【발명의 명칭】

콜라겐 트리펩타이드를 고함량으로 함유하는 콜라겐 가수분해물 및 이의 용

【기술분야】

본 출원은 2016년 2월 5일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2016-0014896호 를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다. 본 발명은 콜라겐 트리템타이드를 고함량으로 함유하는 콜라겐 가수분해물 및 이의 용도에 관한 것으로， 보다 상세하게는 콜라겐 트리펩타이드를 특이적으로 많이 생성하는 콜라겐 가수분해효소를 이용하여 제조된 콜라겐 가수분해물 및 이를 유효성분으로 포함하는 하는 발모촉진 및 피부상태 개선용 조성물에 관한 것이다.

[배경ᅳ기술】

콜라겐은 프를린， 옥시 프를린， 글라이신， 글루타민산 등 약 18종의 아미노 산으로 구성된 동물의 섬유성 단백질로서 사람의 경우 인체를 구성하고 있는 5,000 종류의 단백질 중 가장 많은 3W를 차지하고 있는 특수한 구조 단백질이다. 특히， 피부, 뼈， 힘줄에 많이 존재하고 있으며 특히 피부 속 진피층에 70%는 콜라겐으로 구성되어 있어 콜라겐이 피부 구성 성분으로서 매우 중요한 역할을 하고 있다. 콜 라겐은 각종 아미노산이 폴리펩타이드 형태로 결합하여 세 가닥으로 꼬여 있는 형 상을 나타내며 분자량은 대략 300 , 000 정도로 매우 크다. 저분자 콜라겐은 콜라겐 분해효소 등에 의해 분해되어 분자량 5， 000으로 저 분자화 된 것으로 콜라겐 펩타이드라고 불리기도 하며, 이 저분자콜라겐이 인체에 ᅳ들어오면 인체내 단백질 분해효소에 의해 더욱 분해되어 최종적으로 아미노산 형 Efl 로 인체에 흡수된다. 대부분의 단백질이 분자량이 12，000~7으000인데 비하여 콜라 겐의 분자량은 300 , 000으로 매우 커서 흡수되가가 더욱 어렵기 때문에， 저분자콜라 겐으로 인체내 소화， 흡수가 용이하도록 추출, 분리, 정제과정을 거친 후 분해과정 을 거쳐 분자량이 5, 000 이하인 펩타이드 형태로 만든 것이다. 콜라겐 트리펩타이드란 아미노산 3개 (글라이신 -x-y)가 연결되어 있는 작은 콜라겐 (분자량이 보통 200~500)을 말하며, 분자량이 작아 피부를 쉽게 투과하는 것 으로 알려져 있다. 한편, 아미노산이 4개 이상 연결되어 있으면 분자구조가 커서 피부를 투과하지 못한다. 콜라겐 트리템타이드는 피부투과 후 곧바로 서로 다시 연 결됨으로써 손상된 콜라겐 조직올 복구하는 시간을 단축시키는데 기여한다. 또한， 섭취하였을 때에도 저분자콜라겐보다 체내 흡수율이 높아 콜라겐의 생체 효능을 극 대화시킬 수 있는 장점이 있다. 일반적으로 콜라겐은 주로 소， 돼지， 생선， 오징어 등을 원료로 하며， 효소 에 의해 가수분해되어 콜라겐 펩타이드 조성물을 얻을 수 있다. 그러나 일반적으로 사용되어지는 단백질 분해효소에 의해서는 트리펩타이드의 함량이 매우 낮아 고함 량 트리펩타이드 조성물을 얻기에는 어려움이 있었다. 따라서 고함량 트리펩타이드 콜레겐 가수분해물을 제조하기 위한 효율적인 제조 방법이 꾸준히 요구되고 있는 실정이다. 한편， 모발은 서로 다른 주기를 가지며 성장기 (anagen) , 퇴행기 (catagen)， 휴지기 (telogen)를 거쳐서 성장하고 탈락한다. 이러한 주기는 3~6년에 걸쳐 반복 되는데， 일일 평균 50〜 100 개의 모발이 정상적으로 탈락하게 된다. 일반적으로 탈 모증이라 함은 이러한 주기 중에서 성장기 모발의 비율이 짧아지고 퇴행기 또는 휴 지기 모발이 많아져 탈락하는 모발의 슷자가 비정상적으로 많아지는 것을 일컫는 다. 탈모의 원인으로는 남성호르몬 작용 과잉설， 피지분비 과잉설, 혈액순환 불 량설， 과산화물， 세균 등에 의한 두피기능 저하설， 유전적 요인， 노화, 스트레스 등이 논의되고 있다. 그 원인 중 하나인 남성호르몬의 일종인 테스토스테론 (testosteron)은 5 a -reductase라는 효소에 의해 디하이드로테스토스테론 (dihydrotestoserone ;DHT)으로 활성화되며， 이 DHT가 특정 수용체와 결합하고 탈모 를 일으키는 단백질을 유도하여 탈모가 일어난다. 또한 이와 같은 기작에 의하여 피지를 과잉생성하기도 하며 여드름이나 지루성 피부염 등을 일으켜서 두피에 염증 을 동반한 탈모가 나타나기도 한다. 탈모증 (alopecia)은 질병， 영양부족， 노화, 호르몬 불균형 등에 의해 야기되 는 것으로 알려져 있다. 많은 연구가 진행되어 왔음에도 불구하고, 근본적인 탈모 에 대한 메커니즘은 잘 알려져 있지 않다. 또한 탈모를 치료하기 위한 노력도 진행 되어 왔다 . 그럼에도 불구하고， 지금까지 오직 두 개의 약물들 (피나스테라이드

( f inaster ide) 및 미녹시딜 (minoxidi l ) )만이 탈모 치료를 위해 FDA(Food and Drug Admini strat ion) (U. S. A)에서 인가되었다. 5 α -reductase 억제제인 피나스테라이드 는 남성의 안드로겐성 탈모증 (androgenet i c alopecia)에서 육모를 촉진시키기 위해 이용되어 왔다. 혈압강하제 (ant i-hypertensive agent )인 미녹시딜은 ATP-민감성 K- 채널 개방에 의해 육모를 촉진시킬 수 있다. 그러나, 약물의 효과는 예측불가능한 효과 및 부작용 때문에 제한적이고 일시적이다. 탈모를 예방하고 육모를 촉진시키 는 더 나은 새로운 치료제가 필요하다. 지금까지 탈모를 방지하여 주고 발모촉진 및 모발에 생장에 효과를 가지고 있다고 알려져 있는 미녹시딜 (minoxidi l ) 이나 트 리코사카라이드 (tr ichosacchar ide)등의 제제들의 경우, 뚜렷한 효능의 부재 및 인 체 안정성, 피부자극 유발 등의 부작용 문제가 대두되고 있어 안전성 및 효능이 확 보된 조성물 개발이 시급한 실정이다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

이에, 본 발명자들은 콜라겐 트리펩타이드의 함량이 높아 체내 흡수도가 우 수한 콜라겐 가수분해물을 제조하기 위하여 노력한 결과， 바실러스 서브틸리스를 이용하여 제조한 신규한 콜라겐 가수분해효소로 콜라겐을 가수분해하면 콜라겐 트 리펩타이드의 함량이 높은 가수분해물을 제조할 수 있음을 발견하였고， 이의 발모 촉진, 피부상태 개선 효과가 종래 콜라겐 가수분해물과 비교해 현저히 우수하다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서， 본 발명의 목적은 (a) 어린 (생선 비늘)을 물과 흔합하고 열처리하는 단계;

(b) 바실러스 서브틸리스 균주 배양액을 원심분리한 후 원심분리된 상등액을 농축시키고, 이온교환 크로마토그래피법을 이용하여 정제하는 방법에 의해 콜라겐 분해효소를 제조하는 단계 ; 및

(c) 상기 콜라겐 분해효소를 상기 (a) 단계의 흔합물에 투입하여 25 내지 45 ^° C에서 5 내지 15시간 동안 가수분해 시키는 단계에 의해 제조되며， 전체 가수분해 물 대비 콜라겐 트리펩타이드가 20 내지 70 중량 % 로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 콜라겐 가수분해물올 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 콜라겐 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 탈 모방지 및 /또는 발모촉진용 식품 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 콜라겐 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 탈 모방지 및 /또는 발모촉진용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 콜라겐 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 탈 모방지 및 /또는 발모촉진용 화장료 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 콜라겐 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피 부 주름개선， 피부 탄력개선， 피부 노화방지 및 /또는 피부 보습용 화장료 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 콜라겐 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피 부 주름개선， 피부 탄력개선, 피부 노화방지 및 /또는 피부 보습용 식품 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 탈모방지 및 /또는 발모촉진용 제제를 제조하기 위한 상기 콜라겐 가수분해물의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 콜라겐 가수분해물의 유효량을 이를 필요로 하 는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 탈모방지 및 /또는 발모촉진 방법을 제공하 는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 피부 주름개선， 피부 탄력개선， 피부 노화방지 또는 피부 보습용 제제를 제조하기 위한 상기 콜라겐 가수분해물의 용도를 제공하는 것 이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 콜라겐 가수분해물의 유효량을 이를 필요로 하 는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 피부 주름개선， 피부 탄력개선， 피부 노화 방지 또는 피부 보습 방법을 제공하는 것이다. 【기술적 해결방법】

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 어린 (생선 비늘)을 물과 흔합하 고 열처리하는 단계 ;

(b) 바실러스 서브틸리스 균주 배양액을 원심분리한후 원심분리된 상등액을 농축시키고, 이온교환 크로마토그래피법을 이용하여 정제하는 방법에 의해 콜라겐 분해효소를 제조하는 단계; 및

(c) 상기 콜라겐 분해효소를 상기 (a) 단계의 흔합물에 투입하여 25 내지 45 ^° C에서 5 내지 15시간 동안 가수분해 시키는 단계에 의해 제조되며, 전체 가수분해 물 대비 콜라겐 트리펩타이드가 20 내지 70 중량 %로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 콜라겐 가수분해물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 콜라겐 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 탈 모방지 및 /또는 발모촉진용 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적은 상기 콜라겐 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 탈 모방지 및 /또는 발모촉진용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 콜라겐 가수분해물 을 유효성분으로 포함하는 탈모방지 및 /또는 발모촉진용 화장료 조성물을 제공한 다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 콜라겐 가수분해물 올 유효성분으로 포함하는 피부 주름개선， 피부 탄력개선， 피부 노화방지 및 /또는 피부 보습용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 콜라겐 가수분해물 을 유효성분으로 포함하는 피부 주름개선， 피부 탄력개선， 피부 노화방지 및 /또는 피부 보습용 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 탈모방지 및 /또는 발모촉진용 제제 를 제조하기 위한상기 콜라겐 가수분해물의 용도를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 상기 콜라겐 가수분해물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 탈모방지 및 /또는 발모촉진 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여. 피부 주름개선， 피부 탄력개선， 피 부 노화방지 또는 피부 보습용 제제를 제조하기 위한 상기 콜라겐 가수분해물의 용 도를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 상기 콜라겐 가수분해물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 피부 주름개선 피부 탄력 개선， 피부 노화방지 또는 피부 보습 방법을 제공한다. 이하본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 (a) 어린 (생선 비늘)을 물과 흔합하고 80 내지 100 ^° C에서 3 내지 8시간 동안 열처리하는 단계;

