DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention se situe dans le domaine des maladies dites « maladies mitochondriales », impliquant un dysfonctionnement énergétique des mitochondries. Elle concerne l'utilisation combinée du bézafibrate et du resvératrol ou de certains de ses dérivés pour le traitement de ces maladies, ainsi qu'un kit pharmaceutique comprenant à la fois du bézafibrate et du resvératrol ou certains de ses dérivés. La combinaison est plus particulièrement utilisée dans le traitement des déficits modérés de la β-oxydation des acides gras à chaîne longue ou de la chaîne respiratoire des mitochondries.

ART ANTERIEUR La fonction principale de la mitochondrie est la production d'énergie métabolique, sous forme d'ATP, requise par les cellules pour de nombreuses fonctions, et notamment, au niveau des muscles, pour la contraction musculaire. Ce processus fait intervenir, entre autres :

i) la β-oxydation mitochondriale des acides gras à chaîne longue (ci-après appelée « β- oxydation ») qui produit de l'acétyl coenzyme A à partir des acides gras, et

ii) la phosphorylation oxydative (OXPHOS) qui produit ΑΤΡ au sein de la chaîne respiratoire mitochondriale, à partir des équivalents réduits (NADH, FADH ₂ ) issus de la β-oxydation, et de l'oxydation de l'acétyl-coenzyme A.

De nombreuses enzymes et protéines sont impliquées dans ces processus. Les enzymes et protéines de la β-oxydation, et la très grande majorité des protéines et enzymes de la chaîne respiratoire, sont codées par le génome nucléaire. De plus, un petit nombre de protéines de la chaîne respiratoire sont codés par l'ADN mitochondrial.

Des mutations des gènes codant ces différentes enzymes et protéines peuvent entraîner un dysfonctionnement énergétique de la mitochondrie à l'origine d'une grande diversité de manifestations cliniques.

Certaines mutations conduisent à un déficit « sévère » de production d'énergie métabolique par les mitochondries, mettant alors le pronostic vital du sujet muté en péril. D'autres mutations conduisent à un déficit « modéré », ne mettant pas le pronostic vital du sujet muté en danger, mais conduisant à des symptômes relativement handicapants. Dans le cas des déficits modérés de β-oxydation, les maladies sont bien caractérisées au plan clinique et biologique, et entraînent l'apparition d'une myopathie avec raideurs musculaires, intolérance à l'effort, et épisodes de destruction du muscle (ou rhabdomyolyse) à partir de l'adolescence, ou chez le jeune adulte. Les complications possibles (insuffisance rénale nécessitant une hospitalisation) et le fait que ces atteintes musculaires peuvent survenir en réponse à un exercice physique même modéré, conduisent la plupart des patients à auto-limiter en permanence leur activité physique dans tous les domaines de la vie courante, entraînant une détérioration importante de leur qualité de vie. Dans le cas des déficits modérés de la chaîne respiratoire, les phénotypes sont moins stéréotypés, et plus variables. Cependant, ces déficits modérés de la chaîne respiratoire peuvent également inclure une myopathie avec raideurs musculaires, myalgies, intolérance à l'effort, et épisodes de destruction du muscle (ou rhabdomyolyse), ainsi que d'autres symptômes pouvant toucher de nombreux autres organes (notamment le cœur, le système nerveux, et le système digestif).

Dans la très grande majorité des cas, ces maladies sont encore sans traitement à l'heure actuelle. En effet, pour les déficits de β-oxydation, la prise en charge proposée est exclusivement nutritionnelle (régime riche en glucose, pauvre en lipides) et comportementale (limitation du jeûne et de l'exercice), et celle-ci est peu ou pas efficace. Pour les déficits de chaîne respiratoire, la prise en charge est essentiellement « supportive », avec l'administration de vitamines, cofacteurs, antioxydants, etc.. éventuellement associée à des mesures comportementales mais il n'existe aucune preuve scientifique ou clinique d'efficacité de ces interventions dans la très grande majorité des cas. Il existe donc un besoin réel et une forte attente des patients pour le traitement de ces déficits, amplifiés par la mise en évidence récente d'une incidence non négligeable des déficits de chaîne respiratoire (1 /5000 à 1 /8000 naissances).

Outre ces maladies rares d'origine génétique, des dysfonctionnements énergétiques des mitochondries ont été observés dans de nombreuses autres pathologies, et notamment dans les maladies métaboliques (en particulier le diabète de type 2 et l'obésité, voir Andreux et al. Nat Rev Drug Discov. 2013 Jun;12(6):465-83) et dans certaines maladies neurodégénératives (en particulier dans la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique, l'ataxie de Friedrich et la maladie de Charcot-Marie-Tooth (voir Andreux et al. Nat Rev Drug Discov. 2013 Jun;12(6):465-83; Chaturvedi et al. Mol Cell Neurosci. 2013 Jul 55:101 -14; et Chaturvedi et al. Free Radie Biol Med. 2013 Oct; 63:1 -29).

Là encore, il s'agit de pathologies ne bénéficiant pas à l'heure actuelle de traitements satisfaisants.

Une stratégie envisagée pour le traitement et la prévention de ces pathologies est d'augmenter l'activité des enzymes mitochondriales impliquées dans la production d'énergie en stimulant leur production. Ainsi, dans le cadre des déficits modérés d'origine génétique de β-oxydation ou de la chaine respiratoire des mitochondries, les inventeurs ont précédemment montré que le bézafibrate (BZ) et le resvératrol (RSV) pouvaient chacun isolément induire une augmentation de la quantité de protéine mutée et améliorer voire corriger certains déficits modérés de 6-oxydation ou de la chaîne respiratoire (voir Djouadi et al. Pediatr Res, 2003, 54 :446-51 ; Djouadi et al. J. Clin. Endocrinol. Metab, 2005, 90:1791 -1797; Djouadi et al. Hum Mol Genêt, 2005, 14:2695-2703; Bastin et al. J Clin Endocrinol Metab, 2008, 93:1433-1441 ; Bonnefont et al. N Engl J Med, 2009 360;8; Bonnefont et al. Clin Pharmacol Ther, 2010, 88: 101 -108; et Bastin et al. Hum. Mol Genêt. 201 1 , 20 :2048-2057). Certains dérivés de RSV ont également été montrés comme ayant les mêmes propriétés de le RSV dans les déficits modérés de β-oxydation (Aires V, et al. Orphanet J Rare Dis. 2014 Jun 5;9:79).

De manière similaire, le BZ et le RSV ont chacun été montré isolément comme ayant des effets bénéfiques in vivo dans des modèles animaux et/ou chez l'homme concernant les maladies suivantes : diabète de type 2 (voir Andreux et al. Nat Rev Drug Discov. 2013 Jun;12(6):465-83 ; Bhatt et al. Nutr. Res. 32, 537-541 (2012)), obésité (Andreux et al. Nat Rev Drug Discov. 2013 Jun;12(6):465-83 ; Timmers et al. Cell Metab. 2011 Nov 2;14(5):612-22), la maladie de Huntington (voir Johri et al. 2012. Hum. Mol. Genêt. 21 , 1124-1137; Chaturvedi et al. Mol Cell Neurosci. 2013 Jul 55:101 -14; et Chaturvedi et al. Free Radie Biol Med. 2013 Oct; 63:1 -29), et la maladie de Parkinson (voir Chaturvedi et al. Mol Cell Neurosci. 2013 Jul 55:101 -14; et Chaturvedi et al. Free Radie Biol Med. 2013 Oct; 63:1 -29).

Il existe néanmoins un besoin de nouvelles thérapies des maladies impliquant un dysfonctionnement énergétique des mitochondries. En particulier, dans les expériences décrites ci-dessus, le BZ et le RSV étaient généralement utilisés à des doses élevées. Bien que ces molécules ne soient pas associées à de forts effets secondaires, l'administration de doses élevées de médicaments n'est jamais souhaitable. De plus, diminuer les doses administrées permet également de diminuer le coût du traitement.

Dans l'art antérieur, le BZ et le RSV sont décrits comme deux molécules dont les effets pharmacologiques aboutissent in fine à l'activation d'une cible commune, à savoir le co- activateur de transcription PGC1 alpha (« peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1 alpha », voir Johri et al. 2012. Hum. Mol. Genêt. 21 , 1124-1137 ; Bastin et al. J Clin Endocrinol Metab, 2008, 93:1433-1441 ; Lagouge et al. Cell 127, 1109-1122; Bastin et al. Hum. Mol Genêt. 2011 , 20 :2048-2057). Ainsi, d'après l'art antérieur, un traitement par le bézafibrate seul, ou par le resvératrol seul, conduirait à augmenter l'activité de PGC-1 a, et c'est ce mécanisme qui déclencherait une expression accrue des gènes codant pour les enzymes de la chaîne respiratoire ou de la β-oxydation mitochondriale. Selon cette hypothèse, l'homme du métier ne pouvait anticiper aucune interaction fonctionnelle entre les deux molécules et pouvait s'attendre à ce que les deux molécules aient des effets similaires, et que l'administration en combinaison des deux molécules conduise au mieux à des effets additifs, voire même ne conduise à aucune amplification de l'effet de chacune des molécules utilisée seule. D'ailleurs, si chacune des molécules a été testée seule dans de nombreuses maladies impliquant un dysfonctionnement énergétique des mitochondries, aucune équipe de recherche n'avait jusqu'ici suggéré de combiner ces deux molécules dans le cadre du traitement ou de la prévention d'aucune de ces maladies.

RESUME DE L'INVENTION

De façon surprenante, dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont trouvé que l'utilisation combinée du BZ et du RSV génère des effets synergiques, permettant ainsi d'obtenir une réponse fonctionnelle d'augmentation des fonctions de production d'énergie des mitochondries à des doses de BZ et de RSV beaucoup plus faibles que celles efficaces pour chacune des molécules utilisée seule. Plus particulièrement, les inventeurs ont montré que les effets pharmacologiques du BZ sur les cellules de patients présentant un déficit modéré en CPT2, VLCAD, ou LCHAD (enzymes de la 6-oxydation) ou en COX10 (complexe IV de la chaîne respiratoire) sont potentialités par l'addition de RSV, conduisant ainsi à une synergie des deux composés et à une meilleure correction des déficits des enzymes de la β-oxydation ou de la chaîne respiratoire par la combinaison (BZ + RSV), comparé aux effets du BZ ou du RSV seul.

