CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está relacionada con una combinación y composición farmacéutica con actividad antitumoral, antimetastásica e inductora de la respuesta inmune para el tratamiento del cáncer que comprende uno o más compuestos derivados del ácido gálico y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables para la adecuación de una forma farmacéutica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El cáncer es la principal causa de muerte a nivel mundial; de acuerdo con las estadísticas de la O S en 2004 se registraron 7.4 millones de muertes y en el 2008, 559.000 muertes a nivel mundial por cáncer de seno (OMS, 201 0). La terapia sistémica es el principal tratamiento para el cáncer de seno metastásico e incluye la quimioterapia, la terapia hormonal y la terapia dirigida con anticuerpos monoclonales; sin embargo, actualmente es considerado incurable y se estima una media de supervivencia de 12 meses en mujeres que no han recibido tratamiento (Cold, S. 1993). La resistencia de las células tumorales metastásicas al tratamiento quimioterapéutico, es debida en parte al desarrollo de múltiples mecanismos de resistencia a drogas, los cuales permiten una eliminación rápida de las drogas, y además protege a las células de la muerte a través del desarrollo de mecanismos anti-apoptóticos o de sobrevida (Chai, To et al. 2010). Por otra parte, las células tumorales remanentes migran a los tejidos, a donde pueden ser destruidas por células de la respuesta inmune, siempre y cuando la respuesta inmune haya sido inducida durante las fases iniciales de la carcinogénesis, o durante la terapia de los tumores que ya se han instalado (Fulton, Miller et al. 2006). El tratamiento del tumor, debería entonces comprender la combinación o mezcla de moléculas que induzcan la muerte de las células tumorales permitiendo a su vez el control de los mecanismos de resistencia, y además que permitan que durante esta terapia se favorezca la inducción de una respuesta inmune que asegure el control de las células metastásicas que escapan de la destrucción inicial directa.

Solo el 15% de los pacientes que presentan compromiso de los nodulos linfoides y que no son tratados con cirugía presentan cáncer recurrente (Morrison, Schmidt et al. 2008), lo que hace pensar que otros mecanismos, entre ellos la respuesta inmune, podrían estar jugando un papel importante en el control de las metástasis. Los sitios mas comunes de metástasis en cáncer de seno son el pulmón, las vértebras, el hígado, la médula ósea, el tejido endocrino y el sistema nervioso central (Fulton, Miller et al. 2006), lo cual se reproduce también en el modelo murino con células 4T1 , considerado altamente metastásico. Este patrón de metástasis se incrementa en ratones SCID, deficientes en linfocitos T o B, y en ratones "nude", deficientes de linfocitos T (Williams, Alosco et al. 1993) (Visonneau, Cesano et al. 1998) , o incluso en ratones NOG, deficientes en células NK y en citocinas (Dewan, Terunuma et al. 2005), lo que soporta aún más la participación de la respuesta inmune en el control de las metástasis. De hecho, la metástasis a los ganglios linfáticos centinelas en pacientes con cáncer de seno, se asocia con un bajo potencial de maduración y migración de las células dendríticas así como con un bajo infiltrado de linfocitos T CD8, sugiriendo que la inmunosupresión, posiblemente generada por el tumor, favorece la migración metastásica ( ansfield, Heikkila et al. 201 1 ).

El concepto de las terapias múltiples, tiene sus antecedentes en el uso de los productos herbales complejos utilizados en la medicina tradicional, los cuales se han presentado como una alternativa terapéutica ampliamente utilizada (entre el 30 y 75% de los pacientes con cáncer a nivel mundial) para reducir los efectos colaterales y la toxicidad orgánica de la quimioterapia, para proteger y estimular el sistema inmune o para prevenir futuras neoplasias o la recurrencia de las mismas (Richardson 2001 ). Los productos herbales, constituidos por múltiples moléculas, presentan por lo general un componente activo identificado, el cual actúa en sinergia con otros metabolitos presentes en la combinación de la planta y que dadas sus bajas concentraciones, muchas veces no son identificados. Esta sinergia, permite ejercer la actividad biológica con un índice de toxicidad que es menor que el de los metabolitos aislados.

Dentro de los metabolitos con amplia actividad biológica, se encuentra el ácido gálico, el cual ha sido descrito como antioxidante, antialérgico, antimutagénico, anticarcinogénico y antiinflamatorio (Gandhi and Nair 2005). Serrano y col en 1998, encontraron que el ácido gálico y sus derivados (metil, propil, octil y lauril esteres) inducen apoptosis en diversas líneas celulares tumorales dentro de las cuales se mencionan diferentes tipos de leucemias, linfomas y mielomas (Serrano, Palacios et al. 1998). Adicionalmente, se ha reportado actividad importante para los metil, propil y octil esteres del ácido gálico, sobre la línea celular tumoral HeLa (Adenocarcinoma de cérvix humano) (Fiuza, Gomes et al. 2004). Estudios encaminados a determinar la actividad antitumoral del ácido gálico y sus derivados (esteres) han demostrado su efecto citotóxico sobre la línea celular tumoral L1210 (Leucemia) y la inducción de apoptosis determinada por fragmentación del DNA en geles de agarosa (Locatelli, Rosso et al. 2008). Se ha mostrado que el ácido tánico (galotanino), es inhibidor de la formación de tumores, en un modelo con D BA (dimetilbenzantraceno) como promotor tumoral ( ukhtar, Das et al. 1 988). Por otra parte, se ha reportado que la aplicación tópica de ácido tánico inhibe, de manera dosis dependiente, la actividad ornitina descarboxilasa, la cual está relacionada con la formación de tumores en la epidermis de ratones donde los tumores fueron inducidos por TPA (12-0-tetradecanoilforbol-13-acetato) (Gali, Perchellet et al. 1992). De igual forma se ha mostrado que la aplicación tópica del ácido tánico inhibe la carcinogénesis inducida por luz ultravioleta, en ratones BALB/c (Gensler, Gerrish et al. 1994).