(b) 바실러스서브틸리스 균주 배양액을 원심분리한후 원심분리된 상등액을 농축시키고, 이온교환 크로마토그래피법을 이용하여 정제하는 방법에 의해 콜라겐 분해효소를 제조하는 단계 ; 및

(c) 상기 콜라겐 분해효소를 상기 (a) 단계의 흔합물에 투입하여 25 내지 45 ^° C에서 5 내지 15시간 동안 가수분해 시키는 단계에 의해 제조되며， 전체 가수분해 물 대비 콜라겐 트리펩타이드가 20 내지 70 중량 % 로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는콜라겐 가수분해물을 제공한다. 본 발명에서 상기 ) 단계는 콜라겐을 추출할 어린을 물과 흔합하여 고은에 서 열처리하는 공정으로， 어린에 포함되어 있는 콜라겐을 물로 추출해내는 단계이 다. 상기 (a) 단계에서 첨가되는 어린과 물의 비율은 특별히 제한되는 것은 아니지 만， 바람직하게는 어린:물이 2 :8의 중량비율로 흔합될 수 있다. 상기 (a)단계에서 어린으로부터 콜라겐을 추출하기 위한온도조건은 80 내지 120 ^° C , 바람직하게는 85 내지 110 ^° C , 보다 바람직하게는 90 내지 100 ^° C일 수 있으 나， 이에 제한되는 것은 아니며 최적의 온도조건은 콜라겐을 추출하는 시간, 어린 과 물의 비율에 따라서 달라질 수 있다. 상기 (a) 단계에서 열처리 하는 시간은 콜 라겐을 추출하는 온도조건에 따라 달라질 수 있으나 1시간 내지 10시간, 바람직하 게는 2시간 내지 9시간 보다 바람직하게는 3시간 내지 8시간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 (b) 단계는 콜라겐을 가수분해할 가수분해 효소를 준비하는 단계로서， 종래 당업계에서 콜라겐을 가수분해하기 위해 사용되는 효소들과 비교해 콜라겐트 리펩타이드의 함량이 특히 높은 가수분해물을 제조할 수 있는 효소를 준비하는 단 계이다. 본 발명자는 상기 (b) 단계의 콜라겐 분해효소 제조방법에 대해 대한민국 특허청에 출원한 바 있으며 (출원번호: KR10-2015-0124453호) , 상기 특허문헌은 본 발명에서 참고가 될 수 있다. 본 발명에서 상기 바실러스 서브틸리스는 기탁번호. KCTC12866BP인 균주인 것 을 특징으로 할 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 알실시예에 따르면, 본 발명자는 바실러스 서브틸리스 균주 배양 액에 포함된 콜라겐 분해 효소를 분리하기 위하여 다양한 조건에서 이온교환 크로 마토그래피법을 수행하였다. 상기 (b) 단계의 이온교환 크로마토그래피법은 양이온 교환 크로마토그래피를 이용할 수 있으며， 이 경우 염화나트륨 (NaCl )을 0.1 내지 0.3M의 농도로 사용할 때 목적효소의 회수율이 가장 좋다는 것을 확인하였다. 따 라서， 상기 (b) 단계의 이온교환 크로마토그래피법이 양이온교환 크로마토그래피인 경우에는 0. 1 내지 0.3M의 염화나트륨 (NaCl )을 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 다른 일실시예에 따르면， 본 발명에서 상기 (b) 단계의 이온교환 크로마토그래피법은 음이온 교환 크로마토그래피를 이용할 수 있으며， 이 경우 염 화나트륨 (NaCl )을 0.09 내지 0. 155M의 농도로 사용할 때 목적효소의 회수율이 가장 좋다는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 (b) 단계의 이온교환 크로마토그래피법이 음이온교환 크로마토그래피인 경우에는 0.09 내지 0. 155M의 염화나트륨 (NaCl )을 이 용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 상기 (c)단계는 (a)단계에서 준비된 콜라겐 추출물과 (b)단계에 서 제조한콜라겐 분해효소를 흔합하여 콜라겐을 가수분해하는 단계이다. 본 발명의 일실시예에서는， (b)단계에서 제조한 콜라겐 분해효소가 25 내지 45 ^° C 온도조건에서 가장 오랜 시간 동안 효소활성을 유지하는 것을 확인하였다. 온 도조건이 45 ^° C를 초과하는 경우에는 초기 효소활성은 일시적으로 증가할 수 있으나 시간 경과에 따른 활성의 소실이 너무 커져 콜라겐을 가수분해하는 효과가 충분히 나타나지 않는다는 문제점이 있으며， 반대로 25 ^° C 미만인 경우에는 효소활성이 너 무 낮아콜라겐을 가수분해하기 어렵다는 문제가 있다. 따라서， 상기 (c ) 단계에서 가수분해 온도조건은 바람직하게는 25 내지 45 ^° C , 보다 바람직하게는 27 내지 42 ^° C , 보다 더 바람직하게는 30 내지 40 ^° C , 가장 바람직하게는 35 내지 40 ^° C일 수 있다. 본 발명에서 상기 (c)단계 이후에 수득된 콜라겐 가수분해물을 원심분리， 이 온교환 크로마토그래피， 여과 등을 통해 이물질을 제거하고， 농축하는 단계를 추가 로 포함할 수 있다. 이물질을 제가하고 농축하는 과정은 당업계에서 통상적으로 사 용되는 방법은 제한없이 이용될 수 있다. 본 발명에서 상기 방법에 따라 제조된 콜라겐 가수분해물은 타가수분해효소 를 이용하여 제조된 콜라겐 가수분해물과 비교해 콜라겐 트리펩타이드의 함량이 현 저히 향상된 것을 기술적 특징으로 한다. 콜라겐 트리펩타이드란 아미노산이 3개 (글라이신 -x-y)가 연결되어 있는 작은 콜라겐 (분자량이 보통 200~500)을 말하며, 분자량이 작아 피부를 쉽게 투과하는 것 으로 알려져 있다. 한편 아미노산이 4개 이상 연결되어 있으면 분자구조가 커서 피부를 투과하지 못한다. 콜라겐 트리템타이드는 피부투과 후 곧바로 서로 다시 연 결됨으로써 손상된 콜라겐 조직을 복구하는 시간을 단축시키는데 기여한다. 또한, 섭취하였을 때에도 일반적인 저분자콜라겐보다 체내 흡수율이 높아 콜라겐의 생체 효능을 극대화시킬 수 있는 장점이 있다. 따라서， 콜라겐 가수분해물 내에 콜라겐 트리펩타이드의 함량이 높을수록 생체이용률이 높아 콜라겐의 생리학적 활성이 극 대화될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면， 본 발명의 상기 콜라겐 가수분해물은 콜라겐 트리펩타이드의 함량이 총 가수분해물 대비 약 53중량 % 로 확인되었다. 타가수분해 효소를 이용하여 제조된 콜라겐 가수분해물은 콜라겐 트리펩타이드가 거의 포함되 어 있지 않은 것으로 확인되었다 (실시예 4 및 비교예). 콜라겐은 그 자체로는 체내 에 흡수되는 것이 용이하지 않기 때문에 작은 펩타이드 형태로 가수분해하여 이용 하는 것이 가장 바람직하며, 본 발명의 콜라겐 가수분해물은 체내 흡수가 용이한 콜라겐 트리펩타이드의 함량이 종래 보고된 콜라겐 가수분해물과 비교해 현저히 높 다는 점에서 매우 우수하다. 구체적으로， 본 발명에서 상기 콜라겐 가수분해물은 전체 가수분해물 대비 콜라겐 트리펩타이드가 20, 21， 22， 23， 24， 25, 26， 27, 28， 29， 30， 31， 32， 33, 34, 35, 36， 37， 38, 39, 40， 41, 42， 43, 44， 45, 46, 47, 48， 49， 50, 51, 52， 53, 54, 55, 56， 57， 58， 59, 60， 61, 62， 63, 64， 65, 66， 67， 68， 69， 70 중량 % 로 포함되어 있올 수 있으며， 전체 가수분해물 대비 콜라겐 트리펩타이드가 20 내 지 70 중량 % 범위 이내라면 상기 수치에 제한되지 않는다. 바람직하게는 30 내지 70 중량 %， 40 내지 70 중량 ¾, 50 내지 70 중량 %， 30 내지 60 중량 %， 40 내지 60 중 량%일 수 있으며 , 가장 바람직하게는 50. 내지 60 중량 %일 수 있으나， 이에 제한되 는 것은 아니다.

