[0001] 本发明涉及酶活性的检测方法， 具体为一种检测日化产品中溶菌酶活性的方法 背景技术

[0002] 种类繁多的日用化学品， 随着科学技术的发展， 制作日益精良， 在原料的选择 上， 使用的天然原料越来越受青睐。 同时在功能的研发上， 日益依赖于分子生 物学、 生物工程、 皮肤生理医学等学科的发展。 酶制剂因其安全性、 高效性和 专一性越来越多地为日化产业所关注。 具有高稳定性和高效性的生物酶复合制 剂正在不断开拓日化领域的新时代。

[0003] 生物酶是生物体产生的一种催化剂， 它的化学本质是蛋白质。 其特点： 一是催 化的高效性， 催化效率可达 10 〜 10 倍， 是一般的化学催化剂无可比拟的； 二是酶具有高度的作用专一性； 三是催化性能的高稳定性。

[0004] 雪豹 FE口腔清洁卫生用品是以溶菌酶为核心的生物� ��复合制剂。 具有抗菌消炎 , 有止血， 帮助组织修复， 增强机体抵抗力等功效。 溶菌酶 （lysozyme) 又称胞 壁质酶 （muramidase) 或 N-乙酰胞壁质聚糖水解酶 (N-acetylmuramide glycanohydrlase) , 能专一性水解细菌细胞壁， （通过催化细菌细胞壁肽聚糖中 Ν-乙酰氨基葡糖与 Ν-乙酰胞壁酸之间的 β- 1 , 4糖苷键水解） ， 而达到杀灭细菌 的目的。 而且它的最小抑菌浓度是微克级的。 与一般化学催化剂相比较， 其突 出特点是彻底杀灭细菌而非抑菌， 没有造成化学残留和耐药性问题。

[0005] 溶菌酶广泛存在于人体多种组织， 和禽类的蛋清以及微生物中。 它是一种天然 酶， 安全绿色的添加剂， 无抗药性， 也是国家认可的食品添加剂成分。 也是国 际化妆品原料标准 INC中认可的通用原料。

[0006] 溶菌酶的活力捡测目前国内外一般采用比浊法 GB/T 302990-2014。 其原理是以 溶壁微球菌 （Micrococcus lysodeikticus) 为反应底物 使用溶菌酶催化水解其细 胞壁， 细菌因失去细胞壁的保护无法维持细胞内渗透 压平衡而裂解死亡， 导致 菌悬液的浊度降低， 通过分光光度计测定在 450nm处的吸光光度值的变化并换算 出样品酶活性单位。

[0007] 酶活性的定义为在 25摄氏度， O.lmol/L磷酸盐缓冲液 （pH6.2) 中， 以溶壁微球 菌为底物， 于 450nm处每分钟使吸光度值下降 0.001时所需的酶量。 活性单位为 U /mg或 U/g或 U/mL。

[0008] 用分光光度计进行定量分析吋， 利用样品的吸光值与样品的浓度成正比的原理 , 可将待测试样的纯品配制成一系列标准溶液， 事先绘制标准曲线， 由待测未 知样品的吸光度对照标准曲线， 就可得到其含量或活力单位。

[0009] 溶菌酶在日化产品中得到广泛的应用， 对日化产品中溶菌酶活性的检测是企业 生产重要的一项， 日化产品成分复杂， 尤以乳液， 胶体或膏霜类产品居多。 随 着溶菌酶应用范围的增大， 其在日化领域中溶菌酶比浊法的局限性日益凸 显。 日化产品配方成分复杂， 干扰多， 影响大， 重复性差， 产品中含有悬浊物或胶 粒等散射质点时入射光通过样品就会有一部分 光因散射而损失掉， 使透射光强 度减少， 实测吸收光度增大， 干扰浊度测定。 甚至很多情况下由于胶体溶液的 透光性差而导致数据无法检测。

技术问题

[0010] 本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技 术， 针对日化产品成分复杂的特 点， 提供一种检测溶菌酶活性的色源底物透明圈法 ， 与比浊法相比， 具有检测 灵敏、 检测结果可靠， 检测更简便快速的优点。

问题的解决方案

技术解决方案

[0011] 本发明解决上述问题所釆用的技术方案为： 一种检测日化产品中溶菌酶活性的 色源底物透明圏法： 利用溶菌酶水解特点， 在含色源底物的固体培养基中形成 透明圏， 所述的色源底物是活性染料艳红所标记的溶壁 微球菌， 在合适的浓度 范围内， 溶菌酶的活力与透明圏的直径呈线性关系， 以溶菌酶活力单位为纵坐 标， 透明圈直径为横坐标， 绘制标准梯度曲线， 根据样品的透明圈直径与标准 样品的标准梯度曲线比较， 可计算出样品中溶菌酶的活力单位。

[0012] 上述检测日化产品中溶菌酶活性的色源底物透 明圈法的具体步骤： [0013] 1) 溶壁微球菌的培养和收集： 取菌种， 接种于肉汤培养基， 37°C培养 12小时 以后通过离心收集菌体， 经冷冻干燥， 获得干燥菌体， 该肉汤培养基的质量百 分比成分： 牛肉膏 0.5<¾、 蛋白胨 1.0%、 NaCl 0.5% . 琼脂 2.5<¾， pH7.5， 压力 1 03.4KPa, 灭菌 15分钟以上；