Feldman K.S. en el 2007 divulgo en la patente US 7288273 un método para inhibir la liberación de TNF-α e IL-Ι β, que comprende la administración de un análogo de la coriarina A (un elagitanino dimerico unido por un enlace dihidrodigaloil éter). Los inventores muestran que el dímero análogo a la coriarina A es capaz de inhibir la producción de TNF-α e I L-1 β en células mononucleares de sangre periférica estimuladas con LPS; por el contrario, galotaninos monomericos como la β-D-pentagaloil glucosa, inducen shock séptico en modelos de ratas debido a la inducción de altos niveles plasmáticos de I L-1 β. Estos compuestos dimericos análogos de la coriarina A y las composiciones de los mismos, son propuestos como antagonistas de TNF-α útiles para el tratamiento de patologías como el shock séptico asociado a la sobreproducción de TNF-a y otras citocinas.

Las patentes US 6063770 y 6200568 (Falcon J.) divulgan una composición para el tratamiento del cáncer que comprende ácido tánico o complejos del mismo obtenidos a partir de extractos de las especies Musa paradisiaca y Musa Cavendish Enano en una proporción de entre el 5 y 20%. De acuerdo con la invención, el ácido tánico precipita los polímeros de ácido siálico (a-2,8-N-acetil neuraminico) expuestos en la superficie de las células tumorales permitiendo el reconocimiento de los antígenos tumorales por las células del sistema inmune.

La patente WO 2005/000330 (Greenway F.L., et al) revela un método para la disminución o prevención de la angiogénesis asociada a retinopatía diabética, degeneración macular, obesidad, lupus, psoriasis, neovascularización corneal, tumores benignos y malignos, entre otros, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de ácido gálico o un derivado del mismo seleccionado de: ácido tánico, metil galato, propil galato, butil galato, octil galato, etil galato, lauril galato, ácido elagico, galoil glucosa, digaloil glucosa, trigaloil glucosa, tetragaloil glucosa, pentagaloil glucosa o gliceril trigalato. Asimismo, incluye como agentes anti-angiogenicos los extractos de las plantas Rubus suavissimus S. Lee, Diospyros kaki L, Rheum palmatum L, Cornus officinale Nakai, Rubus fruticosus, Rubus occidentalis y especialmente las fracciones de alta polaridad de los frutos de Púnica granatum L.

La combinación de los derivados del ácido gálico de la presente invención, disminuye la capacidad clonogénica de células tumorales y presenta actividad citotóxica sobre diferentes líneas de células tumorales, a través de mecanismos que inducen depolarización de la mitocondria, y activación de caspasa 3, sugiriendo un mecanismo de inducción de apoptosis. Además, sobre líneas de células tumorales humanas de cáncer de seno ( CF7), el control de la proliferación celular se debe principalmente a un arresto de las células en la fase G1 del ciclo celular, y a la inducción de un mecanismo de autofagia, que posteriormente conlleva a la muerte celular. Las células 4T1 reproducen en el ratón el patrón de metástasis de los pacientes con cáncer de seno siendo un buen modelo para evaluar la actividad de fármacos antimetastásicos, y en este modelo se encontró que la combinación de los compuestos de la invención disminuye el tamaño del tumor primario, la reacción leucemoide inducida por el tumor, y reduce el número de metástasis en bazo, hígado y ganglios linfáticos mesentéricos sugiriendo una actividad sobre las células madre tumorales, las cuales son las principales responsables de la metástasis. Además, induce activación de la respuesta inmune evidenciada por la presencia de linfocitos T CD4 y CD8 específicos del tumor y productores de citocinas, que proliferan frente al estímulo antigénico. La actividad de esta combinación no había sido evaluada previamente por otros autores y nuestros resultados sugieren que estos compuestos presentan un alto potencial para ser utilizados en la terapia del cáncer ejerciendo su actividad sobre el tumor primario y las metástasis a través de: (1 ) un mecanismo directo sobre la célula tumoral y (2) un mecanismo que implica la activación de la respuesta inmune.

OBJETOS DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la invención se refiere a una combinación de compuestos derivados del ácido gálico, capaz de disminuir el tamaño del tumor primario y el número de metástasis, a través de un mecanismo directo sobre el tumor y un mecanismo indirecto que implica la activación de la respuesta inmune específica.

En un segundo aspecto, la invención divulga una composición farmacéutica que comprende una combinación de compuestos derivados del ácido gálico y excipientes farmacéuticamente aceptables Igualmente, es parte de la invención el uso de dicha combinación de compuestos derivados del ácido gálico para la producción de medicamentos para el tratamiento del cáncer.

En un aspecto adicional, la invención incluye el uso de la composición de la invención como adyuvante de la quimioterapia convencional con agentes inhibidores de topoisomerasas, inhibidores de mitosis, agentes alquilantes y antimetabolitos, entre otros.

En un aspecto final, se divulga un método para tratamiento del cáncer que comprende la administración de la composición de la invención de forma simultanea o separada con agentes quimioterápeuticos convencionales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra la inducción de la depolarización de la membrana mitocondrial de células K562 (A) y 4T1 (B) tratadas con la combinación de la invención.

La figura 2 muestra la inducción de apoptosis sobre líneas celulares tumorales por tratamiento con la combinación de la invención.

