸等不影响丁醇的发酵， 而酚类抑制物对丁醇发酵有 明显的抑制效应。 然而， 酚类化合物对微生物生长与发酵的抑制机制比 较复杂， 其抑制机理 还不清晰。

基于此， 木质纤维预处理后的毒素抑制物 （如阿魏酸、 香兰酥等） 严重抑制拜氏梭菌的 生长和发酵性能； 提高拜氏梭菌对酚类化合物等毒素的抗逆性， 是木质纤维原料制备燃料丁 醇产业化必须解决的关键问题之一。

发明内容 说 明 书 为了解决上述问题， 本发明提供一种容易获得的高抗逆性拜氏梭菌 ， 其对酚类化合物等 毒素具有高抗逆性。

本发明的目的在于提供一种高抗逆性拜氏梭菌 。

本发明的另一目的在于提供一种高抗逆性拜氏 梭菌的构建方法。

本发明的再一目的在于提供一种高抗逆性拜氏 梭菌的应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种高抗逆性拜氏梭菌， 其缺失正常的 Cbei_3304蛋白功能。

进一步的， 上述高抗逆性拜氏梭菌， 其基因 Cbei_3304不能正常表达。

进一步的， 上述高抗逆性拜氏梭菌， 其基因 Cbei_3304被插入失活。

上述一种高抗逆性拜氏梭菌在发酵制备丁醇中 的应用。

进一步的， 上述应用具体为： 高抗逆性拜氏梭菌以不脱毒的木质纤维酸解糖 液为原料直 接发酵制备丁醇。

本发明的有益效果是：

本发明将拜氏梭菌中编码膜蛋白的 Cbei— 3304基因进行插入失活后， 使得此基因不能正 常表达， 获得 Cb _ei _3304基因插入失活的重组菌株。 本发明提供了一种简单、 高效的提高拜 氏梭菌抗逆性的方法， 借助此方法得到的重组菌株对毒素物质 （阿魏酸、 香草酸等） 具有较 高抗逆性， 当以未脱毒的甘蔗渣酸解糖液为碳源时，在 2L发酵罐中总溶剂产量和丁醇产量分 别达到了 7.0 g/L和 5.1 g/L， 而同等条件培养的出发菌株基本不生长。利用 本发明方法构建的 重组菌株， 其抗逆性强、 丁醇产量高， 是一种适用于甘蔗渣等木质纤维原料发酵生产 丁醇的 优良菌种。

附图说明

图 1为本发明插入失活载体 pWJ的质粒图谱；

图 2为本发明使用二型内含子插入失活的机理图� �

图 3为转化子菌落 PCR电泳图。

具体雄

根据下述实施例， 可以更好地理解本发明。 然而， 本领域的技术人员容易理解， 实施例 所描述的具体的物料配比、 工艺条件及其结果仅用于说明本发明， 而不应当也不会限制权利 要求书中所详细描述的本发明。

猫例 1

一、拜氏梭菌 Cbei_3304基因插入失活突变株的构建 说 明 书 构建拜氏梭菌 Cbei_3304基因插入失活突变株的原理如图 2所示， 具体构建过程包括以 下步骤：

(1) Cbei—3304插入失活载体的构建

1 ) 设计内含子

根据 NCBI数据库收录的拜氏梭菌的 Cbei—3304基因序列 （如 SEQ ID No: 1所示）， 借 助软件设计合适的插入基因位点 (http://www.clostron.com) , 选择插入在第 101-102个碱基之 间， 并生成内含子序列， 合成内含子序列 S-101 (其序列如 SEQ ID NO: 2所示）， 并设计以 下引物。

克隆引物：

pWJ-OSC-101-S: 5 '- ggagtgtcgaggatcctcgagataattatccttacacttcgcc -3 '，其序列如 SEQ ID NO:

3所示；

pWJ-OSC- 101 -A: 5 ' -ggttctcctacagattgtacaaatgtggtgataacagataag-3 '， 其序列如 SEQ ID NO：