Dans un premier aspect, la présente invention concerne donc une combinaison de bézafibrate et de resvératrol, pour son utilisation en tant que médicament.

L'invention concerne en outre une combinaison de bézafibrate et de resvératrol, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies impliquant un dysfonctionnement énergétique des mitochondries.

Dans un mode de réalisation préféré, la maladie impliquant un dysfonctionnement énergétique des mitochondries est caractérisée par un déficit modéré dans la β- oxydation mitochondriale des acides gras à chaîne longue, ou par un déficit modéré de la chaîne respiratoire des mitochondries. Ces déficits modérés sont avantageusement associés à la présence d'au moins une mutation sur chaque allèle d'un gène codant pour une enzyme du processus de β-oxydation mitochondriale des acides gras à chaîne longue (notamment CPT2, VLCAD et LCHAD) ou d'un gène codant pour une enzyme ou une protéine (notamment une sous-unité ou un facteur d'assemblage des complexes I à IV) indispensable au fonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale. Ces mutations peuvent être portées par l'ADN mitochondrial ou l'ADN nucléaire.

Dans un autre mode de réalisation préféré, la maladie impliquant un dysfonctionnement énergétique des mitochondries est choisie parmi les maladies métaboliques (notamment le diabète de type 2 et l'obésité) et les maladies neurodégénératives (notamment la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique, l'ataxie de Friedrich et la maladie de Charcot-Marie-Tooth).

Dans un deuxième aspect, l'invention concerne également un kit pharmaceutique comprenant du bézafibrate et du resvératrol. Le bézafibrate et le resvératrol peuvent être présents dans le kit dans une même formulation ou dans deux formulations distinctes.

DESCRIPTION DES FIGURES

Figure 1. Effet synergique du Resvératrol et du Bézafibrate pour la correction de déficits en VLCAD chez deux patients (E3536 (A) et CHA Ma (B)). Le pourcentage d'augmentation de l'oxydation des acides gras (OAG) de chaque composition testée, par rapport aux cellules recevant le véhicule seul est représenté en fonction de la composition testée.

Figure 2. Effet synergique du Resvératrol et du Bézafibrate pour la correction de déficits en CPT2 chez deux patients (BRA Ma (A) et DIA Ke (B)). Le pourcentage d'augmentation de l'oxydation des acides gras (OAG) de chaque composition testée, par rapport aux cellules recevant le véhicule seul est représenté en fonction de la composition testée.

Figure 3. Oxydation du palmitate dans des fibroblastes de témoins et d'un patient déficitaire en LCHAD. La quantité de palmitate tritié oxydée par heure et par mg de protéine dans des cellules d'un sujet contrôle sain (« Contrôle ») et dans des cellules d'un patient déficitaire en LCHAD (« Patient LCHAD ») est représentée pour des cellules cultivées en présence de DMSO (véhicule), 75μΜ de RSV, 400 μΜ de BZ, ou (30μΜ de RSV + 35 μΜ de BZ).

Figure 4. Consommation d'oxygène de fibroblastes témoins et déficitaires en complexe IV de la chaine respiratoire (gène muté COX10). La consommation d'oxygène par million de cellules est représentée dans des cellules d'un sujet contrôle sain (« Contrôle ») et dans des cellules d'un patient déficitaire en complexe IV de la chaine respiratoire (« Patient COX10 ») pour des cellules cultivées en présence de DMSO (véhicule), 75μΜ de RSV, 400 μΜ de BZ, ou (30μΜ de RSV + 35 μΜ de BZ).

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

Définitions

Par « bézafibrate » ou « BZ », on entend l'acide 2-(4-(2-((4- chlorobenzoyl)amino)éthyl)phénoxy)-2-méthylpropanoïque (CAS n° 41859-67-0) de formule (I) suivante :

Par « resvératrol », « trans-resvératrol », « RSV » ou « trans-RSV », on entend le 5-[(E)- 2-(4-hydroxyphényl)-éthényl] benzène- 1 ,3-diol (CAS n° 501 -36-0) de formule (II) suivante :

Par « cis- resvératrol » ou « cis-RSV », on entend le 5-[(Z)-2-(4-hydroxyphényl)-éthényl] benzène-1 ,3-diol (CAS n° 61434-67-1 ) de formule (III) suivante :

Par « dihydro- resvératrol », « dihydro-RSV », « dihydro-trans- resvératrol », « dihydro- trans-RSV », on entend le 5-[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]benzene-1 ,3-diol de formule (III) suivante :

Par « picéide », « trans-picédide », « resvératrol-3-O-glucoside », ou « trans- resvératrol-3-O-glucoside », on entend le 2-[3-Hydroxy-5-[(E)-2-(4- hydroxyphenyl)ethenyl]phenoxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5- triol (CAS n° 27208-80- 6) de formule (V) suivante :

Le cis-resvératrol, le dihydro-resvératrol et le picéide sont tous des dérivés proches du resvératrol et partagent une forte homologie de structure. Ces dérivés ont en outre été montrés comme ayant les mêmes propriétés d'induire une augmentation de la quantité de protéine mutée et d'améliorer voire corriger certains déficits modérés de 6- oxydation (Aires V, et al. Orphanet J Rare Dis. 201 Jun 5;9:79).

Par « administration simultanée », on entend aussi bien l'administration sous forme d'une unique formulation pharmaceutique associant les deux principes actifs BZ et RSV, que l'administration séparée de deux formulations pharmaceutiques distinctes contenant chacune l'un des deux principes actifs en prise simultanée ou à très faible intervalle (au maximum environ 1 heure).

Par « maladie impliquant un dysfonctionnement énergétique des mitochondries », on entend toute maladie dans laquelle est observé un déficit modéré dans au moins un des processus de production d'ATP par les mitochondries, et notamment dans la β-oxydation des acides gras à chaîne longue (également appelée dans la présente description « β- oxydation ») qui produit de l'acétyl coenzyme A à partir des acides gras ou dans la chaîne respiratoire des mitochondries, dans au moins certains types cellulaires (en particulier les fibroblastes, les myoblastes, les myotubes) , ou dans au moins certains tissus, comme par exemple le muscle squelettique, le tissu adipeux blanc, le foie, le pancréas (Patti et al. Endocrine Reviews,2010, 31 :364-395), ou le cerveau (Andreux et al. Nat Rev Drug Discov. 2013 Jun;12(6):465-83)

Par « déficit modéré », on entend que le processus impliqué dans la production d'ATP par les mitochondries qui est déficitaire possède néanmoins dans les cellules (notamment les fibroblastes) du sujet une activité résiduelle d'au moins 30%, de préférence au moins 35%, de préférence au moins 40%, de préférence au moins 45%, de préférence au moins 50%, de l'activité de ce même processus dans des cellules saines contrôles.

L'activité résiduelle des cellules d'un sujet test dans un des processus de la production d'ATP par les mitochondries peut être mesurée par différents tests in vitro comparant l'activité des cellules du sujet test à celle de cellules d'un sujet contrôle sain. Le pourcentage d'activité résiduelle (ou « activité résiduelle ») peut alors être calculé par la formule suivante :

, , activité dans les cellules tests

Activité résiduelle =— -r-,— ; ; rr-, : -,— x 100

activité dans les cellules saines contrôles

En particulier, concernant la β-oxydation, l'activité résiduelle des cellules d'un sujet test peut être mesurée in vitro en mesurant la β-oxydation du palmitate dans des cellules du sujet test et dans des cellules d'un sujet contrôle sain, et en calculant le pourcentage d'activité résiduelle selon la formule suivante :

Activité résiduelle en 6-oxydation taux de β-oxydation du p 1almitate dans les cellules tests X taux de 6-oxydation du palmitate dans les cellules saines contrôles

L'activité de β-oxydation du palmitate par des cellules peut être mesurée par toute technologie appropriée connue de l'homme du métier. Cela peut notamment être fait en utilisant du palmitate tritié complexé avec de la BSA (albumine sérique bovine), qui est ajouté aux cellules à tester. Après incubation, l'ajout d'acide trichloroacétique (TCA) dans un échantillon de surnageant permet de précipiter les complexes (BSA/palmitate tritié) non métabolisés, qui sont exclus par centrifugation. La mesure du tritium présent dans le surnageant après centrifugation et exclusion des complexes (BSA/palmitate tritié) non métabolisés permet de déterminer la quantité de palmitate métabolisée par les cellules. Un exemple précis de protocole de mise en œuvre de ce procédé de mesure de l'activité de β-oxydation du palmitate est décrit à l'Exemple 1. Dans un mode de réalisation préféré, la combinaison de BZ et de RSV est administrée à un sujet dont les cellules ont une activité de β-oxydation du palmitate d'au moins 30%, de préférence au moins 35%, de préférence au moins 40%, de préférence au moins 45%, de préférence au moins 50%, de l'activité de ce même processus dans des cellules saines contrôles. Avantageusement, la combinaison de BZ et de RSV est administrée à un sujet dont les cellules ont une activité de β-oxydation du palmitate dans un test utilisant du palmitate tritié complexé à de la BSA d'au moins 30%, de préférence au moins 35%, de préférence au moins 40%, de préférence au moins 45%, de préférence au moins 50%, de l'activité de ce même processus dans le même test dans des cellules saines contrôles. On parle alors de « déficit modéré dans la β-oxydation mitochondriale des acides gras à chaîne longue ». Ces déficits modérés dans la β-oxydation mitochondriale des acides gras à chaîne longue sont des pathologies bien connues de l'homme du métier (Eaton S, et al. Biochem J. 1996 Dec 1 ;320 (Pt 2):345-57 ; Kompare M, et al. Semin Pediatr Neurol. 2008 Sep;15(3): 140-9).

