DE LA MALADIE DE PARKINSON

L'invention se rapporte au domaine du traitement de la maladie de Parkinson. Plus particulièrement, elle concerne l'utilisation d'une molécule inhibitrice de la production de ROS d'origine mitochondriale telle que l'anéthole trithione (ATT) ou la 4-hydroxy- anéthole trithione (ATX), seule ou en association avec une tétracycline anti-synucléine, telle que la doxycycline, dans le traitement de la maladie de Parkinson.

Etat de la technique

La maladie de Parkinson est une maladie neurologique chronique dégénérative affectant le système nerveux central. Elle provoque des tremblements, une lenteur dans les mouvements et une raideur musculaire. Cette maladie est restée longtemps sans traitement.

C'est avec l'agrément délivré par la FDA, en 1970, pour la L-DOPA que débute véritablement le traitement de la maladie de Parkinson (MP), un traitement qui vise à restaurer le déficit en dopamine observé au niveau central. Cette logique sera reprise avec la mise sur le marché des inhibiteurs du métabolisme de la L-DOPA, COMT et IMAO-B, comme avec celle des différents agonistes dopaminergiques. Dans tous les cas, il s'agit de traitements supplétifs strictement symptomatiques agissant sur les troubles moteurs, dont les effets s'épuisent inexorablement avec le temps.

De nombreuses cibles thérapeutiques ont été identifiées mais aucune d'entre elles n'a été validée cliniquement. Parmi ces différentes approches, on peut mentionner la rotigotine (US2007/0191470), un agoniste partiel de la glycine (US2004/0087596), une association d'un agent dopaminergique et d'un agoniste du récepteur à la nicotine ou d'un récepteur nicotinique (EP1977746)...

On ne dispose pas, à ce jour, de traitement étiologique de la maladie de Parkinson. Exposé de l'invention

Les inventeurs proposent une nouvelle approche thérapeutique combinant l'inhibition de deux voies impliquées dans la maladie de Parkinson. La stratégie proposée est représentée à la Figure 1. Elle est basée sur une hypothèse jamais avancée auparavant, selon laquelle la mort des neurones dopaminergiques serait à attribuer pour l'essentiel à une boucle vicieuse qui se forme entre ROS mitochondriaux et oligomères toxiques issus de I'a-synuclein présente dans les terminaisons présynaptiques, et qui s'auto-entretient. Viennent s'ajouter à ce mécanisme premier :

• une activation de la microglie, responsable de la libération de facteurs proinflammatoires qui vont concourir au dysfonctionnement mitochondrial et par là à la production de ROS, ainsi que

• une activation des MMPs, notamment MMP3, qui forment une boucle négative avec les ROS et participent à l'entretien de ce système délétère. (Voir Figure 2)

La présente invention propose donc de briser ce cercle vicieux en combinant : un blocage de la production de ROS au niveau mitochondrial par administration d'anéthole trithione (ATT), avec une stabilisation de l'équilibre a-synuclein-protofibrilles afin de stopper la production d'oligomères toxiques par une administration combinée de doxycycline et d'ATT.

D'une part, l'anéthole trithione (ATT) a la propriété de bloquer la production de ROS au niveau du complexe Iq de la chaîne respiratoire (Détaillé, 2019) ; ce blocage va protéger les neurones dopaminergiques de la toxicité par le MPTP (comme montré sur le modèle aigu réalisé chez la souris, WO2017/042267).

L'ATT peut être substituée par l'ATX qui correspond à la forme phénolique de l'ATT.

D'autre part, la doxycycline présente (i) une activité anti-amyloïde en se liant aux protofibrilles, bloquant ainsi la production d'oligomères toxiques ainsi que la propagation interneuronale (seed effect) de ces oligomères toxiques (Gonzalez-Lizarraga, 2017), mais également (ii) s'oppose à la réaction inflammatoire qui accompagne l'activation de la microglie (Bortolanza, 2018) et par ailleurs diminue la libération et l'expression des MPPs dans les neurones dopaminergiques (Bartolanza, 2018 ; Santa-Cecilia, 2019).

Il est à noter que la doxycycline pourrait être remplacée, dans l'indication du traitement de la maladie de Parkinson, par la minocycline ou d'autres tétracyclines, qui partagent avec la doxycycline plusieurs propriétés utilisables dans l'indication proposée.

De plus, les inventeurs ont montré que l'ATT peut également inhiber la formation des oligomères toxiques et est capable de jouer un rôle neuroprotecteur vis-à-vis des neurones dopaminergiques. Ce résultat déjà significatif à lui seul s'accompagne d'un effet synergique fort lorsque l'ATT est associée à la doxycycline.

Ainsi, les inventeurs ont mis en évidence que l'utilisation de l'ATT seul a un effet significatif sur les signes de la maladie de Parkinson à une dose supérieure à celle à laquelle il est habituellement administré à savoir à une dose journalière de 75 mg maximum (voir posologie du Surfalem ^® ) ; ici dans le traitement de Parkinson, la dose envisagée est d'au moins 300 mg par jour.

Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation de l'ATT ou l'ATX, seul ou en combinaison avec une tétracycline anti-synucléine pour le traitement de la maladie de Parkinson.

Avantages de l'invention

La présente invention constitue la première approche thérapeutique étiologique de la maladie de Parkinson. Elle permet une réversion des symptômes se maintenant sur le long terme (au moins 3 ans, avec le recul actuel) et apporte donc un réel bénéfice au patient.

Les observations recueillies sur un cas clinique sont confortées par des analyses réalisées in vitro sur des modèles représentatifs des différents aspects physiologiques de la maladie. Les résultats expérimentaux présentés ci-après attestent d'un effet direct de l'ATX sur deux composantes majeures de la maladie de Parkinson, à savoir l'activation de la microglie et l'agrégation de I'a-synucléine, qu'ils inhibent tous deux. Ces résultats font à eux seuls de l'ATX (ou ATT) un candidat d'intérêt dans le traitement de la maladie de Parkinson. De plus, il est montré que l'association de GATC avec un inhibiteur de I'a-synucléine, en l'occurrence ici la doxycycline, a un effet synergique vis-à-vis de la diminution de l'inflammation. Cette association agit également de manière synergique sur la neuroprotection des neurones dopaminergiques. Elle est de plus très intéressante pour éviter la survenue de mécanismes d'échappement. Elle permet également d'inhiber le « seed effect » (ou effet de propagation) et donc d'empêcher la progression de la maladie.