본 발명은 또한 상기 콜라겐 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 탈모방지 및 /또는 발모촉진용 조성물을 제공한다. 본 명세서에서 "탈모" 는 두피로부터 모발이 탈락하는 현상 또는 모발이 성 기거나 가늘어지는 상태를 의미하며, "탈모 방지" 라 함은 상술한 바와 같은 탈모 현상을 예방하고 억제하는 것을 의미하고， "발모 촉진" 이라 함은 새로운 모발의 생성의 촉진 뿐만 아니라 기존 모발이 건강하게 자라도록 하는 것을 의미한다. 일반적으로 "발모" 는 성장기에서 이루어지며, 휴지기에서 성장기로의 유도 및 성장기에서 퇴행기로의 지연에 의하여 촉진된다. 모발주기는 성장기， 퇴행기， 휴지기로 알려져 있는 3개의 주요 단계들로 나눌 수 있다. 성장기에는 세포의 빠른 증식과 함께 피부 안으로 깊이 모낭이 성장하면서 모발형성이 이루어진다. 다음 현 상은 퇴행기인데 이것은 세포 분열의 중단이 두드러지는 과도기이며， 이 과정에서 모낭은 점차 퇴행하며 발모가 중단된다. 다음 현상인 휴지기에서는 퇴행 모낭은 조 밀하게 찬 모유두 (dermal papilla) 세포를 갖는 배 (germ)를 포함한다. 휴지기에서 새로운 성장기 현상의 개시는 상기 배에서 빠른 세포 증식， 모유두의 팽창 및 기저 막요소의 합성에 의해 유도된다. 따라서， 성장기의 촉진 또는 연장에 의해 모발의 손실 방지， 즉 탈모를 방지 하거나 모발의 재성장을 유발, 즉 발모를 촉진하는 것이 필요하며, 본 발명에 따른 조성물은 이미 존재하고 있는 모발이 빠지지 않게 하는 효과， 이미 존재하는 모발 을 굵게 하는 등 개선시키는 효과， 및 새로운 모발을 생성하는 효과 중 하나 이상 을 포함한다. 종래 가수분해물과 비교해 콜라겐 트리펩타이드의 함량이 현저히 높은 콜라 겐 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 콜라겐 가수분해물의 체내 흡수 및 경피 흡수율이 높고， 흡수속도가 빨라 탈모방지 및.발모촉진 효과가 매우 우수하다. 구체적으로， 본 발명의 일실시예에 따르면， 본 발명에 따른 콜라겐 가수분해 물과 당업계에서 콜라겐을 가수분해하기 위해 일반적으로 사용되는 가수분해효소를 이용하여 제조한 콜라겐 가수분해물의 in vivo흡수도를 평가하여 본 결과， 본 발 명에 따른 콜라겐 가수분해물이 AUClast , Cmax가 현저하 높고， Tmax가 짧은 것으로 나타나 체내 흡수도가 매우 우수한 것을 확인하였다. 이는， 본 발명에 따른 콜라겐 가수분해물의 경우 콜라겐 트리펩타이드의 함량이 현저히 높기 때문에 체내 흡수가 매우 빠르고 흡수율이 우수한 것으로 판단할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일실시예에 따르면， 본 발명에 따른 콜라겐 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 퇴행기 탈모 동물모델에서 모낭세포의 증식을 촉 진하며， 퇴행기의 진행을 억제할 뿐만 아니라 생장기를 유지하는 효과를 나타내며 모발을 성장시키는 효과가 매우 우수한 것으로 확인되었다. 한편， 이러한 본 발명 에 따른 조성물의 모발생성 촉진효과는 양성대조군으로 사용된 미녹시딜 (Minoxidi l )과 동등한 정도로 우수한 것으로 확인되었다. 본 발명에 따른 콜라겐 가수분해물에는 콜라겐 트리펩타이드의 함량이 매우 높아 체내로 흡수되는 콜라겐 유래 펩타이드의 양이 많기 때문에 우수한 효과를 나 타내는 것으로 사료된다. 따라서 , 본 발명은 상기 콜라겐 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 탈모방 지 및 /또는 발모촉진용 식품 조성물을 제공한다. 이러한 식품 조성물은 유효성분인 콜라겐 가수분해물을 함유하는 것 외에 통 상의 싀품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으 로서 함유할 수 있다. 상기한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드， 예를 들어, 포도당， 과당 등; 디사카라이드， 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이 드， 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당， 및 자일리를，소 르비를， 에리트리를 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴)， 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A , 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 ( 사카린， 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화 되 어 기능성 식품으로 이용하거나， 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어， 음료류， 육류， 초코렛，식품류, 과자류, 피 자， 라면， 기타 면류， ¾류， 사탕류， 아이스크림류, 알코을 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다. 또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 콜라겐 가수분해물 외에 여러 가지 영 양제， 비타민, 광물 (전해질)， 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제， 착색제 및 중진제 (치즈， 초콜릿 등)， 펙트산 및 그의 염， 알긴산 및 그의 염， 유기산， 보 호성 콜로이드 증점제， pH 조절제， 안정화제， 방부제， 글리세린, 알콜， 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과 일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 본 발명의 유효성분인 콜라겐 가수분해물은 천연물질로서 독성 및 부작용은 거의 없으므로 탈모 방지 및 /또는 발모 촉진을 목적으로 장기간 복용 시에도 안심 하고사용할수 있다. 본 발명의 상기 식품 조성물은 콜라겐 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 및 /또는 발모 촉진용 건강기능식품일 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 탈모 방지 및 /또는 발모 촉진을 목적으로, 정제， 캅셀， 분말， 과립, 액상, 환등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다. 본 발명에서 "건강기능식품" 이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제 6727호 에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식 품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며， 식품 첨 가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한， 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨 가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하 여 판정한다. 상기 "식품 첨가물 공전" 에 수재된 품목으로는 예를 들어， 케톤류， 글리 신， 구연산칼슘， 니코틴산， 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소， 감초추출물， 결정 셀롤로오스， 고량색소， 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제， 면류첨 가알칼리제， 보존료제제， 타르색소제제 등의 흔합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들 어， 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 콜라겐 가수분해물을 부형 제, 결합제， 붕해제 및 다른 첨가제와 흔합한 흔합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음， 활택제 등을 넣어 압축성형하거나， 상기 흔합물을 직접 압축 성형할 수 있 다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅샐제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 콜라겐 가수분해물을 부형제 등의 첨가제와 흔합한 흔합물을 층진하여 제조할 수 있으며， 연질 캅셀제는 콜라겐 가수분해물을 부형제 등의 첨가제와 흔합 한 흔합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 층진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 갑셀 제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비를 등의 가소제， 착색제， 보존제 등을 함유 할 수 있다. 환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 콜라겐 가수분해물과 부형 제， 결합제， 붕해제 등을 흔합한 흔합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제 할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분， 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 콜라겐 가수분해물과 부 형제， 결합제， 붕해제 등을 흔합한 흔합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제 조할 수 있으며 , 필요에 따라 착향제， 교미제 등을 함유할 수 있다. 상기 건강기능식품은 음료류， 육류, 초코렛， 식품류， 과자류， 피자， 라면, 기타 면류， 껌류， 사탕류， 아이스크림류， 알코올 음료류， 비타민 복합제 및 건강보 조식품류 등일 수 있다. 본 발명은 또한 상기 콜라겐 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 탈모방지 및 /또는 발모촉진용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 콜라겐 가수분해물을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 , 부형제 또는 희석제를 추 가로 함유할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여 용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스， 전분， 셀를로스 유 도체， 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투 여용 담체는 물， 적합한 오일， 식염수， 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황 산수소나트륨， 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드， 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington' s Pharmaceut i cal Sciences , 19th ed. , Mack Publ i shing Company, East on, PA, 1995) . 본 발명의 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투 여할 수 있다. 예를 들면， 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투 여방법으로는 이에 한정되지는 않으나， 정맥내， 근육내， 동맥내， 골수내， 경막내， 심장내， 경피， 피하， 복강내， 비강내， 장관， 국소， 설하 또는 직장내 투여일 수 있 다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경구투여될 수 있다. 예컨대, 본 발 명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘 로 피부를 가볍게 단자 (pr i ck)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으 로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할수 있다. 경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립， 정제, 환제， 당 의정제， 캡술제， 액제, 겔제， 시럽제， 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어， 경구용 제제는 활성성분을 고체 부 형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 흔합물로 가공 함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈， 덱스트로즈， 수크로즈, 솔비를， 만니를, 자일리를， 에리스리를 및 말티를 등을 포 함하는 당류와 옥수수 전분， 밀 전분， 쌀 전분 및 감자 전분 등올 포함하는 전분 류, 셀를로즈， 메틸 셀를로즈， 나트륨 카르복시메틸샐를로오즈 및 하이드록시프로 필메틸-셀를로즈 등을 포함하는 샐를로즈류， 젤라틴， 폴리비닐피를리돈 등과 같은 층전제가 포함될 수 있다. 또한， 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피를리돈， 한천， 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가， 본 발명의 약학적 조성물은 항웅집제, 윤활제 , 습윤제， 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제， 오일 제， 보습제， 겔제， 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문 ¾ (Remington ¹ s Pharmaceut ical Science , 15th Edi t ion, 1975. Mack Publ i shing Company, East on, Pennsylvania 18042 , Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다. 본 발명의 약학적 조성물이 피부외용 약학적 조성물로 사용될 경우 탈모 방 지, 발모 촉진 및 두피 개선 효과를 갖는 피부외용제로서 크림, 젤， 패취， 분무제， 연고제 , 경고제， 로션제, 리니멘트제 , 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 제 형태의 약학조성물로 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자 에게 투여될 수 있으며， 다중 투여량 (mult iple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치 료 방법 ( fract ionated treatment protocol )에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약 학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 는 본 발명의 당단백 분획의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 kg 당 약 O . Olug 내지 1 ,000 mg, 가장 바람직하게는 0. 1 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 본 발명의 치료제 후보물질의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟 수뿐만 아니라 환자의 연령， 체중 건강 상태, 성별， 질환의 중증도， 식이 및 배설 율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로， 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 약 학적 조성물을 탈모방지 및 발모촉진용 약학적 제제로서의 특정한 용도에 따른 적 절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형， 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아 니한다. 본 발명은 또한 상기 콜라겐 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 탈모방지 및 /또는 발모촉진용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 화장료 조성물은 유효성분인 콜라겐 가수분해물 뿐만 아니 라， 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며， 예컨대 항 산화제， 안정화제， 용해화제， 비타민 , 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 , 그리 고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 상술한 콜라겐 가수분해물 이외에, 콜라겐 가수분 해물에 의한 탈모방지 및 발모 촉진의 작용을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 탈모방지제 및 /또는 발모제를 흔합하여 사용할 수 있다. 또한， 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며， 예를 들어， 헤어토닉， 헤어컨디셔너, 헤어에센스， 헤어로션， 헤어영양로션， 헤어샴푸， 헤어린스， 헤어트리트먼트， 헤어크림, 헤어영 양크림, 헤어모이스처크림 헤어맛사지크림， 헤어왁스, 헤어에어로졸， 헤어팩, 헤 어영양팩， 헤어 비누， 헤어클렌징품， 머릿기름， 모발건조제, 모발보존처리제， 모발 염색제， 모발용 웨이브제， 모발탈색게， 헤어겔， 헤어글레이즈, 헤어드레싱어， 헤어 래커， 헤어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이 등 다양한 형태로 제조될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 콜라겐 가수분해물은 피부 주름 개 선효과, 피부 보습효과 등 피부상태를 개선하는 효과가 매우 우수한 것으로 확인되 었다. 한편， 이러한 피부상태 개선효과는 종래 보고된 콜라겐 가수분해효소에 의해 제조된 콜라겐 가수분해물 보다도 현저히 우수한 것이었다. 이는 본 발명에 따른 콜라겐 가수분해물이 고함량의 콜라겐 트리펩타이드로 이루어져 있기 때문에 생체 이용률이 높아 콜라겐의 생리학적 활성이 다 우수하게 발휘된 것으로 판단할 수 있 었다. 본 발명에 따른 콜라겐 가수분해물의 피부상태 개선효과는 구체적인 실시예 를 통해서 보다 명확하게 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 콜라겐 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름개선， 피부 탄력개선， 피부 노화방지 및 /또는 피부 보습용 화장료 조성물을 제 공한다. ^'

또한, 본 발명은 상기 콜라겐 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 주 름개선， 피부 탄력개선， 피부 노화방지 및 /또는 피부 보습용 식품 조성물을 제공한 다. 상기 화장료 조성물 및 식품 조성물에 대해서는 전술한 내용이 그대로 적용 이 될 수 있다. 본 발명은 탈모방지 및 /또는 발모촉진용 제제를 제조하기 위한 상기 콜라겐 가수분해물의 용도를 제공한다. 본 발명은 상기 콜라겐 가수분해물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투 여하는 것을 특징으로 하는 탈모방지 및 /또는 발모촉진 방법을 제공한다. 본 발명은 피부 주름개선， 피부 탄력개선, 피부 노화방지 또는 피부 보습용 제제를 제조하기 위한 상기 콜라겐 가수분해물의 용도를 제공한다. 본 발명은 상기 콜라겐 가수분해물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투 여하는 것을 특징으로 하는 피부 주름개선， 피부 탄력개선， 피부 노화방지 또는 피 부 보습 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 '유효량' 이란 개체에게 투여하였을 때, 발모촉진 및 /또는 탈모의 개선， 치료 예방 등을 나타내는 양을 말하고， 피부 주름, 피부 탄력， 피부 노화 및 /또는 피부 보습의 개선. 치료. 예방 등을 나타내는 양을 말하며， 상기 '개 체' 란 동물， 바람직하게는 포유동물， 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며， 동 물에서 유래한 세포， 조직， 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자 (pat ient ) 일 수 있다. 【유리한 효과】

본 발명은 콜라겐 트리템타이드가 고함량으로 포함된 콜라겐 가수분해물 및 이의 용도에 관한 것으로， 본 발명의 콜라겐 가수분해물은 종래 보고된 콜라겐 가 수분해물과 비교해 콜라겐 트리펩타이드의 함량이 현저히 높아 체내 흡수율이 우수 하며， 우수한 탈모예방， 발모촉진， 주름개선 및 /또는 보습효과를 나타낸다.

