TITRE : ASSOCIATION DU CARVACROL AVEC L’ACIDE GALLIQUE ET/OU

LA CURCUMINE

Domaine technique de l’invention

La présente invention a pour objet des associations comprenant du carvacrol avec de l’acide gallique et/ou de la curcumine. Cette association est avantageusement utilisée pour inhiber la croissance ou la formation de biofilms de bactéries ou pour éliminer des biofilms matures.

Arrière-plan technique

Dans la nature, les bactéries sont retrouvées très majoritairement sous forme de biofilm (99% des bactéries). Le biofilm est l’un des modes de vie les plus répandus sur Terre et joue un rôle majeur dans de nombreux cycles élémentaires. Il est présent partout où la vie peut exister et est ainsi capable de coloniser tous les types de surfaces qu’elles soient naturelles, comme les systèmes aquatiques et la plupart des organismes comme l’Homme, ou artificielles comme les canalisations d’eau, les tuyauteries industrielles et les dispositifs médicaux. ^(1_4)

Formation des biofilms

Le biofilm est initié par l’adhésion de bactéries planctoniques sur une surface. Cette adhésion devient irréversible et les bactéries commencent à former des micro colonies. Les micro-colonies se développent et s’organisent en clusters tridimensionnels qui permettent le passage des nutriments. Après une phase de croissance exponentielle et grâce à la détection du quorum (« quorum sensing » en anglais qui définit l'aptitude des bactéries à détecter et à réagir à des signaux moléculaires bactériens permettant de coordonner leur comportement collectif), les bactéries produisent une matrice exo-polysaccharidique protectrice (« slime » en anglais) amenant le biofilm à maturation. Enfin, les bactéries pourront se disperser seules ou en amas pour venir contaminer d’autres surfaces. ⁽¹ · ² · ⁵⁾ Composition du biofilm Le biofilm se compose d’une structure de micro-colonies d’une ou plusieurs espèces de bactéries qui adhèrent entre elles et produisent une matrice protectrice. Celle-ci, qui représente près de 85% des composants du biofilm, est composée d’exopolysaccharides, de protéines, de glycolipides, d’ADN extracellulaire et d’autres composés qui dépendront des espèces contenues dans le biofilm. Il existe ainsi de nombreux éléments dans cette structure et plusieurs systèmes de communication qui permettront aux bactéries de former une communauté tout en acquérant de nouvelles propriétés comme la résistance aux antibiotiques. Il est reconnu que les bactéries en biofilms sont jusqu’à 1000 fois plus tolérantes aux antibiotiques que les bactéries planctoniques. En effet, le biofilm limite la diffusion des antibiotiques ou antiseptiques via des interactions avec sa matrice et les polymères qui la composent. La faible croissance des bactéries au sein du biofilm mature les rend peu susceptibles à de nombreux antibiotiques qui ciblent les mécanismes de réplication bactérienne. Le mode de vie en biofilm s’accompagne d’une modulation importante de l’expression des gènes qui augmente la tolérance aux biocides, la capacité de réponse aux stress de l’environnement et la virulence. 2 6

Complications liées aux biofilms Le biofilm s’il n’est pas souhaité et maîtrisé entraîne de multiples complications comme la corrosion des équipements industriels, des navires, l’obstruction de canalisation, la contamination de l’eau, la contamination de produits notamment dans l’agro-alimentaire, ou encore des infections liées à la présence de biofilms sur des dispositifs médicaux implantables ou sur les surfaces d’un organisme, notamment des plaies. Tout cela entraîne des efforts de maintenance d’équipements accrus dans les diverses industries et des coûts additionnels considérables et constitue un problème majeur de santé publique. ^{(1 3} · ⁵ · ⁷⁾

Biofilms de Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus Le biofilm est composé d’une hétérogénéité de micro-organismes qui variera selon l’environnement ⁽² L Parmi eux sont retrouvés les espèces bactériennes telles que Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus. P. aeruginosa, qui est une bactérie Gram négative, est retrouvée dans de nombreux environnements différents tels que le sol, les légumes, l’eau en général. P. aeruginosa peut aussi se développer dans des conditions hostiles telles que dans du savon, du carburant, de la solution antiseptique. Plus globalement, la présence de cette espèce est associée à l’activité humaine ^{(8 10)} . Staphylococcus aureus est une bactérie Gram positive qui est retrouvée dans divers environnements et surtout dans l’industrie agroalimentaire, sur la surface des aliments et des équipements ⁽¹¹ - ¹²⁾ . Ces deux espèces sont aussi à l’origine de multiples infections chez l’Homme et représentent, avec Escherichia coli, les germes les plus retrouvés dans le cas des infections nosocomiales ⁽¹³⁾ . De par l’acquisition de résistance aux antibiotiques, ces bactéries sont classées par l’OMS dans les listes d’agents pathogènes prioritaires de classe critique pour P. aeruginosa et élevée pour S. aureus pour le développement de nouvelles solutions antimicrobiennes ⁽¹⁴⁾ .

Traitement des biofilms

De nombreuses possibilités existent pour pallier à l’installation du biofilm en jouant sur l’hydrophobicité, la rugosité de surface. Des traitements comme la fonctionnalisation des surfaces par des métaux, des polymères, des enzymes permettent de limiter l’adhérence des bactéries et donc la formation de biofilms. Lorsque le biofilm est déjà bien installé, d’autres stratégies doivent être mises en place ⁽³ · ⁵ · ⁷⁾ . L’utilisation d’antibiotiques, d’antiseptiques, de biocides ou encore de désinfectants a longtemps été de mise sans succès. On sait aujourd’hui que le biofilm, de par sa nature, est tolérant voire résistant à ces composés ⁽⁶ - ¹⁵ - ¹⁶⁾ . De nouvelles pistes sont en développement comme l’utilisation de chélateur du fer, de particules métalliques, de bactériophages, d’enzymes ou encore d’extraits de plantes pour lutter contre les biofilms ⁽³ - ⁵⁾ .

Objet du brevet La présente invention a pour objet de proposer une nouvelle solution face à ce problème majeur au travers de différentes associations d’actifs, issus de plantes, comprenant du carvacrol, de l’acide gallique et de la curcumine.

La présente invention concerne les 3 associations : carvacrol avec de l’acide gallique, carvacrol avec de la curcumine et carvacrol avec de l’acide gallique et de la curcumine.

Ces associations peuvent avantageusement être préparées sous forme de solution, de semi-solide, de poudre, de compresse, mèche ou fil.

Description détaillée de l’invention • Définitions

Dans la présente demande, le terme « antimicrobien » fait référence à un composé ou une composition qui tue les micro-organismes ou inhibe ou arrête leur croissance, y compris, mais sans s’y limiter, les bactéries et les levures sous forme planctonique.

Le terme « antibactérien » est un antimicrobien spécifique des bactéries.

Le terme « biomasse bactérienne » désigne la quantité totale de bactéries dans un espace déterminé à un moment déterminé.

Le terme « biofilm » fait référence à des communautés d’une ou plusieurs espèces de micro-organismes, telles que des bactéries, engluées dans une matrice extracellulaire composée majoritairement de polysaccharides et de protéines. Les bactéries dans un biofilm peuvent être jusqu’à 1000 fois plus résistantes aux antibiotiques/antibactériens que leurs homologues planctoniques. Dans le cadre de la présente invention, on entend par biofilm mature un biofilm qui présente une stabilité en termes de biomasse bactérienne, c’est-à-dire dont la biomasse bactérienne le constituant reste sensiblement constante.

Le terme biofilm mono-, double- ou multi-espèces désigne un biofilm dont la formation résulte d’une espèce bactérienne unique, d’un mélange de deux espèces bactériennes ou d’un mélange de plusieurs espèces bactériennes. Le terme « antibiofilm » fait référence à l'inhibition de la formation de biofilms ou à la déstabilisation ou à la dispersion des biofilms préformés ou matures ou à l’élimination des bactéries présentes dans ce biofilm.

Le terme « inhibition » fait référence à une diminution de la croissance bactérienne et/ou de la formation de biofilm.

Le terme « prévention » se réfère à l’évitement de la formation d’un biofilm.

Le terme « traitement » fait référence à une intervention effectuée dans le but d’éliminer un biofilm déjà présent.

Le terme « solvant » se réfère à un liquide qui permet de solubiliser les principes actifs de l’invention.

• Association

La présente invention se rapporte à une association comprenant du carvacrol avec l’acide gallique et/ou la curcumine ; elle concerne ainsi les 3 associations : carvacrol avec acide gallique, carvacrol avec curcumine et carvacrol avec acide gallique et curcumine.

La Demanderesse a observé de manière surprenante une action synergique de l’association du carvacrol et de l’acide gallique, et de l’association du carvacrol et de la curcumine, ainsi que de l’association de ces trois composés (carvacrol, acide gallique et curcumine) sur la diminution de la biomasse bactérienne présente dans les biofilms, mais également sur les biofilms en tant que tels, quel que soit leur degré de maturité et que ces biofilms soient mono- ou multi-espèces. Ces propriétés avantageuses permettent ainsi une destruction accrue des bactéries à la fois sous forme planctonique et sous forme de biofilm lorsque ces actifs sont utilisés en association par rapport à leurs actions isolées.