Concernant la chaîne respiratoire, l'activité résiduelle des cellules d'un sujet peut être mesurée in vitro en mesurant la consommation en oxygène dans des cellules du sujet test et dans des cellules d'un sujet contrôle sain, et en calculant le pourcentage d'activité résiduelle selon la formule suivante :

Activité résiduelle de la chaîne respiratoire taux de consommation en oxygène dans les cellules tests

taux de consommation en oxygène dans les cellules saines contrôles

La mesure de la consommation d'oxygène peut être réalisée par toute technologie appropriée connue de l'homme du métier. Une technique de polarographie peut notamment être utilisée. Cela peut également et avantageusement être réalisé en utilisant une technologie reposant sur la détection de fluorescence dans un milieu de culture des cellules du sujet test et dans un milieu de culture des cellules d'un sujet contrôle sain de deux sondes fluorescentes ajoutées au milieu de culture, l'une dite « indicatrice » et dont l'intensité de fluorescence dépend du contenu en oxygène du milieu où elle se trouve, et l'autre dite « référence » et dont l'intensité de fluorescence est insensible au contenu en oxygène du milieu où elle se trouve. Le rapport des intensités de fluorescence entre ces deux sondes permet de calculer la consommation en oxygène des cellules. Ce rapport peut être normalisé par l'utilisation de mesures de références dans des milieux sans cellules avec un contenu en oxygène stable et faible (condition « 0% 0 ₂ ») ou fort (condition « 100% 0 ₂ ») respectivement.

Cette technologie utilise notamment des plaques de culture revêtues d'un polymère auquel sont intégrées les deux sondes fluorescentes « indicatrice » et « référence ». L'échantillon à tester (cellules à tester reprises dans un milieu de culture), un échantillon contrôle (cellules saines reprises dans le même milieu de culture), ainsi que des échantillons témoins avec un contenu en oxygène stable et faible (condition « 0% 0 ₂ ») ou fort (condition « 100% 0 ₂ ») respectivement, sont répartis sur la plaque de culture, recouverts d'un produit empêchant tout échange d'air entre l'échantillon et l'air ambiant (huile minérale notamment), et la cinétique de fluorescence des deux sondes (indicatrice et référence) est mesurée dans les différents puits. Les valeurs de fluorescence ainsi mesurées permettent de calculer la pression en oxygène (p0 ₂ ), selon la formule suivante :

où k ₀ v représente le rapport de fluorescence entre la sonde indicatrice et la sonde référence dans la condition 0% 0 ₂ , k ₁₀ o représente le rapport de fluorescence entre la sonde indicatrice et la sonde référence dans la condition 100% 0 ₂ , et l _R représente le rapport de fluorescence entre la sonde indicatrice et la sonde référence dans la condition testée (échantillon de cellules du patient ou échantillon contrôle). Le taux de consommation en oxygène (dit « OUR ») correspond alors à la valeur absolue de la pente de la droite représentant la p0 ₂ en fonction du temps. Un exemple précis de protocole de mise en œuvre de cette technologie de mesure de la consommation d'oxygène est décrit à l'Exemple 2.

Dans un mode de réalisation préféré, la combinaison de BZ et de RSV est administrée à un sujet dont les cellules ont une activité de consommation d'oxygène d'au moins 30%, de préférence au moins 35%, de préférence au moins 40%, de préférence au moins 45%, de préférence au moins 50%, de l'activité de ce même processus dans des cellules saines contrôles. Avantageusement, la combinaison de BZ et de RSV est administrée à un sujet dont les cellules ont une activité de consommation d'oxygène dans un test utilisant la combinaison de deux sondes fluorescentes ajoutées au milieu de culture, l'une dite « indicatrice » et dont l'intensité de fluorescence dépend du contenu en oxygène du milieu où elle se trouve, et l'autre dite « référence » et dont l'intensité de fluorescence est insensible au contenu en oxygène du milieu où elle se trouve, d'au moins 30%, de préférence au moins 35%, de préférence au moins 40%, de préférence au moins 45%, de préférence au moins 50%, de l'activité dans le même test de ce même processus dans des cellules saines contrôles. On parle alors de « déficit modéré de la chaîne respiratoire des mitochondries ». Ces déficits modérés de la chaîne respiratoire des mitochondries sont des pathologies bien connues de l'homme du métier (Rôtig A, Munnich A. Genetic features of mitochondrial respiratory chain disorders. J Am Soc Nephrol. 2003 Dec;14(12):2995-3007).

Un agent découplant la chaîne respiratoire des mitochondries (et donc leur consommation en oxygène) de la production d'ATP (dit « agent découplant », comme le dinitrophénol, le carbonyl cyanide m-chloro-phenyl hydrazone (CCCP), et le p- trifluoromethoxy-carbonyl-cyanide-phenyl hydrazone (FCCP)) peut être ajouté aux échantillons de cellules tests et contrôles pour augmenter la consommation d'oxygène et ainsi mettre plus facilement en évidence un déficit.

Dans un mode de réalisation particulier, la combinaison de BZ et de RSV est en outre administrée à un sujet dont les cellules ont une activité significativement déficitaire dans un processus impliqué dans la production d'ATP par les mitochondries, c'est-à-dire à une sujet dont les cellules ont une activité résiduelle d'au plus 85 %, de préférence d'au plus 80 %, voire d'au plus 75% de l'activité de ce même processus dans des cellules saines contrôles. Dans le cas où le processus impliqué dans la production d'ATP par les mitochondries qui est déficitaire est le processus de β-oxydation mitochondriale des acides gras à chaîne longue, la combinaison de BZ et de RSV est de préférence administrée à un sujet dont les cellules ont une activité résiduelle de β-oxydation du palmitate d'au plus 85 %, de préférence d'au plus 80 %, voire d'au plus 75% de l'activité de β-oxydation du palmitate dans des cellules saines contrôles. Avantageusement, l'activité de β-oxydation du palmitate est mesurée par le test utilisant du palmitate tritié complexé à de la BSA décrit ci-dessus. Dans le cas où le processus impliqué dans la production d'ATP par les mitochondries qui est déficitaire est la chaîne respiratoire mitochondriale, la combinaison de BZ et de RSV est de préférence administrée à un sujet dont les cellules ont une consommation en oxygène d'au plus 85 %, de préférence d'au plus 80 %, voire d'au plus 75% de la consommation en oxygène dans des cellules saines contrôles. Avantageusement, la consommation en oxygène est mesurée par le test utilisant la combinaison de deux sondes fluorescentes ajoutées au milieu de culture, l'une dite « indicatrice » et dont l'intensité de fluorescence dépend du contenu en oxygène du milieu où elle se trouve, et l'autre dite « référence » et dont l'intensité de fluorescence est insensible au contenu en oxygène du milieu où elle se trouve, tel que décrit ci-dessus.

Ce mode de réalisation est particulièrement adapté aux dysfonctionnements énergétiques des mitochondries n'étant pas associés à la présence de mutations dans un gène codant pour une enzyme du processus de β-oxydation mitochondriale des acides gras à chaîne longue (notamment CPT2, VLCAD et LCHAD) ou dans un gène codant pour une enzyme ou une protéine de la chaîne respiratoire mitochondriale (notamment une sous-unité ou un facteur d'assemblage des complexes I à IV). De façon préférée, la combinaison de BZ et de RSV est administrée à un sujet souffrant d'une maladie impliquant un dysfonctionnement énergétique des mitochondries choisie parmi les maladies métaboliques ou les maladies neurodégénératives, et dont les cellules ont une activité résiduelle dans un processus impliqué dans la production d'ATP par les mitochondries d'au plus 85 %, de préférence d'au plus 80 %, voire d'au plus 75% de l'activité de ce même processus dans des cellules saines contrôles. Comme décrit ci- dessus, le sujet auquel la combinaison de BZ et de RSV est administrée souffre de préférence d'un déficit modéré dans un processus déficitaire impliqué dans la production d'ATP par les mitochondries, c'est-à-dire que l'activité résiduelle du processus déficitaire impliqué dans la production d'ATP par les mitochondries est de préférence d'au moins 30%, de préférence au moins 35%, de préférence au moins 40%, de préférence au moins 45%, de préférence au moins 50%, de l'activité de ce même processus dans des cellules saines contrôles. Par « traitement », on entend une amélioration constatée au niveau clinique ou biochimique de la pathologie du patient.

Dans le cadre des déficits modérés de la β-oxydation dans les mitochondries, les principaux symptômes cliniques correspondent à une myopathie, avec raideurs musculaires, myalgie, intolérance à l'effort, et épisodes de destruction du muscle (ou rhabdomyolyse). Sur le plan biochimique, ces déficits sont caractérisés par une activité réduite (telle que définie ci-dessus) de β-oxydation des cellules (et notamment des fibroblastes) des patients par rapport à des cellules de sujets sains. Par conséquent, dans le cadre des déficits modérés de la β-oxydation dans les mitochondries, le terme « traitement » se réfère à une amélioration de la fonction de β-oxydation des cellules du patient et/ou à une diminution du nombre et/ou de l'intensité des raideurs musculaires et/ou des épisodes de myalgie et/ou de rhabdomyolyse. Dans le cadre des déficits modérés de la chaîne respiratoire des mitochondries, les principaux symptômes cliniques peuvent aussi correspondre à une myopathie avec raideurs musculaires, myalgie, intolérance à l'effort, et épisodes de destruction du muscle (ou rhabdomyolyse). Cependant, d'autres symptômes peuvent également être observés touchant une grande diversité d'organes (notamment le cœur, le système nerveux, et le système digestif). Sur le plan biochimique, ces déficits sont caractérisés par une activité réduite (telle que définie ci-dessus) de respiration des cellules (et notamment des fibroblastes) des patients par rapport à des cellules de sujets sains. Par conséquent, dans le cadre des déficits modérés de chaîne respiratoire des mitochondries, le terme « traitement » se réfère à une amélioration de la fonction de respiration des cellules du patient et/ou à une diminution du nombre et/ou de l'intensité des raideurs musculaires, des épisodes de myalgie et/ou de rhabdomyolyse, ou des atteintes cardiaques, neurologiques ou digestives. Par « prévention », on entend le fait d'empêcher ou de retarder la survenue ou de diminuer l'intensité des manifestations cliniques ou biochimiques associées à la maladie.

