Titre de l’invention : Co-extraction de composés actifs à caractères hydrophiles et hydrophobes issus de microalgues et macroalgues

[0001] La présente demande de brevet concerne un procédé d’obtention d’un extrait aqueux pro venant d’au moins deux algues (microalgues et/ou macroalgues), permettant un meilleur rendement d’extraction des composés hydrophiles et hydrophobes desdites algues. En outre, l’invention concerne lesdits ex-traits aqueux, ainsi que leur utilisation dans la pré vention des pathologies cardiovasculaires, et en tant qu’ingrédient fonctionnel en alimen taire, en particulier de complément alimentaire.

Art antérieur

[0002] A l’heure actuelle, les extraits issus de microalgue disponibles sur le marché sont pour la majorité des extraits purifiés ne contenant qu’une seule famille de molécule : protéines, sucres ou lipides... Il est cependant envisageable de trouver des extraits combinés conte nant plusieurs molécules de même nature, issues de différentes étapes d’extraction.

[0003] Ainsi le document ES2728088 décrit un procédé de microencapsulation d’huiles au sein de microalgues en milieu aqueux. Néanmoins, ce brevet fait intervenir plusieurs étapes d’ex traction dont une étape préliminaire à l’homogénéisation consistant en la rupture cellulaire et la formation d’émulsion avec les différents composés. De plus, le procédé évoqué fait intervenir des composés exogènes à la biomasse initiale.

[0004] Par ailleurs, le document CN104413077 propose une extraction simultanée d’origan et de trèfle pour l’élaboration d’un mélange avec une activité de pesticide. Ladite invention fait intervenir un solvant éthanolique d’une part et ne comporte pas d’enjeu de solubilisation de composés de nature lipophile d’autre part.

[0005] Le document ES2335333 décrit quant à lui une émulsion huile dans eau (H/E) ou eau dans huile (E/H) réalisée avec un filtrat issu d’une macération de macroalgue dans de l’eau. Ce procédé n’a donc pas vocation à solubiliser des composés de nature apolaire issus d’une matrice végétale brute puisque l’huile utilisée est une source exogène vis-à-vis de la ma croalgue employée. De plus, ce procédé ne fait intervenir qu’une seule espèce de ma croalgue et ne propose donc pas d’enjeu de co-extraction ou de solubilisation de composés hydrophobes ou peu solubles dans l’eau.

[0006] Le document GR1008712 s’intéresse quant à lui à la solubilisation de composés aroma tiques d’herbes dans une huile d’olive préalablement extraite. Ce procédé ne permet donc pas l’obtention de composés hydrosolubles et comporte deux étapes distinctes d’extraction.

[0007] Enfin, le brevet FR3052064 met enjeu une extraction d’huile de graines d’une même es pèce ou d’un mélange de 2 espèces. Cette huile est ensuite mélangée avec de l’eau ainsi que des mucilages de lin pour l’obtention d’une émulsion. Parallèlement à l’invention citée précédemment, celle-ci ne permet pas non plus la solubilisation de composés hydroso lubles contenus dans les graines. De plus aucune synergie d’activité n’est démontrée ici.

1 [0008] Ainsi, aucun ingrédient issu de microalgue généré en une seule étape d’extraction ne pré sente à la fois des composés hydrosolubles et liposolubles. En effet, ayant des polarités dif férentes, toutes les molécules d’intérêt nutritionnel/santé ne peuvent être solubles dans le même solvant.

[0009] La Demanderesse a développé un procédé permettant d’obtenir un ingrédient alimentaire de composition unique grâce à un procédé innovant de co-extraction simultanée de 2 es pèces de microalgues différentes permettant de surmonter les problèmes ci-dessus.

[0010] Contrairement aux documents cités ci-dessus, l’invention emploie l’ensemble des matières premières sous leurs formes brutes, limitant ainsi le nombre d’opérations unitaires telle que l’extraction préalable de l’huile d’une des espèces. Ceci permet en conséquent une réduc tion du temps de traitement ainsi que du coût de production de l’extrait final. De plus, ledit procédé ne fait intervenir aucun solvant dérivé de la pétrochimie ou présentant une toxicité quelconque ou encore un risque d’inflammabilité.