Le carvacrol (5-isopropyl-2-méthylphénol ou cymophénol) est un isomère du thymol et un monoterpénoïde. Il est retrouvé dans l’origan, le thym, les huiles essentielles dérivées de ces plantes ou encore de la bergamote. Ce composé, via sa structure et sa nature hydrophobe, vient interagir avec la membrane bactérienne et la perméabiliser ; il est notamment connu pour agir sur des bactéries de type Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae et Proteus mirabilis. ⁽¹⁷ - ²¹⁾

L’acide gallique (l’acide 3, 4, 5-trihidroxybenzoïque) est un acide phénolique retrouvé dans les galles, l’écorce de chêne, les feuilles de thé, les tanins ou encore dans le kaki, la goyave et la pomme cannelle. Ce composé est issu de l’acide tannique. Cette molécule présente une action inhibitrice sur de nombreuses espèces bactériennes comme Staphylococcus aureus (aussi bien des souches sensibles que résistantes aux agents antibactériens), Escherichia coli, Staphylococcus epidermis ou encore Pseudomonas aeruginosa. L’acide gallique possède également un grand pouvoir antioxydant. ^{(22 26)}

La curcumine (1 ,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1 ,6-heptadiene-3,5-dione) est un composant phénolique retrouvé dans le curcuma. La curcumine a des propriétés inhibitrices de la croissance de diverses bactéries appartenant aux genres Streptococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, ou des espèces Hélicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli et Enterococcus faecalis. Par ailleurs, la curcumine présente également des propriétés anti-inflammatoires. ^(27_30)

A titre d’exemple, ces actifs sont disponibles dans le commerce sous la dénomination suivante : « 41086 - Acros Organics » pour l’acide gallique, « W224511 - Sigma Aldrich » pour le carvacrol et « 8.20354.0010 - Merck » pour la curcumine.

Ces trois actifs ont chacun une action inhibitrice de la formation de certains biofilms mais ont peu d’effet sur les biofilms matures. ^{(31 33)} Le carvacrol a une faible activité sur des biofilms matures de S. aureus, et n’élimine pas par exemple les biofilms de P. aeruginosa. ⁽³⁴⁾

Les associations objets de la présente invention peuvent être préparées sous différentes formes ou conditionnements, et notamment sous la forme d’une solution, d’un semi-solide, d’une poudre, d’une compresse, d’une mèche et/ou d’un fil pour la prévention et/ou le traitement de biofilm.

Dans l’association selon l’invention, le ratio du carvacrol et de l’acide gallique et celui du carvacrol et de la curcumine est compris entre 0,1 et 10 que l’association comprenne deux ou trois composés.

Avantageusement, le ratio du carvacrol et de l’acide gallique et le ratio du carvacrol et de la curcumine est compris entre 1 ,5 et 10, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Dans une première variante, le ratio du carvacrol et de l’acide gallique est compris entre 0,1 et 5, encore plus préférentielle entre 1 ,5 et 5, et par exemple d’environ 5, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Dans une seconde variante, le ratio du carvacrol et de l’acide gallique est compris entre 5 et 10, encore plus préférentielle entre 6 et 10, et par exemple d’environ 10, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Avantageusement, le ratio du carvacrol et de la curcumine est compris entre 5 et 10, encore plus préférentiellement entre 6 et 10, que l’association comprenne deux ou trois composés. Le ratio du carvacrol et de la curcumine est par exemple d’environ 10, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Ces ratios peuvent être mis en oeuvre quelle que soit la forme du produit comprenant l’association selon l’invention.

Selon un mode de réalisation particulier, l’association selon l’invention comprend en outre un ou plusieurs ingrédients choisis parmi un tampon, un agent stabilisant, un tensioactif, une vitamine, un minéral, tout élément de la matrice extracellulaire, un ajusteur de pH, un antibiotique, un antimicrobien et un autre antibiofilm.

• Différentes formes ou conditionnements possibles de l’association

Solution antibiofilm

La présente invention concerne également une solution antibiofilm comprenant l’une au moins des associations selon l’invention dans un solvant acceptable. Avantageusement, le ratio du carvacrol et de l’acide gallique est compris entre 0,1 et 10, de préférence entre 1 ,5 et 10, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Dans une première variante, le ratio du carvacrol et de l’acide gallique est compris entre 0,1 et 5, encore plus préférentielle entre 1 ,5 et 5, et par exemple d’environ 5, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Dans une seconde variante, le ratio du carvacrol et de l’acide gallique est compris entre 5 et 10, encore plus préférentielle entre 6 et 10, et par exemple d’environ 10, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Avantageusement, le ratio du carvacrol et de la curcumine est compris entre 0,1 et 10, de préférence compris entre 5 et 10, encore plus préférentiellement entre 6 et 10, que l’association comprenne deux ou trois composés. Le ratio est par exemple d’environ 10, que l’association comprenne deux ou trois composés. La solution selon l’invention peut comprendre jusqu’à 50 mg/mL de carvacrol, jusqu’à 10 mg/mL d’acide gallique et/ou jusqu’à 5 mg/mL de curcumine ; en particulier entre 0,1 mg/mL et 50 mg/mL de carvacrol, entre 0,5 mg/mL et 5 mg/mL de curcumine et/ou entre 0,1 mg/mL et 10 mg/mL d’acide gallique.

Une des difficultés que la Demanderesse a résolue est de trouver un solvant commun au carvacrol, à l’acide gallique et la curcumine.

Le solvant acceptable peut être de l’eau avec un agent stabilisant tel qu’une cyclodextrine (en particulier l’hydroxypropyl- -cyclodextrine), de l’éthanol ou un mélange d’éthanol et d’eau, dans lequel l’éthanol est compris entre 7.5% et 100% en volume par rapport au volume total du solvant. De préférence, l’éthanol est compris entre 30% et 100% en volume par rapport au volume total du solvant, dans le mélange d’éthanol et d’eau.

Un agent stabilisant selon l’invention est un composé permettant d’éviter la dégradation, la précipitation et/ou la volatilisation d’un ou plusieurs principes actifs (en particulier le carvacrol). La préparation de la solution selon l’invention peut se faire simplement par mélange des actifs dans le solvant. A titre d’exemple, la solution antibiofilm est chauffée à environ 50 °C pendant une durée de 5 à 20 minutes en présence ou en absence d’agitation.

Tel que démontré ci-dessous (Exemple 1 ), l’association selon l’invention en solution, permet d’obtenir un effet synergique de l’activité antibiofilm.

La solution antibiofilm selon l’invention peut être utilisée en tant que telle pour inhiber la croissance ou la formation de biofilms de bactéries ou pour éliminer des biofilms matures.

La solution antibiofilm selon l’invention peut aussi avantageusement être utilisée pour la fabrication et la fonctionnalisation de matériaux et de produits tels que des semi-solides, de la poudre, des compresses, des mèches ou des fils.

La présente invention concerne également un produit de traitement antibiofilm comprenant l’une au moins des associations selon l’invention.

Préférentiellement, le produit de traitement antibiofilm est choisi parmi un semi- solide, une poudre, une compresse, une mèche ou un fil.

Le produit de traitement selon l’invention peut être utilisé pour inhiber la croissance ou la formation de biofilms de bactéries ou pour éliminer des biofilms matures.

Semi-solide antibiofilm

La présente invention concerne également un semi-solide antibiofilm, pouvant notamment former un pansement hémostatique et/ou cicatrisant, comprenant l’association selon l’invention.

Un semi-solide peut être défini comme une préparation de type gel, crème, pommade, pâte, etc. constituée d’un excipient simple ou composé, dans lequel sont habituellement dissous ou dispersés un ou plusieurs principes actifs. Dans le semi-solide, le ratio du carvacrol et de l’acide gallique peut être compris entre 0,1 et 10, de préférence entre 1 ,5 et 10, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Dans une première variante, le ratio du carvacrol et de l’acide gallique est compris entre 0,1 et 5, encore plus préférentielle entre 1 ,5 et 5, et par exemple d’environ 5, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Dans une seconde variante, le ratio du carvacrol et de l’acide gallique est compris entre 5 et 10, encore plus préférentielle entre 6 et 10, et par exemple d’environ 10, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Avantageusement, dans le semi-solide, le ratio du carvacrol et de la curcumine est compris entre 0,1 et 10, de préférence compris entre 5 et 10, encore plus préférentiellement entre 6 et 10, que l’association comprenne deux ou trois composés. Le ratio du carvacrol et de la curcumine est par exemple d’environ 10, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Le semi-solide peut comprendre jusqu’à 800 mg de carvacrol, jusqu’à 200 mg d’acide gallique et jusqu’à 100 mg de curcumine en poids total dans 1 g de semi- solide ; en particulier, entre 20 mg et 800 mg de carvacrol, entre 5 mg et 200 mg d’acide gallique et/ou entre 2 mg et 100 mg de curcumine, dans 1 g de semi-solide. Avantageusement, le semi-solide peut comprendre entre 44 mg et 790 mg de carvacrol, entre 8 mg et 160 mg d’acide gallique et entre 8 mg et 80 mg de curcumine, dans 1 g de semi-solide.

Avantageusement, le semi-solide comprend une matrice à base de sel d’alginate et l’association selon l’invention.

Tel que défini précédemment ; le sel d’alginate dans le semi-solide peut être choisi parmi l’alginate de calcium, l’alginate de sodium, l’alginate de potassium, l’alginate de lithium, l’alginate de zinc, l’alginate de manganèse ou l’alginate d’ammonium, de préférence d’alginate de calcium. La préparation de semi-solide est bien connue de l’homme du métier ; à titre d’exemple, une méthode de préparation d’un semi-solide antibiofilm consiste en une émulsion à base de sel d’alginate avec une phase hydrophile, telle que de l’eau avec un agent gélifiant et une phase lipophile, telle que de l’huile de soja raffinée, comportant les principes actifs selon l’association de l’invention.

Poudre antibiofilm

La présente invention concerne également une poudre antibiofilm, pouvant notamment former une poudre hémostatique et/ou cicatrisante, comprenant l’association selon l’invention.