Des effets bénéfiques d'un traitement associant ATT et une tétracycline sont attendus chez tous les patients Parkinson, au minimum en induisant une stabilisation de l'état du patient. Toutefois, il est prévisible que l'administration de ce traitement chez des patients à un stade précoce, dès l'apparition des premiers symptômes, voire en préventif chez les patients susceptibles de développer la maladie, permette une régression très significative (possiblement totale) des symptômes et que le patient puisse maintenir cet état sur le long terme.

La mise à disposition pour tous les patients Parkinson de cette approche thérapeutique novatrice sera facilitée du fait qu'elle repose sur l'utilisation de molécules disponibles sur le marché et dont l'innocuité est établie de longue date. Cet aspect est très favorable à son adoption par les médecins et les patients.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

Un premier objet de l'invention concerne l'utilisation d'une molécule inhibitrice de la production de ROS d'origine mitochondriale telle que l'anéthole trithione (ATT) ou son dérivé la 4-OH-anéthole trithione (ATX) pour traiter la maladie de Parkinson, dans laquelle la dose journalière est comprise entre 300 mg et 1200 mg.

L'ATT et l'ATX sont deux inhibiteurs spécifiques des ROS d'origine mitochondriale.

L'ATX correspond à la forme phénolique de l'ATT telle qu'elle est métabolisée par le foie, à la fois chez l'homme et chez l'animal. Cette forme 4-OH-anethole trithione a été décrite précédemment (Li et al., J Pharm Biomed Anal, 2008, 47 : 612-617). La structure d'ATT étant conservée lors de cette métabolisation, il y a tout lieu de penser que l'activité antiROS portée par ATT est retrouvée dans ATX, ce d'autant qu'après administration orale, qui est actuellement la forme commercialisée, l'essentiel du produit circulant retrouvé est GATC (Yu, 2011). De plus, GATC porte un groupement phénol en para qui permet la formation d'esters. Dans un mode de réalisation particulier, GATC est utilisé sous sa forme estérifiée, par exemple sous forme d'ester : de phosphate, d'éthylidenephosphate, de sulfate, d'hémisuccinate, d'acétate, de propionate, d'isobutyrate, d'hexanoate, de pivalate, d'éthoxycarbonate, de nicotinate, ou encore d'ester d'amino-acides comme la glycine, diéthylglycine ou valine ester, et la liste n'est pas limitative.

La dose proposée est nettement supérieure aux doses proposées dans l'art antérieur pour traiter des maladies dont l'atteinte est périphérique. En effet, la dose de 300 mg à 1200 mg par jour est considérée comme nécessaire pour permettre à la molécule active d'atteindre les neurones après passage de la barrière hémato-céphalique. Cette dose peut être ajustée en fonction du stade de la maladie et/ou du patient par exemple à 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1000 mg ou 1200 mg par jour.

Il est préféré d'administrer cette dose en 2, 3 ou 4 prises reparties à intervalles réguliers sur la journée afin d'assurer autant que possible un taux constant d'ATT ou d'ATX dans les neurones dopaminergiques, cellules-cibles dans cette pathologie. De manière préférée, l'administration est répartie en 3 prises. Pour un meilleur confort de vie du patient, elle peut être prise en 2 fois.

Les doses pour l'ATX sont les mêmes que celles proposées pour ATT dans la mesure où ATX est porteur de l'essentiel de l'activité d'ATT puisque ATT se métabolise presqu'immédiatement et totalement en ATX via une O-déméthylation, au point qu'on ne retrouve quasiment pas d'ATT dans les urines des 24h (He J. et al. J Pharm Biomed Anal. 2011, 54 : 551-556 ; Li TM. et al. Anal Chim Acta 2007, 594 : 274-278 ; Li WY. et al. J Pharm Biomed Anal. 2008, 47 : 612-617).

L'utilisation d'une monothérapie ATT ou ATX peut être envisagée en primo-traitement préventif de l'apparition des symptômes ou pour atténuer ou faire disparaître les premiers signes et ralentir ou stopper leur évolution. En effet, IΆTT a un effet inhibiteur à la fois sur l'inhibition de l'inflammation et sur la formation d'agrégats toxiques dans les neurones dopaminergiques, ce qui permet d'éviter la propagation de la maladie lié au seed effect. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'ATT est administrée chez un patient présentant les premiers symptômes de la maladie (stade précoce) ou chez un patient susceptible de développer une maladie de Parkinson.

Le traitement ATT s'adresse en particulier à un patient présentant un stade précoce de la maladie ou à un patient asymptomatique.

Par « patient asymptomatique » on entend un patient diagnostiqué comme susceptible de développer une maladie de Parkinson, mais qui ne présente pas de symptômes.

L'ATT ou l'ATX peut également être administré chez un patient traité par la L-DOPA. Dans ce mode de réalisation, il est attendu chez les patients traités de longue date avec de la L-DOPA et présentant des signes dyskinétiques, une amélioration de ces derniers. De plus, le fait d'administrer une association ATT-tétracycline permet de contrôler les symptômes avec pour conséquence que la dose de L-DOPA peut être diminuée, de sorte à ce que les effets secondaires de dyskinésie disparaissent.

Un deuxième objet de l'invention concerne l'utilisation d'une association de (i) une molécule inhibitrice de la production de ROS d'origine mitochondriale telle que l'ATT ou son dérivé l'ATX et de (ii) une tétracycline anti-synucléine, pour traiter la maladie de Parkinson.

Par « tétracyclines anti-synucléine », on entend la doxycycline, la minocycline, la glycylcycline, l'éravacycline, l'omadacycline, la tétracycline, l'oxytétracycline, la chlortétracycline ou un de leurs dérivés.

Par « dérivés de la doxycycline », on entend la 9-amino-doxycycline et la 9-aminométhyl- doxycycline, et leurs dérivés acylés respectifs, ainsi que la 9-amino-4-dédiméthylamino- doxycycline et la 9-aminométhyl-4-dédiméthylamino-doxycycline, et leurs dérivés acylés respectifs. Par « dérivés de la minocycline », on entend la 9-amino-minocycline et la 9-aminométhyl- minocycline, et leurs dérivés acylés respectifs.