Dans le cadre des déficits modérés de la β-oxydation dans les mitochondries, le terme « prévention » se réfère donc au fait d'empêcher ou de retarder la survenue ou de diminuer l'intensité de la perte d'activité de β-oxydation des cellules du patients, et/ou d'empêcher ou de retarder la survenue ou de diminuer l'intensité des raideurs musculaires et/ou des épisodes de myalgie et/ou de rhabdomyolyse.

Dans le cadre des déficits modérés de la chaîne respiratoire des mitochondries, le terme « prévention » se réfère donc au fait d'empêcher ou de retarder la survenue ou de diminuer l'intensité de la perte d'activité de respiration des cellules du patient et/ou d'empêcher ou de retarder la survenue ou de diminuer l'intensité des raideurs musculaires, des épisodes de myalgie et/ou de rhabdomyolyse, ou des atteintes cardiaques ou neurologiques ou digestives. Par « quantités efficaces » de BZ et de RSV ou de l'un de ses dérivés (cis-RSV, dihydro- RSV, ou picéide), on entend des quantités respectives permettant, en combinaison, un traitement ou une prévention d'une maladie impliquant un dysfonctionnement énergétique des mitochondries chez un patient.

Combinaison de bézafibrate (BZ) et de resvératrol (RSV) ou l'un de ses dérivés, pour son utilisation simultanée ou étalée dans le temps en tant que médicament

Malgré les enseignements de l'art antérieur selon lesquels le BZ et le RSV ciblent tous deux PCG1 -alpha, les inventeurs ont trouvé de façon surprenante que l'utilisation combinée du BZ et du RSV génère des effets synergiques, permettant ainsi d'obtenir une réponse fonctionnelle d'augmentation des fonctions de production d'énergie des mitochondries à des doses de BZ et de RSV beaucoup plus faibles que celles efficaces pour chacune des molécules utilisée seule. En particulier, cette synergie a été démontrée sur des cellules de patients présentant un déficit modéré en CPT2, VLCAD, LCHAD (enzymes de la β-oxydation), ou en COX10 (complexe IV de la chaîne respiratoire). La découverte par les inventeurs que, contrairement à d'autres fibrates, le bézafibrate est capable de corriger un déficit en CPT2 rend la combinaison spécifique bézafibrate / resvératrol particulièrement efficace pour le traitement ou la prévention de maladie impliquant un dysfonctionnement énergétique des mitochondries.

Dans un premier aspect, la présente invention concerne donc une combinaison 1 ) de Bézafibrate et 2) de resvératrol, cis- resvératrol, dihydro- resvératrol, picéide ou leurs mélanges (avantageusement de resvératrol), pour son utilisation en tant que médicament.

En particulier, la présente invention concerne une combinaison 1 ) de bézafibrate et 2) de resvératrol, cis- resvératrol, dihydro-resvératrol, picéide ou leurs mélanges (avantageusement de resvératrol), pour son utilisation dans le traitement ou la prévention des maladies impliquant un dysfonctionnement énergétique des mitochondries.

La présente invention concerne également l'utilisation en combinaison 1 ) du BZ et 2) du RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement de RSV), pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention des maladies impliquant un dysfonctionnement énergétique des mitochondries.

La présente invention concerne également l'utilisation en combinaison 1 ) du BZ et 2) du RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement de RSV), pour le traitement ou la prévention des maladies impliquant un dysfonctionnement énergétique des mitochondries.

La présente invention concerne également une méthode de traitement thérapeutique d'une maladie impliquant un dysfonctionnement énergétique des mitochondries chez un patient en ayant besoin, comprenant l'administration au dit patient de quantités efficaces en combinaison 1 ) de BZ et 2) de RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement de RSV). Maladies impliquant un dysfonctionnement énergétique des mitochondries

Les maladies impliquant un dysfonctionnement énergétique des mitochondries sont définies ci-dessus et incluent :

• des maladies génétiques rares, associées à la présence d'au moins une mutation, de préférence d'au moins deux mutations, dans un gène codant pour une enzyme ou une protéine impliquée dans un des processus de production d'ATP par les mitochondries, et notamment dans les processus de β-oxydation ou dans la chaîne respiratoire, et

• des maladies principalement acquises bien qu'ayant éventuellement une composante génétique, beaucoup plus fréquentes, et généralement associées à des problèmes métaboliques (maladies métaboliques) et/ou au vieillissement (maladies neurodégénératives).

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la maladie impliquant un dysfonctionnement énergétique des mitochondries est caractérisée par un déficit modéré dans la β-oxydation mitochondriale des acides gras à chaîne longue. Comme indiqué ci-dessus, ces déficits modérés dans la β-oxydation mitochondriale des acides gras à chaîne longue sont des pathologies bien connues de l'homme du métier (Eaton S, et al. Biochem J. 1996 Dec 1 ;320 (Pt 2):345-57 ; Kompare M, et al. Semin Pediatr Neurol. 2008 Sep;15(3): 140-9). Avantageusement, le déficit modéré dans la β-oxydation mitochondriale des acides gras à chaîne longue est associé à la présence d'au moins une mutation sur chaque allèle d'un gène codant pour une enzyme du processus de β- oxydation mitochondriale des acides gras à chaîne longue.

En effet, tous les déficits de β-oxydation décrits sont de transmission autosomique récessive, c'est-à-dire que les sujets souffrant de déficits de β-oxydation sont porteurs de deux allèles mutés (l'un d'origine maternelle, l'autre d'origine paternelle) d'un gène codant pour une enzyme du processus de β-oxydation mitochondriale des acides gras à chaîne longue. La mutation peut être identique sur les deux allèles mutés, auquel cas le sujet a un génotype homozygote. Alternativement, la mutation peut être distincte sur les deux allèles mutés, le sujet ayant alors un génotype hétérozygote. L'expression « sur chaque allèle » fait alors référence à la présence d'une mutation à la fois sur l'allèle d'origine maternelle et sur l'allèle d'origine paternelle, sous forme homozygote (mutation identique sur les deux allèles mutés) ou hétérozygote (mutation distincte sur les deux allèles mutés).

Le processus de β-oxydation fait intervenir de nombreuses enzymes, qui sont susceptibles en cas de mutation(s) de conduire à un déficit de β-oxydation (voir Eaton et al. Biochem J. 1996 Dec 1 ;320 (Pt 2):345-57). Les enzymes impliquées dans la β- oxydation pour lesquelles des mutations conduisant à un déficit modéré de B-oxydation sont les plus fréquentes sont les suivantes : carnitine palmitoyltransférase type 2 (appelée ci-après « CPT2 »), acyl-CoA déshydrogénase des acides gras à chaînes très longues (appelée ci-après « VLCAD »), et 3-hydroxyacyl CoA déhydrogénase des acides gras à chaîne longue (appelée ci-après « LCHAD »). Par conséquent, dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, le sujet traité souffre d'un déficit modéré dans la β-oxydation mitochondriale des acides gras à chaîne longue associé à au moins une mutation sur chaque allèle, à l'état homozygote (mutation identique sur les deux allèles mutés) ou hétérozygote (mutation distincte sur les deux allèles mutés), d'un des gènes codant pour une des enzymes suivantes : CPT2, VLCAD, et LCHAD. Cependant les déficits modérés de β-oxydation associés à une mutation sur chaque allèle, à l'état homozygote ou hétérozygote, d'un des gènes codant pour une autre enzyme ou protéine impliquée dans le processus de β-oxydation sont également l'objet de la présente invention. De telles enzymes ou protéines incluent notamment : carnitine palmitoyltransférase type 1 (« CPT1 »), carnitine acylcarnitine translocase, d'autres acyl CoA déshydrogénases (acyl-CoA déshydrogénase des acides gras à chaînes courtes « SCAD », moyennes « MCAD », ou longues « LCAD »), protéine trifonctionnelle mitochondriale (regroupant les activités de 2-enoyl-CoA hydratase des acides gras à chaînes longues, de LCHAD, et de 3-oxoacyl-CoA thiolase des acides gras à chaînes longues) 2-enoyl-CoA hydratase des acides gras à chaînes courtes, 3-oxoacyl-CoA thiolase des acides gras à chaînes courtes, Electron-Transfer-Flavoprotéine (« ETF »), Electron-Transfer-Flavoprotéine déshydrogénase (ETFDH, encore appelée ETF:ubiquinone oxydoréductase « ETFQO »).

Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, la maladie impliquant un dysfonctionnement énergétique des mitochondries est caractérisée par un déficit modéré de la chaîne respiratoire des mitochondries. Comme indiqué ci-dessus, ces déficits modérés de la chaîne respiratoire des mitochondries sont des pathologies bien connues de l'homme du métier (Rôtig A, Munnich A. Genetic features of mitochondrial respiratory chain disorders. J Am Soc Nephrol. 2003 Dec;1 (12):2995-3007). Avantageusement, le déficit modéré de la chaîne respiratoire des mitochondries est associé à la présence d'au moins une mutation sur chaque allèle d'un gène, avantageusement nucléaire, codant pour une enzyme ou pour une protéine indispensable au fonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale.

Les déficits génétiques de la chaîne respiratoire des mitochondries peuvent faire intervenir des gènes nucléaires, auquel cas les déficits connus sont également, comme pour les déficits de β-oxydation, de transmission autosomique récessive, c'est-à-dire que les sujets souffrant de tels déficits de la chaîne respiratoire des mitochondries sont porteurs de deux allèles mutés (l'un d'origine maternelle, l'autre d'origine paternelle) d'un gène codant pour une enzyme ou pour une protéine indispensable au fonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale. La mutation peut être identique sur les deux allèles mutés, auquel cas le sujet a un génotype homozygote. Alternativement, la mutation peut être distincte sur les deux allèles mutés, le sujet ayant alors un génotype hétérozygote. Comme pour les déficits de β-oxydation, l'expression « sur chaque allèle » fait alors référence à la présence d'une mutation à la fois sur l'allèle d'origine maternelle et sur l'allèle d'origine paternelle, sous forme homozygote (mutation identique sur les deux allèles mutés) ou hétérozygote (mutation distincte sur les deux allèles mutés).