Dans la poudre, le ratio du carvacrol et de l’acide gallique peut être compris entre 0,1 et 10, de préférence entre 1 ,5 et 10, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Dans une première variante, le ratio du carvacrol et de l’acide gallique est compris entre 0,1 et 5, encore plus préférentielle entre 1 ,5 et 5, et par exemple d’environ 5, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Dans une seconde variante, le ratio du carvacrol et de l’acide gallique est compris entre 5 et 10, encore plus préférentielle entre 6 et 10, et par exemple d’environ 10, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Avantageusement, dans la poudre, le ratio du carvacrol et de la curcumine est compris entre 0,1 et 10, de préférence compris entre 5 et 10, encore plus préférentiellement entre 6 et 10, que l’association comprenne deux ou trois composés. Le ratio est par exemple d’environ 10, que l’association comprenne deux ou trois composés.

La poudre peut comprendre jusqu’à 800 mg de carvacrol, jusqu’à 200 mg d’acide gallique et jusqu’à 100 mg de curcumine en poids total dans 1 g de poudre ; en particulier entre 20 mg et 800 mg de carvacrol, entre 5 mg et 200 mg d’acide gallique et/ou entre 2 mg et 100 mg de curcumine, en poids dans 1 g de poudre (poids de la poudre seule sans les actifs). Avantageusement, la poudre peut comprendre entre 44 mg et 790 mg de carvacrol, entre 8 mg et 160 mg d’acide gallique et entre 8 mg et 80 mg de curcumine, en poids dans 1 g de poudre.

La poudre peut également se présenter sous forme d’une pluralité de particules de forme granulaire. Les particules ont avantageusement une taille inférieure à 200 miti, de préférence une taille de l’ordre de 75 pm, qui est définie avec tamis ou par mesure de diffraction laser.

Selon un mode de réalisation, la poudre se présente sous forme d’une pluralité de particules de forme cylindrique obtenues à partir de fibres et comprenant l’association selon l’invention.

Les particules sous forme cylindrique peuvent avoir une longueur comprise entre 20 pm et 2 mm et un diamètre compris entre 5 pm et 50 pm.

Les particules constituant la poudre, quelle que soit leur forme, sont préférentiellement composées de sel d’alginate. Par exemple, le sel d’alginate peut être choisi parmi l’alginate de calcium, l’alginate de sodium, l’alginate de potassium, l’alginate de lithium, l’alginate de zinc, l’alginate de manganèse ou l’alginate d’ammonium, de préférence d’alginate de calcium.

De manière générale, le procédé de fabrication de la poudre selon l’invention comprend les étapes suivantes : préparation d’une poudre, immersion de cette poudre dans une solution antibiofilm selon l’invention contenant les principes actifs pour former une fibre, lavage et séchage de la fibre par évaporation du solvant de la solution antibiofilm, hachage de la fibre pour obtenir des particules sous la forme souhaitée (telle que granulaire, cylindrique, etc.) de la poudre selon l’invention. La poudre sous forme d’une pluralité de particules de forme cylindrique selon l’invention peut être préparée comme décrit dans le brevet EP-B1 -2836243 déposé par la Demanderesse.

A titre d’exemple et dans le cas particulier de la poudre composée de particules sous forme cylindrique, les principes actifs peuvent alternativement être ajoutés après hachage des fibres par immersion des particules dans la solution antibiofilm. Ces particules associées aux principes actifs sont à nouveau séchées par évaporation du solvant.

Compresse antibiofilm

La présente invention concerne également une compresse antibiofilm, pouvant notamment former un pansement hémostatique et/ou cicatrisant, la compresse comprenant l’association selon l’invention.

Dans la compresse, le ratio du carvacrol et de l’acide gallique peut être compris entre 0,1 et 10, de préférence entre 1 ,5 et 10, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Dans une première variante, le ratio du carvacrol et de l’acide gallique est compris entre 0,1 et 5, encore plus préférentielle entre 1 ,5 et 5, et par exemple d’environ 5, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Dans une seconde variante, le ratio du carvacrol et de l’acide gallique est compris entre 5 et 10, encore plus préférentielle entre 6 et 10, et par exemple d’environ 10, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Avantageusement, dans la compresse, le ratio du carvacrol et de la curcumine est compris entre 0,1 et 10, de préférence compris entre 5 et 10, encore plus préférentiellement entre 6 et 10, que l’association comprenne deux ou trois composés. Le ratio est par exemple d’environ 10, que l’association comprenne deux ou trois composés.

La compresse peut comprendre jusqu’à 800 mg de carvacrol, jusqu’à 200 mg d’acide gallique et jusqu’à 100 mg de curcumine en poids total dans 1 g de compresse ; en particulier entre 20 mg et 800 mg de carvacrol, entre 5 mg et 200 mg d’acide gallique et/ou entre 2 mg et 100 mg de curcumine, dans 1g de compresse.

Avantageusement, la compresse peut comprendre entre 44 mg et 790 mg de carvacrol, entre 8 mg et 160 mg d’acide gallique et entre 8 mg et 80 mg de curcumine, dans 1 g de compresse.

La teneur en principes actifs dans la compresse peut également être exprimée en densité surfacique (mg/cm ² de compresse).

Ainsi, la compresse peut comprendre jusqu’à 1500 mg de carvacrol, jusqu’à 300 mg d’acide gallique et/ou jusqu’à 200 mg de curcumine, dans 100 cm ² de compresse.

Préférentiellement, la compresse peut comprendre entre 50 mg et 1500 mg de carvacrol, entre 10 mg et 300 mg d’acide gallique et/ou entre 5 mg et 200 mg de curcumine, pour 100 cm ² de compresse.

Avantageusement, la compresse peut comprendre entre 66 mg et 1190 mg de carvacrol, entre 26 mg et 240 mg d’acide gallique et entre 13 mg et 120 mg de curcumine, pour 100 cm ² de compresse.

Le pansement, par exemple utilisé couramment dans le traitement des plaies, peut être choisi parmi les hydrofibres, les alginates, les hydrocellulaires, les hydrocolloïdes, les hydrogels, des pansements vaselinés, des pansements au charbon actif, des pansements à l’argent et des pansements à base d’acide hyaluronique.

Avantageusement, la compresse comprend une matrice à base de sel d’alginate et l’association selon l’invention.

Tel que défini précédemment, le sel d’alginate dans la compresse peut être choisi parmi l’alginate de calcium, l’alginate de sodium, l’alginate de potassium, l’alginate de lithium, l’alginate de zinc, l’alginate de manganèse ou l’alginate d’ammonium, de préférence l’alginate de calcium. A titre d’exemple, une méthode de préparation de compresse antibiofilm consiste en une imprégnation d’une laize avec une solution comportant les principes actifs selon l’association de l’invention.

Tel que démontré ci-dessous (Exemple 2), l’association selon l’invention en compresse, permet également d’obtenir un effet synergique de l’activité antibiofilm.

Mèche antibiofilm

La présente invention concerne également une mèche antibiofilm, notamment hémostatique et/ou cicatrisante, comprenant l’association selon l’invention.

Une mèche peut être définie comme étant un pansement sous forme d’une bande ou de toron.

Dans la mèche, le ratio du carvacrol et de l’acide gallique peut être compris entre 0,1 et 10, de préférence entre 1 ,5 et 10, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Dans une première variante, le ratio du carvacrol et de l’acide gallique est compris entre 0,1 et 5, encore plus préférentielle entre 1 ,5 et 5, et par exemple d’environ 5, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Dans une seconde variante, le ratio du carvacrol et de l’acide gallique est compris entre 5 et 10, encore plus préférentielle entre 6 et 10, et par exemple d’environ 10, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Avantageusement, dans la mèche, le ratio du carvacrol et de la curcumine est compris entre 0,1 et 10, de préférence compris entre 5 et 10, encore plus préférentiellement entre 6 et 10, que l’association comprenne deux ou trois composés. Le ratio est par exemple d’environ 10, que l’association comprenne deux ou trois composés

La mèche peut comprendre jusqu’à 800 mg de carvacrol, jusqu’à 200 mg d’acide gallique et jusqu’à 100 mg de curcumine en poids total dans 1 g de mèche ; en particulier entre 20 mg et 800 mg de carvacrol, entre 5 mg et 200 mg d’acide gallique et/ou entre 2 mg et 100 mg de curcumine, dans 1 g de mèche. Avantageusement, la mèche peut comprendre entre 44 mg et 790 mg de carvacrol, entre 8 mg et 160 mg d’acide gallique et entre 8 mg et 80 mg de curcumine, dans 1 g de mèche.

Avantageusement, la mèche comprend une matrice à base de sel d’alginate et l’association selon l’invention.

Tel que défini précédemment ; le sel d’alginate dans la mèche peut être choisi parmi l’alginate de calcium, l’alginate de sodium, l’alginate de potassium, l’alginate de lithium, l’alginate de zinc, l’alginate de manganèse ou l’alginate d’ammonium, de préférence d’alginate de calcium.

A titre d’exemple, une méthode de préparation de la mèche antibiofilm consiste en une imprégnation d’une mèche avec une solution comportant les principes actifs selon l’association de l’invention.

Fil antibiofilm

La présente invention concerne également un fil antibiofilm comprenant l’association selon l’invention.

Un fil peut être défini comme étant un brin long et fin composé d’un ou de plusieurs filaments.

Le fil selon l’invention peut être utilisé pour des renforts, des sutures de plaies ou comme tricot.