La figura 3 muestra la disminución de la capacidad formadora de colonias de las células 4T1 y K562 tratadas con una combinación de la invención.

La figura 4 muestra la actividad adyuvante de la combinación de la invención (tratamiento con dosis sub-optimas de la combinación y de agentes quimioterapéuticos) sobre células tumorales humanas de cáncer de seno.

La figura 5 muestra el efecto de la combinación de compuestos derivados del ácido gálico de la invención sobre el diámetro y el peso del tumor en un modelo in vivo de cáncer de seno murino.

La figura 6 muestra la disminución de focos metastásicos y de megacariocitos en órganos parenquimatosos de animales tratados con una combinación de compuestos derivados del ácido gálico de la invención.

La figura 7 muestra la disminución de la producción de interleucina 6 en ratones con tumor tratados con la combinación de compuestos derivados del ácido gálico. La figura 8 muestra la expresión en membrana de calreticulina y la movilización de H GB1 del núcleo al citoplasma, en células tumorales tratadas con los compuestos de derivados del ácido gálico.

La figura 9 muestra como la vacunación con células tumorales tratadas con la combinación FA-CS y DOX favorece la generación de LT CD4+ productores de citocinas IL-2, I FN-y y TNF-oc.

La figura 1 0 muestra la producción de citocinas propias de células de memoria en respuesta al antígeno, obtenidas de ganglio poplíteo de ratones vacunados con células tumorales tratadas con una combinación de la invención o con doxorrubicina.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Para facilitar la descripción de los componentes de la presente invención, se establecen las siguientes definiciones para los términos utilizados en la memoria descriptiva de la presente invención.

La expresión "compuestos derivados del ácido gálico" hace referencia a las estructuras resultantes de la sustituciones indicadas en las estructuras carbonadas I y II, los cuales son compuestos que incluyen al menos una molécula de ácido gálico en su estructura y se han denominado de forma genérica en la presente memoria como derivados del ácido gálico.

La expresión "una combinación de compuestos derivados del ácido gálico" se entiende como la mezcla de uno o más compuestos de formula I, de uno o más compuestos de fórmula I I y del compuesto 3,4,5,6-tetrakis[(3,4,5- trihidroxibenzoil)oxi]oxan-2-il]metil-3,4,5-trihidroxi benzoato (denominación común: pentagaloil glucosa) que forman el principio activo o fármaco, el cual en un rango de dosificación apropiado es mezclado con excipientes farmacéuticamente aceptables para generar una composición farmacéutica.

La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se entiende como el nivel de dosificación de los compuestos de la invención necesario para inducir un efecto biológico deseado en el tratamiento de la enfermedad dentro de un balance riesgo/beneficio aceptable a cualquier tratamiento médico. La expresión "terapéutico" incluye el tratamiento o profilaxis de una enfermedad para un mamífero incluyendo el hombre.

En un primer aspecto la invención hace referencia a una combinación con actividad antitumoral, antimetastásica e inductora de la respuesta inmune para el tratamiento del cáncer que comprende: a. Entre el 75 y 85% respecto al peso total de la combinación de uno o más compuestos de formula I:

(i)

hidrógeno, hidroxilo, -COO ^" , -COOH seleccionado de hidrógeno, hidroxilo, -COO ^" , -COOH

R ₃ , R ₄ , R ₅ , R ₆ y son seleccionados de hidrógeno, hidroxilo o

Donde dichos compuestos de formula I son seleccionados preferiblemente a partir de:

Ácido 3,4,5-trihidroxi-1 -(3,4,5-trihidroxibenzoil)oxiciclohexano-1 -carboxilico, Ácido 1 ,4,5-trihidroxi-3-(3,4,5-trihidroxibenzoil)oxiciclohexano-1 -carboxilico, Ácido 1 ,3,5-trihidroxi-4-(3,4,5-trihidroxibenzoil)oxiciclohexano-1 -carboxilico, Ácido 1 ,3,4-trihidroxi-5-(3,4,5-trihidroxibenzoil)oxiciclohexano-1 -carboxilico, Ácido 1 ,4-dihidroxi-3,5-bis[(3,4,5-trihidroxibenzoil)oxi]ciclohexan o-1 -carboxilico, Ácido 1 ,5-dihidroxi-3,4-bis[(3,4,5-trihidroxibenzoil)oxi]ciclohexan o-1 -carboxilico, Ácido 1 ,3-dihidroxi-4,5-bis[(3,4,5-trihidroxibenzoil)oxi]ciclohexan o-1 -carboxilico, Ácido 4-hidroxi-1 ,3,5-tris[(3,4,5-trihidroxibenzoil)oxi]ciclohexano-1 -carboxilico, Ácido 5-hidroxi-1 ,3,4-tris[(3,4,5-trihidroxibenzoil)oxi]ciclohexano-1 -carboxilico, Ácido 3-hidroxi-1 ,4,5-tris[(3,4,5-trihidroxibenzoil)oxi]ciclohexano-1 -carboxilico, Ácido 1 -hidroxi-3,4,5-tris[(3,4,5-trihidroxibenzoil)oxi]ciclohexano -1 -carboxilico, Ácido 1 ,3,4,5-tetrakis[(3,4,5-trihidroxibenzoil)oxi]ciclohexano-1 -carboxilico.