Les déficits génétiques de la chaîne respiratoire des mitochondries peuvent également faire intervenir des gènes mitochondriaux (i.e. des gènes codés par l'ADN mitochondrial), d'origine uniquement maternelle. Dans ce cas, il n'y a qu'un seul « allèle » au sens de la présente invention, d'origine maternelle, et l'expression « sur chaque allèle » fait alors référence à la présence d'une mutation sur l'allèle d'origine maternelle uniquement. En revanche, le génome mitochondrial transmis par la mère peut être caractérisé par un certain degré d'hétéroplasmie, c'est-à-dire que toutes les copies d'ADN mitochondrial ne sont pas nécessairement porteuses de la mutation. Lorsque le déficit est lié à un gène mitochondrial, il est alors associé à la présence d'au moins une mutation dans un gène mitochondrial codant pour une enzyme ou pour une protéine indispensable au fonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale. La chaine respiratoire des mitochondries fait également intervenir de nombreuses enzymes et protéines, qui sont susceptibles en cas de mutation(s) de conduire à un déficit de la chaîne respiratoire. Cette voie métabolique comporte 5 complexes enzymatiques appelés complexe I (« Cl » ou « nicotamide dinucléotide déshydrogénase- ubiquinone oxydoréductase » ou « NADH-CoQ réductase », plus de 40 sous-unités), complexe II (« Cil » ou « succinate déhydrogénase-ubiquinone oxydoréductase » ou « succinate-CoQ réductase », 4 sous-unités), complexe III (« Clll », ou « ubiquinone- cytochrome c oxydoréductase », 11 sous-unités), complexe IV (« CIV » ou « cytochrome c oxydase », 13 sous-unités), et complexe V (« CV » ou « ATP synthase » ou « ATPase », environ 16 sous-unités).

A l'heure actuelle, en 2013, un certain nombre de sous-unités présentes dans chacun de ces complexes, ainsi qu'un certain nombre d'autres protéines dites d'assemblage ou dites ancillaires indispensables au fonctionnement de ces complexes, ainsi que différentes mutations ciblant ces protéines et responsables d'un déficit de la chaine respiratoire, sont connues de l'homme du métier (voir Vafai et al. 2012, Nature, 491 : 374-383). Cependant, d'autres protéines indispensables au fonctionnement de la chaine respiratoire, et d'autres mutations ciblant ces protéines et entraînant un déficit de chaîne respiratoire, seront vraisemblablement découvertes dans les années à venir. Les gènes les plus fréquemment mutés conduisant à un déficit de la chaine respiratoire sont les gènes de structure ou les gènes d'assemblage du complexe I (Cl), et du complexe IV (CIV). Par conséquent, dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, le sujet traité souffre d'un déficit modéré de la chaine respiratoire associé à la présence d'au moins une mutation sur chaque allèle d'un des gènes codant pour une des sous-unités ou une des protéines indispensables au fonctionnement des complexes I à IV, en particulier au niveau des gènes du Complexe I : NDUFS1 , NDUFS2, NDUFS3, NDUFS4, NDUFS6, NDUFS7, NDUFV1 , NDUFV2, ACAD9, et du Complexe IV : COX10, SURF1.

Cependant des déficits modérés de la chaine respiratoire associés à au moins une mutation sur chaque allèle d'autres gènes codant pour une des sous-unités ou une des protéines indispensables au fonctionnement de la chaine respiratoire sont également l'objet de la présente invention et notamment les gènes suivants :

• Complexe I : NDUFA1 , NDUFA2, NDUFA9, NDUFA10, NDUFA11 , NDUFA12, NUDFB3, NDUFB9, NDUFS8, NDUFAF1 , NDUFAF2, NDUFAF3, NDUFAF4, NDUFAF5, NDUFAF6, FOXRED1 , NUBPL, ND1 , ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5, ND6 ;

· Complexe II : SDHA, SDHB, SDHC, SDHD, SDHAF1 , SDHAF2 ;

• Complexe III : UQ.CRB, UQ.CRQ, BCS1 L, HCCS, TTC19, CYTB ; Complexe IV : COX4I2, COX6B1 , COX15, ETHE1 , FASTKD2, SC01 , SC02, COX14, COA5, COX1 , COX2;

Complexe V : ΑΤΡ5Ε, ATPAF2, ΤΜΕΜ70, ΑΤΡ6, ΑΤΡ8;

Autres : TWINKLE, MTFMT, GFM1 , LRPPRC, MPV17, MRPS16, MRPS22, POLG, POLG2, TRMU, TSFM, TU FM, C12orf65, MTPAP, MRPL3, SARS2, YARS2, HARS2, MARS2, AARS2, RARS2, EARS2, DARS2, TAC01 , MT01 , RMND1 , PNPT1 , PUS1 , ABCB7, RXN, ISCU, NFU1 , BOLA3, GLRX5, DNAJC19, G FER, HSPD1 , SPG7, TIMM8A, AIFM1 , AFG3L2, DGUOK, RRM2B, SLC25A3, ANT1 , SUCLA2, SUCLG1 , TK2, TYMP, ADCK3, AGK, COQ2, COQ6, COQ9, DRP1 , MFN2, OPA1 , PDSS1 , PDSS2, TAZ, SERAC1.

Dans encore un autre mode de réalisation, la maladie impliquant un dysfonctionnement énergétique des mitochondries est choisie parmi les maladies métaboliques et les maladies neurodégénératives.

En effet, une dysfonction énergétique des mitochondries a été mise en évidence dans de nombreuses maladies métaboliques ou neurodégénératives. Concernant les maladies métaboliques, une telle dysfonction énergétique des mitochondries a été mise en évidence notamment dans le cadre du diabète de type 2 et de l'obésité (Andreux et al. Nat Rev Drug Discov. 2013 Jun;12(6):465-83). Concernant les maladies neurodégénératives, une dysfonction énergétique des mitochondries a été mise en évidence au moins dans les pathologies suivantes : la maladie de Parkinson, la maladie d 'Alzheimer, la maladie de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique, l'ataxie de Friedrich, la maladie de Charcot-Marie-Tooth, et le syndrome de Down (Andreux et al. Nat Rev Drug Discov. 2013 Jun;12(6):465-83 ; Chaturvedi et al. Mol Cell Neurosci. 2013 Jul 55:101 -14; Chaturvedi et al. Free Radie Biol Med. 2013 Oct; 63:1 -29; et Papa S, et al. Trends Mol Med. 2013 Jan;19(1 ):61 -9).

De plus, le BZ ou le RSV ont été suggéré comme pouvant avoir un effet bénéfique sur la pathologie et les conditions de vie des patients souffrant de ces maladies (Andreux et al. Nat Rev Drug Discov. 2013 Jun;12(6):465-83 ; Chaturvedi et al. Mol Cell Neurosci. 2013 Jul 55:101 -14; et Chaturvedi et al. Free Radie Biol Med. 2013 Oct; 63:1 -29). Il est donc raisonnable de penser que les effets de synergie entre le BZ et le RSV observés par les inventeurs dans le cadre des déficits modérés de β-oxydation ou de la chaîne respiratoire s'appliqueront également dans le cadre de ces pathologies, et permettront donc une meilleure prise en charge des patients souffrant de ces maladies.

Ainsi, dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la maladie métabolique est choisie parmi le diabète de type 2 et l'obésité. Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, la maladie neurodégénérative est choisie parmi la maladie de Parkinson, la maladie d 'Alzheimer, la maladie de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique, l'ataxie de Friedrich et la maladie de Charcot-Marie-Tooth, et en particulier parmi la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington. De plus, dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la combinaison 1 ) de BZ et 2) de RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement de RSV) est destinée à être utilisée dans le traitement ou la prévention des maladies métaboliques (notamment le diabète de type 2 et l'obésité) et/ou des maladies neurodégénératives (notamment la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Huntington, la sclérose latérale amyotrophique, l'ataxie de Friedrich et la maladie de Charcot-Marie-Tooth, et en particulier parmi la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington), chez des sujets souffrant d'un déficit modéré dans la β- oxydation mitochondriale des acides gras à chaîne longue ou d'un déficit modéré de la chaîne respiratoire des mitochondries, tel que décrits ci-dessus.

Administration

Les administrations du BZ et du RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement du RSV) peuvent être simultanées ou séquentielles, ces termes étant définis ci-dessus.

Que l'administration soit faite de façon simultanée ou séquentielle, le BZ et le RSV, cis- RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement le RSV) peuvent être administrés par toute voie d'administration appropriée, notamment par voie orale. Dans un mode de réalisation préféré, le BZ et le RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement le RSV) sont tous deux administrés par voie orale, puisqu'il s'agit de la voie d'administration préconisée pour chacun de ces deux principes actifs. Bien qu'il n'existe à ce jour aucune formulation combinant le BZ et le RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement le RSV), le développement d'une telle formulation permettrait de simplifier l'administration simultanée de ces 2 principes actifs pour les patients. La prise simultanée, tel que défini ci-dessus, d'un ou plusieurs comprimés de BZ et d'une ou plusieurs gélules de RSV, constitue toutefois également un mode de réalisation préféré, puisque le BZ est aujourd'hui disponible sous forme de comprimés et le RSV sous forme de gélules.

Les effets synergiques mis en évidence par les inventeurs permettent de réduire significativement les doses de BZ et de RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement de RSV) administrées aux patients. Dans l'art antérieur, les doses de BZ administrées aux patients souffrant de déficits modérés dans l'enzyme de β-oxydation CPT2 étaient de 600 mg/jour (voir Bonnefont et al. N Engl J Med, 2009 360;8 ; et Bonnefont et al. Clin Pharmacol Ther, 2010, 88: 101 -108). Lorsqu'administré seul, les doses de RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement de RSV) administrées à des sujets adultes dans l'art antérieur varient généralement d'au moins 150 mg/jour à plus de 1 g/jour.