Dans le fil, le ratio du carvacrol et de l’acide gallique peut être compris entre 0,1 et 10, de préférence entre 1 ,5 et 10, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Dans une première variante, le ratio du carvacrol et de l’acide gallique est compris entre 0,1 et 5, encore plus préférentielle entre 1 ,5 et 5, et par exemple d’environ 5, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Dans une seconde variante, le ratio du carvacrol et de l’acide gallique est compris entre 5 et 10, encore plus préférentielle entre 6 et 10, et par exemple d’environ 10, que l’association comprenne deux ou trois composés. Avantageusement, dans le fil, le ratio du carvacrol et de la curcumine est compris entre 0,1 et 10, de préférence compris entre 5 et 10, encore plus préférentiellement entre 6 et 10, que l’association comprenne deux ou trois composés. Le ratio est par exemple d’environ 10, que l’association comprenne deux ou trois composés.

Le fil peut comprendre jusqu’à 800 mg de carvacrol, jusqu’à 200 mg d’acide gallique et jusqu’à 100 mg de curcumine en poids total dans 1 g de fil ; en particulier, entre 20 mg et 800 mg de carvacrol, entre 5 mg et 200 mg d’acide gallique et/ou entre 2 mg et 100 mg de curcumine, dans 1 g de fil. Avantageusement, le fil peut comprendre entre 44 mg et 790 mg de carvacrol, entre 8 mg et 160 mg d’acide gallique et entre 8 mg et 80 mg de curcumine, dans 1 g de fil.

Avantageusement, le fil comprend une matrice à base de sel d’alginate et l’association selon l’invention.

Tel que défini précédemment ; le sel d’alginate dans le fil peut être choisi parmi l’alginate de calcium, l’alginate de sodium, l’alginate de potassium, l’alginate de lithium, l’alginate de zinc, l’alginate de manganèse ou l’alginate d’ammonium, de préférence d’alginate de calcium.

A titre d’exemple, une méthode de préparation du fil antibiofilm consiste en une imprégnation du fil par passage dans une solution comportant les principes actifs selon l’association de l’invention.

La présente invention se rapporte encore à l’association, la solution, le semi-solide, la poudre, la compresse, la mèche et/ou le fil, pour leur utilisation pour la prévention de la formation, l’inhibition du développement, l’élimination et/ou le traitement de biofilms notamment dans les équipements industriels, les canalisations, en agroalimentaire, dans les dispositifs médicaux ou encore dans tout organisme mammifère. Les bactéries du biofilm peuvent être, sans caractère limitatif, des bactéries Gram négatif (par exemple, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli et/ou Acinetobacter baumannii) et/ou des bactéries Gram positif (par exemple, Staphylococcus aureus et/ou des bactéries du genre Propionibacterium).

La présente invention concerne également une association comprenant du carvacrol avec l’acide gallique et/ou la curcumine ou la solution, le semi-solide, la poudre, la compresse, la mèche et le fil comprenant ladite association, pour utilisation pour prévenir et/ou traiter des désordres provoqués par ou associés à des biofilms, de préférence dans un organisme mammifère.

Avantageusement, les biofilms comprennent des bactéries qui sont des bactéries Gram négatif et/ou des bactéries Gram positif.

A titre d’exemple, les désordres provoqués par ou associés à des biofilms peuvent être :

- la mucoviscidose,

- les infections urinaires récidivantes,

- les infections associées aux plaies chroniques,

- les pathologies buccodentaires et oto-rhino-laryngologie (ORL) ; par exemple les infections buccodentaires (carie ou stomatite).

En particulier, l’utilisation pourra être destinée à prévenir et/ou traiter l’infection des plaies et/ou favoriser leur cicatrisation.

Par mammifère, on entend de préférence, les hommes et les animaux d’élevage ou domestiques.

L’utilisation selon l’invention présente un intérêt marqué dans le domaine vétérinaire en ce qu’elle évite l’utilisation d’antibiotiques et les phénomènes de résistance qui peuvent en résulter.

La présente invention se rapporte aussi à l’utilisation d’une association comprenant du carvacrol avec l’acide gallique et/ou la curcumine ou d’une solution comprenant ladite association comme agent antibiofilm, de préférence pour éviter la formation et/ou limiter le développement et/ou éliminer les biofilms dans les équipements industriels, les canalisations, en agroalimentaire, dans les dispositifs médicaux. Avantageusement, les biofilms comprennent des bactéries qui sont des bactéries Gram négatif et/ou des bactéries Gram positif.

Brève description des figures

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront au cours de la lecture de la description détaillée qui va suivre pour la compréhension de laquelle on se reportera aux figures annexées dans lesquelles :

[Fig.1] La figure 1 représente un histogramme illustrant l’activité synergique de l’association du carvacrol et de l’acide gallique en solution sur des biofilms mono espèce ;

[Fig.2] La figure 2 représente un histogramme illustrant l’activité antibiofilm de l’association du carvacrol et de l’acide gallique en solution sur un biofilm mono espèce de P. aeruginosa ;

[Fig.3] La figure 3 représente un histogramme illustrant l’activité antibiofilm de l’association du carvacrol et de la curcumine en solution sur un biofilm mono espèce de S. aureus ;

[Fig.4] La figure 4 représente un histogramme illustrant l’activité antibiofilm de l’association du carvacrol et de l’acide gallique en solution sur des biofilms bi- espèces ;

[Fig.5] La figure 5 représente un histogramme illustrant l’activité synergique de l’association du carvacrol et de l’acide gallique dans une compresse sur des biofilms mono-espèce ;

[Fig.6] La figure 6 représente un histogramme illustrant l’activité antibiofilm de l’association du carvacrol et de la curcumine dans une compresse sur des biofilms mono-espèce ;

[Fig.7] La figure 7 représente un histogramme illustrant l’activité antibiofilm de l’association du carvacrol avec de l’hydroxypropyl- -cyclodextrine et de l’acide gallique dans une compresse sur un biofilm mono-espèce de S. aureus. Exemples de l’invention

Exemple 1 - Effet antibiofilm synergique de l’association sous forme de solution

L’activité antibiofilm des actifs (carvacrol référencé K, acide gallique référencé G, curcumine référencée Q), seuls ou en mélange, a été testée sur des biofilms matures préparés avec des souches isolées (biofilm mono-espèces) ou avec un mélange de deux souches (biofilm bi-espèces) ; les espèces utilisées sont Staphylococcus aureus (également référencée par S. aureus) et Pseudomonas aeruginosa (également référencée par P. aeruginosa).

Exemple 1.1 : Test de l’association carvacrol + acide gallique sur des biofilms mono-espèces Protocole

Différentes solutions d’actifs sont préparées en solubilisant respectivement une masse de 1 ,22.10 ² g de carvacrol et/ou de 2,50 g d’acide gallique dans un volume de 250 mL d’un mélange d’éthanol à 75% et d’eau à 25% ou d’eau uniquement pour l’acide gallique. Pour la solution de carvacrol une agitation manuelle suffit à obtenir la solution finale. En présence d’acide gallique il est nécessaire d’ajouter une étape de chauffe à 50 °C et sous agitation de 5 min. Il est ainsi obtenu des solutions de carvacrol et/ou d’acide gallique respectivement à 50 mg/mL et/ou 10 mg/mL.

Des solutions d’actifs sont ensuite diluées au 10 ^ème , de façon à ne pas altérer/biaiser l’effet des actifs sur les biofilms dans un solvant fortement concentré.

Préparation des différents biofilms mono-' à tester avec les solutions

1 mL d’une suspension bactérienne calibrée à 10 ⁶ UFC/mL faite dans du milieu TS

(Tryptycase Soja) ou LB (Lysogénie Broth) respectivement à partir d’une préculture de S. aureus ou de P. aeruginosa est déposé dans des puits de plaques 24 puits contenant une lamelle de verre de diamètre 12mm. Les plaques sont laissées 24h à 37°C afin d’obtenir des biofilms mono-espèces matures. Le biofilm peut alors être mis en contact d’une ou plusieurs solutions selon l’invention et de solutions témoins (solvant sans actif) durant 24h à 37°C. Selon le volume de cette solution, la concentration des principes actifs au contact du biofilm variera. Les concentrations de solution antibiofilm testées sont annotées sur la figure 1 .

Ainsi, en référence à la figure 1 , une quantité de 100 pL de solution contenant du carvacrol est ajoutée dans un puits contenant un biofilm et 900 pL de milieu TS ou LB ; une quantité de 205 pL de solution contenant de l’acide gallique sont ajoutées dans un puits contenant un biofilm et 795 pL de milieu TS ou LB ; 205 pL de solution d’acide gallique et 100 pL de solution de carvacrol sont ajoutées dans un puit contenant un biofilm et 695 pL de milieu TS ou LB.

Un dénombrement bactérien est ensuite réalisé : après trois rinçages des biofilms avec une solution de chlorure de sodium (NaCI) à 9 g/L, les biofilms subissent deux sonications de 10 minutes en présence de 500 pL de NaCI à 9g/L les deux fois. Cette solution est récupérée dans des Eppendorfs. À partir de ceux-ci, 7 dilutions en cascade à raison de 10 sont faites pour obtenir des solutions diluées de 10° à 10 ⁷ . Des étalements sur géloses PCA (Plat Count Agar) de 100 pL de chacune des dilutions sont réalisés. Les géloses sont incubées 24h à 37°C. Après ce temps, elles sont prises en photos et les colonies présentes à leur surface sont dénombrées à l’aide du logiciel Fiji. Chaque condition testée est réalisée en triplicat et par conséquent, la moyenne, l’écart-type et le coefficient de variation de la biomasse bactérienne sont déterminés. La biomasse bactérienne est exprimée en nombres de bactéries/cm ² . Résultats : effet sur les biofilms mono-espèce

L’activité antibiofilm de chacun des principes actifs seul (carvacrol ou acide gallique) ou en combinaison (carvacrol et acide gallique) en solution est testée sur les biofilms mono-espèce. Ceci permet de contrôler la réduction de la biomasse bactérienne des biofilms mono-espèce obtenue pour chaque principe actif et pour la combinaison d’actifs. La figure 1 illustre les activités antibiofilm du carvacrol seul en solution, de l’acide gallique seul en solution et de l’association du carvacrol et de l’acide gallique combinés en solution dans un solvant éthanol.

