La presente invención se sitúa dentro del sector agroalimentario . Esta invención se refiere a un procedimiento de pasterización en frío especifico para el control del microorganismo Cronobacter sakazakii sobre fórmula láctea infantil liquida con cacao caracterizado porque la adición del cacao se realiza tras el tratamiento mediante pulsos eléctricos de alta intensidad. Estado de la técnica

Actualmente, en la mayor parte de los casos, el procesado de fórmulas lácteas infantiles liquidas se realiza partiendo de fórmula láctea deshidratada base (producto no estéril) (EFSA. 2004. EFSA J. 113: 1-35), que una vez reconstituida, se somete a tratamiento térmico UHT (135°C, 2-5s) (Prakash S Huppertz T Karychuck O Deeth H. 2010. J. Food Eng. 96(2) : 179-184) garantizando la esterilidad comercial del producto. Sin embargo, tratamientos tan intensos térmicamente, destruyen factores nutricionales como vitaminas, proteínas, y minerales (Gillis E. 2005. NTRS 519-H; Igual M García-Martínez M Camacho M García-Navarrete N. 2011. Innov Food Sci. Emerg Technol. In press. Online 5 January 2011; Patras A Brunton N P O ^' Donell C Tiwaru B K. 2010. Trends Food Sci. Technol. 21(1) : 3-11) . No sólo los destruyen inmediatamente tras el tratamiento, sino que dichos factores (por ejemplo vitaminas) se pierden durante la vida útil del producto (Torregrosa F Esteve M Frígola A Cortés C. 2006. J. Food Eng 73(4) : 339-345) . Además la biodisponibilidad de ciertos componentes se ve reducida también debido al tratamiento térmico, por ejemplo la biodisponibilidad de calcio (Sarriá B López-Faldiño R Vaquero P. 2001. Nutrition 17(4) : 326-331) . Otro de los problemas asociado a este tipo de tratamientos térmicos de esterilización es la desestabilización en la matriz del producto que debe ser corregida mediante la adición de estabilizadores (patente 46777, 3685, USA, 1987; Prakash S Huppertz T Karychuck O Deeth H. 2010. J. Food Eng . 96(2) : 179-184) . Además dicha desestabilización provoca la formación de depósitos en las conducciones de los equipos de tratamiento, el llamado "fouling", reduciendo la eficacia de los mismos, e incrementado los costes (Pelegrine D H Gómez MT, Gaspareto CA. 2008. Rev. Pub. e Inv. ISBN: 1900-6608 Vol 2(1) : 15-27) .

Entre los ingredientes adicionados a las bebidas lácteas para niños destaca el cacao por su sabor, aroma y valor nutricional, constituyendo un producto muy atractivo para el público infantil, y que a la vez supone una fuente importante de nutrientes esenciales en su crecimiento (Dreosti I E. 2000. Nutrition 16(7-8) : 692-694; Ariefdjohan MWd Savaiano D.A. 2005. Nutrition Rev. 63(12) : 427-430) . Sin embargo, también el cacao se adiciona en polvo (Liang B Hartle R W. 2004. J. Dairy Sci. 87: 20-31) y por tanto en forma no estéril. Los microorganismos que pueden ser vehiculizados a través de fórmula láctea infantil en polvo, asi como a través de otros ingredientes deshidratados añadidos a la formulación de bebidas lácteas (cacao en polvo, cereales en polvo, etc) , y que preocupan más a la comunidad científica (FAO/WHO, 2004. Enterobacter sakazakii and other micro-organisms in powdered infant formula. Microbiological Risk Assessment Series no. 6. Italy. ftp://ftp.fao.org/ docrep/fao/007/y5502e/y5502e00.pdf last accessed: 05.03.2009), son Cronobacter sakazakii y Salmonella entérica , pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae . De ellos, Cronobacter sakazakii puede tener graves consecuencias en niños menores de 3 años (Iversen C and Forsythe S. 2003. Trends Food Sci. Technol. 14: 443-454) . Aunque los niveles del microorganismo en la fórmula en polvo son bajos (EFSA. 2004. EFSA J. 113: 1-35), su proliferación puede ser muy rápida una vez se rehidrata la fórmula. Las autoridades de salud pública (FAO/WHO, 2004. Enterobacter sakazakii and other micro-organisms in powdered infant formula. Microbiological Risk Assessment Series no. 6. Italy. ftp://ftp.fao.org/ docrep/fao/007/y5502e/y5502e00.pdf last accessed:

05.03.2009; EFSA. 2004. EFSA J. 113: 1-35) se centran actualmente en recomendaciones que instan a la comunidad científica y a empresas fabricantes, a la búsqueda de nuevos métodos bactericidas que consigan controlar los niveles de C. sakazakii respetando el valor nutricional de la leche, en contraposición al tratamiento térmico.