Dans un mode de réalisation particulier de cette utilisation, la dose journalière d'ATT ou son dérivé IΆTC est comprise entre 300 mg et 1200 mg et la dose journalière de doxycycline ou de minocycline ou d'un de leurs dérivés est comprise entre 30 mg et 200 mg.

Les doses peuvent varier selon le stade de la maladie et/ou le patient. La dose de doxycycline ou de minocycline peut par exemple être comprise entre 30 mg et 60 mg, ou entre 60 mg et 90 mg ou entre 90 mg et 120 mg ou encore entre 120 mg et 200 mg par jour. Cette dose journalière est repartie en 2, 3 ou 4 doses, de préférence en 2 ou 3 doses.

Dans un mode de réalisation préféré, l'association comprend l'ATT et la doxycycline.

L'association de l'ATT ou ATX avec la doxycycline ou minocycline peut être proposée dans une approche préventive ou curative de la survenue d'un mécanisme d'échappement aux traitements établis, possiblement en complément de tels traitements.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'association ATT et tétracycline est administrée chez un patient présentant les premiers symptômes de la maladie (stade précoce) ou chez un patient susceptible de développer une maladie de Parkinson. Chez ces patients, les effets attendus sont plus significatifs, à savoir une disparition de symptômes ou l'empêchement de leur apparition et une stabilisation de la maladie sur le long terme. L'association ATT+ tétracycline s'adresse en particulier à un patient présentant un stade précoce de la maladie ou à un patient asymptomatique.

Cette association de molécules peut être administrée chez un patient sous traitement par la L-DOPA. Ces deux traitements peuvent être considérés comme complémentaires, l'association ATT/ATX - tétracycline permettant d'inhiber deux mécanismes d'action majeurs de la maladie de Parkinson alors que la L-DOPA vient compenser la perte de fonction des neurones dopaminergiques. Ainsi, les deux traitements peuvent agir de manière complémentaire, d'une part sur la cause de la perte des neurones dopaminergiques et d'autre part sur le niveau de dopamine pour atténuer les symptômes présents. Le fait de combiner ces deux traitements peut être tout à fait avantageux, surtout en cas d'échappement d'une des voies thérapeutiques ciblées.

Un troisième objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une molécule inhibitrice de la production de ROS d'origine mitochondriale telle que l'ATT ou de l'ATX, une tétracycline anti-synucléine et des excipients.

Une telle composition peut être formulée de sorte à permettre 2 ou 3 prises médicamenteuses par jour. A titre d'exemple pour 3 doses quotidiennes, une telle composition peut comprendre entre 100 mg et 400 mg d'ATT ou ATX et entre 10 mg et 65 mg de doxycycline ou de minocycline ou de l'un de leurs dérivés. Pour 2 doses quotidiennes, une telle composition peut comprendre entre 150 mg et 600 mg d'ATT ou ATX et entre 15 mg et 98 mg de doxycycline ou de minocycline ou de l'un de leurs dérivés.

Dans un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique comprend de l'ATT et de la doxycycline.

Un quatrième objet de l'invention concerne l'utilisation d'une composition pharmaceutique comprenant (i) une molécule inhibitrice de la production de ROS d'origine mitochondriale telle que l'ATT, (ii) une tétracycline anti-synucléine et (iii) des excipients pour traiter la maladie de Parkinson.

Cette composition peut être administrée à un patient traité par la L-DOPA, notamment chez un patient présentant des symptômes malgré une prise médicamenteuse de L-DOPA.

Un cinquième objet de l'invention concerne une chimère, entre (i) l'ATX et (ii) un dérivé de tétracycline anti-synucléine telle que la doxycycline ou la minocycline.

Par « chimère », aussi appelé produit de condensation, on entend la molécule qui se forme après une réaction de condensation entre la 4-OH-anétholetrithione (ATX) et l'un des dérivés en position 9 de la doxycycline ou de la minocycline. Dans un mode de réalisation préféré, la chimère comprend la conjugaison de GATC avec un dérivé de la doxycycline.

La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples qui suivent, fournis à titre d'illustration et ne devant en aucun cas être considérés comme limitant la portée de la présente invention.

DESCRIPTION DES FIGURES

Figure 1 : Représentation graphique de l'approche thérapeutique objet de l'invention combinant l'inhibition de deux voies impliquées dans la maladie de Parkinson ; ces voies créent une boucle vicieuse associant les ROS mitochondriaux et les oligomères toxiques issus de I'a-synuclein présente dans les terminaisons présynaptiques, et qui s'auto-entretient. D'après ESK El Sayed, 2018 et RM Meade, 2019.

Figure 2 : Vue schématique du mécanisme de mort cellulaire observé au niveau neuronal dans la maladie de Parkinson ; d'après Bortolanza, 2018 ; El Sayed, 2018 ; Guo, 2018 ; Liu, 2018 : Mead, 2019 ; Santa-Cecilia, 2019. (Abréviations : ETC - Electron Transport Chain ; MMP - Matrix metalloproteinase ; mPTP - mitochondria permeability transition pore ; mtDNA - ADN mitochondrial ; ROS - Reactive Oxygen Species).

Figure 3 : Impact de traitements avec de GATC, de la DOX ou de l'ATX+DOX sur des microglies en culture, activées avec du LPS - A - Effet anti-inflammatoire de l'ATX sur des microglies en culture, activées par du LPS. Mesure par un test ELISA de la libération de TNF-a dans des cultures de microglies exposées au LPS (lOng/mL) pendant 24 hrs, en présence ou en absence d'ATX (1-30mM) ou de DEX (2.5mM). Les données représentent les valeurs moyennes ± SEM, exprimées en % des valeurs mesurées, en la seule présence de l'inflammogène (n=3-7 puits/condition), ^**** p<0.0001 vs. control; ^## p<0.01, ^#### p<0.0001 vs. LPS. B- Effet anti inflammatoire de la DOX sur des microglies en culture, activées par du LPS. Mesure par un test ELISA de la libération de TNF-a dans des cultures de microglies, exposées à du LPS (lOng/mL) pendant 24 hrs, en présence ou en absence de DOX (10-100mM) ou de DEX (2.5mM). Les données représentent les valeurs moyennes ± SEM, exprimées en % des valeurs mesurées, en la seule présence de l'inflammogène (n=3-9 puits/condition). ****p<0.0001 vs. control; ####p<0.0001 vs. LPS. C- Effet anti-inflammatoire d'un traitement combinant ATX+DOX sur des microglies en culture, activées par du LPS. Mesure par un test ELISA de la libération de TNF-a dans des cultures de microglies, exposées à du LPS (lOng/mL) pendant 24 hrs, en présence ou en absence d'ATX (10 mM), de DOX (50, IOOmM), des deux traitements combinés (ATX + DOX) ou de DEX (2.5mM). Les données représentent les valeurs moyennes ± SEM, exprimées en % des valeurs mesurées, en la seule présence de l'inflammogène (n=5-13 puits/condition). ****p<0.0001 vs. control; ###p<0.001, ####p<0.0001 vs. LPS; &&p<0.01 vs. ATX ou DOX, séparément.