Asimismo se incluye dentro del alcance de la invención los esteres metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo y heptilo y las sales de adición con ácidos o bases inorgánicas con metales alcalinos y alcalino térreos, tales como: calcio, litio, magnesio, aluminio, sodio, potasio de los compuestos mencionados anteriormente. b. Entre el 1 0 y 20% respecto al peso total de la combinación de uno o más compuestos de formula II :

(II)

Donde:

R-i es seleccionado de hidrógeno, metilo, etilo propilo, butilo, pentilo, hexilo o heptilo rógeno o

Con la condición que R-¡ y R ₂ no son simultáneamente hidrógeno Donde dichos compuestos de formula I I son seleccionados preferiblemente a partir de: 3,4,5-trihidroxibenzoato

et¡l-3,4,5-tr¡h¡drox¡benzoato

Etil-3,4,5-trihidroxibenzoato

Propil-3,4,5-trihidroxibenzoato

Butil-3,4,5-trihidroxibenzoato

Pentil-3,4,5-trihidroxibenzoato

Hexil-3,4,5-trihidroxibenzoato

Heptil-3,4,5-trihidroxibenzoato

3,4-dihidroxi-5-(3,4,5-trihidroxibenzoil)-oxi-benzoato

etil-3,4-dihidroxi-5-(3,4,5-trihidroxibenzoil)-oxi-benzoato

Etil-3,4-dihidroxi-5-(3,4,5-trihidroxibenzoil)-oxi-benzoato

Propil-3,4-dihidroxi-5-(3,4,5-trihidroxibenzoil)-oxi-benzoat o

Butil-3,4-dihidroxi-5-(3,4,5-trihidroxibenzoil)-oxi-benzoato

Pentil-3,4-dihidroxi-5-(3,4,5-trihidroxibenzoil)-oxi-benzoat o

Hexil-3,4-dihidroxi-5-(3,4,5-trihidroxibenzoil)-oxi-benzoato

Heptil-3,4-dihidroxi-5-(3,4,5-trihidroxibenzoil)-oxi-benzoat o

c. Entre el 0, 1 y 8% respecto al peso total de la combinación del compuesto 3,4,5,6-tetrakis[(3,4,5-trihidroxibenzoil)oxi]oxan-2-il]meti l-3,4,5-trihidroxi benzoato (denominación común: pentagaloil glucosa)

Dicha combinación puede ser empleada para la preparación de medicamentos con actividad terapéutica antitumoral, antimetastásica e inductora de la respuesta inmune útiles en el tratamiento del cáncer.

En un segundo aspecto la invención hace referencia a una composición farmacéutica con actividad antitumoral, antimetastásica e inductora de la respuesta inmune para el tratamiento del cáncer que comprende:

(a) Uno o más compuestos de formula I :

(i)

Ri es hidrógeno, hidroxilo, -COO ^" , -COOH

R ₂ es seleccionado de hidrógeno, hidroxilo, -COO ^" , -COOH o

R ₃ , R ₄ , R ₅ , R ₆ y R7 son seleccionados de hidrógeno, hidroxilo o

(b) Uno o más compuestos de formula I I :

Donde: Ri es seleccionado de hidrógeno, metilo, etilo propilo, butilo, pentilo, hexilo o heptilo

R ₂ es seleccionado de hidrógeno o

Con la condición que R-¡ y R ₂ no son simultáneamente hidrógeno,

(c) El compuesto 3,4,5,6-tetrakis[(3,4,5-trihidroxibenzoil)oxi]oxan-2-il]meti l-3,4,5- trihidroxi benzoato,

(d) y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables para la adecuación de una forma farmacéutica liquida, sólida o heterodispersa.

Dicha composición puede ser formulada con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables para administración oral en formas farmacéuticas sólidas o líquidas, para administración tópica en formas heterodispersas (cremas W/O, cremas O/W, geles y ungüentos entre otros) y para administración parenteral o rectal. Las composiciones de la invención pueden ser administradas a humanos y otros mamíferos oralmente, rectalmente, parenteralmente, tópicamente, intravaginalmente, bucalmente o como spray nasal u oral.

Las composiciones para administración oral que contienen la combinación de compuestos de la invención, incluyen las formas farmacéuticas orales usadas convencionalmente, tales como: tabletas, cápsulas, formas bucales y líquidos orales, suspensiones o soluciones. Las cápsulas pueden contener mezclas de los agentes activos con excipientes inertes y/o diluyentes tales como: almidones farmacéuticamente aceptables (por ejemplo maíz, papa o almidón), azúcares, agentes endulzantes artificiales, celulosas en polvo (carboximetilcelulosa, metil celulosa, etil celulosa, hidroxipropil metil celulosa), harinas, gelatinas y gomas entre otros.

Las composiciones en tabletas pueden elaborarse por métodos de compresión convencional, granulación húmeda o granulación seca y pueden utilizarse excipientes tales como: diluyentes, lubricantes, desintegrantes, surfactantes, agentes de suspensión o estabilización, incluyendo pero no limitado al estearato de magnesio, ácido esteárico, talco, laurilsulfato de sodio, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, gelatina, ácido algínico, goma acacia, goma xantana, citrato de sodio, silicatos complejos, carbonato de calcio, lactosa, caolín, manitol, cloruro de sodio, almidones secos y sacarosa en grados farmacéuticamente aceptable. Así mismo, las composiciones orales reveladas en la invención pueden ser formulaciones convencionales o formulaciones de liberación retardada o controlada que alteren la absorción de los agentes activos.

Las formulaciones para administración parenteral de la invención pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables, incluyendo pero no limitados a: surfactantes (lecitina, acacia, tragacanto, esteres de ácidos grasos polioxietilados de sorbitan, grasas polioxietilados, oleotrigliceridos polioxietilados, polioxialquilen derivados de propilen glicol, productos de condensación de óxido de polietileno y alcoholes grasos, alquilfenoles o ácidos grasos), agentes modificadores de la tonicidad (cloruro de sodio, sacarosa, dextrosa, manitol, lactosa, trihalosa, glucosa, glicina), solventes (agua, propilenglicol, polietilenglicol, glicerol, etanol), reguladores de pH (buffer fosfato, citrato, lactato, glicina, tris, bicarbonato sódico), antioxidantes (oc-tocoferol, BHT, BHA), quelantes (EDTA) y agentes modificadores de la viscosidad (carboximetil celulosa, croscarmelosa, hidroxipropil celulosa).