La tecnología de Pulsos Eléctricos de Alta Intensidad (Pulsed Electric Fields, PEF) consistente en la aplicación durante tiempos cortos (με) de un campo eléctrico de alta intensidad (10-40 kV/cm) . Esta tecnología está basada en la capacidad que tienen los alimentos de conducir la electricidad por su elevado contenido en agua. Se trata de un proceso no térmico de pasterización en frío, ya que el incremento de temperatura que se produce es mínimo. Por tanto, los productos tratados por PEF muestran unas características organolépticas y nutricionales superiores a las de productos tratados térmicamente (Sánchez-Moreno C Plaza L Élez-Martínez P De Ancos B Martín-Belloso O. 2005 J Agrie Food Chem, 53(11) 4403-4409; Cortés C Esteve M J Frígola A. 2008. Eur . Food Res Technol, 227: 629-635; Walking-Ribeiro M Rodríguez-González O Jayaram S and Griffiths M W 2010. Int. J. Food Microbiol. 144(3) : 379- 386) . Este tratamiento de pasteurización en frió mediante pulsos eléctricos de alta intensidad se ha descrito específicamente para el tratamiento de Cronobacter sakazakii en diferentes fórmulas comerciales de leches infantiles (Pina-Pérez MC. Food Control. 2009. 20(12) : 1145-1150) . Este estudio muestra una reducción de C. sakazakii de 2.30 ciclos log después del tratamiento PEF (15 kV/cm-3000 is) seguido de 24 h de almacenamiento refrigerado (8 °C) .

Según diversos estudios, los niveles de inactivación por PEF pueden verse incrementados cuando el tratamiento se aplica en combinación o en presencia de sustancias con poder antimicrobiano (Smith K Mittal GS Griffiths MW. 2002. Food Microbiol and Safety 2304-2308; Pina-Pérez MC Silva-Angulo A B Rodrigo D Martínez A. 2009. Int J. Food Microbiol 130: 196-204) . Entre los ingredientes naturales a los que se les ha atribuido un poder antimicrobiano frente a Enterobacteriaceae encontramos el cacao (Busta FF and Peck ML . Antimicrobial effect of cocoa on Salmonellae. Appl Microbiol 1968;16:424-425) . Es en la fracción fenólica del cacao en la que radica el poder antimicrobiano del mismo, fracción que puede verse afectada o degradarse por tratamiento térmico (Patras A Brunton N P O ^' Donell C Tiwaru B K. 2010. Trends Food Sci. Technol. 21(1) : 3-11) .Hasta el momento, los tratamientos combinados de pasterización mediante PEF y sustancia microbiana se caracterizan porque la adición de dicha sustancia antimicrobiana se realiza antes del tratamiento PEF.

La presente invención proporciona un procedimiento mejorado para el control específico de C. sakazakii en fórmula láctea infantil líquida con cacao. El procedimiento de la presente invención comprende una etapa de pasterización mediante pulsos eléctricos de alta intensidad, lo que permite evitar el detrimento en el valor nutricional del producto tratado que se produce mediante procesado térmico. Asi mismo, el procedimiento de la presente invención también comprende la adición de un cacao en polvo rico en polifenoles, preferentemente con un contenido min. de 12%, tras el tratamiento por PEF, lo que permite aprovechar el poder antimicrobiano del cacao asi como el beneficio para la salud de su fracción fenólica. La adición del cacao con posterioridad al tratamiento PEF da lugar a unos resultados mayores de inactivación del C. sakazakii _r por lo que el procedimiento de la presente invención representa una mejora respecto a los ya conocidos en el estado de la técnica. Descripción de la invención

Las fórmulas lácteas infantiles liquidas con cacao se obtienen mayoritariamente partiendo de fórmula láctea en polvo, producto no estéril, susceptible de contener C. sakazakii. Las fórmulas lácteas infantiles liquidas con cacao conocidas son un producto UHT (Ultra-hight temperature) . Sin embargo, un tratamiento térmico tan intenso actúa también en detrimento del valor nutricional y organoléptico del producto.