【도면꾀 간단한 설명】

도 1은 본 발명의 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소의 양이온 이온수 지를 이용한 분리 정제 결과를 나타낸 도면이다. A는 정제된 콜라겐 분해효소의 SDS-PAGE 분석결과이다 (M: protein si ze marker , cone : 농축 샘풀， wash: wash, E1-E5 : elut ion 샘플 1~5) . B는 AKTA pr imer에서 버퍼의 농도별 변화에 따른 콜라 겐 분해효소 정제를 peak로 나타내고 있다 (화살표는 각각의 elut ion sample 들에 대한 표시이다. ) .

도 2는 본 발명의 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소의 음이은 이온수 지를 이용한 분리 정제 결과를 나타낸 도면이다. A는 정제된 콜라겐 분해효소의 SDS-PAGE 분석결과이다 (M: protein si ze marker , PI : peak 1을 나타냄) . B는 AKTK pr imer에서 버퍼의 농도별 변화에 따른 콜라겐 분해효소의 정제를 peak로 나타내고 있다 (화살표는 각각의 e hit ion sample에 대한 표시이다) .

도 3은 본 발명의 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소의 온도별 효소활 성 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4는 본 발명의 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소의 시간과 온도에 따른 효소활성 변화 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5는 본 발명의 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소의 pH별 효소활성 결과를 나타내는 그래프이다.

도 6은 본 발명의 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소와 일반 단백질 분해효소의 콜라겐 트리펩타이드 생산성을 비교한 HPLC 데이터이다 (A: CTP 표준물 질， B: BP, C: Alcalase 2.4L FG' D: Flavourzyme 1000L, E : Col lupul in MG) .

도 7은 본 발명의 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소를 이용하여 콜라 겐 트리펩타이드 함량이 높은 콜라겐 가수분해물을 생산하는 제조공정이다.

도 8은 본 발명의 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소를 이용하여 생산 된 가수분해물의 콜라겐 트리펩타이드 (CTP) 함량을 분석한 HPLC 데이터이다 (A: CTP 표준물질， B: BP, C : Alcalase 2.4L FG) .

도 9는 Dexamethasone으로 퇴행기 탈모를 유도한 동물모델에서 시험물질의 투여가 모낭의 생장기 및 퇴행기 비율에 미치는 효과를 평가한 그래프이다 ( (A)제모 9일째, (B)제모 11일， (C)제모 14일， (D)제모 17일, anagen: 성장기, catagen: 퇴 화기, Nor : dexamethasone을 처리하지 않고 제모만 진행한 normal군, Control : dexamethasone 처리 및 제모를 진행한 후 용매를 투여한 군, BP-CH: dexamethasone 처리 및 제모를 진행한 후 본 발명의 콜라겐 가수분해물을 투여한 군， Minox : dexamethasone 처리 및 제모를 진행한후 미녹시딜을 투여한 양성대조군) .

도 10은 Dexamethasone으로 퇴행기 탈모를 유도한 동물모델에서 시험물질의 투여가 시험동물의 발모 진행에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.

도 11는 Dexamethasone으로 퇴행기 탈모를 유도한 동물모델 피부조직의 모낭 성장을 조직염색을 통해 관찰한 결과이다 (Dex : dexamethasone) .

도 12는 UV조사에 의해 주름을 유도한 동물모델에 각 물질을 투여한후 주름 개선 효과를 실리콘과 에폰수지를 사용한 모사판으로 관찰한 결과이다 (N: Normal , C: Control , P: Posi t ive control , C0L17 , C0L34: 일반 콜라겐분해효소에 의해 생 산된 콜라겐 가수분해물 17 mg/kg 또는 34 mg/kg투여군， CTP17, CTP34: 본 발명의 콜라겐 가수분해물 17 mg/kg또는 34 mg/kg투여군).

도 13은 실험이 종료된 후 SKH-1 hairless 마우스의 피부를 채취하여 Masson's Tri chrome staining을 진행한 결과를 나타낸다 (N: Normal , C: Control , P: Positive control, C0L17, C0L34: 일반 콜라겐분해효소에 의해 생산된 콜라겐 가수분해물 17 mg/kg 또는 34 mg/kg 투여군， CTP17, CTP34: 본 발명의 콜라겐 가수 분해물 17 mg/kg또는 34 mg/kg투여군).

도 14는 실험이 종료된 후 SKH-1 hairless 마우스의 피부를 채취하여 조직 내 Collagen 1A (A)및， MMP-l(B)의 단백질 발현량을 웨스턴 블롯으로 확인한 것을 정량화한 결과이다 (N: Normal , C: Control, P: Positive control, C0L17, C0L34: 일반 콜라겐분해효소에 의해 생산된 콜라겐 가수분해물 17 mg/kg 또는 34 mg/kg 투 여군， CTP17, CTP34: 본 발명의 콜라겐 가수분해물 17 mg/kg 또는 34 mg/kg 투여 군).

도 15는 실험 중간인 5주차, 10주차에서 마우스 피부의 유분 (A), 수분 (B)의 정도 차이를 확인한 결과이다 (N: Normal , C: Control, P: Positive control , C0L17, C0L34: 일반 콜라겐분해효소에 의해 생산된 콜라겐 가수분해물 17 mg/kg 또 는 34 mg/kg 투여군， CTP17, CTP34: 본 발명의 콜라겐 가수분해물 17 mg/kg 또는 34 mg/kg투여군).

도 16은 피부건조를 유도한 Balb-c 마우스에 각각의 물질을 투여한 후 피부 수분함유량을 평가한 결과이다 (N: Normal , C: Control, P: Positive control, CTP17: 본 발명의 콜라겐 가수분해물 17 mg/kg, C0L34: 종래 보고된 가수분해효소 를 이용하여 제조한콜라겐 가수분해물 34 mg/kg투여군).

도 17은 피부건조를 유도한 Balb-c 마우스에 각각의 물질을 투여한 후 가려 움으로 인한 긁음 횟수를 측정한 결과이다 (N: Normal , C: Control, P: Positive control, CTP17: 본 발명의 콜라겐 가수분해물 17 mg/kg, C0L34: 종래 보고된 가수 분해효소를 이용하여 제조한콜라겐 가수분해물 34 mg/kg투여군).

도 18은 피부건조를 유도한 Balb-c 마우스에 각각의 물질을 투여하고， 실험 이 종료된 후 각 마우스의 피부 조직을 채취하여 피부보습인자 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯을 통해 확인하여 정량화한 결과이다 (A: Collagen 1A, B: AQP3, C: HAS2, N: Normal , C: Control, P: Positive control, CTP17: 본 발명의 콜라겐 가 수분해물 17 mg/kg, C0L34: 종래 보고된 가수분해효소를 이용하여 제조한 콜라겐 가수분해물 34 mg/kg투여군). 【발명의 실시를 위한 형태】

이하본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

콜라겐 가수분해효소의 제조

본 발명에서 콜라겐 가수분해물을 제조하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조 된 콜라겐 가수분해물에 관해서는 한국특허출원 제 10— 2014-0158019호를 참고할 수 있다. 즉， 바실러스 서브틸리스 균주 (기탁번호 KCTC12866BP)를 100 ml의 mTB medium (yeast extract 2.4%, tryptone 1.2%, glycerol 1%, KH ₂ P0 ₄ 2.31%, H ₂ HP0 ₄

12.54%)에 배양한 뒤 6500 rpm에서 15분간 원심분리 하였다. 상등액을 조심스럽게 새로운 류브에 옮긴 후 30 kDa f i lter를 이용하여 5배 농축하였다. 농축한 상등액 을 AKTA pr ime 장치를 이용하여 이온 교환크로마토그래피법으로 정제하였다. 이때 사용한 정제 조건은 A 버퍼 (50 mM Tr i s-HCKpH 7.5) )를 binding 버퍼로 사용하였고 B 버퍼 (50 mM Tr i s-HCKpH 7.5) , 0.5M NaCl )를 이용해 경사를 주었다. 유속은 5 ml/min 으로 흘려주었다. 정제는 양이온 교환 크로마토그래피와 음이온 교환 크로마토그래피법을 사용하였는데， 이온수지로는 양이온 수지인 SP sepharose resin(GE Heal thcare , new-Jersey, USA)와 음이온 수지인 Q sepharosse resin(GE healthcar , new-Jersey, USA)을 각각사용하였다. 처음 양이온 교환 크로마토그래피에서는 0.5M NaCl로 경사를 주고 각 분획별 로 정제단백질을 받았다. 도 1B에 나타난 바와 같이， 정제 프로파일에서 단백질 피 크가 나타나는 분획 (E1~E5)의 단백질 정제도를 SDS-PAGE상에서 확인한 결과, E1 , E2에서 목적효소로 예상되는 단백질이 포함되어 있었고， 특히， E1에 가장 많은 콜 라겐 분해효소가 있는 것을 확인하였다 (도 1A의 화살표 표시)

E1~E5의 NaCl 농도는 El : 0. 1-0.2M, E2 : 0.2-0.3M, E3 : 0.3-0.4M, E4: 0.4-0.5M, E5: 0.5M 이기 때문에, 양이온 교환 크로마토그래피에서 목적효소를 분 리할 수 있는 NaCl 농도는 0.1-0.3M인 것을 알 수 있었고 가장 좋게는 E1 부분인 0.1-0.2M의 NaCl 농도에서 목적효소의 회수율이 가장 좋은 것을 알 수 있었다. 다 음으로는 E1을 음이온 교환크로마토그래피법으로 정제하였다. 이때 사용된 버퍼는 0.25M의 NaCl을 사용하였고 양이온교환 크로마토그래피 와 동일하게 경사를 주었다. 도 2B에 나타낸 바와 같이 정제프로파일에서 음이온 교환수지는 0.09-0.115M의 NaCl에서 단백질 피크가 나타나는 것을 확인하였다 (도 2B의 화살표 표시). 이 분획의 정제도를 SDS-PAGE상에서 확인한 결과， 목적효소가 대부분 깨끗하 게 정제된 것을 확인하였다 (도 2A의 P1). 따라서 음이온 교환 크로마토그래피에서 는 0.09~0.155M의 NaCl에서 목적효소의 회수율이 가장 좋은 것을 알 수 있었다. 이 후， 정제된 신규 콜라겐 분해효소는 BP로 명명하였다.