Sur la figure 1 , le carvacrol a pour effet de réduire la biomasse bactérienne de S. aureus et de P. aeruginosa. En effet, la biomasse bactérienne de S. aureus est diminuée de -6,2 log (par rapport au biofilm sans traitement) en présence de 0,5 mg/mL de carvacrol. L’effet observé est moindre sur P. aeruginosa avec une diminution de la biomasse bactérienne de -1 ,5 log en présence de 0,5 mg/mL de carvacrol.

Ainsi, le carvacrol présente une activité antibiofilm plus importante sur S. aureus que sur P. aeruginosa.

Toujours sur la figure 1 , l’acide gallique n’a pas pour effet de réduire la biomasse bactérienne de S. aureus et de P. aeruginosa. En effet, une quantité d’acide gallique de 2 mg/mL, ne réduit pas la biomasse bactérienne de S. aureus et de P. aeruginosa. Ainsi, l’acide gallique seul ne présente pas d’activité antibiofilm sur S. aureus et sur P. aeruginosa.

L’activité antibiofilm de l’association carvacrol et acide gallique, est aussi testée sur les biofilms mono-espèce.

De manière remarquable, lorsque l’activité antibiofilm de l’association carvacrol et acide gallique est testée sur les biofilms mono-espèce, un effet synergique du carvacrol et de l’acide gallique est observé sur la réduction de la biomasse bactérienne de S. aureus et de P. aeruginosa (figure 1 ).

La combinaison de carvacrol à 0,5 mg/mL et d’acide gallique à 2 mg/mL élimine totalement le biofilm à S. aureus (une réduction de la biomasse bactérienne de - 8,2 log) et diminuent fortement le biofilm à P. aeruginosa (une réduction de la biomasse bactérienne d’environ -6,3 log). Ainsi, ces résultats montrent que l’association carvacrol et acide gallique a un effet antibiofilm synergique sur S. aureus et P. aeruginosa. Synthèse de l’effet antibiofilm de l’association carvacrol K et acide gallique G en solution sur des biofilms matures mono-espèce (figure 1)

Les résultats démontrent avec l’association K+G (ratio 0,25), une réduction de la biomasse de 8,2 log sur des biofilms de S. aureus et de 6,3 log sur des biofilms de P. aeruginosa.

Cet effet antibiofilm de l’association K+G en solution est plus fort que l’effet antibiofilm observé avec K et G utilisés seuls, démontrant une activité antibiofilm synergique de l’association.

L’effet antibiofilm (en italique) et l’effet synergique (souligné) des résultats de la figure 1 sont résumés sur le tableau suivant (Table 1).

[Table 1]

Exemple 1.2 : Test de l’association carvacrol + acide gallique sur un des biofilms mono-espèces

L’essai a été reproduit sur des biofilms mono-espèce de P. aeruginosa en utilisant cette fois une solution d’acide gallique à une concentration de 3,33 mg/mL, une solution de carvacrol à une concentration de 5 mg/mL et une solution d’acide gallique et de carvacrol à une concentration de 3,33 mg/mL et 5 mg/mL respectivement.

Ainsi, en référence à la figure 2, une quantité de 100 pL de solution contenant du carvacrol est ajoutée dans un puits contenant un biofilm et 900 pL de milieu LB; une quantité de 100 pL de solution contenant de l’acide gallique est ajoutée dans un puits contenant un biofilm et 900 pL de milieu LB; une quantité de 100 pL de solution d’acide gallique et de carvacrol est ajoutée dans un puits contenant un biofilm et 900 pL de milieu LB. Résultats

La figure 2 illustre les activités antibiofilm du carvacrol seul en solution, de l’acide gallique seul en solution et de l’association du carvacrol et de l’acide gallique combinés en solution.

Sur la figure 2, le carvacrol seul a pour effet de réduire la biomasse bactérienne de P. aeruginosa. En effet, la biomasse bactérienne de P. aeruginosa est diminuée de -3,2 log (par rapport au biofilm sans traitement) en présence de 0,50 mg/mL de carvacrol.

Ainsi, le carvacrol seul présente une activité antibiofilm sur P. aeruginosa. Toujours sur la figure 2, l’acide gallique (notamment à faible quantité par rapport à la figure 1 ) n’a pas pour effet de réduire la biomasse bactérienne de P. aeruginosa. En effet, la biomasse bactérienne de P. aeruginosa est diminuée très faiblement (par rapport au biofilm sans traitement) en présence de 0,33 mg/mL d’acide gallique. Ainsi, l’acide gallique seul ne présente pas d’activité antibiofilm sur P. aeruginosa.

L’activité antibiofilm de l’association carvacrol et acide gallique (à faible quantité), est aussi testée sur les biofilms mono-espèce.

De manière remarquable, un effet synergique du carvacrol et de l’acide gallique est observé sur la réduction de la biomasse bactérienne de P. aeruginosa (figure 2). La combinaison de carvacrol à 0,50 mg/mL et de l’acide gallique à 0,33 mg/mL a pour effet de réduire la biomasse bactérienne de P. aeruginosa (une réduction de la biomasse bactérienne de -4,7 log). Ainsi, ces résultats montrent que l’association carvacrol et acide gallique a un effet antibiofilm synergique sur P. aeruginosa. Synthèse de l’effet antibiofilm de l’association carvacrol K et acide gallique G (à faible quantité) en solution sur des biofilms matures mono-espèce (figure 2) Les résultats démontrent avec l’association K+G (ratio 1 ,5), une réduction de la biomasse de 4,7 log sur des biofilms de P. aeruginosa.

Cet effet antibiofilm de l’association K+G en solution est plus fort que l’effet antibiofilm observé avec K et G utilisés seuls, démontrant une activité antibiofilm synergique de l’association. L’effet antibiofilm (en italique) et l’effet synergique (souligné) des résultats de la figure 2 sont résumés sur le tableau suivant (Table 2). [Table 2] Les résultats de la figure 2 sont repris dans le tableau suivant (Table 3) pour démontrer l’effet synergique de l’association K+G.

[Table 3]

L’effet antimicrobien est calculé en divisant la biomasse bactérienne mesurée pour le ou les composants en solution par rapport à la biomasse bactérienne mesurée pour le solvant.

L’effet synergique de la combinaison de deux composants est évalué selon la méthode d’indépendance de Bliss ⁽³⁵⁾ avec la formule : Ec = Ea + Eb - Ea x Eb avec Ec : activité produite par la combinaison des composants A et B ; avec Ea : activité du composant A à une dose a ; avec Eb : activité du composant B à une dose b. Cette formule d’indépendance de Bliss est appliquée aux résultats obtenus pour l’association carvacrol et acide gallique sur la souche P. aeruqinosa :

Ec = (16,585366) + (99,673171 ) - [(16,585366) x (99,673171 )] = 99,727377 avec Ec activité minimale nécessaire de la combinaison carvacrol et acide gallique pour produire un effet synergique ; avec Ea réduction biomasse obtenue pour le carvacrol à 0,50 mg/mL ; avec Eb réduction biomasse obtenue pour la curcumine à 0,33 mg/mL.

Les résultats obtenus sur la figure 2 pour la combinaison carvacrol et acide gallique montrent un effet antimicrobien de 99,990098% sur le biofilm, supérieur à la valeur seuil Ec (99,727377), ceci confirme donc un effet synergique.

Exemple 1.3 : Test de l’association carvacrol + curcumine sur un des biofilms mono-espèces Protocole

L’essai a été conduit sur des biofilms mono-espèce de S. aureus en utilisant cette fois une solution de curcumine à une concentration de 5 mg/mL, une solution de carvacrol à une concentration de 0,73 mg/mL et une solution de curcumine et de carvacrol à une concentration de 5 mg/mL et 0,73 mg/mL respectivement.

Ainsi, en référence à la figure 3, une quantité de 175 pL de solution contenant de la curcumine est ajoutée dans un puits contenant un biofilm et 825 pL de milieu TS; une quantité de 175 pL de solution contenant du carvacrol est ajoutée dans un puits contenant un biofilm et 825 pL de milieu TS; une quantité de 175 pL de solution de curcumine et de carvacrol est ajoutée dans un puits contenant un biofilm et 825 pL de milieu TS. Résultats

L’activité antibiofilm de chacun des principes actifs seul (carvacrol ou curcumine) ou en combinaison (carvacrol et curcumine) en solution est testée sur les biofilms mono-espèce. Ceci permet de contrôler la réduction de la biomasse bactérienne des biofilms mono-espèce obtenue pour chaque principe actif et pour la combinaison d’actifs.

La figure 3 illustre les activités antibiofilm du carvacrol seul en solution, de la curcumine seule en solution et de l’association du carvacrol et de la curcumine combinés en solution.

Sur la figure 3, le carvacrol seul (notamment à faible quantité) a pour effet de réduire la biomasse bactérienne de S. aureus. En effet, la biomasse bactérienne de S. aureus est diminuée par rapport au biofilm sans traitement (activité biomasse de - 4,6 log) en présence de 0,13 mg/mL de carvacrol.