Description détaillée de l’invention

[0011] Ainsi, selon un premier aspect, l’invention concerne un procédé d’obtention d’un extrait d’algues à partir d’au moins deux algues, permettant un meilleur rendement d’extraction de composés hydrophiles et de composés hydrophobes, comprenant les étapes de : a. Mélange desdites au moins deux espèces d’algues, de préférence sous forme de poudre sèche, avec un solvant aqueux, de préférence à un ratio d’entre 1% et 20% en poids total du mélange desdites au moins deux espèces d’algues ; b. Homogénéisation du mélange obtenu à l’étape a. à une température comprise entre 4 et 30°C, de préférence par agitation ou ultrasons ; c. Application de micro-ondes, ou d’un broyage à billes, ou d’ultrasons ou d’une homogé néisation haute pression audit mélange obtenu à l’étape b. ; d. Optionnellement, macération du mélange obtenu à l’étape c., de préférence à une tempé rature comprise entre 4 et 25°C entre 30 minutes et 12h ; e. Obtention d’un extrait aqueux d’algues comprenant des composés hydrophiles et des composés hydrophobes issus desdites au moins deux algues.

[0012] Ainsi, le procédé selon l’invention permet la co-extraction séquentielle (ou simultanée) de métabolites primaires et secondaires, de nature hydrophile et hydrophobe, issus d’algues (de microalgues et/ou de macroalgues) en milieu aqueux.

[0013] Classiquement, l’eau apparaît comme un excellent solvant au sein de la plante mais est un solvant médiocre dès lors que l’on cherche à extraire des composés hydrophobes. Le pro cédé selon l’invention permet le développement d’un solvant auto généré à partir d’une unique étape d’extraction de microalgues et/ou macroalgues en milieu aqueux. Le solvant complexe obtenu se trouve alors structuré par les composés amphiphiles co-extraits de sorte à pouvoir inclure des composés hydrophobes desdites microalgues.

[0014] Par « extrait d’algues » sont entendus le produit obtenu de la co-extraction réalisée par le procédé selon l’invention, comprenant des composés extraits des algues (microalgues et/ou macroalgues) ayant servi à l’extraction.

[0015] De manière préférée, les algues utilisées à l’étape a. sont sous forme sous forme de poudre sèche, de préférence de granulométrie inférieure à 100 pm

2 [0016] Cette poudre sèche d’algues (microalgues ou macroalgues) est obtenue à partir de l’inté gralité de l’organisme. Les microalgues sont entières et les macroalgues sont broyées sous forme de poudre avant usage.

[0017] Selon un mode de réalisation, ledit procédé d’obtention d’un extrait d’algues selon l’inven tion est réalisé à partir d’au moins deux, d’au moins trois, d’au moins quatre, d’au moins cinq, d’au moins six, d’au moins sept, d’au moins huit, d’au moins neuf, ou d’au moins dix algues.

[0018] Le nombre d’algues est choisi en fonction des composés à extraire qu’elles contiennent.

[0019] Par « un ratio d’entre 1% et 20% en poids total du mélange desdites au moins deux espèces d’algues » est entendu selon l’invention que le poids total additionné de l’ensemble des es pèces d’algues, de préférence sous forme de poudre de biomasse sèche, ajouté dans le sol vant représente entre 1% et 20% du mélange obtenu à l’étape a.

[0020] Le procédé développé par la Demanderesse repose sur le fait que les composés extraits par exemple d’une souche de microalgue favorisent la solubilisation et l’extraction des compo sés de l’autre algue, par exemple d’une souche de microalgue co-extraite, du fait de leurs propriétés intrinsèques. Ces composés ne pourraient être extraits seuls dans l’eau du fait de leur nature peu polaire.

[0021] Par ailleurs, de tels extraits ne pourraient avoir la même composition en étant extraits sépa rément puis assemblés. En effet, le procédé selon l’invention permet la solubilisation et l’extraction de composés normalement insolubles dans un tel solvant grâce à leur co-ex- traction simultanée, difficilement possible dans le cas d’une simple extraction à l’eau.