[0014] 2) 活性艳红染料标记溶性微球菌： 取干燥菌体 5g， 加入 50毫升 1.25mol/L

NaOH, 再加 2.5克活性染料艳红 K-2BP搅拌均匀， 于 25°C水浴放置 24小吋进行 染色， 离心收集染色菌体； 染色菌体反复用蒸馏水洗涤并离心以除去未参 加反 应的游离染料， 反复处理直到上清液无色， 由此得到净化的染色菌体；

[0015] 进行酶活力测定时， 将染色菌体直接悬于 0.1mol/L、 pH6.5的磷酸盐缓冲液内 , 制成浓度为 1%色源底物溶液； 或者将染色菌体冻干保存， 使用时用憐酸盐缓 冲液冲配；

[0016] 3) 平板制备： 将灭菌后的含 1.6wt<¾琼脂的固体培养基 250ml冷却至 50°C, 加 色源底物溶液 50ml, 混匀后小心倒入直径为 150mm的培养皿平板内， 70ml/个， 水平放置， 待凝固后， 放置洁净工作台内 1小吋， 或置于 4°C冰箱存放备用； 使用 前用无菌打孔器在每个平板上打出所需的孔洞 ， 弃去孔中琼脂块， 形成完整空 穴备用；

[0017] 4) 样品的处理： 取含溶菌酶的固体样品 1克或液体或乳液样品 1毫升， 加 0.1 M 、 pH 6.5的磷酸盐缓冲液 3mL， 搅拌混勾后室温下放置 2小时及以上， 离心后取 上淸液作为酶含量的检测样品；

[0018] 5) 检测： 用移液器向培养皿平板上的琼脂孔内加入不同 量的标准溶菌酶溶液 以形成梯度， 标准溶菌酶溶液参照 CAS编号： 12650-88-3 , Sigma, 同吋加入待 检测含酶样品， 和未含溶菌酶产品的样品， 作为空白对照， 加入量 lOOul /孔；

[0019] 6) 将加入标准酶溶液和样品的平板水平移入 37°C恒温培养箱中培养 12小吋；

[0020] 7) 酶反应后扩散透明圈直径减去琼脂孔直径即为 检测试样的实际透明圈直径 , 以样品的实际透明圈直径与绘制标准梯度曲线 进行比对， 以确定样品的酶活 力单位， 并由此可通过稀释倍数换算计算出实际日化产 品的总酶活力单位。

[0021] 优选操作是， 步骤 1中菌体收集的离心转速为 3000 rpm。

[0022] 优选操作是， 步骤 2中染色菌体收集的离心转速为 3000r/min， 离心时间为 lOmin [0023] 优选操作是， 步骤 4离心操作的转速为 12， 000转 /分， 离心吋间为 10min。 发明的有益效果

有益效果

[0024] 与现有技术相比， 本发明的优点在于： 本方法是釆用色源底物法与透明圈法的 有机结合， 进行溶菌酶的定性定量检测， 可排除胶体等因素带来的干扰， 同吋 又能体现溶菌酶在此对于细菌细胞壁的裂解专 一性， 因为其它的抑菌成分无法 分解色源底物 （染色的细菌细胞壁） 从而无法形成透明圈， 故本方法直观， 快 速， 灵敏， 简便， 正确。

对附图的简要说明

附图说明

[0025] 图 1为本发明实施例中标准溶菌酶溶液的染色底� �透明圈实验结果；

[0026] 图 2为本发明实施例中含酶牙膏和口香糖样品及� �空白对照样的染色底物透明 圈实验结果；

[0027] 图 3为本发明实施例中含酶漱口水、 沐浴露和洁面乳样品及其空白对照样的染 色底物透明圈实验结果；

[0028] 图 4为本发明实施例中标准梯度曲线， 图标标识： 表示透明圈直径和其对应的 酶活力单位所在位置

[0029] 參 表示为不同量的溶菌酶标准品；

[0030] ①表示 A和 B， 含酶牙膏；

[0031] ②表示 C， 含酶口香糖；

[0032] ③表示 D，含酶漱口水；

[0033] ④表示 E, 含酶沐浴露；

[0034] ⑤表示 G, 含酶洁面乳。

实施该发明的最佳实施例

本发明的最佳实施方式

[0035] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描 述。 [0036] 试验样品为含溶菌酶产品（ A- G)， 空白样品为市场上其他未含溶菌酶相对应的 产品： 云南白药牙膏（A')， 美加净植尚牙膏 (Β') ,好丽友口香糖 (C')， 益口佳漱口 水 (D')，潘婷 （Pantene Pro-V) 沐浴露 （Ε') , 妮维雅 （Nivea) 洁面乳 （G') 进行空白对照试验：