Ainsi, le carvacrol seul présente également une activité antibiofilm sur S. aureus, en particulier à très faible quantité.

Toujours sur la figure 3, la curcumine (également à faible quantité) a pour effet de réduire faiblement la biomasse bactérienne de S. aureus. En effet, la biomasse bactérienne de S. aureus est diminuée de -2,5 log (par rapport au biofilm sans traitement) en présence de 0,88 mg/mL de curcumine. Ainsi, la curcumine seule présente une faible activité antibiofilm sur S. aureus.

L’activité antibiofilm de l’association carvacrol et curcumine, est aussi testée sur le biofilm mono-espèce de S. aureus.

De manière remarquable, lorsque l’activité antibiofilm de l’association carvacrol et curcumine est testée sur le biofilm mono-espèce de S. aureus, un effet synergique du carvacrol et de la curcumine est observé sur la réduction de la biomasse bactérienne de S. aureus (figure 3).

La combinaison de carvacrol à 0, 13 mg/mL et de la curcumine à 0,88 mg/mL a pour effet de réduire la biomasse bactérienne de S. aureus (une réduction de la biomasse bactérienne de -6,0 log). Ainsi, ces résultats montrent que l’association carvacrol et curcumine a un effet antibiofilm synergique sur S. aureus. Synthèse de l’effet antibiofilm de l’association carvacrol K et curcumine Q en solution sur un des biofilms matures mono-espèce (figure 3)

Les résultats démontrent avec l’association K+Q (ratio 0,17), une réduction de la biomasse de 6,0 log sur des biofilms de S. aureus. Cet effet antibiofilm de l’association K+Q en solution est plus fort que l’effet antibiofilm observé avec K et Q utilisés seuls, démontrant une activité antibiofilm synergique de l’association.

L’effet antibiofilm (en italique) et l’effet synergique (souligné) des résultats de la figure 3 sont résumés sur le tableau suivant (Table 4).

[Table 4]

Les résultats de la figure 3 sont repris dans le tableau suivant (Table 5) pour démontrer l’effet synergique de l’association K+Q.

[Table 5]

Formule d’indépendance de Bliss appliquée aux résultats obtenus pour l’association carvacrol et curcumine sur la souche S. aureus :

Ec = (99,965098) + (95,664460) - [(99,965098) x (95,664460)] = 99,998487 avec Ec activité minimale nécessaire de la combinaison carvacrol et curcumine pour produire un effet synergique ; avec Ea réduction biomasse obtenue pour le carvacrol à 0,13 mg/mL ; avec Eb réduction biomasse obtenue pour la curcumine à 0,88 mg/mL. Les résultats obtenus sur la figure 3 pour la combinaison carvacrol et curcumine montrent un effet antimicrobien de 99,998610% sur le biofilm, supérieur à la valeur seuil Ec (99,998487), ceci confirme donc un effet synergique.

Exemple 1.4 Test de l’association carvacrol + acide gallique sur des biofilms bi-espèces Protocole

Différentes solutions d’actifs sont préparées en solubilisant respectivement une masse de 1 ,22.10 ^-2 g de carvacrol et/ou de 2,50 g d’acide gallique dans un volume de 250 mL d’un mélange d’éthanol à 75% et d’eau à 25% ou d’eau uniquement pour l’acide gallique. Pour la solution de carvacrol une agitation manuelle suffit à obtenir la solution finale. En présence d’acide gallique il est nécessaire d’ajouter une étape de chauffe à 50 °C et sous agitation de 5 min. Il est ainsi obtenu des solutions de carvacrol et/ou d’acide gallique respectivement à 50 mg/mL et/ou 10 mg/mL.

Des solutions d’actifs sont ensuite diluées au 10 ^ème , de façon à ne pas altérer/biaiser l’effet des actifs sur les biofilms dans un solvant fortement concentré.

Une suspension bactérienne contenant 10 ⁶ UFC/mL de S. aureus et 10 ⁶ UFC/mL de P. aeruginosa est préparée dans du milieu TS à partir de précultures de ces deux souches. 1 mL de cette suspension bactérienne mixte est déposée dans des puits de plaques 24 puits contenant une lamelle de verre de diamètre 12mm. Les plaques sont laissées 24h à 37°C afin d’obtenir des biofilms bi-espèces matures. Le biofilm est mis en contact d’une ou plusieurs solutions d’actifs durant 24h à 37°C. Selon le volume de solutions d’actifs, la concentration en actifs au contact du biofilm variera. Les différentes concentrations testées sont annotées sur la figure 4.

Ainsi, en référence à la figure 4, 205 pL ou 500 pL de solution d’acide gallique et 100 pL de solution de carvacrol sont ajoutées dans un puit contenant un biofilm et respectivement 695 pL ou 400 pL de milieu TS. Un dénombrement tel que décrit ci-dessus dans le protocole du biofilm mono espèce est réalisé (lavages, dilutions et étalement sur gélose) à l’exception que pour chaque dilution, un étalement est fait sur gélose mannitol et sur gélose cétrimide pour dénombrer respectivement de manière spécifique la biomasse bactérienne de S. aureus et de P. aeruginosa. Résultat : effet sur les biofilms bi-espèces (biofilms mixtes)

L’activité antibiofilm de l’association du carvacrol et de l’acide gallique en solution est évaluée sur les biofilms bi-espèces (figure 4).

De manière remarquable, un effet antibiofilm du carvacrol et de l’acide gallique est observé sur la réduction de la biomasse bactérienne des biofilms mixte de S. aureus et P. aeruginosa.

En effet, les combinaisons de carvacrol à 0,5 mg/mL et de l’acide gallique à 2 mg/mL ou 5 mg/mL, réduisent fortement la biomasse bactérienne totale du biofilm bi-espèces de -3,7 log avec spécifiquement une réduction de la biomasse bactérienne de S. aureus de -6,2 log et celle de P. aeruginosa de -3,2 log (pour l’acide gallique à 2 mg/mL) et de -5,4log avec spécifiquement une réduction de la biomasse bactérienne de S. aureus de -6,2 log et celle de P. aeruginosa de -4,9 log (pour l’acide gallique à 5 mg/mL).

Par définition dans la présente demande, une forte activité antibiofilm est établie lorsque la réduction de la biomasse bactérienne est supérieure à -4,5 log. Lorsque la réduction de la biomasse bactérienne est inférieure à -4,5 log, l’activité antibiofilm est qualifiée de modérée.

Ainsi, la combinaison du carvacrol à 0,5 mg/mL et de l’acide gallique à 2 mg/mL permet une action antibiofilm préférentiellement sur S. aureus et une action antibiofilm plus faible sur P. aeruginosa dans le biofilm bi-espèces. La combinaison du carvacrol et de l’acide gallique dans une quantité de 0,5/5 mg/mL permet une forte action antibiofilm à la fois sur S. aureus et sur P. aeruginosa dans le biofilm bi-espèces. Synthèse de l’effet antibiofilm de l’association carvacrol K et acide gallique G en solution sur des biofilms matures bi-espèces (figure 4)

Les résultats présentent la réduction de biomasse de biofilms composés de S. aureus et de P. aeruginosa avec l’association K+G utilisée en solution à deux ratios (0,25 et 0,1 ) :

K à 0,5 mg/mL et G à 2 mg/mL (ratio 0,25) : une action antibiofilm préférentiellement sur S. aureus et une action antibiofilm plus faible sur P. aeruginosa K à 0,5 mg/mL et G à 5 mg/mL (ratio 0,1 ) : une forte action antibiofilm à la fois sur S. aureus et sur P. aeruginosa (effet antibiofilm = en italique). L’effet antibiofilm (en italique) des résultats de la figure 4 est résumé sur le tableau suivant (Table 6). [Table 6] Exemple 2 - Effet antibiofilm synergique de l’association sous forme de compresse

L’activité antibiofilm de l’association selon l’invention formulée dans une compresse à base de sel d’alginate est testée sur des biofilms mono-espèce réalisés avec les espèces S. aureus ou P. aeruginosa.

Préparation de la compresse Une laize de sel d’alginate est imprégnée d’un mélange comprenant du carvacrol et/ou de l’acide gallique et/ou de la curcumine par l’intermédiaire d’une machine adaptée.

Pour cela, une masse de 1 ,22.10 ² g de carvacrol et/ou une masse de 2,50 g d’acide gallique et/ou une masse de 1 ,55 g de curcumine sont pesés et mis dans un récipient. Un volume de 250 ml_ d’un mélange d’éthanol à 75% et d’eau à 25% est ajouté dans le récipient. L’ensemble est chauffé à 50°C et sous agitation jusqu’à solubilisation totale des actifs.

Puis, une laize d’une longueur prédéterminée est imprégnée de cette solution ; elle est ensuite séchée et stérilisée.

Les quantités du ou des principes actifs combinés selon les associations antibiofilm de l’invention sont représentées sur le tableau suivant (Table 7).

[Table 7]

Exemple 2.1 : Test de l’association carvacrol + acide gallique sous forme de compresse sur des biofilms mono-espèces Protocole

1 mL de suspension bactérienne calibrée à 10 ⁶ UFC/mL à partir d’une préculture de S. aureus ou de P. aeruginosa est déposé dans des puits de plaques 24 puits contenant une lamelle de verre de diamètre 12 mm. Les plaques sont laissées 24h à 37°C afin d’obtenir des biofilms mono-espèces matures. Le biofilm peut alors être mis en contact d’une ou plusieurs compresses enrichies de carvacrol ou d’acide gallique ou de carvacrol et d’acide gallique selon l’invention, durant 24h à 37°C.