Figure 4 : Impact de traitements avec de l'ATX, de la DOX ou de l'ATX+DOX sur des microglies en culture activées avec du PAM3CSK4 - A - Effet anti-inflammatoire de l'ATX sur des microglies en culture, activées par du PAM3CSK4. Mesure par un test ELISA de la libération de TNF-a dans des cultures de microglies exposées à du PAM3CSK4 (lpg/mL) pendant 24 hrs, en présence ou en absence d'ATX (5-30mM) ou de DEX (2.5mM). Les données représentent les moyennes ± SEM, exprimées en % des valeurs mesurées, en la seule présence de l'inflammogène (n=4-12 puits/ condition), ****p<0.0001 vs. control; #p< 0.05, ####p<0.0001 vs. PAM3CSK4. B - Effet anti-inflammatoire de la DOX sur des microglies en culture, activées par du PAM3CSK4. Mesure par un test ELISA de la libération de TNF-a dans des cultures de microglies exposées à du PAM3CSK4 (lpg/mL) pendant 24 hrs, en présence ou en absence de DOX (10-100mM) ou de DEX (2.5mM). Les données représentent les valeurs moyennes ± SEM exprimées en % des valeurs mesurées, en la seule présence de l'inflammogène (n=4-8 puits/ condition), ****p<0.0001 vs. control; #p<0.05, ###p<0.001,####p<0.0001 vs.PAM3CSK4. C- Effet anti-inflammatoire d'un traitement combinant ATX+DOX sur des microglies en culture, activées par du PAM3CSK4. Mesure par un test ELISA de la libération de TNF-a dans des cultures de microglies exposées à du PAM3CSK4 (lpg/mL) pendant 24 h, en présence ou en absence d'ATX (5 mM), de DOX (50, 100mM), des deux traitements combinés ou de DEX (2.5mM). Les données représentent les valeurs moyennes ± SEM, exprimées en % des valeurs mesurées, en la seule présence de l'inflammogène (n=4-12 puits/ condition). ****p<0.0001 vs. control; #p<0.05, ##p<0.01, ####p<0.0001 vs. LPS; &p<0.05 vs. ATX ou DOX, séparément. Figure 5 : Effets inhibiteurs de GATC, de la DOX ou de l'ATX+DOX sur l'agrégation amyloïde de I'a- synucléine - A - Effets de la DOX et du DMF sur l'agrégation amyloïde de l'a-synucléine. Intensité de fluorescence émise par la ThT, dans les conditions où l'a-synucléine monomérique (aSm) est agitée (600 rpm, 37°C, 96h), en présence ou en absence de DOX (IOOmM) ou de DMF (1%). Comparaison avec de G aSm qui n'est pas agitée. Les données expérimentales représentent les valeurs moyennes ± SEM, en % des valeurs obtenues dans les conditions où les monomères sont agités seuls, sans traitement (n=6-8 mesures/condition), ****p<0.0001 vs. Control ; ####p<0.0001 vs. aSm agitée. B - Effet de l'ATX, combiné ou non à de la DOX, sur l'agrégation amyloïde de l'a- synucléine. Intensité de fluorescence émise par la ThT, dans les conditions où l'a- synucléine monomérique est agitée (600 rpm, 37°C, pendant 96h) en présence ou en absence de DOX (IOmM) ou d'ATX (1, 10 ou IOOmM). Les données expérimentales représentent les moyennes ± SEM, en % des valeurs obtenues dans les conditions ou les monomères sont agités seuls, sans traitement (n=6-8 mesures/ condition), **p<0.01, ****p<0.0001 vs. aS agitée.

Figure 6 : Microscoscopie électronique à transmission démontrant l'effet antiagrégant du composé ATX. Images d'agrégats d'a-synucléine produits en présence d'ATX (10 mM; aS:ATX), de DOX (10 pM; aS:DOX) ou des deux traitements combinés (aS:DOX:ATX). Barres d'échelle: 1 pm (4,000X) and 500 nm (10,000X).

Figure 7 : Potentiel neuroprotecteur de l'ATX vis-à-vis des neurones dopaminergiques subissant un stress oxydatif spontané, à bas-bruit. Illustration décrivant les effets neuroprotecteurs de l'ATX (3pM), de la DOX (D-3447, Sigma Adrich ; 10 pM) ou de l'apotransferrine (APO; T-1428, Sigma Adrich; 150pg/mL) dans des cultures de mésencéphale âgées de 7 jours.

Figure 8 : Effets neuroprotecteurs coopératifs de l'ATX et de la DOX vis-à-vis de neurones dopaminergiques en culture, subissant un stress oxydatif chronique spontané, à bas-bruit.

Survie des neurones dopaminergiques dans des cultures de mésencéphale traitées ou non pendant 7 jours avec de l'apotransferrine (APO; 150 pg/mL), de l'ATX (0.75 pM; 3 pM), de la DOX (7.5 pM; 10 pM) ou une combinaison ATX (0.75 pM) + DOX (7.5 pM). Les données expérimentales représentent les valeurs moyennes ± SEM, en % des valeurs obtenues en présence d'apotransferrine (n=4-13 puits/condition), ***p<0.001 vs. contrôles; ^### p<0.001 vs. une même concentration d'ATX ou de DOX, appliquée séparément.