<실시예 2>

BP의 효소반옹 조건 실험

최적온도 실험으로 20~70 ^° C의 온도에서 효소반응을 진행하여 역가를 측정하 였다. 도 3에 도시된 바와 같이， 실험 결과 30~55 ^° C에서 효소활성을 지니고 있으 며， 특히 50 ^° C에서 가장 높은 비활성 (specific activity)과 상대적 활성 (relative activity)을 보이고 60 ^° C부터는 활성이 급격하게 떨어지는 것으로 확인되었다. 실제 대량생산에 적용하기 위한 온도 안정화 실험을 실시하였다. 온도는 30 ^° C, 35 ^° C, 40 ^° C, 그리고 50 ^° C로 맞추어 주었고 각각의 은도별 시료를 0시간부터 12 시간까지 시간별로 sampling하여 각각의 잔존 활성을 확인하였다.

도 4에 나타난 바와 같이 , 그 결과 온도가 낮을수록 효소의 안정화가 지속되 는 것이 보였고， 35 ^° C와 40 ^° C에서는 12시간이 지나면 효소의 활성이 59.3%정도 남 아 있는 것으로 확인되었다. 이러한 결과로 미루어 보아 현재 콜라겐 트리펩타이드 의 생산 공정을 35 ^° C로 셋팅하는 것이 바람직하였다.

다음으로, 최적 pH에서 대해서 알아보았다. 돈피 젤라틴 기질을 각각의 pH별 로 만들어진 버퍼 (50 mM citrate-Na ₂ HP0 ₄ (pH 5.0-6.0), 50 mM Tris-HCKpH

6.0-9.0), 50 mM Na ₂ C0 ₃ -N¾HC0 ₃ (pH 9.0~10.0))에 녹인 뒤 효소의 활성을 측정하여 최적 pH를 확인하였다. BP는 pH 7.4에서 가장 높은 활성을 보였고 pH 6~10까지 중 성대의 영역에서 높은 활성을 보였다. 그러나， 도 5에 도시된 바와 같이， 산성이나 염기성으로 갈수록 효소의 활성은 비슷하게 떨어지는 것이 확인되었다. 이하, 상술한 콜라겐 분해효소 (BP)를 이용하여 콜라겐 트리펩타이드를 제조 하는 과정에 대해 설명한다.

<실시예 3>

BP의 콜라겐 트리펩타이드 생산성 확인

전처리된 어린 (물고기 비늘)을 교반기가 장착되어 있는 반웅기에 어린과 물 의 중량비율을 20 :80의 비율로 균일하게 흔합하여 약 90 ^° C에서 5시간 열처리를 실 시하여 각 4개의 시료를 준비하였다. 4개의 시료에 BP (제조사: 아미코젠)， Alcalase 2.4L FG (제조사: 노보자임， 구입처: 바이오시스), Flavourzyme 1,000L ( 제조사: 노보자임， 구입처: 바이오시스)， Collupulin MG (제조사: 노보자임, 구입 처: 대종상사)의 효소를 사용하여 콜라겐 트리펩타이드 생산성을 비교하였다. 각 효소의 반웅 조건 (온도， pH, 효소사용량， 반응시간)는 다음과 같다.

- BP: 35 ^° C, pH 7.4， 30 unit/g (어린)， 12시간

- Alcalase 2.4L FG: 60 ^° C, pH 7.0, 30 unit/g (어린)， 12시간 ᅳ Flavourzyme 1,000L: 55 ^° C , pH 6.0, 30 unit/g (어린)， 12시간

- Collupulin MG: 60 ^° C, pH 7.0, 30 unit/g (어린)， 12시간 효소처리 후， 80 ^° C에서 30분간 열처리하여 효소를 실활하였다. 다음으로， 4 가지 효소를 비교 분석하여 BP의 콜라겐 트리펩타이드 생상성을 확인하였다.

제조된 콜라겐가수분해물 분석은 HPLCXgilson사)를 사용하였으며，

TM

Superdex Peptide 10/300GL 컬럼， 이동상 (10 mM Tris-CKpH 7.4), 0.15 M NaCl , 5 mM CaCl ₂ ), 유속: 0.5 i /min의 조건에서 콜라겐 트리펩타이드 (col lagen tripeptide, CTP)를 분석하였다. CTP의 표준물질로는 세 개의 아미노산으로 구성된 글리신-프를린 -하이드록시프를린 (glycine-proline-hydroxyproline, GPH)을 사용하 였다. 도 6에 나타난 바와 같이， 분석결과， CTP표준물질의 경우에는 약 55분대에서 피크가 형성되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 4가지 효소의 분해활성을 비교한 결 과, BP를 이용하여 가수분해한 콜라겐 가수분해물의 경우에는 피크가 대부분 늦은 시간에 나와 콜라겐이 저분자화 되었다는 것을 알 수 있었고, 표준물질에 동일한 시간대에서 커다란 피크가 보여, CTP의 함량이 높음을 알 수 있었다. Alcalase 2.4 L FG를 이용하여 가수분해한 콜라겐 가수분해물은 다른 Flavourzyme 1000 L 또는 col lupuin MG를 이용하여 가수분해한 콜라겐 가수분해물 비해 저분자 함량이 높았 지만， CTP의 함량은 거의 없는 것으로 나타났다. 이 결과로 BP가 콜라겐 트리펩타 이드 생산에 매우 효과적임을 알수 있었다.

<실시예 4>

BP를 이용한콜라겐가수분해물의 제조

콜라겐트리펩타이드가 함유된 콜라겐가수분해물을 생산하기 위해 BP를 이용 한 제조방법을 확립하였다. 전처리된 어린 (생선 비늘)을 교반기가 장착되어 있는 반웅기에 어린과 물의 중량비율을 20:80의 비율로 균일하게 흔합하여 약 90 ^° C에서 5시간 열처리를 실시하였다.

열처리된 상기액을 35 ^° C에서 10% NaOH를 투입하여 용액내 pH 7.4가 되도록 보정하였다. 보정된 상기액에 BP를 약 30 unit/g (어린) 투입 후 35 ^° C에서 12시간동 안 반응시켰다. 효소반웅 후 80 ^° C에서 30분간 열처리하여 효소를 실활하였다. 효소 처리된 콜라겐 펩타이드액을 초고속 연속원심분리기를 이용하여 이물질을 제거한 후 이온칼럼정제 통해서 금속이온 등 이물질을 제거하였다ᅳ

상기의 액을 진공감압농축기를 이용하여 Brix 35%까지 농축 후 활성탄정제를 통해서 탈색， 탈취를 실시하였다. 활성탄 정제액을 정밀여과 (membrane f i ltrat ion) 로 제균 후 분무건조기로 분말화하여 품질검사를 시행하였고 포장 단계를 거쳐 트 리펩타이드가고함량으로 포함된 콜라겐 가수분해물을 제조하였다 (도 7) .

<비교예 1>

일반적인 가수분해효소를 이용하콜라계가수분해물의 제조

신규 BP를 이용한 제조공정과 비교를 위해 일반적으로 저분자 콜라겐 분해공 정에 사용되는 Alcalase 2.4 L FG (제조사: 노보자임， 구입처 : 바이오시스)를 이용 하여 콜라겐 트리펩타이드 생산성을 비교하였다. 전처리된 어린 (생선 비늘)을 교반 기가 장착되어 있는 반웅기에 어린과 물의 중량비율을 20:80의 비율로 균일하게 흔 합하여 약 90 ^° C에서 5시간 열처리를 실시하였다.

열처리된 상기액을 55 ^° C에서 10% NaOH를 투입하여 용액내 pH 7.5가 되도톡 보정하였다. 보정된 상기액에 Alcalase효소를 약 30 unit/g (어린) 투입 후 35 ^° C에 서 12시간동안 처리하였다. 효소반웅 후 80 ^° C에서 30분간 열처리하여 효소를 실활 하였다.

효소처리된 콜라겐 펩타이드액을 초고속 연속원심분리기를 이용하여 이물질 을 제거한 후 이온칼펌정제 통해서 금속이온 등 이물질을 제거하였다. 상기의 액을 진공감압농축기를 이용하여 Br ix 35%까지 농축 후 활성탄정제를 통해서 탈색, 탈취 를 실시하였다. 활성탄정제액을 필터프레스 여과 및 정밀여과 (membrane f i l trat ion)로 제균 후 분무건조기로 분말화하여 품질검사를 시행한 한 후 콜라겐 트리펩타이드 (CTP) 함량을 분석하였다.

CTP함량은 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다. 시료는 BP 및 Alcalase를 사용하여 제조된 최종 배합 전 단계의 콜라겐 가수분해물을 분석하였 다. 도 8에서 나타낸 바와 같이， CTP함량의 경우, BP를 사용하여 제조된 콜라겐 가수분해물에서 CTP 표준물질과 동일한 위치에서 피크가 나타나는 것을 확인할 수 있었으며， Alcalase를 사용하여 제조된 콜라겐 가수분해물에서는 동일한 위치에 피 크가나타나지 않았다.

BP와 Al cal ase를 이용하여 제조된 콜라겐가수분해물의 CTP 함량을 정량적으 로 비교한 결과， BP는 53. 1^ Alcalase는 0%였다. 이 결과는 BP를 사용하면 콜라겐 트리펩타이드의 함량이 높은 콜라겐 가수분해물을 제조할 수 있음을 보여주고 있 다.

<실시예 5>

BP이용 콜라겐 가수분해물과 Alcalase이용 콜라겐 가수분해물의 흡수도 비교 <5-1>동물 실험방법

male Spr ague-Daw ley (SD) rat를 ether로 마취시킨 상태에서, 오른쪽 경동맥 을 polyethylene tubing으로 cannulat ion한 다음， infusion harness를 이용하여 cannula를 목뒤로 빼내어 랫트가 자유로이 움직일 수 있도록 하고 수술부위는 봉합 하였다. Cannulat ion한 rat을 12시간 이상 절식 시키고, 물은 자유로이 공급한 후, 각 군당 6마리에 상기 실시예 4 및 비교예 1의 콜라겐 가수분해물 제조 방법에 따 라 BP를 이용한 콜라겐 가수분해물 (BP-CH)과 Al cal ase를 이용한 콜라겐 가수분해물 (Alcalase-CH)을 500 mg/kg(5 mL/kg)의 용량으로 증류수에 녹여 투여하였다. 투여 후 시간 별로 (15， 30， 45, 60， 90, 120, 180, 240， 및 360 분) 경동맥으로 채혈하 고 원심분리하여 혈장을 분리하였다. 혈장 시료들은 분석 시까지 -20 ^° C 냉동고에 보관한 후, LC-MS/MS로 혈장 중 하이드록시 프를린 (Hydroxypro line, Hyp) 의 농도 를 동시 분석하여 정량하였다.

<5-2> LC-MS/MS분석법

시료 전처리: 혈장 50 에 내부표준액 (Gabapentin 0.1 ug/mL) 50 uL를 가하고 흔합한 다음 5% trichloroacetic acid 50 를 넣고 흔합하여 13,000 rpm 에서 10분간 원심분리하여 얻은 상층액을 증류수로 2배 희석한 용액 2 를 LC- MS/MS에 주입하여 분석하였다.