[0022] Ce phénomène de solubilisation implique des espèces telles que des hydrotropes ou molé cules amphiphiles jouant le rôle de tensio-actif et améliorant ainsi la solubilité de certains composés peu polaires dans l’eau.

[0023] Par « meilleur rendement d’extraction » est entendu que l’extraction simultanée (coextrac tion) desdites algues permet d’obtenir une quantité totale plus importante de composés hy drophiles et hydrophobes que si lesdites algues étaient extraites isolément.

[0024] Par « composés hydrophiles » sont entendu les composés ayant une affinité pour l’eau et ayant une tendance à s'y solubiliser.

[0025] Par « composés hydrophobes » ou composés « lipophiles » sont entendu les composés ayant une affinité pour les solvants polaires comme les lipides, et qui sont solubles dans un corps gras. A contrario, ces composés sont insolubles dans les solvants polaires comme l’eau.

[0026] De manière préférée, lesdits composés hydrophiles sont choisis parmi : les protéines ; les vitamines hydrosolubles, de préférence les vitamines du groupe B ; les sucres ; les pigments hydrophiles, de préférence la phycocyanine ; les minéraux, de préférence le Fer ou le Calcium ; les composés phénoliques.

3 [0027] De manière préférée, les et les composés hydrophobes sont choisis parmi : les acides gras ; les stérols ; les vitamines liposolubles, de préférence vitamine E ou les tocophérols ; les pigments liposolubles, de préférence les caroténoïdes.

[0028] En effet, les composés sont choisis parmi : protéines, vitamines hydrosolubles (vitamines du groupe B), sucres, pigments hydrophiles (phycocyanine), minéraux (Fe, Ca...), et com posés phénoliques pour les composés hydrophiles ; les acides gras, stérols, vitamines lipo solubles (vitamine E ou tocophérols), pigments liposolubles (caroténoïdes) pour les com posés hydrophobes.

[0029] Par « solvant aqueux » on entend désigner de l’eau, de l’eau distillée, de l’eau milliQ, de l’eau osmosée, de l’eau acidifiée ou basifïée, une solution aqueuse tamponnée dont le pH peut varier de 5 à 12 une solution aqueuse agrémentée d’enzymes, de composés de nature amphiphile ou d’agents technologiques variés.

[0030] De manière préférée, le solvant aqueux est choisi parmi de l’eau, de l’eau distillée, de l’eau acidifiée ou basifïée ou une solution aqueuse tamponnée.

[0031] De manière encore plus préférée le solvant aqueux est choisi parmi un tampon phosphate et un tampon acétate, dont le pH est compris entre 6 et 11.

[0032] De manière préférée, à l’étape a., le ratio entre les au moins deux espèces d’algues (de mi croalgues et/ou macroalgues) est entre 1 :10 et 10 :1.

[0033] Par « micro-ondes » est entendu selon l’invention que le mélange subit l’application de ces rayonnements électromagnétiques de longueur d'onde intermédiaire entre l'infrarouge et les ondes de radiodiffusion, communément appelées micro-ondes.

[0034] Par « broyage à billes » est entendu l’utilisation d’un dispositif composé d'un tambour ho rizontal mis en rotation par un moteur. Le tambour est rempli partiellement du produit à broyer auquel sont ajoutés les éléments de broyage (billes métalliques par exemple).

[0035] Par « ultrasons » est entendu selon l’invention que le mélange subit l’application de ces ondes vibratoires de valeurs supérieures à 20000 Hz, communément appelées ultrasons.

[0036] Par « homogénéisation haute pression » est entendu que le mélange est réalisé dans un dis positif capable par l’application d’une pression importante de pouvoir créer des particules microscopiques permettant de mélanger des substances.

[0037] Par « agitation » est entendu l’opération consistant à mélanger une ou plusieurs phases pour les rendre homogènes.

[0038] Par « macération » est entendu selon l’invention l’étape où le mélange obtenu à l’étape précédente est laissé pendant un temps donné à une température donné, afin de continuer l’extraction des composés.