Dans un mode de réalisation préféré, la dose de BZ administrée en combinaison avec du RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement du RSV) à un sujet adulte est de préférence comprise entre 100 et 400 mg/jour, et notamment entre 100 et 350 mg/jour, entre 100 et 300 mg/jour, entre 100 et 250 mg/jour, entre 100 et 200 mg/jour, entre 100 et 150 mg/jour, entre 150 et 400 mg/jour, entre 150 et 350 mg/jour, entre 150 et 300 mg/jour, entre 150 et 250 mg/jour, entre 150 et 200 mg/jour, entre 200 et 400 mg/jour, entre 200 et 350 mg/jour, entre 200 et 300 mg/jour, entre 200 et 250 mg/jour, entre 250 et 400 mg/jour, entre 250 et 350 mg/jour, entre 250 et 300 mg/jour, entre 300 et 400 mg/jour, entre 300 et 350 mg/jour, ou entre 350 et 400 mg/jour. Les comprimés actuellement disponibles de BZ les moins dosés sont de 200 mg, et la dose de BZ administrée en combinaison avec du RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement du RSV) à un sujet adulte peut donc avantageusement être de 200 ou 400 mg/jour. Néanmoins, si des formulations moins dosées de BZ étaient disponibles, des doses plus faibles pourraient être envisagées.

Dans un mode de réalisation préféré, la dose de RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement de RSV) administrée en combinaison avec du BZ à un sujet adulte est significativement inférieure à 1 g/jour et est de préférence comprise entre 150 et 500 mg/jour, et notamment entre 150 et 450 mg/jour, entre 150 et 400 mg/jour, entre 150 et 350 mg/jour, entre 150 et 300 mg/jour, entre 150 et 250 mg/jour, entre 150 et 200 mg/jour, entre 200 et 500 mg/jour, entre 200 et 450 mg/jour, entre 200 et 400 mg/jour, entre 200 et 350 mg/jour, entre 200 et 300 mg/jour, entre 200 et 250 mg/jour, entre 250 et 500 mg/jour, entre 250 et 450 mg/jour, entre 250 et 400 mg/jour, entre 250 et 350 mg/jour, entre 250 et 300 mg/jour, entre 300 et 500 mg/jour, entre 300 et 450 mg/jour, entre 300 et 400 mg/jour, entre 300 et 350 mg/jour, entre 350 et 500 mg/jour, entre 350 et 450 mg/jour, entre 350 et 400 mg/jour, entre 400 et 500 mg/jour, entre 400 et 450 mg/jour, ou entre 450 et 500 mg/jour. Le RSV est actuellement disponible sous forme de gélules contenant des quantités variables de RSV allant de quelques dizaines de mg (notamment 20 ou 50 mg) à quelques centaines de mg (notamment 200, 250 ou 500 mg), permettant ainsi d'ajuster facilement la dose souhaitée. Le cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges peuvent également se présenter sous formes de gélules similaires à celles existant pour le RSV.

Avantageusement, les doses de BZ et de RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement de RSV) administrées en combinaison à un sujet adulte sont de préférence comprises :

• entre 100 et 400 mg/jour, et notamment entre 100 et 350 mg/jour, entre 100 et 300 mg/jour, entre 100 et 250 mg/jour, entre 100 et 200 mg/jour, entre 100 et 150 mg/jour, entre 150 et 400 mg/jour, entre 150 et 350 mg/jour, entre 150 et

300 mg/jour, entre 150 et 250 mg/jour, entre 150 et 200 mg/jour, entre 200 et 400 mg/jour, entre 200 et 350 mg/jour, entre 200 et 300 mg/jour, entre 200 et 250 mg/jour, entre 250 et 400 mg/jour, entre 250 et 350 mg/jour, entre 250 et 300 mg/jour, entre 300 et 400 mg/jour, entre 300 et 350 mg/jour, ou entre 350 et 400 mg/jour pour le BZ, et • entre 150 et 500 mg/jour, et notamment entre 150 et 450 mg/jour, entre 150 et 400 mg/jour, entre 150 et 350 mg/jour, entre 150 et 300 mg/jour, entre 150 et 250 mg/jour, entre 150 et 200 mg/jour, entre 200 et 500 mg/jour, entre 200 et 450 mg/jour, entre 200 et 400 mg/jour, entre 200 et 350 mg/jour, entre 200 et 300 mg/jour, entre 200 et 250 mg/jour, entre 250 et 500 mg/jour, entre 250 et

450 mg/jour, entre 250 et 400 mg/jour, entre 250 et 350 mg/jour, entre 250 et 300 mg/jour, entre 300 et 500 mg/jour, entre 300 et 450 mg/jour, entre 300 et 400 mg/jour, entre 300 et 350 mg/jour, entre 350 et 500 mg/jour, entre 350 et 450 mg/jour, entre 350 et 400 mg/jour, entre 400 et 500 mg/jour, entre 400 et 450 mg/jour, ou entre 450 et 500 mg/jour pour le RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, piceide ou leurs mélanges (avantageusement le RSV).

Les doses journalières mentionnées ci-dessus peuvent être administrées, notamment lorsque l'administration est faite par voie orale, en une ou plusieurs prises réparties au cours de la journée. De préférence, le nombre de prises quotidiennes n'excède pas trois. Notamment, la dose journalière peut être administrée en 1 , 2, 3, ou 4 prises quotidiennes. Lorsqu'ils sont administrés sous forme de formulation à libération immédiate, le BZ et le RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement le RSV) ont une demi-vie assez courte, ce qui conduit à privilégier plusieurs prises quotidiennes (2, 3 ou 4, en particulier 2 ou 3) afin de maintenir une certaine concentration circulante. Cependant, dans le cas où des formulations à libération prolongée seraient utilisées, une ou deux prises quotidiennes peuvent être suffisantes.

Réalisation d'un test préclinique prédictif avant administration

Un aspect intéressant de la présente invention est qu'il est possible de sélectionner, par un test in vitro préalable, les patients susceptibles de bénéficier du traitement combinant 1 ) le BZ et 2) le RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement le RSV).

En effet, lorsqu'un des processus de production d'ATP par les mitochondries est mis en évidence comme en déficit modéré (tel que défini ci-dessus) chez un patient, alors la capacité du patient à répondre à un traitement combinant 1 ) le BZ et 2) le RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement le RSV) peut être prédite en testant in vitro la capacité de la combinaison (BZ+(RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement RSV))) à améliorer, voire à restaurer, l'activité du processus déficitaire dans les cellules du patient.

Notamment, dans le cas de patients souffrant d'un déficit modéré de β-oxydation ou de la chaîne respiratoire des mitochondries, il est possible de prédire l'efficacité chez ces patients du traitement combinant 1 ) le BZ et 2) le RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement le RSV) sur la base de la comparaison des activités de β-oxydation ou de la chaîne respiratoire des mitochondries dans des cellules du patient en absence et en présence de la combinaison (BZ+(RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement RSV))). Dans ce contexte, les activités de β-oxydation ou de la chaîne respiratoire peuvent être mesurées par les tests décrits ci-dessus pour établir l'existence d'un déficit modéré. Si la présence de la combinaison 1 ) de BZ et 2) de RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement de RSV) permet d'améliorer in vitro la fonction de β-oxydation ou de la chaîne respiratoire dans des cellules du patient, alors le traitement combinant 1 ) le BZ et 2) le RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement le RSV) devrait se révéler efficace dans le traitement et la prévention des symptômes du patient in vivo. Dans le cas contraire (pas d'amélioration significative de la fonction déficitaire in vitro), il est probable que le traitement combinant 1 ) le BZ et 2) le RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement le RSV) sera inefficace chez le patient. Ainsi, dans un mode de réalisation de l'invention, le patient peut être sélectionné parmi ceux pour lesquels la présence combinée 1 ) de BZ et 2) de RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement de RSV) permet d'améliorer l'activité de β-oxydation ou de la chaîne respiratoire dans des cellules du patient in vitro. De préférence, cette amélioration est observée in vitro pour des doses 1 ) de BZ et 2) de RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement de RSV) comprises entre 25 et 35 μΜ (pour le BZ) et entre 20 et 30 μΜ (pour RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement RSV)).

Kit pharmaceutique comprenant du bézafibrate et du resvératrol ou ses dérivés, pour une administration simultanée ou étalée dans le temps

Dans un deuxième aspect, la présente invention concerne également un kit pharmaceutique comprenant 1 ) du bézafibrate et 2) du resvératrol, cis- resvératrol, dihydro- resvératrol, picéide ou leurs mélanges (avantageusement du resvératrol).

Dans le kit pharmaceutique selon l'invention, le BZ et le RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement le RSV) peuvent être présents sous la forme d'une unique formulation pharmaceutique associant les deux principes actifs 1 ) BZ et 2) RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement RSV), ou bien de deux formulations distinctes comprenant chacune l'un des principes actifs (permettant alors une administration simultanée ou séquentielle).

Dans tous les cas, la dose de BZ est choisie de façon à permettre l'administration des doses journalières définies ci-dessus en 1 , 2 ou 3 prises quotidiennes. Ainsi, la dose de BZ comprise dans le kit pharmaceutique selon l'invention est avantageusement comprise entre 33 et 400 mg, et notamment entre 33 et 350 mg, entre 33 et 300 mg, entre 33 et 250 mg, entre 33 et 200 mg, entre 33 et 150 mg, entre 50 et 400 mg, entre 50 et 350 mg, entre 50 et 300 mg, entre 50 et 250 mg, entre 50 et 200 mg, entre 67 et 400 mg, entre 67 et 350 mg, entre 67 et 300 mg, entre 67 et 250 mg, entre 67 et 400 mg, entre 83 et 350 mg, entre 83 et 300 mg, entre 100 et 400 mg, entre 100 et 350 mg, ou entre 1 17 et 400 mg.