Los niveles de dosificación de la combinación de compuestos de la invención en la composición farmacéutica proporcionada por la invención pueden variar para alcanzar la respuesta terapéutica deseada dependiendo de las condiciones fisiológicas y patológicas del individuo, la formulación y la ruta de administración. Los niveles de dosificación seleccionados dependen específicamente de la potencia terapéutica de los compuestos, la ruta de administración, la severidad de la condición tratada y la historia médica previa del paciente a ser tratado.

La dosis diaria total de la combinación de la invención usada en la composición de la invención puede variar en el rango desde 0.001 a 1000 mg/Kg/día. Para propósitos de administración oral, las dosis preferibles se encuentran en el rango de 0.001 a 5 mg/Kg/día y parenteral en el rango de 0.0001 a 2 mg/Kg/día. Si se requiere, la dosis efectiva diaria puede ser dividida en dosis múltiples para propósitos de administración, consecuentemente la invención comprende composiciones de dosis simples que contienen la cantidad efectiva o dosis múltiples que alcanzan la dosis diaria efectiva tras varias administraciones. La composición farmacéutica de la invención comprende como principio activo compuestos de formula I, I I y pentagaloil glucosa en un rango entre el 0,01 y el 90% en peso de la composición, con la condición que entre el 75 y 85% de dicho principio activo corresponde a uno o más compuestos de formula I.

En otro aspecto la invención hace referencia al uso de la composición de la invención para la preparación de medicamentos con actividad terapéutica antitumoral, antimetastásica e inductora de la respuesta inmune útiles en el tratamiento del cáncer.

Asimismo, la invención incluye el uso de la composición de la invención como adyuvante de la quimioterapia convencional con agentes inhibidores de topoisomerasas, inhibidores de mitosis, agentes alquilantes y antimetabolitos, entre otros para el tratamiento del cáncer. Dicha actividad adyuvante se ve reflejada en la disminución de la dosis requerida del agente quimioterapéutico disminuyendo por ende la toxicidad sistémica de la terapia.

Dentro del alcance de la invención, se incluye un método para el tratamiento del cáncer que comprende la administración concomitante o separada de la composición de la invención con agentes quimioterápeuticos convencionales del tipo inhibidores de topoisomerasas, inhibidores de mitosis, agentes alquilantes y antimetabolitos en dosis inferiores a las requeridas en la quimioterapia convencional.

MODALIDADES PREFERIDAS DE LA INVENCIÓN

Una de las combinaciones de compuestos derivados del ácido gálico evaluada a lo largo de los ejemplos presentados en la memoria descriptiva de la invención, se ha denominado genéricamente como FA-CS. Esta combinación comprende entre el 75 y 85% en % peso/peso de compuestos de fórmula I, entre un 10 y 20% en % peso/peso de compuestos de formula I I, y entre el 0, 1 y 8% respecto al peso total de la combinación del compuesto pentagaloil glucosa (3,4,5,6-tetrakis[(3,4,5-trihidroxibenzoil)oxi]oxan-2-il]met il- 3,4,5-trihidroxi benzoato), de acuerdo con la siguiente tabla:

Compuestos de formula I %p/p respecto al

(75-85 %p/p respecto al total de la combinación) total de la

combinación

Ácido l ,3,5-trihidroxi-4-(3.4,5-Whicfroxtben20il)oxiciciohei(ano-1

carbólico {ácido 4-O-galoii uintco),

Ácido 1 ,3,4-trihidroxi-5-(3.4,5-tfihidroí(tben20il)oxicic!ohexano- 1

carboxilico (ácido 5-O-ga.loiiquinico),

Ácido 1 ,4-dihidroxi-3,5-bis[(3,4,5-trihidroxibenzoil)oxi] ciclohexano-1 - carboxilico (ácido 3,5-O-digaloilquínico),

Ácido 1 ,5-dihidroxi-3,4-bis[(3,4,5-trihidroxibenzoil)oxi] ciclohexano-1 - carboxilico (ácido 3,4-O-digaloilquínico),

Ácido 1 ,3-dihidroxi-4,5-bis[(3,4,5-trihidroxibenzoil)oxi] ciclohexano-1 - carboxilico (ácido 4,5-O-digaloilquínico),

Ácido 4-hidfoxi-1 ,3.5-trls[(3.4.5-trih¡droxiber>zoif)oxi]ciciohexano-1

carboxilico {ácido .3.5-tri-O-gatoílquínico),

Ácido 5-hldfoxi-1,3,4-tris[(3,4.5-trlhidrox¡ber(zoil)oxi]c¡ciohe í(ano-1

carboxilico {ácido 1 ,3,4-trí-O-gaíoilquinico),

Ácido 3-h idroxi- 1 A .5-t r¡ s[( 3.4 ,5-tri h id ro x i benzoíí)oxi]ci cioh exana- 1

carboxilico {ácido ,4.5-tri-C jaloílquínico),

Ácido 1 - h Idroxi -3,4 , 5-tr i s[( 3 ,4 ,5-tri h id roxl benzoit}oxi]c¡ cioh ex ano- 1

carboxilico {ácido 3,4,5-trí-O-gaíoilquinico),

Compuestos de formula II %p/p respecto al

(10-20 %p/p respecto al total de la combinación) total de la combinación

3 ,4-d i hídroxi-S-( 3 ,4, 5-fríhidroxíbe n zoi I) -QXÍ -ben zoato

Metil 3,4-dihidroxi-5-(3,4,5-trihidroxibenzoil)-oxi-benzoato 1 -10

Metil 3,4,5-trihidroxibenzoato 0,1 -5

3,4,5,6-tetrakis[(3,4,5-trihidroxibenzoil)oxi]oxan-2-il]m etil-3,4,5- 0,1 -8 trihidroxibenzoato (Pentagaloil glucosa) A continuación se presentan a titulo ilustrativo los hechos científicos que sustentan la presente invención, los cuales no deben entenderse como una limitante de la invención.