[0037] 含溶菌酉毎产品标 iP,如下（ A - G )：

[0038] 牙膏（ A&B )配方设计为： 山梨糖醇， 水，水合硅石， 磷酸氢钙,丙二醇,月桂酸 肌氨酸钠,食用香精， 焦磷酸四钠,纤维素胶，卡拉胶,植酸钠,糖精钠 ,溶菌酶；

[0039] 口香糖（C )配方设计为： 加工树胶基质，山梨糖醇， 木糖醇， 甘油， 碳酸钙， 溶菌酶 ,食用香料；

[0040] 漱口水 ( D)配方设计为：甘油,氢化蓖麻油,溶菌酶， 阿斯巴甜,冬青油,薄荷脑

； 乙醇； 食用香精； 食用色素,去离子水；

[0041] 沐浴露 (E)配方设计为： 椰油酰胺丙基甜菜碱，乳化硅油， 枸橼酸,香精， EDTA, 溶菌酶,色素,去离子水；

[0042] 洁面乳 (G)配方设计为：月桂酰肌氨酸钠， 杏仁油， 羊毛脂， 硬脂酸单甘油酯

, 汉生胶,甘油， 香精， 溶菌酶， 去离子水。

[0043] 一、 样品的处理

[0044] 取含溶菌酶的牙膏 1克， 含酶口香糖 1克， 含酶漱口水 1毫升， 含酶沐浴露 1毫升 , 含酶洁面乳 1毫升， 分别加 0.1 M , pH 6.5磷酸盐缓冲液 3mL， 在不吋轻缓搅 拌后室温下放置约 2小吋， 以 12， 000转 /分， 离心 10分钟， 取上淸液作为酶含量 的检测样品 （A-G) 。

[0045] 不含溶菌酶的样品也按照上述相对应产品的处 理方法制备酶空白检测样品 （Α' - G') 。

[0046]

[0047] 二、 活性艳红染料标记溶性微球菌 Mlysodeikticus的制备

[0048] 1) 溶壁微球菌的培养和收集： 取菌种， 接种于肉汤培养基， 37°C培养 12小时 以后通过离心 3000 rpm收集菌体， 经冷冻干燥， 获得干燥菌体， 该肉汤培养基的 质量百分比成分： 牛肉膏 0.5<¾、 蛋白胨 1.0%、 NaC1 0.5<¾、 琼脂 2.5%, pH7.5， 压力 1 03.4KPa， 灭菌 15分钟以上； [0049] 2) 活性艳红染料标记溶性微球菌： 取干燥菌体 5g， 加入 50毫升 1.25mol/L

NaOH, 再加 2.5克活性染料艳红 K-2BP搅拌均匀， 于 25°C水浴放置 24小吋进行 染色， 300θΓ/ηώι离心 10分钟收集染色菌体； 染色菌体反复用蒸馏水洗涤并离心 以除去未参加反应的游离染料， 反复处理直到上清液无色， 由此得到净化的染 色菌体。

[0050] 进行酶活力测定时， 将染色菌体直接悬于 0.1m _O l/L、 pH6.5的磷酸盐缓冲液内

, 制成浓度为 1%的色源底物溶液； 或者将染色菌体冻干保存， 使用时用磷酸盐 缓冲溶液制备成浓度为 1%的色源底物溶液。

[0051]

[0052] 三、 平板的制备

[0053] 将灭菌后的含 1.6wt<¾琼脂的固体培养基 250ml冷却至 50°C， 加色源底物溶液 （ 悬浊液） 50ml, 混匀后小心倒入直径为 150mm的培养皿平板内， 70ml/个， 水平 放置， 待凝固后， 放置于洁净工作台内 1小时， 或置于 4°C冰箱存放待第二天使用 ； 使用前用无菌打孔器在每个平板上打出所需的 孔洞， 弃去孔中琼脂块， 形成 完整的空穴备用。

[0054]

[0055] 四、 检测

[0056] 用移液器向培养皿平板上的琼脂孔内加入不同 量的标准溶菌酶溶液以形成梯度 , 标准溶菌酶溶液参照 CAS编号： 12650-88-3， Sigma, 同吋加入待检测含酶样 品 （A-G) ， 和未含溶菌酶产品的样品 （A'- G') ， 作为空白对照， 加入量 lOOul /孔；

[0057] 将平板水平移入 37°C恒温培养箱中培养 12小时；

[0058] 酶反应后扩散透明圏直径减去琼脂孔直径即为 检测试样的实际透明圈直径， 在 合适的浓度范围内， 溶菌酶的活力与透明圏的直径呈线性关系如图 4, 以溶菌酶 活力单位为纵坐标， 透明圏直径为横坐标， 绘制标准梯度曲线， 根据样品的透 明圈直径与标准样品的标准梯度曲线比较， 可计算出样品中溶菌酶的活力单位

[0059] 试验结果如表 1和图 1-3所示， 表 1

[表 1]

除上述实施例外， 本发明还包括有其他实施方式， 凡釆用等同变换或者等效替 换方式形成的技术方案， 均应落入本发明权利要求的保护范围之内。 发明实施例

本发明的实施方式

[0062] 在此处键入本发明的实施方式描述段落。

工业实用性

[0063] 在此处键入工业实用性描述段落。

序列表自由内容

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