De même, la dose de RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement de RSV) est choisie de façon à permettre l'administration des doses journalières définies ci-dessus en 1 , 2 ou 3 prises quotidiennes. Ainsi, la dose de RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement de RSV) comprise dans le kit pharmaceutique selon l'invention est avantageusement comprise entre 50 et 500 mg, et notamment entre 50 et 450 mg, entre 50 et 400 mg, entre 50 et 350 mg, entre 50 et 300 mg, entre 50 et 250 mg, entre 50 et 200 mg, entre 67 et 500 mg, entre 67 et 450 mg, entre 67 et 400 mg, entre 67 et 350 mg, entre 67 et 300 mg, entre 67 et 250 mg, entre 83 et 500 mg, entre 83 et 450 mg, entre 83 et 400 mg, entre 83 et 350 mg, entre 83 et 300 mg, entre 100 et 500 mg, entre 100 et 450 mg, entre 100 et 400 mg, entre 100 et 350 mg, entre 1 17 et 500 mg, entre 1 17 et 450 mg, entre 1 17 et 400 mg, entre 133 et 500 mg, entre 133 et 450 mg, ou entre 150 et 500 mg.

Avantageusement, les doses 1 ) de BZ et 2) de RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement de RSV) présentes dans le kit pharmaceutique selon l'invention sont de préférence comprises :

• entre 33 et 400 mg, et notamment entre 33 et 350 mg, entre 33 et 300 mg, entre 33 et 250 mg, entre 33 et 200 mg, entre 33 et 1 50 mg, entre 50 et 400 mg, entre 50 et 350 mg, entre 50 et 300 mg, entre 50 et 250 mg, entre 50 et 200 mg, entre 67 et 400 mg, entre 67 et 350 mg, entre 67 et 300 mg, entre 67 et 250 mg, entre 67 et 400 mg, entre 83 et 350 mg, entre 83 et 300 mg, entre 100 et 400 mg, entre 100 et 350 mg, ou entre 1 17 et 400 mg pour le BZ, et

• entre 50 et 500 mg, et notamment entre 50 et 450 mg, entre 50 et 400 mg, entre 50 et 350 mg, entre 50 et 300 mg, entre 50 et 250 mg, entre 50 et 200 mg, entre 67 et 500 mg, entre 67 et 450 mg, entre 67 et 400 mg, entre 67 et 350 mg, entre 67 et 300 mg, entre 67 et 250 mg, entre 83 et 500 mg, entre 83 et 450 mg, entre 83 et 400 mg, entre 83 et 350 mg, entre 83 et 300 mg, entre 100 et 500 mg, entre 100 et 450 mg, entre 100 et 400 mg, entre 100 et 350 mg, entre 1 17 et 500 mg, entre 1 17 et 450 mg, entre 1 17 et 400 mg, entre 133 et 500 mg, entre 133 et 450 mg, ou entre 1 50 et 500 mg pour le RSV, cis-RSV, dihydro-RSV, picéide ou leurs mélanges (avantageusement le RSV).

Les exemples qui suivent visent à illustrer la présente invention. EXEMPLES

Exemple 1 : Etude des effets de faibles doses de resvératrol (RSV) (20 ou 30 μΜ) en combinaison avec de faibles doses de bézafibrate (BZ) (25 ou 35 μΜ) dans des fibroblastes de patients souffrant d'un déficit modéré de β-oxydation

L'effet de faibles doses de RSV (20 ou 30 μΜ) en combinaison avec de faibles doses de BZ (25 ou 35 μΜ) dans des fibroblastes affectés par un déficit modéré de β-oxydation a été étudié chez deux patients souffrant d'un déficit modéré en VLCAD et deux patients souffrant d'un déficit modéré en CPT2.

Patients et méthodes Patients

Patients déficitaires en VLCAD :

Patient E3536 : Forme myopathique du déficit ; génotype A304T/G439D ; valeur de β- oxydation mesurée sur fibroblastes en l'absence de traitement : 1 ,69 nanomol/h/mg prot (contre 5,24 chez le témoin) soit -68%.

Patient CHAMa : Forme myopathique du déficit ; génotype V283A/V283A ; valeur de β- oxydation mesurée sur fibroblastes en l'absence de traitement : 2,74 nanomol/h/mg prot (contre 5,24 chez le témoin) soit -48%.

Patients déficitaires en CPT2:

Patient BRAMa : Forme myopathique du déficit ; génotype S1 13L/R124Q valeur de β- oxydation mesurée sur fibroblastes en l'absence de traitement : 3,28 nanomol/h/mg prot (contre 5,24 chez le témoin) soit -37%.

Patient DIAKe : Forme myopathique du déficit ; génotype S1 13L/S38AFsX36; valeur de β-oxydation mesurée sur fibroblastes en l'absence de traitement : 2,86 nanomol/h/mg prot (contre 5,24 chez le témoin) soit 45-%. Traitements réalisés

Les fibroblastes sont cultivés à 37° C en milieu Ham F10 complet, c'est-à-dire additionné de 12% de sérum de veau foetal, de 100U/ml de pénicilline, et de 0,1 mg/ml de streptomycine, à raison de 70000 cellules par ml et par puits dans des boites de culture à 24 puits. 24 h après l'ensemencement, des solutions stock de RSV (0,2M) et de BZ (0,4M) sont préparées dans du DMSO afin de préparer les différents milieux de traitement des cellules. Pour le traitement, le milieu de culture est éliminé et remplacé par 1 ml de milieu Ham F10 complet additionné d'une des molécules d'intérêt à l'une des concentration suivantes, 75μΜ RSV, ou 400 μΜ BZ, ou 20μΜ RSV, ou 30μΜ RSV, ou 25μΜ BZ, ou 35μΜ BZ, ou bien le milieu de culture est éliminé et remplacé par 1 ml de milieu Ham F10 complet additionné d'une combinaison des deux molécules d'intérêt aux concentrations suivantes : (20μΜ RSV+25|iM BZ), ou (30μΜ Ι¾ν+35μΜ BZ). Des puits additionnels reçoivent 1 ml de milieu complet additionné du seul diluant des molécules d 'intérêt (DMSO <0,05%). Chacune de ces conditions de traitement est réalisée en triple (3 puits) pour chaque patient, à chaque expérience. Les boites à 24 puits sont ensuite incubées 48 heures à 37° C. Ainsi, les cellules de chacun des individus étudiés sont donc traitées dans l'ensemble des conditions énumérées, en parallèle, pendant 48 heures, avant la mesure de la β-oxydation du palmitate.

Mesure de la β-oxydation du palmitate.

L'acide gras utilisé est le Palmitate marqué au tritium (Pal ³ H ) en position 9 et 10. Une solution mère, est préparée à l'avance en mélangeant 100μί de Pal ³ H, 1 30μί de palmitate "froid" à 50mM et 1 3ml_ d'une solution de BSA à 25mg/ml_. On obtient ainsi un complexe Pal ³ H/BSA (Bovine Sérum Albumine) assurant une bonne solubilisation du palmitate (concentration finale du palmitate: 500μΜ).

Le test d'oxydation du Palmitate ³ H est mené sur des fibroblastes ensemencés en plaque 24 puits. Le milieu de culture est d'abord éliminé et les puits sont rincés trois fois au PBS. Une solution de travail de Pal ³ H à 125μΜ est préparée, à partir de la solution mère à 500μΜ, dans du PBS avec Ca/Mg, additionné de 1 mM carnitine. 200μί de cette solution de Pal ³ H sont introduits dans chacun des puits et les plaques sont incubées à 37° C pendant 2 heures.

Pendant ce temps, trois fioles de comptage sont préparées pour la mesure de la radioactivité spécifique (RDA, en CPM/nmoles d'acides gras) du milieu de réaction. Ces fioles contiennent 5 mL de liquide de scintillation, 1 ,5 mL d'eau distillée, et 20 μΐ de la solution de Pal ³ H/BSA. Le liquide de scintillation convertit l'énergie radioactive du ³ H en énergie lumineuse, ce qui permet ainsi de mesurer la radioactivité, exprimée en coups par minute (CPM) à l'aide d'un compteur à scintillation liquide.

A la fin des 2 heures d'incubation, on prélève 200μί dans chaque puits que l'on mélange à 200μί d'acide trichloracétique (TCA) à 10%. Cet acide fort assure la précipitation du complexe BSA/AG non métabolisé. Les tubes sont alors centrifugés 10 minutes à 4° C à 3300rpm.

Après la centrifugation, 350μΙ de surnageant sont prélevés et mélangés à 55μΙ de NaOH 6M pour neutraliser le pH. La totalité du volume, soit 450μΙ, est transférée dans une colonne de résine échangeuse d'ions qui retient l'eau tritiée.

Ces colonnes sont ensuite transférées dans des fioles à scintillation. L'eau tritiée est alors éluée par 1 ,7 ml d'eau distillée. 5ml de liquide de scintillation sont additionnés à l'eau tritiée et les fioles sont introduites dans le compteur à scintillation liquide.

Résultats

Pour les deux patients souffrant d'un déficit modéré en VLCAD, les résultats obtenus sont présentés dans les Tableaux 1 et 2 ci-dessous et sur la Figure 1 . Tableau 1. % d'augmentation de l'oxydation des acides gras (OAG) observés pour le patient E3536

^* Théorique = addition des pourcentages obtenus avec chacun des composés utilisé seul

Tableau 2. % d'augmentation de l'oxydation des acides gras (OAG) observés pour le patient CHA Ma

^* Théorique = addition des pourcentages obtenus avec chacun des composés utilisé seul

Les Tableaux 1 et 2 et la Figure 1 montrent une synergie entre les effets du RSV et du BZ, avec un facteur de synergie compris entre 1 ,3 et 2, indiquant que :

l'effet observé de la combinaison RSV+BZ est jusqu'à 2 fois supérieur à l'effet additionné de chacun des composés, la synergie est particulièrement apparente dans l'exemple du BZ, puisque les effets de 25μΜ ou de 35 μΜ BZ seul sont négligeables (<8%) ou très faibles (maximum 20%).

La combinaison (RSV 30μΜ + BZ 35μΜ) montre des effets supérieurs ou égaux à ceux observés avec 75 μΜ RSV seul ou avec 400μΜ BZ seul

des effets plus puissants sont ainsi obtenus avec des doses de ces composés beaucoup plus faibles que s'ils avaient été utilisés seuls.

Pour les deux patients souffrant d'un déficit modéré en CPT2, les résultats obtenus sont présentés dans les Tableaux 3 et 4 ci-dessous et sur la Figure 2.