분석 장치: Agilentl260 HPLC system과 Agilent6460 tr i le-quadrupole mass spectrometer

컬럼: Zorbax SB-Aq , particle size 1.8μ , 2.0 mm, i.d. 100 mm, 1. 컬럼 온도: 30 ^° C

이동상 : 0.1% formic acid (A) acetonitri le (B) gradient elution 유속: 0.25 mL/min

주입량: 2 _U L

<5-3>흡수도 평가방법

각 군의 각 목적성분에 대한 혈장농도 -시간 곡선을 작성한 후, 혈장농도-시 간 곡선의 총면적 (AUC; Area under the plasma concent rat ion-t ime curve)을 구하 여 흡수도를 비교하였다. AUC는 사다리꼴 방법 (linear trapezoidal method)에 의 해서 구하였다. Terminal phase에서의 외삽이 어려워 무한대까지의 총 AUC는 구하 지 않고， 마지막 채혈시점인 6시간까지의 AUClast를 구하였다. 최고 혈중 농도 (Cmax)와 최고 혈중 농도 도달 시간 (Tmax)은 그래프 상에서 직접 읽어 구하였다. 각 군 간의 AUC, Cmax, Tmax 수치를 one-way AN0VA 분석과 Duncan사후 검정법으로 통계적 유의성을 검토하였다.

<5-4>콜라겐 가수분해물의 흡수도 실험 결과

혈중 free Hyp의 AUC값과 Cmax값이 BP-CH와 Alcalase-CH 군 간에 유의적인 차이를 보였다. 이는 혈액에 Hyp의 흡수율이 높았음을 뜻한다. 또한 BP-CP 투여 군 에서 Tmax 값이 Alcalase-CH 군에 비하여 빠른 것으로 나타났다. 이 결과는 BP-CH 를 섭취한 후 Hyp가 빠르게 흡수되었다는 것을 의미하며， 혈액에서 머문 시간이 짧 은 것으로 보아 혈액에서 조직으로의 흡수가빨리 일어났음을 알수 있었다 (표 1). 본 실험을 통하여 콜라겐 특이적인 아미노산인 Hyp의 혈중 변화 추이를 살피 어 BP를 이용한 콜라겐 가수분해물의 흡수 효용성이 Alcalase를 이용한 콜라겐 가 수분해물에 비하여 높음을 확인할 수 있었다.

【표 1】

BP 이용 콜라겐 가수분해물 및 Alcalase 이용 콜라겐 가수분해물의 Hyp에 대 한 흡수도 결과 비교

Abbreviation

AUC st , total area under the lasma concent rat iont ime curve from time zero to last measured time, 6 hr; C peak lasma concent rat i on； T _max , t i me to reach C _max

a

SD: Standard deviations b CTP group is significantly (p< 0.05) different from Alcalase-CP group.

Median (range) for T _max

〈실시예 6>

BP를 이용한콜라겐 가수분해물의 탈모방지 및 발모촉진 효과 <6-l>실험동물 식이 제조

실시예 4의 콜라겐 가수분해효소 제조방법과 동일한 방법에 의해 콜라겐 가 수분해물을 제조하되， BP효소 처리량을 17 uni t /g로 처리하여 CTP함량 28%를 가지 는 콜라겐 가수분해물 (BP-CH)제조하여 식이에 사용하였다.

<6-2> 실험동물 및 퇴행기 탈모 동물모델의 확립

실험동물은 C57BL/6 마우스로， 멜라닌 색소가 모낭에 존재하여 멜라닌 색소 의 양에 따라 피부색이 변화하여 피부색으로 모발주기 확인이 가능한 종으로 (생장 기: 검은색, 퇴행기 및 휴지기: 분홍색) 생후 6-7주령이 되면 휴지기로 변화한다. 이러한 특성 때문에 선택하였으며， 6주령의 C57BL/6 암컷 마우스 ( 17g-20g)를 대한 바이오링크 (층북)로부터 35두 입수하였다. 시험군은 dexamethasone S. 퇴행기를 유도하는 dexamethasone 처치군, dexamethasone 처치와 BP를 이용하여 제조한 콜라겐 가수분해물 (BP-CH) 투여군 용 매대조군 (cont ro l ) 및 양성대조군 (3% Minox i di l ) 처치군으로 설정하였고， 각 군당 8마리씩 구성하였다. 용미!대조군 및 콜라겐 가수분해물은 투여시 체중올 측정하여 2 , 000 mg/10 ml /kg씩 매 1회， 10일간 경구투여 하였고， 양성대조군인 Minoxi di l 또 한 매일 도포하였다.

7주령의 시험동물의 등을 동물용 제모기 및 제모제 니크린 (일동제약)을 이용 하여 털을 제거하고 물로 재빨리 세척하였다. 제모 7일후부터 시료 및 미녹시딜을 매일 1회씩 10일간 투여하였다. 0. 1% Dexamethasone은 제모 9일째부터 1 ml /day씩 5일간 시험동물의 등에 도포하였다. 시험동물은 마지막 시료 및 Minoxi di l 투여 다 음날 ether로 마취하여 회생하였다.

<6-3> 탈모 퇴행기 억제 및 생장기 유지효과 확인

매일 1회 시험동물의 임상증상 및 사망여부를 확인하였다. 생장기 유도 효과 를 육안으로 확인하기 위하여 주 1회 사진 촬영을 하였고， 퇴행기 억제 효과를 관 찰하기 위하여 3일에 1회 사진 촬영을 하였다. 촬영된 사진은 ImageJ를 이용하여 시험동물의 전체 제모 부위 중 색이 회색에서 검은색으로 변하는 비율을 측정하여 생장기 및 퇴행기의 비율을 구하였다. 이에 대한 결과를 하기 표 2， 도 9 및 도 10에 나타내었다.

【표 2]

퇴행기 억제 모델에서 제모부위 중 퇴행기 비율 (%)

Dexatoethasone

계모 후 겨간 정샅대조 — ϊ¾1 fll조군

IP-CH

(coniro扁)

Day 9 57.0 ± 26.8 67.4 ± 17.0 56.9 ± 2S.3 40.8 15.4* π 22.6 ± iz . r ^* 100 -0 0.0 29.8 ± 197" 17,8 ± 4.9·"

14 7.6 + 5, 7** 99,3 ± 1.2 32.0 ±： 23.6 ^s * 9.7 + 6 , 2"

17 0, 8 ± 2, Γ 97,7 ± 2.3 27 , 3 ± 26.4** 8, 8 ± 6.6

Tlhe al es are me ni.SE,

SSgnificant dsfierene© from Control group by D mist's t-teat： ^** Ο.ΟΙ.

상기 표의 수치는 제모하여 퇴행기를 유도한 부위의 퇴행기 진행 비율을 뜻 한다. 즉， 비율이 높을수록 퇴행기 진행율이 높고， 낮을수록 퇴행기가 억제됨을 의 미한다. 상기 표에서 BP-CH는 본 발명의 콜라겐 가수분해물을 섭취한 동물군을 의 미한다. 상기 표 2， 도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이， 제모 9 일째 생장기 및 퇴 행기의 비율은 정상대조군 및 시험물질 투여군에서는 차이가 없었지만 minoxidi l 도포군은 dexamethasone만 처리한 용매대조군에 비해 통계적으로 유의하게 생장기 의 비율이 높고 퇴행기의 비율이 감소하였다. 제모 11일， 14일, 17일째 용매대조군은 등이 분홍색을 띄며 시험이 종료되는 시점까지 퇴행기를 유지하였다. 제모 11일째부터 시험물질 투여군 및 minoxidi l 투 여군의 생장기 비율은 통계적으로 유의하게 증가하였다.

<6-3>조직학적 검사

상기 실시예 <5-1>에 따라 실험을 진행한 후, 시험동물의 제모부위 피부를 채취하여 모낭상태를 관찰하고자 하였다.

즉， 시험동물을 ethyl ether로 과마취하여 회생시키고 피부 조직을 제거하여 10% 중성포르말린 용액에 보관하고， 파라핀 포매하여 5 ί皿의 두께로 박절하여 조직 슬라이드를 제작하고 Hematoxyl in & Eosin Staining 염색하였다. 이에 대한 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이， Dexamethasone 처리로 퇴행기를 유도한 용매대조 군은 표피층이 얇아지고 모낭은 생성되지 않았다. Dexamethasone을 처리하고 콜라 겐 가수분해물을 섭취한 군 (BP-CH)의 표피는 두터워지고 모낭이 발달하면서 생성되 었다. minoxidi l 도포군 또한 표피층이 두터워 지고 모낭이 발달된 것을 확인할 수 있었다.

즉, 본 발명에 따른 콜라겐 가수분해물은 퇴행기 탈모 상태에서 모낭세포의 증식을 촉진하여 모발성장을 향상시키는 효과가뛰어나다는 것을 알수 있었다.

<실시예 7>

BP를 이용하콜라 가수분해물의 주름개선 효과

본 시험에 사용한 SKH-1 hai r less mouse계， 6주령 모델 (암컷)을 샘타코 BIOKOREA (경기도 오산시， 한국) 로부터 수입， 분양 받아 (주)동남의화학연구원 동 물사 (동물시설등록증: 제 412호)에서 일주일간 검역과 순화사육을 거친 건강한 동 물로 사육환경을 온도 (22 土 3) ^° C , 상대습도 (50 士 10)%， 조명시간 12시간 (07: 00~ 19 : 00)로 설정하여 실시하였다. 하기 표 3과 같이 각 군당 10마리씩 총 7군으로 나누어 실험하였다. 정상군 을 제외한 나머지 주름유도군은 UVB조사를 10주간 단계별로 하였으며， 조사군에는 C ntr이군과 Posi t ive controls (ret inoic acid 2 mg/kg, i .p . ) , 일반 콜라겐 분 해 효소 (Alcalase)에 의한 콜라겐 가수분해물 (C0L) 및 본 발명에 따른 콜라겐 가수 분해물 (CTP) 시료투여를 각각 용량별로 17 mg/kg, 34 mg/kg 14주간 경구 투여하였 다. 사료는 실험동물용 고형사료 (샘타코 BIOKOREA, 한국)를 사용하였으며 음수는 자유 섭취시켰다.

【표 3] 실험동물의 구성

양성대조군 (Posit ive control )의 경우 Bel inda M 방법 (The journal of invest igat ive dermatology, 112(3)； 271-278, 1999. )을 참고하여 ret inoic acid 0.05%를 복강투여 하였다.

자외선 조사장치 (동서과학， UV-1000)는 캐비넷 내에 UVB를 방출하는

Sunlamp로 방출하였으며， 광원은 302 nm로, UVB 강도가 0.3 mW/cm ² 가 되는 높이에서 조사하였다.

자외선 조사량은 UV-radiometer로 측정하였으며， 마우스를 자외선 조사용 케이지에 가둔 후, 등 부위에 격일간격으로 1주일에 3회， 총 10주간 [0주: 60 mJ/m ² (1 M.E.D) , 1주: 120 mJ/m ² (2 M.E.D) , 2~3주: 180 mj/m ² (3 M.E.D) , 4~5주: 240 mJ/m ² (4 M.E.D) 5주~10주: 240 mJ/m ² (4 M.E.D)] 조사하였다.