EXEMPLES

EXEMPLE 1 : Description d'un cas clinique

Cette solution thérapeutique a été testée chez un homme âgé de 69 ans atteint de la maladie de Parkinson. Un historique des évènements sur 3 ans (recul actuel) est présenté ans ci-après :

Etape 1 : Effet de GATT sur les symptômes de la maladie de Parkinson

Symptômes : Tout début 2018, surviennent les premières manifestations d'un Parkinson : tremblements de la main gauche, ralentissement de la marche, descente chaotique des escaliers, bascule du tronc vers l'avant accompagnée de douleurs dorso-lombaires à type de contractures musculaires, ainsi que les prémices de divers désordres non moteurs patents (repli sur soi, indifférence, prises de décision difficile, perte de la joie de vivre, dépression...), constipation, hypo-osmie. Dans un 1 ^er temps, IΆTT a été testé en monothérapie.

Traitement : S'est posé alors le problème du choix de la dose à employer. Le patient prend déjà de IΆTT pour traiter un problème d'hypertrophie bénigne de la prostate (cf. brevet WO2019/O73173) et l'utilise avec la plus grande satisfaction à la dose de 3cp à 25mg, donnée matin et soir, mais dose qui s'avère de fait, insuffisante pour prendre en charge une maladie de Parkinson. Il est suspecté un problème de passage de la barrière hémato-encéphalique et il est décidé d'augmenter de 4 fois cette dose en la répartissant en 4 prises journalières, soit 4 x 6 comprimés /jour (équivalent à 600 mg/jour), ceci, de façon à réduire au maximum les fluctuations de concentration (la demi-vie plasmatique d'ATT chez l'homme est de l'ordre de 3h).

Résultat : De manière tout à fait spectaculaire, trois jours plus tard, tous les signes cliniques ont disparu, excepté les tremblements, l'hypo-osmie et la constipation. Ces premiers résultats constituent la première preuve de concept de l'action bénéfique de GATT sur la maladie de Parkinson. De manière corrélée, ils confirment l'hypothèse émise selon laquelle les ROS, notamment mitochondriaux, sont impliqués dans la maladie de Parkinson.

Etape 2 : Effet de l'association de GATT et de la doxycycline

Symptômes : En avril-mai 2019, une fatigabilité inhabituelle se manifeste lors de l'exécution de tâches pénibles.

En juillet 2019, apparition de troubles de l'équilibre dans un contexte de profonde fatigue qui justifie l'introduction du Sinemet ^® ; la L-DOPA règle le problème des pertes d'équilibre mais les tremblements de la main ne sont que légèrement améliorés et la fatigabilité persiste tout comme une difficulté à accélérer la marche, et, persiste également la constipation. Une micrographie apparaît.

Traitement : Devant une fatigabilité qui s'aggrave, il est décidé, le 19 décembre 2019, d'ajouter de la doxycycline à la dose de 50 mg toutes les 6h, dose sensée assurer des concentrations stables dans le LCR de l'ordre de 0,9pM/L (Dotevall, 1989 ; Karlsson, 1996), soit environ 3 fois ce que recommande Gonzalez-Lizzaraga (2017).

Résultats : Cinq jours plus tard, les problèmes de fatigabilité ont considérablement régressé et la marche parvient à être plus rapide ; à J10, l'impression de fatigabilité a disparu et la marche est pratiquement revenue à la normale tandis que le tremblement de la main n'est quasiment plus perceptible. A un mois de traitement, les douleurs de dos sont devenues exceptionnelles et la micrographie a disparu. Parallèlement, les doses de Sinemet ^® ont pu être diminuées dès les 1ères semaines de 20-25%, et, aujourd'hui (février 21) de 50-60%. Enfin, depuis le 15 janvier 2020, la posologie a été aménagée en 3 administrations par jour [3 fois 8 comprimés d'ATT à 25mg + 3 fois 50mg de doxycycline] sans perte des bénéfices du traitement. Il est important d'ajouter qu'aucun effet secondaire notable n'a été relevé au cours de ces deux années de traitement, si ce n'est un météorisme intestinal lié à la prise d'ATT. L'état du patient est stable.

En résumé, c'est : 13 mois satisfaisants sous ATT (150 mg, 4 fois par jour) Suivis de 7 mois d'échappement avec survenue de nouveaux symptômes (toujours 150 mg d'ATT, 4 fois par jour) S 13 mois satisfaisants sous ATT + DOX (600 mg ATT + 150 mg de DOX par jour).

Conclusion : L'échappement au traitement par ATT puis, la récupération observée après recours à la doxycycline, constituent une première validation de la réalité de ces deux cibles, ROS et oligomères toxiques de I'a-synuclein, qui coopèrent dans un processus conduisant à la mort des neurones dopaminergiques centraux. Cette coopération implique donc que la thérapeutique choisie, pour être pleinement efficace et durable dans le temps, soit dirigée contre chacune de ces deux cibles à la fois.

EXEMPLE 2 : Effet de l'association ATX et doxycycline sur l'activation de la microglie

1- Matériels et méthodes

Protocoles utilisant des animaux : Les souris utilisées pour cette étude sont hébergées et manipulées selon la directive 2010/63/EU du Parlement Européen et du Conseil du 22 septembre 2010. Les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité d'Ethique pour l'Expérimentation Animale, Charles Darwin no. 5.

Purification des microglies: Les cultures sont produites à partir d'une suspension de cellules, obtenue par dissociation mécanique de cerveaux de souriceaux nouveau-nés, C57BL/6J (Janvier LABS), selon un protocole décrit par Sepulveda-Diaz et collègues (Glia, 2016), modifié par la suite par dos-Santos- Pereira et collègues (Glia, 2020). Le protocole que nous utilisons suit les directives du Conseil de l'Union Européenne (2010/63/EU). Il a été approuvé par le Comité d'Ethique sur l'Expérimentation Animale, Charles Darwin n°5. Nous utilisons des flasques de culture Corning de 75 cm ² , précoatées avec un polycation, le polyéthylèneimine (PEI; lmg/mL) dilué dans un tampon borate pH 8.3, de manière à obtenir une isolation spontanée des cellules microgliales après 15-20 jours de culture, cette isolation se faisant au dépend des autres populations cellulaires, notamment des astrocytes. Pour la maintenance des cultures en flasques, nous utilisons du milieu Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF, Biowest LLC) et 1% d'un cocktail pénicilline/streptomycine (voir détails expérimentaux décrits dans la publication de Sepulveda-Diaz et collègues). Après l'étape de purification des microglies, les microglies adhérentes dans les flasques de cultures, sont trypsinisées pour produire des sous-cultures dans des plaques Nunc multi-puits de 48 puits. Ces cultures sont maintenues en présence de DMEM, supplémenté avec 20 mM d'HEPES et 1% SVF.