[0039] De manière préférée, l’étape b. est réalisée par :

- Agitation à l’aide d’une pale d’agitation pour une durée de 1 à 20 minutes, à une vitesse comprise entre 150 et 1000 rpm, de préférence 150 et 800 rpm ; ou

- Agitation à l’aide d’un disperseur sur une période allant de 1 à 20 minutes, à une vitesse comprise entre 1000 et 16000 rpm ; ou

- Ultrasons à une fréquence comprise entre 10 et 40 kHz, de puissance entre 50 et

4 1000 W pour une durée comprise entre 30s et 20 minutes.

[0040] Par « disperseur » ou « agitateur disperseur est entendu un appareil capable généralement de disperser les poudres dans du liquide. Un exemple de disperseur est un Ultraturrax™.

[0041] De manière encore plus préférée, l’étape b. de est réalisée par agitation à l’aide d’un dis perseur sur une période allant de 1 à 20 minutes, à une vitesse comprise entre 1000 et 16000 rpm.

[0042] De manière préférée, l’étape c. est réalisée par : i. Traitement micro-ondes pour une durée de 5 à 60 min à une fréquence comprise entre 300 MHz et 30 GHz et à une puissance électrique entre 0,5 et 30 watts/cm ³ ; ou ii. Broyage à billes, avec des billes de diamètre 0,4 à 2 mm, un remplissage de la chambre d’extraction compris entre 60 et 90%, à une vitesse de rotation de 1000 à 4000 rpm durant 15 à 90 minutes ; ou iii. Traitement ultrasonore à une fréquence comprise entre 10 et 40 kHz, de puissance entre 50 et 1000 W, pour une durée comprise entre 5 et 60 minutes ; ou iv. Homogénéisation haute pression à une pression comprise entre 500 et 2500 bars, entre 1 et 10 passages, à une température comprise entre 4 et 75°, de préférence entre 4 et 55°C.

[0043] De manière encore plus préférée, l’étape c. d’extraction est réalisée par homogénéisation haute pression à une pression comprise entre 500 et 2500 bars, entre 1 et 10 passages à une température comprise entre 4 et 55°C.

[0044] De manière préférée, ledit procédé comprend en outre une étape f. de séparation solide/li quide de l’extrait aqueux obtenu à l’étape e., de préférence par filtration papier, filtration membranaire ou par centrifugation.

[0045] De manière préférée, l’étape f. de séparation solide/liquide de l’extrait aqueux obtenu à l’étape e. est réalisée par : i. Filtration papier ; ou ii. Filtration membranaire, avec emploi d’un vide ou non, de porosité comprise entre 2 et 50pm ; ou iii. Centrifugation durant 5 à 30 minutes à une puissance comprise entre 2500g et

10000g.

[0046] Par « filtration papier » est entendu un procédé de séparation physique réalisé à l’aide d’un filtre en papier, dont la granulométrie devra être choisie en fonction du solide à filtrer.

[0047] Par « filtration membranaire » est entendu un procédé de séparation physique se déroulant en phase liquide. Le but est de purifier, fractionner ou concentrer des espèces dissoutes ou en suspension dans un solvant au travers d’une membrane organique ou minérale.

[0048] Par « centrifugation » est entendu une technique qui utilise la force centrifuge pour séparer les différents composants d'un mélange.

[0049] De manière encore plus préférée, l’étape f. est réalisée par filtration membranaire.

[0050] Cette étape f. permet d’obtenir un filtrat ou un surnageant.

[0051] Le filtrat est obtenu à l’étape f. dans le cas d’une étape de filtration, papier ou membra naire.

5 [0052] Le surnageant est obtenu à l’étape f. dans le cas d’une étape de centrifugation.

[0053] De manière préférée, ledit procédé comprend en outre une étape g. de séchage du surna geant obtenu à l’étape f., de préférence par lyophilisation, séchage basse température, ato misation ou séchage sous pression.

[0054] Grâce à l’étape g., l’extrait obtenu est un extrait sec sous forme de poudre comprenant des composés hydrophiles et des composés hydrophobes issus desdites algues (microalgues et/ou macroalgues).