<7-1> 피부주름의 형태학적 관찰

피부주름 양상 관찰은 실험동물을 5주〜 14주째 에테르로 가볍게 마취한후 디 지털 카메라로 등 표면을 사진 촬영을 한 후， SILFLO (Flexico developments LTD. Tokyo , Japan) si l icone rubber impression material로 등 쪽 피부 주름의 repl ica 를 제작하여 microscope로 촬영한후 주름의 양상을 실험 군별로 비교 관찰하였다. 피부 주름의 형태를 육안으로 관찰한 결과는 도 12와 같다. SKH-1 hair less 마우스 피부에 SILFL0를 사용하여 제작된 모사판의 피부주름 양상을 관찰한 결과， UVB를 조사한 Contr 군 (C군)은 주름의 두께가 굵고 간격이 넓으며 주름이 깊게 형 성되었고， retinoic acid를 투여한 P군과 C0L 17， 34 mg/kg 투여군， CTP 17， 34 mg/kg를 투여한 군은 C군 대비하여 상대적으로 주름이 덜 형성되거나， 주름의 두께 가 얇고 선이 가는 것을 확인하였다 (도 12).

이를 고려해 볼 때， UVB 10주 조사에도 불구하고 본 발명에 따른 콜라겐 가 수분해물 시료 투여가 SKH-1 hairless 마우스 표피 각질형성세포에 효과적으로 작 용하여 피부 주름 형성에 개선, 예방에 도움이 될 것으로 판단되었다.

<7-2>피부의 조직학적 관찰

절취한 피부 조직을 실온에서 10% 증성포르말린 용액에 24시간 고정 한 후 통상적인 방법으로 수세， 탈수, 투명, 침투 과정을 거친 다음 paraffin으로 포매 하고 4 iim 두께로 절편을 만들어 실온에서 Bouin 용멕에 하룻밤 담그고 Masson' trichrome 염색 후 진피층 내 교원섬유 (collagen fiber)의 양과 형태를 광학현미 경으로 관찰하였다. 또한， 절취한 피부조직을 10% formal in에 넣어 조직을 고정한 후 수세하고 60%에서 100% alcoh 로 순차적으로 탈수하여 파라핀에 _. 포매 하고 block을 만를었 다. 이것을 rotary microtome올 사용 하여 5 μιτι의 두께로 조직절편을 만들어 Hematoxylin & Eosin으로 염색 한 후 광학현미경 (Nikon Co. , Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.

UVB가 과량 조사되면 표피가 거칠어지고 정상적인 교원질의 구조가 파괴되 어 교원질이 불규칙한 배열이 되며， 탄력 섬유의 발현이 감소된다. 피부 진피 층 내 탄력섬유의 변화 및 손실 양과 형태를 관찰한 결과， Contr 군 (C군)은 변성된 탄력섬유를 확인할 수 있었으나， 양성대조군 및 일반 콜 라겐 가수분해물 (C0P군), 본 발명에 따른， 콜라겐 가수분해물 투여군 (CTP군)의 경 우 14주간 시료 처리로 탄력 섬유가 C군과 대비하여 조밀해진 모습을 확인할 수 있 었다 (도 13).

또한 진피 내 콜라겐 양과 형태를 관찰한 결과, UVB만 조사한 C군은 교원섬 유가 파괴되어 배열이 불규칙해졌으며， 콜라겐 양도 NormaKN군)에 비해 줄어든 경 향을 확인할 수 있었다. 그러나 retinoic acid를 처리한 양성대조군 (P군)， C0L군 및 CTP를 14주간 처리한 군 모두 콜라겐의 밀도가 C군과 비교하여 볼 때, 상대적으로 조밀하며 규칙적으로 나타난 것을 확인할 수 있었다. 특히, C0L군과 비교해 진피 내 콜라겐의 양과 조밀한 정도도에서 CTP 투여군이 더 우수한 결과를 나타내었다 ( 도 13).

<7-3>피부조직의 콜라겐， 콜라겐 분해효소 단백질 발현 확인 (Collagen 1A,

MMP-1)

자외선이 피부에 과량으로 노출되면 MMP-1가 많이 발현되고 활성산소가 과량 발생되어， 항산화 작용이 크게 손상된다. 또한， 각질형성세포에 작용하여 염증성 사이토카인 분비를 증가시키고, 진피 내 섬유아세포에서 콜라겐 합성을 저해하여， 분해 효소 활성을 촉진시켜 과량의 주름을 형성한다. 이에， 본 발명자는 UVB를 조 사한 SKH-1 haireless 마우스에 14주간 일반 콜라겐 가수분해물 (C0L군)과 본 발명 에 따른 콜라겐 가수분해물 (CTP군)을 투여한 뒤， 콜라겐 합성 인자인 Collagen 1A 와콜라겐 분해 효소인 MMP-1의 단백질 발현을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. 단백질 분석을 위해 실험 종료후 채취한 마우스 피부 조직을 Cell lysis buffer 20 mg당 200 에 넣은 후 homogenizer를 이용하여 조직을 파쇄한 후， 800 rpm, 10 초 centrifuge하여 상층액만 사용하였다. 24시간 ice incubation 한.뒤 14,000 rpm, 4 ^° C， 20 min centrifuge한다. Bradford assay2)를 이용하여 단백질을 정량 한 후， 단백질의 SDS-PAGE (Poly aery 1 amide Gel Electrophoresis)를 이용하 여 size 별로 분리하였다. Semi-dry transfer system (Bio-Rad, USA)를 이용하여 PVDF (Polyvinyl idene fluoride) membrane에 이동시킨 후 5¾) skim mi lk를 함유한 Blocking buffer (5% skim milk, IX TBST buffer)를 1시간 동안 처리하였다. lx TBST buffer로 10 rain, 3회 washing 후， Primary antibody인 Collagen 1A, MMP-1, MMP-13을 처리한 후 4 ^° C overnight 반웅시켜, lx TBST buffer로 10 min, 3회 washing 한다. Western Blot detection kit (Abfrontier, WEST SAVE GOLD)를 이용 하여 membrane과 반웅시킨 후 Chemi-Doc (BIORAD XRS system) 장비를 이용하여 발 현 정도를 관찰하였으며， GAPDH로 보정하여 비교하였다. 이에 대한 결과를 도 14에 나타내었다.

UVB를 조사한 Control군 (C군)은 콜라겐을 합성하는 인자인 Collagen 1A의 발 현 양이 유의적으로 (p<0.05) 감소한 반면, 시료 투여 군에서는 Col lagen 1A의 발 현 양이 모두 증가한 것을 확인할 수 있었다. 특히， ret inoic acid를 투여한 P군과 C0L 34， CTP 34 투여군에서 p<0.05 유의수준으로 증가함을 확인할 수 있었다 (도 14A) .

콜라겐을 분해하는 효소로 알려진 MMP-1의 단백질 발현을 확인한 결과, UVB 를 조사한 C군에서 MMP-1의 발현양이 증가함을 확인할 수 있었다. 반면에 MMP-1의 발현양은 CTP 17， 34군에서 유의적으로 (p<0.05) 감소하였으며, 이는 양성대조군과 C0L군보다도 월등히 우수한 것이었다 (도 14B) . 결과를 종합하여 볼 때, 과량의 자외선 조사로 콜라겐 분해효소가 증가하고 콜라겐 합성 효소의 발현이 감소한 것이, 본 발명에 따른 콜라겐 가수분해물을 14 주간 처리한 결과， 일반 콜라겐 가수분해물에 비해 Col lagen 1A의 발현양은 증가하 고， MMP-1의 발현을 감소시켜 피부 주름 형성억제에 우수한 것으로 판단할 수 있었 다.

<7-4> 피부 조직의 피부보습 확인

자외선 조사로 인해 피부조직의 손상이 일어나면 피부의 유분 및 수분 함유 량이 감소하게 된다. 10주간 자외선을조사한 마우스의 피부조직 내에서 유분과 수 분의 함유량이 감소하는지 여부， 이러한 유분 및 수분의 감소를 본 발명의 콜라겐 가수분해물이 회복시킬 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다. 일반 콜라겐 가수분해물 (C0L군)과 본 발명에 따른 콜라겐 가수분해물 (CTP군) 의 5주， 10주간 투여한 후 피부 유 /수분함량 측정 장치인 Corneometer CM 820 (Courage - hazake , Koln, Germany)을 이용하여 유 /수분함량을 측정하였다. 항온 항습실 21.5± 2 ^° C , 상대습도 40± 5%에서 30분 이상 안정을 취하게 한 후 일정영역 을 표시하여 수분량을 측정하였다. 이에 대한 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15에서 확인할 수 있는 바와 같이, 10주간의 자외선 조사로 인해 control (C)군의 유분 및 수분 함유량은 자외선을 조사하지 않은 정상대조군 (N)에 비해 현저히 감소가 되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 5주차， 10주차 모두 본 발명에 따른 콜라겐 가수분해물올 처리한 동물군에서는 정상대조군보다도 더 높 은 유분 및 수분 함유량을 나타냈으며, 이러한 효과는 콜라겐 가수분해물의 함량이 증가될수록 유 /수분의 정도가 증가하였다. 특히, 본 발명에 따른 콜라겐 가수분해 물 (CTP군)을 투여한 쥐의 피부보습이 일반 콜라겐 가수분해물 (C0L군)에 비해 매우 우수한 것으로 확인되었다 (도 15A,B) .

<실시예 8>

BP를 이용한 콜라겐 가수분해물의 피부보습 개선 효과

식약처 가이드라인 (건강기능식품시험법 가이드라인， 미용 관련 기능성 시험， 2004. )을 참고하여 하기 표 4와 같이 각 군당 10마리씩 총 5군으로 나누어 실험하 였다. 정상군 (N군)은 Balb-C mouse를 사용하였으며 피부건조모델은 보습을 위한 실험에 유용하게 쓰이는 표피의 수분 방출을 증가시킨 NC/Nga Tnd mouse로 설정하 였다. 피부건조를 유도시키기 위해 Okawa et al . 방법 (Dermatol Sci . 66(2)： 136- 43 , 2012. )을 참고하여 해부 1주일 전부터 acetone과 ether를 1 : 1로 섞은 용액에 화장솜 (2 X 2cm)을 적신 후， 등에 15초간 올려놓은 뒤 30초간 같은 부분에 증류수 로 닦아내어 피부건조를 유도하였다. 피부건조를 유도하지 않은 정상대조군 (Normal군， N군)과 피부건조를 유도하 고 용매만을 투여한 음성대조군 (Control군, C군)의 경우 4주간 0.9% sal ine을 경구 투여하였으며, 양성대조군 (P군)은 식품의약품안전처에서 피부 건조와 수분 보유량 을 개선시키는 것으로 기 인정받은 NAG (N-acetyl glucosamine)를 사용하였다. 섭 취 용량은 N-acetyl glucosamine 17 mg/kg을 경구투여 하였다.