LÍNEAS CELULARES

Las líneas celulares humanas empleadas fueron la K562 (eritroleucemia humana), CF7 (cáncer de seno humano) y A375 (melanoma humano). Las líneas celulares murinas empleadas fueron el Reí (melanoma murino) y 4T1 (cáncer mamario murino). Estas células fueron mantenidas en medio RP I 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2m de L-glutamina, 100U de penicilina, 100pg/ml de estreptomicina y 0.01 de Hepes (Eurobio, Toulouse, FR) a 37°C con 5% C0 ₂ en atmósfera húmeda. La línea celular 4T1 , además fue mantenida con 1 mM de piruvato de sodio (Eurobio, Toulouse, FR). Para los ensayos sobre células normales, se obtuvieron mononucleares humanos de sangre periférica venosa de donantes sanos (PB C), los cuales fueron separados por centrifugación utilizando un gradiente de densidad Ficoll-Hypaque (GE Healthcare Bio- Sciences AB, Bjórkgatan, Uppsala, Sweden).

EJEMPLO 1. Actividad citotóxica de la combinación FA-CS sobre diferentes líneas celulares tumorales

El efecto citotóxico de la combinación de la invención sobre las células tumorales y normales fue evaluado por observación directa al microscopio y por ensayos de TT (Sigma, Saint Louis O, USA). Para esto, las células tumorales en suspensión (5x1 0 ³ células/pozo) o adherentes (3x1 0 ³ células/pozo), fueron puestas en placas de 96 pozos con diferentes concentraciones de FA-CS: 125, 62.5, 31 .2, 15.6, 7.8, 3.9, 1 .95 y 0.975 pg/mL por 48 horas (h). Para evaluar el efecto de la combinación FA-CS sobre células normales, se obtuvieron PBMC (2x10 ⁵ células/pozo), las cuales fueron estimulados previamente por 12 h con fitohemaglutinina (PHA) (Invitrogen Corp, Grandlsland, NY, USA) y cultivadas en placas de 96 pozos con las mismas concentraciones de la combinación. Como control negativo se utilizó etanol (ETOH) al 0.02% y como control positivo se utilizaron diferentes drogas antitumorales como doxorrubicina, camptotecina, vincristina y taxol a las cuales se les determinó la concentración inhibitoria 50 (IC50) para tomarla como base para los ensayos posteriores. Finalizada la incubación, el medio de cultivo fue retirado y se adicionaron 50 μΙ de medio RPMI 1 640 sin rojo de fenol (Eurobio, Toulouse, FR). 50 μΙ de MTT (1 mg/ml) [Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolio] (Sigma, Saint Louis MO, USA), fueron adicionados a cada pozo e incubados por 4h a 37°C. Los cristales de formazan fueron disueltos con dimetilsulfoxido (D SO) y la densidad óptica fue medida a 540 nm en un ultiskan CC/340 (Labsystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA).

El efecto citotóxico del FA-CS fue evaluado por TT sobre diferentes líneas celulares tumorales. El valor de la IC50 sobre las diferentes líneas celulares fue calculado utilizando el software initab. En la tabla 1 se observan las diferentes concentraciones correspondientes a la IC50 calculada para cada línea celular. Estos resultados muestran que la línea de cáncer de seno humana CF-7 presenta la mayor sensibilidad con una IC50 de 4.04 pg/ml seguida por la línea de eritroleucemia humana K562 (27, 1 pg/mL) y melanoma humano A375 (43.4 pg/mL). Para las líneas celulares murinas 4T1 las concentraciones obtenidas son mayores, con valores de 34.1 . La línea Mel Reí, que no se presenta en la tabla presenta una IC50 de 14.1 pg/mL,. La IC50 de los fármacos convencionales también se observa en la tabla 1 .

Tabla 1. Concentración Inhibitoria 50 ^g/ml_) de la combinación FA-CS de la invención y de los fármacos convencionales sobre las líneas de células tumorales y células mononucleares normales.

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La evaluación de la actividad citotóxica del FA-CS sobre las células mononucleares normales fue mayor que la dosis más alta de FA-CS y sobre los fibroblastos, la IC50 fue también superior que el control utilizado: Doxorrubicina.