[0055] Par « Lyophilisation » est entendu le processus de séchage à basse température permettant de retirer l'eau contenue dans un produit, en trois étapes : congélation, sublimation et dé- sorption.

[0056] Par « séchage basse température » est entendu un séchage réalisé à une température ayant un faible écart avec la température de l’air ambiant.

[0057] Par « séchage sous pression » est entendu un séchage réalisé par l’apposition d’une pres sion au mélange.

[0058] Par « Atomisation » est entendu la méthode de déshydratation d'un mélange pour l’obtenir sous forme de poudre, par passage dans un flux d'air chaud.

[0059] De manière préférée, l’étape g. de séchage du surnageant est réalisée par : i. Lyophilisation, ou ii. Séchage basse température entre 40 et 80°C, ou iii. Séchage sous pression, ou iv. Atomisation.

[0060] De manière encore plus préférée, l’étape g. de séchage est réalisée par lyophilisation ou atomisation, dans un flux d’air chaud à une température comprise entre 80°C et 300°C, de préférence entre 90°C à 220°C.

[0061] Par « algues » sont entendues les organismes vivants capables de photosynthèse oxygé- nique dont le cycle de vie se déroule en milieu aquatique. Le terme « algue » inclus selon l’invention aussi bien les « macroalgues » que les « microalgues » quand ces derniers ne sont pas employés.

[0062] De manière préférée, lesdites au moins deux algues sont choisies parmi :

Au moins deux microalgues ; ou

Au moins une microalgue et au moins une macroalgue ; ou

Au moins deux macroalgues.

[0063] Par « microalgue » on entend désigner selon la présente invention les microalgues euca ryotes, qui sont caractérisées par un noyau, comprenant par exemple les chlorophytes, les rhodophytes, les haptophytes, les bacillariophytes, les eustigmatophytes, les eugleno- phytes, les thraustochytriaceae ou encore les dinophytes, lesdits microalgues eucaryotes étant communément dénommées « microalgues », et les microalgues procaryotes, qui ne possèdent pas de noyau, comprenant les cyanophytes, ci-après dénommées spécifiquement « cyanobactéries ».

[0064] De manière préférée selon l’invention, les microalgues eucaryotes sont choisies parmi les chlorophytes, de préférence parmi Chlorella, Auxenochlorella, Dunaliella, Tetraselmis, Haematococcus, Scenedesmus les eustigmatophytes, de préférence Nannochloropsis; les

6 euglénophytes, de préférence, Euglena; les rhodophytes, de préférence Porphyridium; les bacillariophyceae, de préférence Phaeodactylum et Odontella, et les thraustochytriaceae, de préférence Schizochytrium.

[0065] De manière préférée, les cyanobactéries sont choisies parmi la spiruline (Arthrospira pla- tensis ou Arhtrospira maxima) et l’AFA (Aphanizomenon Floes-aquaé).

[0066] De manière encore plus préférée, ladite microalgue est choisie parmi la Chloreïle, Chlo- rella sp., Chlorella vulgaris, Chlorella protothecoides, Chlorella sorokiniana, Chlorella pyrenoidosa, Nannochloropsis sp, Nannochloropsis gaditana, Nannochloropsis oceanica.

[0067] Par « macroalgue » on entend désigner selon la présente invention les algues macrosco piques pluricellulaires dont l’appareil végétatif est visible à l’œil nu et comprenant par exemple les algues rouges, brunes et vertes. Les macroalgues seront aussi dénommées algues dans les paragraphes suivants.

[0068] De manière préférée selon l’invention, les algues rouges (Rhodophyta) sont choisies parmi les genres Chondrus, Gracilaria, Porphyra, Pyropia, Kappaphycus, Euchema et/ou Palma ria.

[0069] De manière préférée, les algues brunes (Phaeophyta) sont choisies parmi les genres Asco- phyllum, Fucus, Undaria, Alaria, Laminaria, Sargassum, et/ou Saccharina.