한편， 상기 실시예 7-4에서 CTP17이 함량이 낮음에도 불구하고 C0L34보다 피부 보습이 좋았기 때문에， 실시예 4에 따라 제조한 본 발명의 콜라겐 가수분해물 17 mg/kg(CLT17군)과 상기 비교예 1에 따라 제조한 콜라겐 가수분해물 34 mg/kg(C0L34군)은 각각 4주간 경구 투여하였다. 사료는 실험동물용 고형사료 (샘타 코 BI0K0REA, 한국)를 사용하여 급여하였으며 음수는 자유 섭취시켰다.

[표 4】

실험동물군 Dc@3

Group H

1 M - 1

Sal i ne, p.'o.

2 C - 10

5 COL 34 34 Co! l Bgen _a p,o, 10

<8-l> 피부 수분함량 측정

건강한 i피의 각질충은 15~20%의 수분을 함유하고 있으며 표피의 수분이 10% 이하로 떨어자면 피부가 건조해지고 윤기와 탄력이 없어져 주름이 증가하게 된 다. 이처럼 피부의 부드럽고 촉촉한 느낌은 표피의 각질층에 존재하는 수분에 의해 유지된다.

각질층의 수분함량은 표피에서 생성 ·분비되는 지질, 흡착체인 피지막과 각 질층 내 존재하는 수용성 성분인 자연보습인자 (NMF: Natural Moi sture factor)에 의해 결정되며, 표피의 수분증발은 세라마이드 및 자연보습인자의 함량변화와 관계 가깊다. 본 발명에 따른 콜라겐 가수분해물 17 mg/kg(CTP 17) 또는 종래 보고된 콜라 겐 분해효소에 의해 제조된 콜라겐 가수분해물 34 mg/kg(C0L 34)의 4 주간 투여가 피부보습에 미치는 영향 및 특성을 확인하기 위하여 실험 종료 일주일 전 피부건조 가 유발된 부위에 피부수분함량측정기， Corneometer CM 820 (Courage - hazake, Koln, Germany)을 이용하여 측정하였다. 항온 항습시설에서 (온도 21.5± 2 ^° C , 상 대습도 40 ± 5%) 30분 이상 안정을 취하게 한 후 일정영역을 표시하여 수분량을 측 정하였다. 이에 대한 결과를 도 16에 나타내었다.

정상대조군 (N군) Balb-C mouse는 표피층의 수분함량이 유지되었으나， 피부건 조가 유도된 ContiOl군 (C군)은 정상대조군과 비교해 수분함량이 감소하였다. 한편, 양성대조군， CTP 17， C0L 34군 모두 피부 수분함유량을 증가시키는 효과를 나타내 었으나， 이 중에서 CTP 17이 가장우수한 효과를 나타내었다.

CTP의 경우 17 mg/kg으로 투여했음에도 불구하고 C0L 34 mg/kg보다 더 우수 한 피부 보습효과를 나타내는 것으로 보아, 콜라겐 트리펩타이드 함량이 높은 본 발명에 따른 콜라겐 가수분해물의 보습효과가 종래 보고된 콜라겐 가수분해물보다 현저히 우수하다는 것을 알 수 있었다.

<8-2>피부건조로 인한 가려움증에 대한 효과

피부는 다양한 면역물질이 내재되어 있으며 외부물질에 가장 먼저 반웅하는 곳이다. 피부 장벽이 손상되면 경 표피 수분손실이 증가되고 수분 결합력이 감소되 어 결국 피부가 건조해지고 가려움증이 발생되어 긁게 된다. 이에， 수분건조 동물 모델에서 각 물질의 투여에 따른 가려움증 완화 효과를 평가하였다.

Scratching behavior는 10분 동안 실험동물이 긁는 모습을 관찰하였다. 같 은 군은 한 우리 내에 넣어 각 마우스가 몇 번을 긁는지 횟수를 세었다. 2초 이상 길게 이어지는 연속 동작이 n초간 지속된 경우 n회로 세었고， 2초 내의 짧은 동작 은 각각 1회로 세었다. 이에 대한 결과를 도 17에 나타내었다.

피부건조를 유도한 후 10분 동안 긁는 횟수를 확인한 결과， 건조증을 유발한 ContiOl군 (C군)에서는 p<0.05 유의수준으로 긁는 횟수가 증가한 반면, 각각의 시료 투여를 한 군에서는 대부분 긁는 횟수가 감소하였다 (ρ<0 · 05) .

한편, 피부건조로 인한 가려움증 완화효과는 CTP 17에서 가장 우수하게 나타 났으며, 이는 C0L 34뿐만 아니라 양성대조군보다도 월등히 우수한 것이었다.

<8-3> 피부보습인자 단백질 회복 효과 (Col lagen 1A, AQP3, HAS2)

단백질 분석을 위해 피부 조직을 cel l lysi s buffer에 넣고 homogenizer로 조직을 파쇄한 후 centri fuge하여 상층액만 취하였다. Bradford assay로 단백질을 정량한 후， SDS-PAGE (Poly aery 1 amide Gel Electrophoresi s)를 실시하였다. Semi- dry transfer system (Bio-Rad, USA)을 이용하여 PVDF (Polyvinyl idene f luor ide) membrane에 이동시킨 후 Col lagen 1A, AQP3 , HAS2 단백질의 발현 정도를 Chemi-Doc (BIORAD XRS system, USA) 장비를 이용하여 관찰하였으며 GAPDH로 보정 ·비교하였 다. ^' (i) Collagen은 세포의 모양， 분화， 이동， 단백질의 합성과 같은 기능 조절 에 참여하고 상처의 회복에 참여하는 중요한 구성성분이다. 피부 건조증이 유발되 면 피부 내 콜라겐 단백질의 양이 줄어들고 결과적으로 주름이 생성되는 등 피부생 리에 부정적인 영향이 나타난다.

(ii) Aquaporin-3 (AQP3)은 피부의 수화 (hydrat ion)에 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 피부가 건조하게 되면 AQP3 발현이 감소하게 되며， Trans epidermal water loss (TEWL)에도 영향을 준다는 보고가 있다. 세포막에 존 재하는 aquaglyceroporin인 aquaporine 3 (AQP3) 의 증가는 피부 수분을 보존하여 결국 노화를 예방하는 인자로 알려져 있다 (J. Lipid Res. 46:2706， 2005.) 따라서 세포막에 존재하는 aquapotine3 (AQP3) 확인은 피부 수분도를 체크하는 중요요소 중 하나이다 (Biology of the cell. 97(7) :479-4862005.)

(iii) 히알루론산 (hyaluronic acid, HA)은 세포외 연결 조직에 존재하는 고 분자의 glycosaminoglycan로서 수분 증발을 막는 장벽의 역할을 수행한다고 알려져 있다. 그러나 나이가 들어감에 따라 수분장벽 역할을 하는 히알루론산의 함량은 급 격하게 줄어든다고 알려져 있다). 외부의 환경적 요인 중 특히 자외선은 피부의 일 정한 히알루론산 유지에 부정적 영향을 준다. 이러한 내재적 혹은 외재적 요인으로 인한 히알루론산의 함량 감소는 피부의 탄력 감소， 거친 피부， 주름의 한 요인이 된다. 따라서 피부에서 히알루론산 함량을 유지하는 것은 피부 보습 및 동안피부를 유지하는데 있어 매우 중요한 요소라 할 수 있다. 히알루론산은 지속적으로 hyaluronic acid Synthase (HAS)에 의해 합성이 된다. 따라서 HAS의 유전자 발현이 증가된다면, 꾀부 내 히알루론산의 양이 상승하여 피부 보습 뿐만 아니라 탄력, 주 름 등에도 긍정적인 영향을 나타내게 된다. 이에, 본 발명자는 본 발명에 따른 콜라겐 가수분해물이 피부건조에 의한 피 부보습인자들의 감소에 미치는 영향을 웨스턴 블롯을 통해 평가하고자 하였다. 이에 대한 결과를 도 18에 나타내었다.

도 18에서 볼 수 있는 바와 같이， Collagen 1A, AQP3 및 HAS는 피부건조 유 도에 의해 정상 대조군보다 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 한편， 양성대 조군， CTP 17 및 COL 34 투여군에서는 Control (C군)과 비교했을 때 각각의 단백질 의 양이 상당부분 회복이 된 것을 알 수 있었다. 이들 중에서 특히 CTP 17 투여군 은 양성대조군 (P군) 보다도 월등히 우수한 피부보습인자 회복 효과를 보여주었을 뿐만 아니라， C0L 34 투여군의 절반 용량을 투여했음에도 불구하고 C0L 34 투여군 보다도 현저히 우수한 효과를 나타내었다. 즉， 콜라겐 트리펩타이드가 고함량으로 포함된 본 발명의 콜라겐 가수분해물 은 체내에서 흡수율이 매우 좋기 때문에， 적은 투여용량으로도 우수한 효과를 나타 낼 수 있음을 알 수 있었다. 이상 살펴본 바와 같이， 본 발명의 콜라겐 가수분해물은 우수한 피부주름 개 선효과 및 피부보습효과를 나타내기 때문에 피부노화를 방지하고 피부탄력올 개선 하는 효과를 나타낼 수 있다.

【산업상 이용가능성】

본 발명은 콜라겐 트리템타이드가고함량으로 포함된 콜라겐 가수분해물 및 이의 용도에 관한 것으로， 본 발명의 콜라겐 가수분해물은 종래 보고된 콜라겐 가 수분해물과 비교해 콜라겐 트리펩타이드의 함량이 현저히 높아 체내 흡수율이 우수 하며， 우수한 탈모예방， 발모촉진， 피부주름 개선 및 /또는 보습효과를 나타내어 산 업상 이용가능성이 매우 높다.

국 제 양 식 특허출원을 위한 부다페스트 국제 조약 하의 미생물 수탁 증명 국제기탁기관에 의해 규칙 7. 1에 따라 발행된 원기탁에 대한 수탁증 수신 : 아미코젠 주식회사

미코젠주식회

(660-852) 대한민국 경상남도진주시 진성면 동부로 1259번길 64

I . 미생물의 표시

기탁자가 첨부한 미생물 식별에 대한 표시:

국제 기탁기관이 부여한수탁번호:

Bacillus subtilis BP

KCTC 12866BP

II . 과학적 성질의 설명 및 /또는분류학상의 위치

항목 I에 표시된 미생물에 대하여 다음사항이 포함되어 있다:

[ X ] 과학적 성질의 설명

[ ] 제안된 분류학상의 위치

(적용시 X 표시 )

I II . 기탁 및 수탁 본국제기탁기관은 2015년 07월 13일에 기탁된 항목 I에 표시된 미생물을수탁하였다.

IV. 이관청구의 수령 본 국제기탁기관은 에 항목 I에 표시된 미생물을 수탁하였으며, 에 원기탁의 부다페스트 조약하의 기탁으로의 이관청구를 수령하였다.

V. 국제기탁기관 국제기탁기관을 대표하는 권한을 가진 자 명칭: Korean Col lect ion for Type Cul tures

또는 권한을 부여받은 공무원 서명 :

주소: (305—806) 대한민국 대전 유성구

과학로 125 한국생명공학연구원 (KRIBB) 박두 상 센터장

서명일: 2015.07.15

BP/4형식 (KCTC Form 17) 단일 페이지

(원문과 상위 없음을 확인함) 대리인 ： 변리사 이 희

변리사 김 석