4所示。

验证引物：

Cbei-3304-T-S : 5 '-taaattacctacagcaaaactgtg-3 ' , 序列如 SEQ ID NO: 5所示；

Cbei-3304-T-A: 5 ' -ggaattaagaaccttgaatctatc-3 ' , 序列如 SEQ ID NO: 6所示。

引物 pWJ-OSC-101-S引入 Xho I酶切位点 (下划线部分），引物 pWJ-OSC-101-A引入 BsrG

I酶切位点 (下划线部分)。

2) Cbei_3304-pWJ-101重组载体构建

用 Xho I和 BsrG I双酶切载体 pWL pWJ质粒图谱如图 1所示，其序列如 SEQ ID NO: 7 所示。 酶切产物经纯化试剂盒 （Takara ) 纯化后， 与内含子序列 S-101 通过一步克隆 ( ClonExpress)连接。 将一步克隆连接的重组质粒转化到大肠杆菌 E.co/ DH5a， 涂布到含有 50 μ g/ml氨苄霉素抗性 LB平板， 37°C培养 12〜16h，挑取转化子，接到液体含有 50 μ g/ml氨 苄霉素 LB培养基中， 37° (：、 200rpm培养 12h， 提取重组质粒（AXYGEN) , 测序验证， 获得 Cbei_3304-pWJ-101重组载体。

3 ) Cbei_3304-pWJ-101重组载体的甲基化

制备 E.co/ Top 10/pAN2的化学感受态，将测序成功的 Cbei_3304-pWJ-101重组载体转化 到大肠杆菌 E.coli Top 10， 由于 pAN2质粒具有四环素抗性， 故涂布到含有 50 u g/ml氨苄霉 素和 10 μ g/ml四环素双抗性 LB平板， 37°C培养 12〜16h， 挑取转化子， 接到液体含有 50 μ g/ml氨苄霉素和 lO g/ml 四环素 LB 培养基中， 37°C、 200rpm培养 12h， 提取甲基化的 说 明 书

Cbei_3304-pWJ-101重组载体（pAN2质粒含有一个枯 草芽孢杆菌噬菌体基因， 能编码甲基转 移酶， 能实现外源质粒在大肠杆菌中的甲基化）， 即 Cbei_3304插入失活载体。

(2) Cbei_3304插入失活载体转化拜氏梭菌 ( ZosinVftVi/M beijerinckii NCIMB 8052)

1 )将 Clostridium beijerinckii NCIMB 8052接种至 CGM培养基（酵母粉 3 g/L， 蛋白胨 5 g L, 可溶性淀粉 10 g/L， 乙酸铵 2 g/L， NaCl 2 g/L, MgS0 ₄ -7H ₂ 0 3 g/L, KH ₂ P0 ₄ 1 g/L, K ₂ HP0 ₄ 1 g/L, FeS0 ₄ 7H ₂ 0 0.1 g L) 37°C过夜培养，次日以 5%比例接种到 CGM培养基， 37°C 培养 6-8h， 以 10%接种到 YTG培养基（酵母粉 16 g L， 蛋白胨 10 g/L， 葡萄糖 5 g/L， 氯 化钠 5 g/L) 37°C培养 3h， OD ₆₀₀ nm=l ;

2)取 50ml拜氏梭菌菌液， 5000rpm, 4°C离心 10 min,弃上清。在以 ETM缓冲液（270mM 蔗糖， 0.6mM Na ₂ HPO ₄ ， 4.4mM Na ₂ HP0 ₄ , 10mM MgCl ₂ )重悬； 同上离心， 去上清， 再次以 ETM缓冲液重悬， 同上离心， 彻底取上清；

3 )以 1ml ET缓冲液（270mM蔗糖， 0.6mM Na ₂ HPO ₄ ， 4.4mM Na¾P0 ₄ 重悬， 取 200μ1， 力口入 1 μ g Cbei_3304插入失活载体， 加入 0.2cm预冷的电转杯， 轻轻混匀；

4) 使用 MicroPulserTM电转仪电转， 条件为电压 1.8kV， 电阻 200Ω， 电容 2.5 F， 电击 后立刻加入 lmL 2xYTG培养基， 转移到无菌离心管中复苏 2〜3h;