[0070] De manière préférée, les algues vertes (Chlorophyta) sont choisies parmi les genres Ulva, Caulerpa, Enteromorpha, Chladophora.

[0071] Selon un deuxième aspect, l’invention concerne les extraits obtenus par le procédé selon l’invention.

[0072] Ces extraits comprennent les composés hydrophiles et hydrophobes mentionnés ci-dessus, en quantité plus importante que si ceux-ci avaient été extraits isolément de chaque algue.

[0073] Selon un troisième aspect, l’invention concerne lesdits extraits pour utilisation en tant que médicament, de préférence dans la prévention des pathologies cardio vasculaires.

[0074] Selon un quatrième aspect, l’invention concerne l’utilisation des extraits selon l’invention en tant qu’ ingrédient fonctionnel en alimentaire.

[0075] De manière préférée, lesdits extraits sont utilisés dans des compléments alimentaires.

[0076] Par « ingrédient fonctionnel » est entendu selon l’invention un ingrédient un aliment ren forcé avec des ingrédients bioactifs et qui offre des bienfaits démontrés pour la santé, tels que les composés hydrophiles et lipophiles.

Figures

[0077] [Fig 1] est un résumé du déroulé de l’exemple 1, comparant une extraction simultanée de deux microalgues, et des extractions isolées.

[0078] [Fig 2] est une figure comparant l’impact des procédés conventionnels et du procédé selon l’invention sur la structure cellulaire des microalgues dans l’exemple 2.

[0079] [Fig 3] représente deux photographies des surnageants A et B obtenus selon le protocole de l’exemple 2.

[0080] [Fig 4] est un résumé du déroulé de l’exemple 2, comparant le procédé selon l’invention comprenant une étape d’homogénéisation à haute pression, et le procédé conventionnel n’en comprenant pas.

Exemples

7 [0081] Exemple 1 : Procédé de co-extraction de composés hydrophiles et lipophiles en milieu aqueux en comparaison à des extractions simples (Figure 1).

[0082] Introduction : Le procédé selon l’invention est étudié pour produire une composition aqueuse enrichie en composés de nature lipophile, peu polaire, en plus des composés hy drophiles extraits par affinité dans le solvant aqueux utilisé. Le défi ici est de parvenir à ex traire des composés lipidiques dans un solvant aqueux (dans lequel ils ne sont pas solubles) grâce à la coextraction. Nous nous focalisations donc au travers de cet exemple sur les li pides. La composition en lipides de l’extrait a été évaluée par la méthode de référence de Bligh and Dyer (1959), qui a permis une quantification efficace des lipides totaux.

[0083] Étapes du procédé d’extraction : a) Préparation de 3 solutions distinctes, à savoir les solutions A, B et C. i) Dans un premier temps, une solution A d ’Arthrospira platensis à 2% dans du tampon phosphate à pH7, ii) La solution B est préparée dans les mêmes conditions que la solution A, avec cette fois-ci à 2% de Nannochloropsis sp., iii) Enfin, la solution C est préparée avec 2% de biomasse algale sèche composée à 50% d’Arthrospira platensis et 50% de Nannochloropsis sp., b) Pré-homogénéisation des solutions A, B et C grâce à un passage à l’Ultraturrax™ du rant 2 minutes à 10000 rpm. c) Lesdites suspensions sont ensuite traitées individuellement grâce à l’homogénéisateur haute pression avec une pression croissance limitée à 800 bars. Lesdites suspensions sont traitées en circuit ouvert et la recirculation est effectuée pour un total de 4 pas sages, effectués avec des pressions croissantes, respectivement 500/600 et 800 bars. d) Lesdites suspensions sont analysées immédiatement après leurs préparations. e) Pour les extraits A et B, un volume précis de 2,8 mL de chaque extrait est prélevé et transféré dans un unique bêcher avec agitateur magnétique, constituant ainsi la somme des 2 extraits de microalgues réalisés indépendamment. f) Pour l’extrait C, un volume précis de 5,6 mL est prélevé et transféré dans un bêcher avec agitateur magnétique. g) Un volume précis de 7mL de chloroforme ainsi qu’un second volume de 14mL de mé- thanol sont ajoutés à l’extrait à doser A + B ou C avant la première mise en agitation à 500 rpm pendant 10 minutes. h) Un second volume de 7 mL de chloroforme est ajouté puis la solution est agitée en mode turbo durant 30 secondes. Enfin, 7 mL d’une solution de KC1 à 0,85% sont ajou tés avant une nouvelle agitation à 4000 rpm pendant 10 min. i) Les extraits A + B et C sont centrifugés à 3000 G pendant 10 min et la phase inférieure est prélevée à la seringue puis transférée dans un tube à hémolyse dont la masse aura été préalablement mesurée. j) Les tubes sont placés sur un thermobloc paramétré à 50°C sous flux d’azote pour per mettre l’évaporation totale des solvants. Enfin, les tubes correspondant aux extraits A,