Como alternativa al tratamiento térmico y a las negativas consecuencias que se pueden derivar del mismo, se plantea el procedimiento de la presente invención, basado en la combinación de diversos factores/procesos de tratamiento para el control de C. sakazakii en fórmula láctea infantil liquida con cacao: a) tratamiento mediante PEF, b) refrigeración, c) adición posterior de cacao rico en polifenoles y d) refrigeración. La invención se refiere a un procedimiento para controlar el microorganismo C. sakazakii mediante una pasterización en frío a temperatura ambiente de una fórmula láctea infantil liquida, mediante la tecnología de PEF, seguida de la adición de cacao rico en polifenoles que además de ser un ingrediente actúa como antimicrobiano, obteniendo un producto pasterizado con una menor degradación del valor nutricional y calidad organoléptica. Mediante este procedimiento se consigue controlar de manera significativa los niveles de Cronobacter sakazakii , que se reducen progresivamente durante 12h de almacenamiento refrigerado, suma de etapas b) y d) , incrementado el efecto del tratamiento por PEF. Adicionalmente, el procedimiento de la presente invención comprende la reconstitución de una fórmula láctea infantil en polvo, para ser tratada mediante la tecnología de PEF. Preferentemente, este tratamiento tiene lugar en condiciones de intensidad de campo eléctrico y tiempo de tratamiento de 15 kV/cm-300C^s, respectivamente, a temperatura ambiente (<25°C) .

Preferentemente, la concentración de cacao adicionado a la base láctea comprende valores entre 1 y 5 % (p/v) , siendo preferente que la concentración de cacao adicionado sea 5 % (p/v) . La adición de una cantidad de cacao superior a 5 % (p/v) podría dar lugar a problemas tecnológicos debido a un aumento de la conductividad eléctrica, viscosidad y formación de partículas en suspensión.

De forma aún más preferente, se adiciona a la base láctea un cacao con un contenido mínimo de 12 % de polifenoles . De acuerdo con otro modo de realización preferente, la base láctea se mantiene refrigerada hasta un máximo de 4 horas entre el tratamiento PEF y la adición de cacao. Preferentemente, la base láctea se mantiene al menos 3-4 horas refrigerada antes de la adición de cacao, siendo más preferente que la adición de cacao tenga lugar al menos 3,5 horas después del tratamiento PEF. De acuerdo con el modo más preferente de la presente invención, la base láctea se mantiene 4 horas refrigerada antes de la adición de cacao.

De acuerdo con otro modo adicional de realización preferente, la base láctea se mantiene en agitación a temperatura menor o igual a 8 °C entre el tratamiento PEF y la adición de cacao.

De acuerdo con otro modo adicional de realización preferente, la base láctea se mantiene refrigerada un máximo de 12 h tras el tratamiento PEF. Preferentemente, la base láctea se mantiene a una temperatura menor o igual a 8 °C tras el tratamiento PEF.

El procedimiento de la presente invención destaca por las siguientes ventajas frente al tratamiento térmico existente.

En primer lugar, el procedimiento de la presente invención permite trabajar a temperatura ambiente (< 25°C) luego se conserva en mayor medida el valor nutricional y calidad organoléptica del producto recién preparado .

Asi mismo, el procesado por PEF supone una utilización más eficiente de la energía, con el consiguiente ahorro económico y respeto al medio ambiente, ya que es una tecnología basada en el consumo de electricidad y no de combustibles fósiles.

Adicionalmente, mediante el presente procedimiento se incrementan los niveles de inactivación para C. sakazakii durante las 12h de almacenamiento refrigerado tras el tratamiento por PEF. Así, de acuerdo con el modo de realización preferente de la presente invención se alcanza la máxima inactivación (4.40 ciclos log) para el control de este microorganismo por esta tecnología (PEF) en fórmula láctea infantil.

Además, el procedimiento de la presente invención permite aprovechar el poder antimicrobiano del cacao frente a C. sakazakii ya que éste se adiciona en el momento que presenta mayor actividad tras el tratamiento por PEF.