5 )取 200μ1上述菌液，涂布到含有 10 μ _§ /ηι1红霉素的 CGM 固体培养基，培养 2〜3天。

(3) Cbei_3304插入失活突变株的筛选

挑取上述步骤 5 )中培养 2〜3天的转化子， 使用引物 Cbei-3304-T-S和 Cbei-3304-T-A对 转化子进行菌落 PCR验证， 筛选出内含子插入基因组的突变株（插入后， PCR扩增出基因条 带电泳图上比野生型大约 lKbp)， 如图 3所示， 将正确插入的突变株传代三次， 同时涂布在 含有红霉素抗性和没有红霉素抗性的 CGM 固体培养基上，筛选出敲除质粒丟失的突变株 （在 红霉素抗性平板上不能生长的突变株）。

二、 Cbei— 3304插入失活突变株的传代稳定性

将上述构建的 Cbei— 3304基因插入失活的拜氏梭菌突变株在固体培� �基上连续转接 7次， 发现所得菌株与出发菌株在形态特征和培养特 征上相同， 生长状态良好。 在以葡萄糖为碳源 的发酵培养基中，检测重组菌的传代稳定性， 插入失活突变菌传代发酵试验结果如表 1所示。

表 1不同传代次数的 Cbei— 3304插入失活突变菌的发酵情况

Cbei— 3304插入失活突变菌

传代次数 丁醇产量 总溶剂产量

(g L) (g L) 说 明 书

1 7.7 11.4

2 7.5 11.2

3 7.8 11.6

4 7.7 11.5

5 7.6 11.3

6 7.9 11.7

7 7.8 11.4

从实验结果可知， 经过 7次连续传代， 两株突变株的总溶剂产量和丁醇产量较稳定， 具 有较好的传代稳定性， 可作为进一步研究和开发的生产菌株。

三、 Cbei— 3304插入失活的拜氏梭菌对模式酚类化合物阿� �酸的髙抗逆性

培养基配方 （％为质量百分比）：

平板培养基： 酵母粉 0.3%， 蛋白胨 0.5%， 可溶性淀粉 1%， 乙酸铵 0.2%， 氯化钠 0.2%， 七水合硫酸镁 0.3%，磷酸二氢钾 0.1%，磷酸氢二钾 0.1%，七水合硫酸亚铁 0.01%，琼脂 1.5%， 其余为水， pH 6。

种子培养基： 酵母粉 0.3%， 蛋白胨 0.5%， 可溶性淀粉 1%， 乙酸铵 0.2%， 氯化钠 0.2%， 七水合硫酸镁 0.3%， 磷酸二氢钾 0. 1%， 磷酸氢二钾 0. 1%， 七水合硫酸亚铁 0.01%， 其余为 水， pH 6。

发酵培养基： 葡萄糖 3%， 乙酸铵 0.22%， 磷酸二氢钾 0.05%， 磷酸氢二钾 0.05%， 氯化 钠 0.001%， 七水合硫酸镁 0.02%， 七水合硫酸亚铁 0.001%， 一水合硫酸锰 0.001%， 玉米浆 0.1%, 阿魏酸 0.06%, 其余为水， pH 6.6„

将上述 Cb _ei _3304插入失活的拜氏梭菌突变株接种至平� ��培养基厌氧培养， 培养温度 35 V , 培养时间 12 h。 将平板培养的突变株接种到种子培养基中， 培养温度 35 Ό , 50 mL 肖 特厌氧瓶装液量 30 mL， 充氮气 3min， 培养温度 35 °C， 培养时间 12 h; 将种子接种到发酵培 养基中， 接种量 10%(y/ _V )， 发酵温度 35 °C， 100 mL 肖特厌氧瓶装液量 50 mL， 充氮气 3min， 发酵培养 72 h后， 检测丁醇产量达到了 6.1 g/L， 而同等条件培养的出发菌株 NCIMB 8052基 本不生长。

四、 Cbei— 3304插入失活的拜氏梭菌对模式酚类化合物香� �酸的髙抗逆性

培养基配方 （％为质量百分比）：

平板培养基： 同上述 "三"。

种子培养基： 同上述 "三"。 说 明 书 发酵培养基： 葡萄糖 3%， 乙酸铵 0.22%， 磷酸二氢钾 0.05%， 磷酸氢二钾 0.05%， 氯化 钠 0.001%， 七水合硫酸镁 0.02%， 七水合硫酸亚铁 0.001%， 一水合硫酸锰 0.001%， 玉米浆 0.1%, 香草酸 0.05%， 其余为水， pH 6.6。