B et C sont à nouveau pesés et la différence de masse obtenue correspond à la masse de

8 lipides contenue dans lesdits extraits. k) Les masses lipidiques obtenus pour chaque extrait sont moyennées (à raison de trois essais par extrait) puis la masse moyenne des extraits A + B est comparée à la masse moyenne issue de l’extrait C.

[Table 1] Paramètres d’extraction de l’exemple 1

[0084] Le procédé suivant l’invention de co-extraction simultanée permet d’enrichir le totum en lipides à hauteur de 18,88 ± 1,21% contre 13,54 ± 0,67% dans le cas de l’addition des ex traits générés indépendamment. Ledit procédé permet donc l’obtention d’une quantité de composés lipophiles 39% plus importante par coextraction simultanée que dans le cas de l’addition des extraits générés indépendamment.

[0085] Exemple 2 : Procédé de co-extraction intensifiée par homogénéisation à haute pression de composés hydrophiles et lipophiles en milieu aqueux en comparaison à une extraction con ventionnelle (Figure 4)

[0086] Le procédé selon l’invention est étudié pour produire un totum aqueux comprenant les composés hydrophobes d’une microalgue riche en lipide, solubilisée grâce au milieu intra cellulaire d’une microalgue riche en protéines. Le premier objectif est ici d’étudier l’im pact de la co-extraction intensifiée par homogénéisation à haute pression sur la structure cellulaire des microalgues, en comparaison avec une co-extraction par méthode conven tionnelle. Le second objectif est d’étudier la composition des fractions dudit totum, grâce à une étape de centrifugation puissante et longue.

[0087] Nous nous focalisons donc au travers de cet exemple sur les lipides ainsi qu’à l’impact du procédé sur la structure cellulaire des microalgues. La composition en lipides de l’extrait a été évaluée par la méthode de référence de Bligh and Dyer (1959), qui a permis une quanti fication efficace des lipides totaux. Cette méthode est décrite plus en détail ci-avant les exemples. La structure cellulaire a quant à elle été étudiée par microscopie photonique d’une part, ainsi que par microscopie à épi-fluorescence d’autre part. Pour cette seconde technique de microscopie, le fluorochrome SYTOX, intercalant de l’ADN a été utilisé. Il permet de mettre évidence les cellules disposant d’une membrane endommagée grâce à

9 l’émission d’une fluorescence verte. En effet, le fluorochrome ne peut se fixer à l’ADN de la cellule que si sa membrane est au préalable endommagée. Les cellules qui viendraient à rester intactes sont repérables par l’auto fluorescence rouge de la chlorophylle contenue dans les microalgues.