Paradigmes de traitement des cultures: La stimulation des microglies est obtenue par un traitement de 24 h avec deux inflammogènes de référence, le LPS (lOng/mL), un agoniste des Toll-like récepteurs (TLR)4 (Dos-Santos-Pereira et al, 2020) ou le PAM3CSK4 (lpg/mL), un agoniste des TLR2 (Acuna et al, Cells, 2019). La 4-hydroxy-anéthol trithione (ATX), la doxycycline (DOX) et la dexaméthasone (DEX; 2.5 mM), utilisée comme anti-inflammatoire de référence, sont ajoutées 4 h avant de déclencher l'activation des cellules microgliales par les inflammogènes. La solution stock d'ATX est à 25 mM, dans du DMSO, celle de DOX, à 10 mM dans de l'eau distillée. Les mécanismes des effets anti- inflammatoires de la DOX vis-à-vis des cellules microgliales, ont été rapportés antérieurement par Santa-Cecilia et collègues (Neurotox Res, 2016).

Evaluation des niveaux de TNF-a: Le milieu de culture des microglies, récupéré 24h après initiation de la stimulation par les inflammogènes, est ensuite congelé à -20°C jusqu'à l'analyse. La détection du TNF-a est réalisée avec un kit ELISA de chez ThermoFisher (BMS607- 3TWO), en suivant les instructions du fournisseur (dos-Santos-Pereira et al, Glia, 2020). L'absorbance de chaque échantillon est mesurée à 450 nm avec un SpectraMax i3X. Analyses statistiques Les données expérimentales ont été analysées avec le logiciel GraphPad Prism 8.3.1, en appliquant un test One-Way ANOVA suivi d'un test post-hoc de Student Newman Keuls.

2- Résultats

L'effet d'une association ATX et doxycycline sur l'inflammation sur une culture de microglie activée in vitro a été comparé à l'effet de chacune des molécules individuellement. L'activation de la microglie a été testée dans deux modèles expérimentaux différents, celle-ci étant mimée soit par le LPS, soit par le PAM3CSK4.

Les résultats obtenus sur la microglie activée par le LPS sont présentés à la Figure 3. Les résultats obtenus sur la microglie activée par le PAM3CSK4 sont présentés à la Figure 4.

On observe que l'ATX seul est capable d'inhiber la libération de TNF-a, marqueur de l'inflammation (Fig.3A et 4A). La doxycycline (DOX) seule induit également une diminution de l'inflammation (Fig. 3B et 4B). De manière très intéressante, l'association ATX + DOX permet d'améliorer l'inhibition de la libération de TNF- a par rapport à celle obtenue avec chacune des molécules testées séparément (Fig. 3C et 4C).

3- Discussion des résultats

Dans un modèle cellulaire permettant de reproduire la composante neuroinflammatoire de la maladie (Sepulveda-Diaz et al, 2016), nous montrons ici que IΆTC exerce des effets antiinflammatoires robustes (à 10 ou 30 mM, selon le paradigme d'activation) vis-à-vis d'inflammogènes de référence, le lipopolysaccharide (LPS) ou le PAM3CSK4, respectivement des agonistes des récepteurs TLR-4 et TLR-2. Dans le même paradigme expérimental, la DOX exerce des effets antiinflammatoires entre 50-100 pM. En testant différentes combinaisons d'ATX et de DOX, nous avons pu montrer que certaines d'entre elles, sont à l'origine d'effets anti-inflammatoires plus robustes que ceux produits par chaque composé, testé séparément, sans pour autant conduire, stricto sensu, à des effets synergiques tels qu'on les définit classiquement. Toutefois, l'effet synergique recherché parait difficile ici à mettre en évidence dans la mesure où les réponses observées en fonction des concentrations mises en œuvre ne sont pas linéaires qu'il s'agisse d'ATX ou de DOX, les effets s'amortissant à mesure que l'on augmente les concentrations (ex. dans le modèle au LPS : 50 mM de DOX inhibe de 50% la libération de TNFa quand 100 mM ne l'inhibe que de 70%, environ ; de la même manière 30 pM d'ATX n'abaissent pas d'un facteur 3 la libération de TNFa observée après 10 pM mais plutôt de 15 à 20%, seulement) ; or, dans ce contexte, toujours dans le modèle LPS, on observe que le seul fait d'ajouter à chacun des 2 bras doxycycline, DOX 50 et DOX 100, une même concentration de 10 pM d'ATX accroît les gains observés avec la doxycycline utilisée seule lorsque l'on fait passer sa concentration de 50 à 100 pM (cf. Fig 3B). Et, la même chose est retrouvée avec le modèle PAM3CSK4 (cf. Fig 4). Pour les inventeurs, ce phénomène est l'expression du potentiel synergique de l'association, jugement qui se trouve renforcé par le fait que, dans le modèle LPS, lOpM d'ATX + lOOpM de DOX font presqu'aussi bien que la dexaméthasone de référence.

EXEMPLE 3 : Effet de GATC sur l'agrégation de Ga-synucléine

1- Matériels et méthodes

Préparation de Ga-synucléine: L'a-synucléine recombinante humaine est produite à partir d'une souche d'Escherichia coli porteuse d'un plasmide pT7-7 contenant la séquence codante de la protéine (Kaylor et al, J Mol Biol, 2005 ; Gonzâlez-Lizârraga et al, Sci Rep, 2020). Après une étape de purification, la pureté de la protéine est évaluée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE). La solution stock d'a-synucléine est préparée dans un tampon contenant 20mM d'HEPES et 150mM de NaCI à pH 7.4. Avant d'initier le protocole d'agrégation, la protéine est centrifugée à 12000 g pendant 30 minutes afin d'éliminer les micro-agrégats. La concentration en protéine est mesurée à 280 nm avec un spectrophotomètre de type Nanodrop 8000 (Gonzâlez-Lizârraga et al, Sci Rep, 2020).