Un dénombrement bactérien est ensuite réalisé : après trois rinçages avec une solution de NaCI à 9 g/L, les biofilms subissent deux sonications de 10 minutes en présence de 500 pl_ de NaCI à 9 g/L les deux fois. Cette solution est ensuite récupérée dans des Eppendorfs. À partir de ceux-ci, 7 dilutions en cascade à raison de 10 sont faites pour obtenir des solutions diluées de 10° à 10 ⁷ . Des étalements sur géloses PCA de 100 pL de chacune des dilutions sont réalisés. Les géloses sont incubées 24h à 37°C. Après ce temps, elles sont prises en photos et les colonies présentes à leur surface sont dénombrées à l’aide du logiciel Fiji. Chaque condition testée est réalisée en triplicat et par conséquent, la moyenne, l’écart-type et le coefficient de variation de la biomasse bactérienne sont déterminés. La biomasse bactérienne est exprimée en nombres de bactéries/cm ² . Résultats : effet de l’activité sur les biofilms mono-espèce L’activité antibiofilm d’une compresse à base de sel d’alginate sans principes actifs est testée. Une absence d’activité antibiofilm de la compresse seule est observée. Ceci est illustré sur les figures 5 et 6.

Les activités antibiofilm de la compresse à base de sel d’alginate comportant chacun des principes actifs seuls ou en combinaison, sont testées sur les biofilms mono-espèces, afin de contrôler la réduction de la biomasse bactérienne obtenue pour chaque principe actif et pour la combinaison.

Sur la figure 3, il est montré qu’une compresse avec une quantité d’acide gallique de 17,7 mg/g réduit la biomasse bactérienne de S. aureus de -5,52 log et celle de P. aeruginosa de -1 ,78 log.

Une compresse avec une quantité de carvacrol de 88,4 mg/g réduit la biomasse bactérienne de S. aureus de -7,83 log par rapport à la compresse témoin. La biomasse bactérienne de P. aeruginosa est également réduite avec une réduction de -2,18 log qui est moins importante que pour la biomasse bactérienne de S. aureus (voir figure 5). Ainsi, les compresses à base de sel d’alginate enrichies en principes actifs seuls présentent des activités antibiofilm plus importantes sur les biofilms à S. aureus que sur les biofilms à P. aeruginosa.

De manière remarquable, un effet antibiofilm fort et un effet antibiofilm synergique de l’association de deux des principes actifs dans une compresse est observé sur la réduction de la biomasse bactérienne respectivement de S. aureus et de P. aeruginosa (figure 5).

Tel que défini ci-dessus, une forte activité antibiofilm est établie lorsque la réduction de la biomasse bactérienne est supérieure à -4,5 log.

Une compresse avec une combinaison de carvacrol à 88,4 mg/g et d’acide gallique à 17,7 mg/g, réduit la biomasse bactérienne de S. aureus de -7,53 log et celle de P. aeruginosa de -4,51 log.

Ainsi, les compresses à base de sel d’alginate enrichies avec l’association de carvacrol et d’acide gallique présentent une forte activité antibiofilm sur le biofilm à S. aureus et un effet antibiofilm synergique sur le biofilm à P. aeruginosa. Synthèse de l’effet antibiofilm de l’association carvacrol K et acide gallique G dans une compresse sur des biofilms matures mono-espèces (figure 5)

Les résultats démontrent que l’association K+G (ratio 5) dans une compresse induit une forte réduction de la biomasse de biofilms de S. aureus (-7,5log) et de biofilms de P. aeruginosa (-4,5log).

Cet effet antibiofilm de l’association K+G dans une compresse est plus fort que l’effet antibiofilm de K et G utilisés seuls sur des biofilms de P. aeruginosa, démontrant une activité antibiofilm synergique de l’association.

L’effet antibiofilm (en italique) et l’effet synergique (souligné) des résultats de la figure 5 sont résumés sur le tableau suivant (Table 8).

[Table 8]

Exemple 2.2 : Test de l’association carvacrol + curcumine sous forme de compresse sur des biofilms mono-espèce Protocole

1 mL de suspension bactérienne calibrée à 10 ⁶ UFC/mL à partir d’une préculture de S. aureus ou de P. aeruginosa est déposé dans des puits de plaques 24 puits contenant une lamelle de verre de diamètre 12 mm. Les plaques sont laissées 24h à 37°C afin d’obtenir des biofilms mono-espèces matures. Le biofilm peut alors être mis en contact d’une ou plusieurs compresses enrichies de carvacrol ou de curcumine ou de carvacrol et de curcumine selon l’invention, durant 24h à 37°C. Un dénombrement bactérien est ensuite réalisé : après trois rinçages avec une solution de NaCI à 9 g/L, les biofilms subissent deux sonications de 10 minutes en présence de 500 pL de NaCI à 9 g/L les deux fois. Cette solution est ensuite récupérée dans des Eppendorfs. À partir de ceux-ci, 7 dilutions en cascade à raison de 10 sont faites pour obtenir des solutions diluées de 10° à 10 ⁷ . Des étalements sur géloses PCA de 100 pL de chacune des dilutions sont réalisés. Les géloses sont incubées 24h à 37°C. Après ce temps, elles sont prises en photos et les colonies présentes à leur surface sont dénombrées à l’aide du logiciel Fiji. Chaque condition testée est réalisée en triplicat et par conséquent, la moyenne, l’écart-type et le coefficient de variation de la biomasse bactérienne sont déterminés. La biomasse bactérienne est exprimée en nombres de bactéries/cm ² . Résultats : effet de l’activité sur les biofilms mono-espèce

Les activités antibiofilm de la compresse à base de sel d’alginate comportant chacun des principes actifs seuls ou en combinaison, sont testées sur les biofilms mono-espèce, afin de contrôler la réduction de la biomasse bactérienne obtenue pour chaque principe actif et pour la combinaison. Sur la figure 6, il est montré qu’une compresse avec une quantité de carvacrol de 88,4 mg/g réduit la biomasse bactérienne de S. aureus de -7,83 log par rapport à la compresse témoin. La biomasse bactérienne de P. aeruginosa est également réduite avec une réduction de -2,18 log qui est moins importante que pour la biomasse bactérienne de S. aureus.

Une compresse avec une quantité de curcumine de 8,8 mg/g réduit la biomasse bactérienne de S. aureus de -4,18 log et celle de P. aeruginosa de -1 ,06 log (voir figure 4).

Ainsi, les compresses à base de sel d’alginate enrichies en principes actifs seuls présentent des activités antibiofilm plus importantes sur les biofilms à S. aureus que sur les biofilms à P. aeruginosa.

De manière remarquable, un effet antibiofilm fort et un effet antibiofilm synergique de l’association de deux des principes actifs dans une compresse est observé sur la réduction de la biomasse bactérienne respectivement de S. aureus et de P. aeruginosa (figure 6).

Tel que défini ci-dessus, une forte activité antibiofilm est établie lorsque la réduction de la biomasse bactérienne est supérieure à -4,5 log.

Une compresse avec une combinaison de carvacrol à 88,4 mg/g et de curcumine à 8,8 mg/g, réduit la biomasse bactérienne de S. aureus de -7,35 log et celle de P. aeruginosa de -4,55 log.

Ainsi, les compresses à base de sel d’alginate enrichies avec l’association de carvacrol et de curcumine présentent une forte activité antibiofilm sur le biofilm à S. aureus et un effet antibiofilm synergique sur le biofilm à P. aeruginosa. Synthèse de l’effet antibiofilm de l’association carvacrol K et curcumine Q dans une compresse sur des biofilms matures mono-espèces (figure 6)

Les résultats démontrent que l’association K+Q (ratio 10) dans une compresse induit une forte réduction de la biomasse de biofilms de S. aureus (-7,4 log) et de biofilms de P. aeruginosa (-4,6 log). Cet effet antibiofilm de l’association K+Q dans une compresse est plus fort que l’effet antibiofilm de K et Q utilisés seuls sur des biofilms de P. aeruginosa, démontrant une activité antibiofilm synergique de l’association.

L’effet antibiofilm (en italique) et l’effet synergique (souligné) des résultats de la figure 5 sont résumés sur le tableau suivant (Table 9). [Table 9]

Exemple 2.3 : Test de l’association carvacrol avec hvdroxvpropvl-b- cvclodextrine + acide gallique sous forme de compresses sur des biofilms mono-espèces

L’essai a été reproduit sur des biofilms mono-espèce de S. aureus en utilisant cette fois des compresses comportant l’association du carvacrol et de l’acide gallique obtenues à partir d’une solution aqueuse antibiofilm. Le carvacrol a été complexé dans la solution avec un agent stabilisant : l’hydroxypropyl- -cyclodextrine pour former le complexe K-HPBCD. Protocole

Le complexe K-HPBCD est obtenu à la suite d’une méthode de complexation par sonication adaptée selon les littératures ⁽³⁶ - ³⁷⁾ d’une solution de carvacrol et d’hydropropyl- -cyclodextrine, tous deux à 16mM. La solution est ensuite filtrée et lyophilisée pour obtenir de la poudre de K-HPBCD. Par dosage spectrophotométrique il est déterminé la quantité équivalente en carvacrol dans les complexes de K-HPBCD. Cette poudre est ensuite solubilisée avec de l’acide gallique dans de l’eau afin d’obtenir une solution antibiofilm. Cette solution antibiofilm a été utilisée pour enrichir les compresses qui sont ensuite mises au contact du biofilm mature de S. aureus durant 24h à 37°C. Résultats

L’activité antibiofilm de compresses contenant une association de carvacrol complexé à l’hydroxypropyl- -cyclodextrine et d’acide gallique est testée sur un biofilm mono-espèce. La figure 7 illustre les activités antibiofilm de ces compresses contenant une association de carvacrol, complexé avec l’hydroxypropyl- -cyclodextrine, et d’acide gallique. La solution du carvacrol complexé à l’hydroxypropyl- -cyclodextrine présente une quantité de carvacrol d’environ 88,4 mg/g.