[0088] Étapes du procédé d’extraction : a) Préparation de 2 solutions distinctes, à savoir les solutions A et B. i. Dams un premier temps, la solution A est préparée avec 2% d 'Arthrospira pla- tensis ainsi que 2% de Nannochloropsis sp., dans du tampon phosphate à pH7, ii. La solution B est préparée dans les mêmes conditions que la solution A, b) La solution A est mise sous agitation à l’aide d’une pale d’agitation à 1000 rpm, à tem pérature ambiante, pendant 30 minutes (extraction conventionnelle). c) La solution B est pré-homogénéisée grâce à un passage à l’Ultraturrax™ durant 2 mi nutes à 10000 rpm. d) Ladite solution B est ensuite traitée grâce à l’homogénéisateur haute pression avec une pression cible de 800 bars. Ladite suspension est traitée en circuit ouvert et la recircula tion est effectuée pour un total de 3 passages, effectués avec des pressions croissantes, respectivement 500/600 et 800 bars. e) Un aliquot de chacune des solutions A et B, dénommés ci-après aliquot A et aliquot B est prélevé pour être observé en microscopie photonique puis en microscopie à épi- fluorescence comme suit. i. Les aliquots A et B sont centrifugés à 13500g pendant 5 min. ii. Les surnageants issus desdits aliquots sont éliminés et les culots repris dans 1 mL d’eau distillée puis vortexés pour ré-homogénéiser chacun des aliquots. iii. 20 pL du réactif SYTOX à 0,5 mM sont ajoutés dans lesdits aliquots. iv. Les aliquots A et B sont ensuite placés à l’obscurité avant d’être observés entre lame et lamelle avec un filtre d’excitation à 490 nm. v. Les observations desdits aliquots A et B sont comparées entre elles ainsi qu’avec les états initiaux des microalgues étudiées. f) Les solutions A et B sont centrifugées à 10000 g pendant 30 min à 20°C immédiate ment après leurs traitements respectifs. g) Les surnageants sont ensuite prélevés et les lipides sont quantifiés au sein desdits sur nageants comme suit. h) Pour chacun des surnageants issus des solutions A et B, ci-après nommés surnageants A et B, un volume précis de 5,6 mL est prélevé et transféré dans un bêcher avec agitateur magnétique. i) Les surnageants A et B sont analysés suivant la méthode de Bligh and Dyer dont les conditions expérimentales ont été décrites ci-avant. j) Les masses de lipides correspondant aux surnageants A et B sont calculées. k) Les masses lipidiques obtenues pour chaque surnageant sont ensuite moyennées (à rai son de trois essais par extrait) puis comparées entre elles.

[0089] [Table 2] Paramètres d’extraction de l’exemple

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[0090] Les observations microscopiques de l’aliquot A issu de ladite solution A permettent de con clure en ce que l’apparence cellulaire obtenue à l’issue de la co-extraction conventionnelle ne diffère aucunement de l’état initial de chacune des microalgues (Figure 2 à gauche).

[0091] Le procédé suivant l’invention permet quant à lui d’obtenir des particules de taille nette ment réduite et homogène, <5mih. L’intensification dudit procédé de co-extraction grâce à l’homogénéisation à haute pression impacte donc clairement la structure cellulaire des mi croalgues traitées (Figure 2 à droite).

[0092] Le procédé de co-extraction conventionnelle aboutit à un surnageant A de coloration bleue, due à la présence de phycocyanine, pigment hydrophile de la spiruline. A contrario, le pro cédé de co-extraction intensifiée par homogénéisation à haute pression fournit un surna geant B de coloration vert foncé, due à l’extraction simultanée de la phycocyanine mais également de la chlorophylle, pigment ne pouvant normalement pas diffuser dans un milieu aqueux au vu de sa polarité (voir Figure 3).

[0093] Le procédé suivant l’invention de co-extraction intensifiée par homogénéisation à haute pression permet d’obtenir un surnageant aqueux enrichi en lipides à hauteur de 8,14 ± 0,62% contre 2,11 ± 0,68% dans le cas d’une co-extraction conventionnelle par macéra tion.

[0094] Ledit procédé permet donc d’obtenir une quantité de composés lipophiles quatre fois plus importante que dans le cas d’une co-extraction conventionnelle.

[0095] Cet exemple démontre donc qu’en l’absence de débris cellulaires, préalablement écartés par une centrifugation puissante, des composés lipidiques sont présents au sein du surna geant issu de la co-extraction intensifiée par homogénéisation à haute pression. Cette solu bilisation de lipides pourrait prendre forme grâce à une émulsification stable des composés lipidiques de Nannochloropsis avec les protéines de la Spiruline.

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