将上述 Cbei_3304插入失活的拜氏梭菌突变株接种至平板 培养基厌氧培养， 培养温度 35 °C , 培养时间 12 h。 将平板培养的突变株接种到种子培养基中， 培养温度 35°C， 50 mL 肖 特厌氧瓶装液量 30 mL， 充氮气 3min， 培养温度 35 °C， 培养时间 12 h; 将种子接种到发酵培 养基中， 接种量 10%(ν/ν)， 发酵温度 35 °C， 100 mL 肖特厌氧瓶装液量 50 mL， 充氮气 3min， 发酵培养 72 h后， 检测丁醇产量达到了 4.6 g/L, 而同等条件培养的出发菌株 NCIMB 8052只 能微弱的生长， 但基本不产丁醇。

五、 Cbei— 3304插入失活的拜氏梭菌对甘蔗渣酸解糖液的� �抗逆性

本部分内容说明 Cbei— 3304插入失活的拜氏梭菌利用甘蔗渣酸解糖液 （可溶性总酚含量 为 2.4 g L)， 在 1L发酵罐中发酵生产丁醇的工艺。

培养基配方 （％为质量百分比）：

平板培养基： 同上述 "三"。

种子培养基： 同上述 "三"。

发酵培养基： 乙酸铵 0.22%， 磷酸二氢钾 0.05%， 憐酸氢二钾 0.05%， 氯化钠 0.001%， 七水合硫酸镁 0.02%， 七水合硫酸亚铁 0.001%， 一水合硫酸锰 0.001%， 玉米浆 0.1%， 用未 脱毒的甘蔗渣酸解糖液（总还原糖为 4 %)配置， 其余为水， pH 6.6， 培养基中可溶性总酚含 量为 2.4 g/L。

将上述 Cbei_3304插入失活的拜氏梭菌突变株接种至平板 培养基厌氧培养， 培养温度 35 °C , 培养时间 12 h。将平板培养的突变株接种到种子培养基中� � 250 mL 肖特厌氧瓶装液量 150 mL, 充氮气 3min， 培养温度 35 °C， 培养时间 12 h; 将种子接种到装有 1 L发酵培养基的 2L发酵罐中， 接种量 10% (v/v), 发酵温度 35 °C， 连续通入氮气， 流速为 0.3 L/min, 发酵 培养 90 h后， 检测总溶剂产量和丁醇产量分别达到了 3.1 g/L和 2.2 g/L， 而同等条件培养的 出发菌株 NCIMB 8052基本不生长。

六、 Cbei— 3304插入失活的拜氏梭菌对甘蔗渣酸解糖液的� �抗逆性

本部分内容说明 Cbei— 3304插入失活的拜氏梭菌利用甘蔗渣酸解糖液 （可溶性总酚含量 为 2.0 g L)， 在 2 L发酵罐中发酵生产丁醇的工艺。

培养基配方 （％为质量百分比）：

平板培养基： 同上述 "三"。 说 明 书 种子培养基： 同上述 "三"。

发酵培养基： 乙酸铵 0.22%， 磷酸二氢钾 0.05%， 磷酸氢二钾 0.05%， 氯化钠 0.001%， 七水合硫酸镁 0.02%， 七水合硫酸亚铁 0.001%， 一水合硫酸锰 0.001%， 玉米浆 0.1%， 用未 脱毒的甘蔗渣酸解糖液 （总还原糖为 3.6%) 配置， 其余为水， pH 6.6， 培养基中可溶性总酚 含量为 2.0 g L。

将上述 Cb _ei _3304插入失活的拜氏梭菌突变株接种至平� ��培养基厌氧培养， 培养温度 35 Ό , 培养时间 12 h。将平板培养的突变株接种到种子培养基中� � 250 mL 肖特厌氧瓶装液量 150 mL， 充氮气 3min， 培养温度 35 °C， 培养时间 12 h; 将种子接种到装有 1 L发酵培养基的 2L发酵罐中， 接种量 10% (v/v), 发酵温度 35 °C， 连续通入氮气， 流速为 0.3 L/min, 发酵 培养 90 h后，检测总溶剂产量和丁醇产量分别达到了 7.0 g/L和 5.1g/L， 而同等条件培养的出 发菌株 NCIMB 8052基本不生长。