Agrégation de l'a-synucléine ex vitro : Le protocole d'agrégation a été adapté de travaux réalisés préalablement (Kaylor et al, J Mol Biol, 2005; Gonzâlez-Lizârraga et al, Sci Rep, 2020). Brièvement, l'agrégation de l'a-synucléine en obtenue par agitation orbitale (600 rpm; Thermomixer Comfort; Eppendorf) à 37°C, pendant 96h, de la protéine recombinante (70 mM), solubilisée dans 20 mM d'HEPES et 150 mM NaCI, à pH 7.4. Le diméthylformamide (DMF), est utilisé pour diluer IΆTC dans ce protocole expérimental. La formation des structures agrégées est suivie par le test à la Thioflavine-T (ThT) (LeVine et al, Meth Enzymol, 1999).

2- Résultats

La capacité de l'association ATX + DOX à empêcher l'agrégation de I'a-synucléine a été évaluée en comparaison avec l'effet de chacune des molécules testées séparément.

Les résultats obtenus sur un modèle ex vitro sont présentés à la Figure 5.

On observe que la DOX est capable d'inhiber cette agrégation, comme confirmé à la Figure 5A.

De manière inattendue, l'ATX possède également cette propriété. De plus, l'inhibition provoquée par l'ATX est efficace, même à faible concentration (Fig. 5B).

L'association ATX + DOX ne permet pas dans ce modèle d'améliorer d'avantage l'inhibition. Toutefois, le fait d'associer deux molécules agissant par des voies métaboliques distinctes est particulièrement prometteur pour prévenir les mécanismes d'échappement.

Le fait d'avoir démontré que l'ATX possède une action inhibitrice à la fois sur l'inflammation de la microglie et sur l'agrégation de I'a-synucléine est un résultat très encourageant pour son utilisation dans le traitement de la maladie de Parkinson, notamment en association avec un inhibiteur de I'a-synucléine tel que la doxycycline.

3- Discussion des résultats

Ce travail expérimental a permis de démontrer que la molécule d'ATX est capable d'inhiber de manière efficace et concentration-dépendante, l'agrégation de I'a-synucléine (aS) recombinante humaine dans un test ex vitro dans lequel l'agrégation amyloïde de la forme monomérique de la protéine est obtenue par agitation orbitale (Gonzâlez-Lizârraga et al, 2017). Les effets inhibiteurs de l'ATX, observables entre 1 et 50mM, ne sont cependant pas amplifiés par la DOX, utilisée à 10 mM, c'est-à-dire une concentration dénuée d'effet propre, anti-agrégant, une manière indirecte de rappeler que les mécanismes d'action des deux molécules sont fondamentalement différents : DOX stabilise la forme monomérique - tétramérique soluble de Ga-synucléine tandis qu'ATT bloque la surproduction de ROS mitochondriaux responsables d'une réorientation du devenir de Ga-synucléine vers sa forme agrégée « oligomérique toxique ».

EXEMPLE 4 : Effet antiagrégant de l'aSynucléine du composé ATX visualisé en microscopie électronique à transmission

1- Matériels et méthodes

Microscopie électronique à transmission: Les échantillons d'-aSynucléine, agités en présence ou non, des traitements d'intérêt, ont été caractérisés en microscopie électronique à transmission. Des aliquotes de 50 pl de chaque solution ont été utilisés pour cette analyse. Le protocole de préparation des échantillons est décrit en détail par Gonzâlez-Lizârraga et collègues (2020). Les images ont été obtenues avec un microscope électronique à transmission, Philips EM 301.

2- Résultats

Les résultats sont présentés à la Figure 6. Ces images confirment que l'ATX (10 mM) réduit efficacement l'agrégation amyloïde de Ga-Synucléine, alors que la DOX est sans effet à cette même concentration. Un effet comparable à celui produit par 10 mM d'ATX, est obtenu avec 100 mM de DOX (Gonzâlez-Lizârraga et al, 2020). Une coopérativité d'action des deux molécules n'a pas pu être démontrée dans cette expérience.

EXEMPLE 5 : Effet neuroprotecteur de GATT vis-à-vis de neurones dopaminergiques en culture subissant un stress oxydatif spontané, à bas-bruit, ATT seule ou en association avec la doxycycline 1- Matériels et méthodes

Cultures de mésencéphale et immuno-détection de la tyrosine hydroxylase (TH): Les cultures de mésencéphale de souris sont produites sur la base d'un protocole décrit initialement par Troadec et collègues (2001) et repris par la suite par Rousseau et collègues (2013). Les cultures sont générées à partir d'embryons de souris Swiss (Janvier LABS, Le Genest-St Isles), prélevés chez la mère gestante au jour 13.5 de gestation. Les cellules dissociées de mésencéphale sont mises en culture dans des plaques de 48 puits contenant 500 pl de milieu DMEM/HamF12, supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal (Biowest LLC, Les Ulis, France). Environ, 80- 100 10 ³ cellules sont ajoutées initialement dans chaque puits de culture. Au bout d'une heure, le milieu initial est remplacé par du milieu DMEM/HamF12 supplémenté avec 20 mg/ mL d'insuline. Le renouvellement du milieu de culture (350mI) et des traitements, se fait aux jours 1 et 3 in vitro. Les cultures sont maintenues au total 7 jours avant fixation et analyse. La présence de sulfate de Fe (II) à l'état de trace (1.5 mM) dans le milieu DMEM/HamF12, est suffisante pour déclencher un stress oxydatif spontané à bas-bruit causant la perte progressive des neurones dopaminergiques dans les cultures de mésencéphale (Rousseau et al, 2013). Les cultures de référence sont traitées avec 150 pg/mL d'apotransferrine (APO ; T- 1428, Sigma Aldrich). L'immuno-détection de la tyrosine hydroxylase est réalisée avec un anticorps anti-tyrosine hydroxylase de souris (Immunostar #22941) dont la présence est révélée avec un 2 ^sd anticorps anti-souris, marqué à l'Alexa-Fluor 555. Le comptage des neurones TH ⁺ est réalisé selon un protocole décrit précédemment (Rousseau et al, 2013). Les comptages sont exprimés en % des valeurs obtenues dans les cultures témoins traitées à l'apotransferrine.