EJEMPLO 2. Inducción de apoptosis en células tumorales por la combinación FA-CS de la invención. Como un indicativo de apoptosis temprana, los cambios en el potencial de la membrana mitocondrial de las células K562 y 4T1 , fueron evaluados en una cinética de 4, 8, 12, 24 y 48h, por citometria de flujo usando la sonda catiónica lipofílica JC-1 (5,5 ^' ,6,6 ^' -tetracloro- 1 , 1 ^' , 3,3 ^' -tetraetilbenzimidolcarbocianinaioduro) (Sigma, Saint Louis O, USA). El JC-1 (10 pg/mL en PBS) fue adicionado a 3x1 0 ⁵ células/mL e incubado por 10 minutos a 37°C. La intensidad de la fluorescencia del JC-1 fue cuantificada en un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, New Jersey, USA) o FACSDiva (BectonDickinson, New Jersey, USA) y el análisis de los datos fue realizado utilizando el software CelIQuest Pro (Becton Dickinson, New Jersey, USA) o Flowjo (TreeStar Inc., Ashland, USA). Todos los tratamientos fueron hechos por triplicado y los resultados fueron expresados como la media +/- SE . La apoptosis fue determinada midiendo la exposición de la fosfatidilserina a través de una marcación con Anexina V/yoduro de propidio (Molecular probes). Para esto 5 x 1 0 ⁵ células 4T1 fueron tratadas con la combinación FA-CS o ETOH (control negativo) por 24 y 48 horas. Finalizado el tratamiento, las células fueron recogidas, centrifugadas y resuspendidas en buffer anexina (Hepes 1 00 mM, NaCI 140 mM, CaCI2 2.5mM) y Anexina V por 8 minutos. Después se agregaron 2.5 μΙ de yoduro de propidio por 2 minutos. Finalizada la incubación se procedió a leer inmediatamente en un citómetro de flujo FACSAria (Becton Dickinson).

Como se puede observar en la figura 2 A, la combinación FA-CS induce un aumento en el porcentaje de células que tienen la membrana mitocondrial despolarizada. Este efecto es dependiente del tiempo y es igual para las dos líneas celulares evaluadas.

Adicionalmente, se determinó la activación de la caspasa 3 y la fragmentación del DNA inducida por el FA-CS. Para evaluar la actividad de la caspasa 3 se empleó el Caspase-3 Colorimetric Assay Kit (R&D systems Inc., Minneapolis, N, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, 2x10 ⁶ células (K562 o 4T1 ) fueron puestas en cultivo en presencia o ausencia de la combinación FA-CS por 48 horas. Como control negativo se empleó ETOH al 0.02% y como control positivo la doxorrubicina. Finalizada la incubación, las células fueron centrifugadas a 250xg por 10 minutos (min) y el pellet resultante fue lisado por 1 0 min en hielo y centrifugado a 10.000 xg por 1 min. La reacción enzimática fue realizada en placas de 96 pozos, usando 50μΙ de lisado celular (1 00-200 g de proteína total) y 50 μΙ del buffer de reacción suplementado con 10 μΙ de DTT fresco y 5 μΙ del sustrato colorimétrico de la caspasa 3 (DEVD-pNA). Después de 1 a 2 horas de incubación a 37 ^Q C, la actividad proteasa de la caspasa 3 fue medida en un espectrofotómetro a 405 nM (Labsystems, Thermo Fisher Scientific,Waltham, USA). La cantidad de actividad caspasa 3 en el lisado celular es directamente proporcional al color obtenido en la reacción. Los resultados se presentan como el aumento relativo de la activación de la caspasa 3 inducida por el FA-CS o el fármaco convencional respecto al control. La figura 2B muestra que la combinación de la invención induce actividad caspasa 3 en las células tratadas K562 izquierda y 4T1 derecha.

Como paso final de la inducción de muerte por apoptosis evaluamos la fragmentación del DNA por tinción con DAPI por microscopía de fluorescencia. Las células K562 (2 x 10 ⁵ cells) y 4T1 (2 x 10 ⁵ cells) fueron puestas en cultivo por 24 h sobre láminas de vidrio (13 mm de diámetro) previamente tratadas con colágeno tipo II (Sigma, Saint Louis MO, USA). Una vez adheridas, las células fueron tratadas con el FA-CS o con sus respectivos controles. Como control positivo se utilizó la doxorrubicina y como control negativo ETOH 0.02% por 48 h a 37 ^Q C y 5% de C02. Después del tratamiento, las células fueron lavadas con PBS pH 7.2 y fijadas con paraformaldehido (PAF) (Sigma, Saint Louis MO, USA) al 2% por 30 min a 4 ^Q C. Las células fijadas fueron lavadas 2 veces con PBS-BSA 2%, incubadas con acetona fría por 1 minuto, lavadas con PBS-BSA 2% y teñidas con 300 nM de DAPI (Sigma, Saint Louis MO, USA) por 5 min. Finalmente, las células fueron tratadas con antifade kit (Molecular probes, InvitrogenCorp, Carlsbad, CA, USA) y analizadas por microscopía de fluorescencia utilizando el microscopio confocal FluoView 1 000 de Olympus (CenterValley PA, USA). En la figura 2C se observan claramente los núcleos fragmentados en respuesta al tratamiento con la combinación de la invención en comparación con el etanol en células 4T1 .

Integrando los resultados presentados se tiene que la combinación FA-CS induce apoptosis de las células tumorales por la vía mitocondrial. El análisis de la cinética de expresión de la fosfatidilserina, lo cual constituye un marcador de muerte por apoptosis, mostró que las células tumorales expresan fosfatidilserina reconocida por la marcación con anexina V y que la muerte no es un evento que induce necrosis temprana sino tardía como se observa en la figura 2 A..

EJEMPLO 3. Reducción de la capacidad clonogénica de las células tumorales por tratamiento con la combinación de la invención.

Para evaluar el efecto de la combinación FA-CS a largo plazo sobre la capacidad clonogénica de las células tumorales, las líneas K562 y 4T1 (1.0X10 ⁵ células /pozo), fueron tratadas con el FA-CS o con sus respectivos controles por 6 horas. Como control positivo se utilizaron vincristina y doxorrubicina y como control negativo ETOH 0.02%. Finalizado el tratamiento, 20.000 células fueron plaqueadas en cajas de Petri de 60mm con agar 0.5-0.3% por 14 días a 37°C con 5% C02 y teñidas posteriormente con cristal violeta al 0,4%. Las colonias con más de 50 células fueron contadas. Todos los tratamientos fueron realizados por triplicado y los resultados son expresados como la media +/- SE del número de colonias totales.