Tableau 3. % d'augmentation de l'oxydation des acides gras (OAG) observés pour le patient BRA Ma

^* Théorique = addition des pourcentages obtenus avec chacun des composés utilisé seul

Tableau 4. % d'augmentation de l'oxydation des acides gras (OAG) observés pour le patient DIA Ke

^* Théorique = addition des pourcentages obtenus avec chacun des composés utilisé seul

Les Tableaux 3 et 4 et la Figure 2 montrent une synergie entre les effets du RSV et du BZ, avec un facteur de synergie compris entre 1 ,3 et 2, indiquant que :

l'effet observé de la combinaison RSV+BZ est jusqu'à 2,2 fois supérieur à l'effet additionné de chacun des composés,

la synergie est particulièrement apparente dans l'exemple du BZ, puisque les effets de 25μΜ ou de 35 μΜ BZ seul sont négligeables ( 0 à 6%).

La combinaison (RSV 30μΜ + BZ 35μΜ) montre des effets supérieurs à ceux observés avec 75 μΜ RSV seul ou avec 400μΜ BZ seul

des effets plus puissants sont ainsi obtenus avec des doses de ces composés beaucoup plus faibles que s'ils avaient été utilisés seuls.

Les mêmes conclusions quant à l'existence d'un effet synergique entre le BZ et le RSV, permettant de diminuer la dose de BZ à un niveau ne permettant pas d'obtenir un effet significatif lorsque le BZ est utilisé seul, sont donc applicables aussi bien aux patients souffrant d'un déficit modéré en VLCAD qu'en CPT2.

Dans les deux cas, une correction des déficits est obtenue in vitro en utilisant la combinaison 30 μΜ RSV+35 μΜ BZ, ce qui correspond à une réduction de la dose d'un facteur 2,5 pour le RSV (le resvératrol seul ne corrige le déficit qu'à 75μΜ) et d'un facteur 11,4 pour le BZ (le BZ seul ne corrige le déficit qu'à 400μΜ).

Des résultats additionnels concernant un patient souffrant d'un déficit en LCHAD, une troisième enzyme impliquée dans la β-oxydation, sont présentés sur la Figure 3. Les résultats montrent que la combinaison de molécule (RSV + BZ) à faible dose (30μΜ de Ι¾ν+35μΜ de BZ) est aussi efficace que le RSV seul, à dose optimale de 75μΜ (dose pourtant plus de 2 fois plus forte que celle utilisée dans la combinaison), et plus efficace que le BZ seul, à dose optimale de 400μΜ (dose pourtant plus de 10 fois plus forte que celle utilisée dans la combinaison). Conclusions

La combinaison (BZ + RSV) à faibles doses (20μΜ de $ν+25μΜ de BZ, ou 30μΜ de Ι¾ν+35μΜ de BZ) a donc montré son efficacité pour corriger trois types de déficits modérés d'enzymes impliquées dans la β-oxydation, avec une efficacité similaire à celle obtenue avec des doses beaucoup plus fortes de chacun des produits seuls. En effet, le fait de combiner les deux molécules permet de diminuer d'un facteur 2 la dose de RSV, et d'un facteur 10 la dose de BZ nécessaire pour corriger le déficit. Cette performance est rendue possible par l'existence d'effets synergiques inattendus entre le BZ et le RSV.

Ces résultats supportent l'applicabilité générale de l'utilisation combinée de BZ et de RSV pour le traitement ou la prévention des déficits modérés en β-oxydation.

Exemple 2 : Effet de faibles doses de resvératrol (RSV) (30 μΜ) en combinaison avec de faibles doses de bézafibrate (BZ) (35 μΜ) dans des fibroblastes de patients souffrant d'un déficit modéré de la chaîne respiratoire

Les effets de faibles doses de resvératrol (RSV) (30 μΜ) en combinaison avec de faibles doses de bézafibrate (BZ) (35 μΜ) ont également été testés dans des fibroblastes de patients souffrant d'un déficit modéré de la chaîne respiratoire.

Patient et méthodes

Patient

Patient déficitaire en complexe IV :

TUFRu : mutation du gène COX10 (génotype Y270C/P382Q). Valeur de consommation d'oxygène mesurée en l'absence de traitement : 4,0±0,5 OUR/10 ⁶ cellules (contre 7,2± 0,8 OUR/10 ⁶ cellules chez le témoin) soit -44%.

Traitements réalisés

Les fibroblastes sont cultivés à 37° C en milieu RPMI 1640 complet c'est-à-dire additionné de 10% de SVF, 100U/ml de pénicilline et 0.1 mg/ml de streptomycine et 5μg/ml de Plasmocin ^™ (Invivogen) dans des boites de culture T75, jusqu'à obtention d'une confluence d'environ 75%. Le jour du traitement, des solutions stock de RSV (0,2M) et de BZ (0,4M) sont préparées dans du DMSO. Le milieu de culture est éliminé et remplacé par un volume identique de milieu RPMI complet additionné d'une des molécules d'intérêt à l'une des concentrations suivantes, 75μΜ RSV, ou 400μΜ BZ, ou bien le milieu de culture est éliminé et remplacé par un volume identique de milieu RPMI complet additionné d'une combinaison des deux molécules d'intérêt aux concentrations suivantes : (30μΜ RSV+35|iM BZ). Pour chaque individu, une T75 de cellules est également traitée par du milieu RPMI complet additionné du seul diluant des molécules d'intérêt (DMSO <0,05%). Chacune de ces conditions de traitement est réalisée pour chaque patient, à chaque expérience. Les boites sont ensuite incubées 48 heures à 37° C. Ainsi, les cellules de chacun des individus étudiés sont donc traitées dans l'ensemble des conditions énumérées, en parallèle, pendant 48 heures, avant la mesure de la consommation d'oxygène. Mesure de la consommation cellulaire en Oxygène : Oxoplate®

Principe

Les Oxoplates ^® OP96U sont des plaques de 96 puits, contenant en leur fonds un polymère fin auquel sont intégrées deux sondes fluorescentes différentes, une sonde dite « indicatrice » et une sonde dite de « référence ». L'intensité de fluorescence de la sonde indicatrice (Indicatrice) dépend du contenu en oxygène de l'échantillon. L'intensité de fluorescence de la sonde de référence (I référence) est insensible à l'oxygène. Les intensités émises par ces deux sondes sont mesurées par un lecteur de plaque (infinité M200, Tecan) et à chaque point de mesure, un ratio l _R est calculé : Indicatrice / 'référence. La fluorescence de la sonde indicatrice est éteinte ("quenchée") par la présence d'oxygène. Ainsi, plus la quantité d'oxygène est importante dans le milieu, plus l'intensité de fluorescence de la sonde indicatrice est basse. Et donc, la consommation d'oxygène par les cellules va se traduire par une augmentation de la fluorescence de la sonde indicatrice.

Pour chaque expérience, dans le but de calibrer les mesures, deux puits supplémentaires sont inclus: un puits correspondant à 0% oxygène (volume d'eau épuisé en 0 ₂ par un réducteur puissant, la dithionite), un puits correspondant à 100% oxygène (volume d'eau fortement agité). Pour chacun de ces deux puits, la moyenne des ratios l _R obtenus tout le long de la cinétique est déterminée. Ces valeurs appelées k ₀ et k ₁₀ o permettent ensuite d'estimer, dans les puits contenant les suspensions cellulaires, le pourcentage de saturation en oxygène (P0 ₂ ) au cours du temps, en utilisant la formule suivante :

pO _?

100 ( J½ - 1 ) / ( J¾ - 1 )

Les valeurs des taux de consommation en oxygène (OUR, Oxygen Uptake Rate) correspondent alors aux valeurs des pentes maximales des cinétiques de diminutions de P0 ₂ . Méthode

Pour les mesures de consommation d'oxygène, tous les puits sont d'abord ensemencés avec la même quantité de cellules en suspension. Ainsi, après traitement, les différentes cellules en culture sont trypsinées et comptées à l'aide d'un compteur de cellules (CASY TT). Elles sont alors centrifugées et reprises dans un volume variable de RPMI 1640 sans glucose (LifeTechnologies) de façon à obtenir une suspension cellulaire de 18 000 cellules/μΐ pour les témoins, et de 20 000 cellules/μΐ, pour les patients. Des aliquotes de chaque suspension cellulaire (3χ3μΙ) sont prélevés pour le dosage de protéines. Ensuite, 10μΙ de suspension cellulaire sont déposés au fond de chaque puits de la plaque Oxoplates ^® (minimum 3 puits par condition testée), puis un volume de 100μ1 de RPMI 1640 sans glucose contenant du CCCP à 1 .25μΜ est ajouté. Ces suspensions cellulaires sont ensuite recouvertes par 200μΙ d'huile minérale lourde (Sigma), préchauffée à 37° C. L'huile minérale assure « l'étanchéité » de la mesure en empêchant tout échange d'air entre les suspensions cellulaire et l'air ambiant. Les fluorescences émises par les sondes sont lues par le fond des puits, toutes les 30 secondes pendant 1 heure, à l'aide d'un lecteur de plaques infinite ^® M200 (Tecan, logiciel Magellan) préchauffé à 37° C. La longueur d'onde d'excitation (540nm) est la même pour la sonde indicatrice et la sonde de référence, qui vont émettre respectivement à 650nm et 590nm.

Les cinétiques d'intensité de fluorescence ont été analysées à l'aide du logiciel Microsoft Excel.

Résultats

Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure 4.

Celle-ci montre que la combinaison (30μΜ de $ν+35μΜ de BZ) est aussi efficace que le RSV seul, à dose optimale de75μM (dose pourtant plus de 2 fois plus forte que celle utilisée dans la combinaison), et plus efficace que le BZ seul, à dose optimale de 400μΜ (dose pourtant plus de 10 fois plus forte que celle utilisée dans la combinaison).

Conclusions

Ces résultats montrent que la combinaison de molécules (RSV + BZ) est également efficace à faibles doses pour améliorer les capacités respiratoires de fibroblastes d'un patient déficitaire en complexe IV de la chaîne respiratoire, supportant ainsi l'utilisation de cette combinaison à faible dose pour la prévention et le traitement des déficits modérés de la chaîne respiratoire. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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