La citada invención es una aplicación industrial en sí misma. Consiste en un procesado alternativo y mejorado a la tecnología actual existente de pasterización térmica) para fórmulas lácteas infantiles líquidas con cacao, específico para el control de C. sakazakii. Breve descripción de la figura

Fig. 1: Diagrama de flujo del procedimiento según el modo de realización preferido. Fig. 2: Niveles de inactivación para C. sakazakii en fórmula láctea suplementada con cacao a diferentes concentraciones (1%, 2.5% y 5% (p/v) ) alcanzados tras el tratamiento por PEF y el almacenamiento refrigerado (12h, 8°C) cuando el cacao se adiciona a los diferentes momentos estudiados. Ejemplos :

Se ensayaron 3 concentraciones de cacao para adicionar a la base láctea 1, 2.5 y 5% (p/v) , asi como 5 momentos diferentes de adición del mismo en sus diferentes concentraciones: 0 y 2 h antes del tratamiento por PEF, y 0, 2, y 4h tras el tratamiento por PEF. Tanto si la adición de cacao se efectúa pre- o post- tratamiento, las muestras se mantienen en agitación a 8°C, 2 y 0 h antes de tratar y 0, 2, y 4h tras el tratamiento. Además, las muestras tratadas se refrigeraron un máximo de 12h tras el tratamiento. Los resultados correspondientes a dichos ensayos se presentan en la figura 2. Procedimiento específico para la adición de cacao 4 horas tras el tratamiento

Se utilizan 75g de fórmula láctea infantil en polvo (leche maternizada) que se reconstituye con 500mL de agua estéril. La fórmula reconstituida se agita intensamente en refrigeración 8°C. Posteriormente, se procede al tratamiento por PEF para las condiciones de intensidad de campo (E, kV/cm) y tiempo de tratamiento (με) de 15 kV/cm; 3000μ3, mediante un equipo en continuo a escala de laboratorio OSU-4D, diseñado por la Ohio State University. El equipo consta de 8 cámaras de tratamiento conectadas en serie de diámetro de 0.23 cm. La forma del pulso, el voltaje y la intensidad de tratamiento fueron registradas mediante un osciloscopio digital (Tektronic TDS 210, Tektronic, OR) . El flujo se fijó en 30mL/min mediante una bomba de engranajes (Cole-Parmer 75210-25, Colé - Parmer Instruments, IL) . La duración del pulso de onda cuadrada bipolar fue de 2.5 με . Tras el tratamiento se almacena la fórmula tratada en refrigeración a 8°C durante 4h en agitación. Transcurrido ese periodo se adiciona cacao en polvo rico en polifenoles (CocoanOX 12%, Naturex España S.L.) al 5% (p/v) (25g cacao/500mL fórmula tratada) . El almacenamiento refrigerado y en agitación se prolonga hasta las 12h. Los recuentos microbianos se realizaron mediante siembra en placa utilizando el medio de tryptic soy agar (TSA, Scharlab Chemie, Barcelona, Spain) por diluciones seriadas en agua de peptona tamponada (l%(p/v)) . Los resultados permiten alcanzar valores de inactivación para C. sakazakii de 4.40 ciclos logio trascurrido el periodo de refrigeración.

De los resultados obtenidos se desprende que para la concentración de cacao 5% (p/v) se obtiene el mayor incremento en los niveles de inactivación, para todas las condiciones de estudio (adición pre y post tratamiento, a los diferentes tiempos) .

En cuanto al momento de adición, cuando el cacao se adiciona hasta 2 h antes del tratamiento, la inactivación de C. sakazakii se ve incrementada menos de 2.0 ciclos logio, (para 5% de cacao (p/v) ) . Sin embargo, tratar por PEF, refrigerar (8°C) en agitación las células tratadas, y adicionar el polvo de cacao rico en polifenoles 4h tras el tratamiento y continuar con el almacenamiento refrigerado a 8°C hasta un máximo de 12h manifiesta una progresiva reducción en los niveles de C. sakazakii,. alcanzando los niveles máximos de inactivación publicados hasta la fecha para este microorganismo (4.40 ciclos log) , en fórmula láctea infantil con cacao, y por esta tecnología. El incremento en la inactivación fue progresivo y ascendente durante el almacenamiento refrigerado.