Analyses statistiques : Les données expérimentales correspondent aux valeurs moyennes + SEM. Le nombre de valeurs individuelles (n) pour chaque point expérimental, découle à minima de deux expériences indépendantes. Les données ont été analysées avec le logiciel GraphPad Prism 8.3.1 ou le logiciel Sigmaplot 12.5, en utilisant un One-Way ANOVA, suivi d'un test post-hoc de Student Newman Keuls.

2- Résultats Les résultats sont présentés aux Figures 7 et 8.

Le traitement avec l'apotransferrine représente le traitement protecteur de référence. A noter qu'en absence de traitement, les neurones immunomarqués par la TH ont virtuellement disparu des cultures. Les images de fluorescence sont présentées sous un format inversé.

La Figure 7 montre l'effet protecteur de l'ATT, celui-ci apparaît même supérieur à celui de la DOX et de l'apotransférrine.

La Figure 8 compare l'effet de 2 concentrations d'ATT, de 2 concentrations de DOX, et le résultat de leur association. Pour ATT, les 2 concentrations testées sont 0.75 et 3 mM ; la concentration de 3 pM présente un effet protecteur comparable au traitement de référence, en l'espèce, l'apotransferrine, mais quasiment aucun effet à 0,75 pM (protection équivalente à 0.6% de celle de l'APO). Concernant la DOX, pour laquelle 2 concentrations sont également testées, 7.5 et 10 pM, l'effet maximal est observé à la concentration de 10 pM tandis qu'à 7,5 pM l'effet protecteur de la DOX n'atteint que 27% de celui de l'apotransferrine. De manière très intéressante, la combinaison de l'ATT à 0,75 pM avec la DOX à 7,5 pM permet une protection équivalente à celle de l'APO, ce qui démontre clairement un effet synergique des deux molécules.

3- Discussion des résultats

Le potentiel neuroprotecteur de l'ATX est ici mis en évidence dans un modèle cellulaire de dégénérescence neuronale dopaminergique dans lequel la DOX est aussi protectrice (voir Figures 7 et 8). L'évaluation de différentes combinaisons de DOX et d'ATX, en utilisant des concentrations de chaque composé, n'ayant pas, ou que peu d'effet, est en cours mais la première série de données expérimentales présentées met clairement en évidence des effets coopératifs, notamment pour la combinaison ATX (0,75 pM) + DOX (7,5 pM) (Figure 8). CONCLUSION

Il est important de souligner que c'est grâce à des mécanismes d'action différents et complémentaires que cette association ATT + DOX parvient à briser ce cercle vicieux qui s'auto-entretient et conduit à terme à la dégénérescence neuronale, et où l'on voit successivement sous l'impact de la maladie les séquences suivantes s'enchaîner :

• I'a-synucléine soluble qui s'auto-agrège et forme des oligomères toxiques,

• ces oligomères toxiques qui vont se fixer à la membrane externe des mitochondries et provoquer leur dysfonctionnement ce qui induit ipso facto fuite électronique et hyperproduction de ROS,

• enfin, bouclant la boucle, la surproduction de ROS qui réoriente la production de l'a- synucléine de sa forme soluble native vers la forme agrégée toxique,

• et, simultanément, le système se propage de proche en proche, de cellule à cellule via le seeding effect. Voir Figure 1

C'est en brisant cette boucle négative qui permet à la maladie de prospérer que l'association ATT-DOX met le patient à l'abri du risque d'échappement thérapeutique auquel expose le choix de la monothérapie ainsi que l'illustre fort bien le cas clinique rapporté dans le brevet ; notons que le patient en question en est à 14 mois de traitement sous l'association et que pour l'instant tout se passe bien pour lui.

Enfin, de manière très intéressante, dans ce travail, les effets anti-agrégants de l'ATX ont été confirmés en microscopie électronique à transmission.

PERSPECTIVES - SUITE DU PROJET EXPERIMENTAL

La suite du projet consistera à valider que le traitement ATT-DOX permet d'inhiber la dyskinésie induite par la L-DOPA. Il s'agira tout d'abord d'établir un modèle de dyskinésies induites par la L-DOPA pour tester l'effet anti-dyskinétique de l'ATT, administrée seule ou de manière concomitante avec la DOX. La DOX sera utilisée comme molécule de référence anti- dyskinétique (Bortolanza et al, 2020). Il s'agira de déterminer si l'ATX exerce comme la DOX des effets anti-dyskinétiques et si des combinaisons DOX/ATX améliorent le comportement des animaux de manière coopérative. Le modèle rongeur de dyskinésies que nous utiliserons consistera à induire une lésion unilatérale de la substance noire par injection stéréotaxique de 6-hydroxydopamine au niveau du «médial forebrain bundle », de manière à générer une perte neuronale dopaminergique >90% dans la substance noire, causant une déplétion pratiquement totale en dopamine dans le striatum dorsal ipsilateral. L'étendue de la perte neuronale sera confirmée par un test rotatoire à l'apomorphine, et les rats lésés seront répartis de manière homogène dans les différents groupes expérimentaux, en fonction de la réponse des animaux à ce test. Deux semaines après la lésion (jour 14), les rats lésés seront rendus dyskinétiques par des traitements quotidiens à la L-DOPA et au benserazide-HCI (un inhibiteur de la DOPA decarboxylase périphérique). Ces traitements seront réalisés sur une période de deux semaines. Dix jours après initiation des traitements à la L-DOPA (jour 24), les composés d'intérêt (DOX, ATT) seront administrés, séparément ou en combinaison, et nous évaluerons les mouvements anormaux ou AIMS (Abnormal Involuntary Movements) chez ces animaux selon des protocoles codifiés et décrits en détail dans la littérature (Dos-Santos Pereira et al, 2021; Bortolanza et al, 2020). Enfin, les animaux seront testés pour déterminer si les composés d'intérêt n'interfèrent pas avec les effets moteurs attendus de la L-DOPA. Pour cela, le comportement horizontal, les stéréotypies et le redressement sur les pattes arrière seront mesurés sous L-DOPA, en présence ou non des traitements d'intérêt, en utilisant un système de suivi vidéo, automatisé.