Sur la figure 7, il est montré qu’une compresse avec une quantité de carvacrol de 88,4 mg/g et d’acide gallique de 17,7mg/g réduit la biomasse bactérienne de S. aureus de -7,6 log par rapport à la compresse témoin.

Ainsi, les compresses à base de sel d’alginate enrichies avec l’association de carvacrol, complexé avec l’hydroxypropyl- -cyclodextrine, et d’acide gallique présentent une forte activité antibiofilm sur le biofilm mature de S. aureus.

REFERENCES

(1) Garrett TR, Bhakoo M, Zhang Z. Bacterial adhesion and biofilms on surfaces. Prog Nat Sci 2008;18:1049-56. https://doi.Org/10.1016/J.PNSC.2008.04.001.

(2) Flemming HC, Wingender J, Szewzyk U, Steinberg P, Rice SA, Kjelleberg S. Biofilms: An emergent form of bacterial life. Nat Rev Microbiol 2016;14:563-75. https://doi.org/10.1038/nrmicro.2016.94.

(3) Tefera Y. Review on biofilm formation and its control options n.d.

(4) Donlan RM. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis 2002;8:881-90. https://doi.org/10.3201/eid0809.020063.

(5) Satpathy S, Sen SK, Pattanaik S, Raut S. Review on bacterial biofilm: An universal cause of contamination. Biocatal Agric Biotechnol 2016;7:56-66. https://doi.Org/10.1016/j.bcab.2016.05.002.

(6) Verderosa AD, Totsika M, Fairfull-Smith KE. Bacterial Biofilm Eradication Agents: A Current Review. Front Chem 2019;7:824. https://doi.org/10.3389/fchem.2019.00824.

(7) Caria C. C. R. de Carvalho. Biofilms: Recent Developments on an Old Battle. Recent Pat Biotechnol 2008;1:49-57. https://doi.org/10.2174/187220807779813965.

(8) Crone S, Vives-Flôrez M, Kvich L, Saunders AM, Malone M, Nicolaisen MFI, et al. The environmental occurrence of Pseudomonas aeruginosa. APMIS 2020;128:220-31. https://doi.org/10.llll/apm.13010.

(9) Mena KD, Gerba CP. Risk assessment of pseudomonas aeruginosa in water. Rev Environ Contam Toxicol 2009;201:71-115. https://doi.org/10.1007/978-l-4419-0032-6_3.

(10) Flardalo C, Edberg SC. Pseudomonas aeruginosa: Assessment of risk from drinking water. Crit Rev Microbiol 1997;23:47-75. https://doi.org/10.3109/10408419709115130.

(11) Rode TM, Langsrud S, Holck A, Mpretrp T. Different patterns of biofilm formation in Staphylococcus aureus under food-related stress conditions. Int J Food Microbiol 2007;116:372-83. https://doi.Org/10.1016/j.ijfoodmicro.2007.02.017.

(12) Doulgeraki Al, Di Ciccio P, lanieri A, Nychas GJE. Methicillin-resistant food-related Staphylococcus aureus: a review of current knowledge and biofilm formation for future studies and applications. Res Microbiol 2017;168:1-15. https://doi.Org/10.1016/j.resmic.2016.08.001.

(13) Joshi M, Kaur S, Mishra T, Kaur Fl. Nosocomial Infection: Source and Prévention. Ijpsr 2019;10:1613. https://doi.org/10.13040/IJPSR.0975-8232.10(4).1613-24.

(14) Govindaraj Vaithinathan A, Vanitha A. WFIO global priority pathogens list on antibiotic résistance: an urgent need for action to integrate One Health data. Perspect Public Health 2018;138:87-8. https://doi.org/10.1177/1757913917743881.

(15) Bridier A, Briandet R, Thomas V, Dubois-Brissonnet F. Résistance of bacterial biofilms to disinfectants: a review. Biofouling 2011;27:1017-32. https://doi.org/10.1080/08927014.2011.626899. (16) Sanchez-Vizuete P, Orgaz B, Aymerich S, Le Coq D, Briandet R. Pathogens protection against the action of disinfectants in multispecies biofilms. Front Microbiol 2015;6:705. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00705.

(17) Ôzkalp B, Sevgi F, Ozcan M, Ôzcan MM. The antibacterial activity of essential oil of oregano (Origanum vulgare L.). J Food, Agric Environ J Food Agric Environ 2010;88:272-4.

(18) Burt S. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods— a review. Int J Food Microbiol 2004;94:223-53. https://doi.Org/10.1016/j.ijfoodmicro.2004.03.022.

(19) Nostro A, Procopio F, Pizzimenti FC, Cannatelli MA, Bisignano G, Marino A, et al. Effects of oregano, carvacrol and thymol on Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis biofilms. J Med Microbiol 2007;56:519-23. https://doi.Org/10.1099/jmm.0.46804-0.

(20) Bnyan IA, Abid AT, Obied FIN. Antibacterial Activity of Carvacrol against Different Types of Bacteria. J Nat Sci Res Www 2014;4:2225-921.

(21) Arfa A Ben, Combes S, Preziosi-Belloy L, Gontard N, Chalier P. Antimicrobial activity of carvacrol related to its Chemical structure n.d. https://doi.Org/10.llll/j.1472-765X.2006.01938.x.

(22) Al-Zahrani SFIM. Antibacterial activities of gallic acid and gallic acid methyl ester on methicillin- resistant Staphylococcus aureus. J Am Sci 2012;8.

(23) Fu L, Lu W, Zhou X. Phenolic Compounds and In Vitro Antibacterial and Antioxidant Activities of Three Tropic Fruits: Persimmon, Guava, and Sweetsop. Biomed Res Int 2016;2016:4287461. https://doi.org/10.1155/2016/4287461.

(24) Cetin-Karaca H. EVALUATION OF NATURAL ANTIMICROBIAL PHENOLIC COMPOUNDS AGAINST FOODBORNE PATHOGENS. Univ Kentucky Master's Theses 2011.

(25) Monte J, Abreu A, Borges A, Simôes L, Simôes M. Antimicrobial Activity of Selected Phytochemicals against Escherichia coli and Staphylococcus aureus and Their Biofilms. Pathogens 2014;3:473-98. https://doi.org/10.3390/pathogens3020473.

(26) Li A, Chen J, Zhu W, Jiang T, Zhang X, Gu Q. Antibacterial activity of gallic acid from the flowers of Rosa chinensis Jacq. against fish pathogens. Aquac Res 2007;38:1110-2. https://doi.org/10.1111/j.1365- 2109.2007.01745.x.

(27) Chattopadhyay I, Biswas K, Bandyopadhyay U, Banerjee RK. Turmeric and curcumin: Biological actions and médicinal applications. Curr Sci 2004;87.

(28) Moghadamtousi SZ, Kadir HA, Hassandarvish P, Tajik H, Abubakar S, Zandi K. A review on antibacterial, antiviral, and antifungal activity of curcumin. Biomed Res Int 2014;2014:186864. https://doi.org/10.1155/2014/186864.

(29) Synergistic antibacterial effect of curcumin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Phytomedicine 2013;20:714-8. https://doi.Org/10.1016/J.PHYMED.2013.02.006.

(30) Tyagi P, Singh M, Kumari H, Kumari A, Mukhopadhyay K. Bactericidal Activity of Curcumin I Is Associated with Damaging of Bacterial Membrane. PLoS One 2015;10:e0121313. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0121313.

(31) Burt SA, Ojo-Fakunle VTA, Woertman J, Veldhuizen EJA. The natural antimicrobial carvacrol inhibits quorum sensing in chromobacterium violaceum and reduces bacterial biofilm formation at sub- léthal concentrations. PLoS One 2014;9. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0093414.

(32) Moshe M, Lellouche J, Banin E. Curcumin: a natural antibiofilm agent, World Scientific Pub Co Pte Lt; 2011, p. 89-93. https://doi.org/10.1142/9789814354868_0017.

(33) Shao D, Li J, Li J, Tang R, Liu L, Shi J, et al. Inhibition of Gallic Acid on the Growth and Biofilm Formation of Escherichia coli and Streptococcus mutans. J Food Sci 2015;80:M1299-305. https://doi.org/10.llll/1750-3841.12902.

(34) Garcia-Salinas S, El izondo-Castillo H, Arruebo M, Mendoza G, Irusta S. Evaluation of the Antimicrobial Activity and Cytotoxicity of Different Components of Natural Origin Présent in Essential Oils. Molécules 2018;23. https://doi.org/10.3390/molecules23061399.

(35) Kyle R. Roell, David M. Reif, Alison A. Motsinger-Reif, An introduction to terminology and methodology of Chemical synergy - Perspectives from across disciplines; 20 avril 2017; Frontiers in

Pharmacology.

(36) Mohandoss S, Edison TNJI, Atchudan R, Palanisamy S, Prabhu NM, Napoléon AA, et al. Ultrasonic- assisted efficient synthesis of inclusion complexes of salsalate drug and b-cyclodextrin dérivatives for potent biomédical applications. J Mol Liq. 2020 Dec 1;319:114358.

(37) Cui H, Siva S, Lin L. Ultrasound processed cuminaldehyde/2-hydroxypropyl-p-cyclodextrin inclusion complex: Préparation, characterization and antibacterial activity. Ultrason Sonochem. 2019 Sep 1;56:84- 93.