Como se observa en la figura 3, después de 14 días en cultivo, la capacidad de proliferación de las células tumorales K562 (3A) y 4T1 (3B) se ve reducida en comparación con el control negativo (ETOH). Resultados similares fueron observados para los respectivos controles positivos.

EJEMPLO 4. Actividad coadyuvante de la combinación FA-CS con agentes quimioterapéuticos convencionales

La actividad coadyuvante de la combinación FA-CS de la invención fue determinada sobre la línea CF-7 a una concentración de 1 ,6 μg/mL (27 veces menos la IC50) en co- tratamiento con agentes quimioterapéuticos tales como: doxorrubicina, vincristina, taxol y camptotecina a concentraciones sub-optimas. Para evaluar la viabilidad celular se utilizó la prueba de TT. Células MCF-7 (3x10 ³ cel/pozo) fueron cultivadas en placas de 96 pozos y tratadas por 6h con la combinación FA-CS, lavadas e incubadas en medio fresco con cada uno de los fármacos quimioterapéuticos por 48h a 37°C en atmosfera húmeda y 5% C02. El ensayo de MTT fue realizado como se describió previamente. Los resultados son expresados como porcentaje de viabilidad celular comparado frente al control.

La figura 4 muestra que la combinación de doxorubicina, vincristina y camptotecina con la combinación de la invención FA-CS disminuye significativamente la viabilidad celular. Estos resultados muestran que el tratamiento con la combinación de la invención puede sensibilizar las células tumorales al tratamiento con los fármacos convencionales, disminuyendo las dosis requeridas en los tratamientos y por ende la toxicidad sistémica asociada a la quimioterapia.

EJEMPLO 5. Inhibición del crecimiento in vivo del tumor primario de células tumorales 4T1 inducido por la combinación de la invención y disminución en las metástasis a diferentes órganos.

Ratones hembras BALB/c de 6 a 12 semanas fueron adquiridas de Charles Rivers laboratorios (Wilmington, MA) y mantenidas en nuestro centro de investigación animal. Los ratones fueron mantenidos en cajas de polietileno y alimentados con comida y agua ad libitum en un cuarto con temperatura y humedad relativa controladas y con ciclos de luz-oscuridad de 12h. Los ratones se aclimataron 1 semana antes de su uso. Células 4T1 (1 x1 0 ⁴ ) fueron resuspendidas en buffer fosfato salino e inyectadas en la glándula mamaria en el lado derecho (subcutáneamente, s.c, día 0). 5 días después de la inoculación los ratones fueron tratados por vía I. P con la combinación (9.3 o 18.7 mg/kg) o el control, dos veces por semana. Para evaluar el efecto de la combinación, grupos de 7-8 ratones fueron separados para su tratamiento diferencial. Semanalmente muestras de sangre fueron tomadas por la vena de la cola para determinar el número de leucocitos, usando un hemocitómetro (ABX MICROS 60®). El volumen del tumor fue determinado dos veces por semana utilizando un calibrador de vernier, y fue calculado usando la siguiente formula: Volumen del tumor (mm ³ ) = [(ancho) ² x longitud]/ ² . Los ratones fueron sacrificados cuando el tumor primario alcanzó los 2000 mm ³ ; y posterior a la muerte se pesó el tumor primario.

La dosis de la combinación fue establecida después de determinar la toxicidad in vivo con el fin de establecer la dosis letal mínima posible de ser utilizada en la terapia. Como se observa en la figura 5 A y B, el FA-CS reduce significativamente el diámetro del tumor comparado con el control negativo desde los 22 hasta los 30 días de tratamiento. Cuando los ratones fueron sacrificados, al final del tratamiento, el peso del tumor fue calculado y claramente se puede observar una disminución del peso del tumor con el tratamiento a las dos concentraciones utilizadas vs el control negativo. Igualmente en la Figura 5C se observa que el tratamiento disminuye la reacción leucemoide que se presenta en este modelo como consecuencia del crecimiento del tumor. Al realizar los análisis histopatológicos de los diferentes órganos como pulmón, hígado, medula ósea, cerebro y bazo, se observó una disminución en el número de células tumorales en los órganos de los ratones tratados con la combinación FA-CS Vs el control negativo (Figura 6A).

Después del tratamiento con la combinación FA-CS, el tumor primario, los pulmones, bazo, hígado, cerebro y medula ósea fueron recolectados y seccionados. Luego, los tejidos fueron fijados en 1 0% de formaldehido (Sigma-Aldrich), embebidos en parafina y cortados en secciones de 2 μηι para ser teñidos con hematoxilina-eosina (H&E). Las células tumorales mestastásicas infiltrantes en los diferentes órganos fueron evaluadas en cada tejido y fueron contadas usando una rejilla micrométrica (poder de resolución 1 0X y 40X) en un microscopio de luz. En la Figura 6B se observa la disminución en el número de metástasis en baso y pulmón, además la disminución en el número de células tumorales presentes en el tumor primario en los ratones tratados con la combinación Vs los controles.

El suero de los ratones tratados con la combinación, fue recolectado por punción cardiaca y la medición de citocinas en suero fue realizada usando el kit de CBA de inflamación para ratones (Becton Dickinson). Los experimentos fueron realizados dos veces. Los resultados se expresan como la media de dos experimentos independientes. Se observa en la Figura 7 una disminución de la IL6 sérica en respuesta al tratamiento con diferentes dosis de la combinación FA-CS. Estos resultados sugieren que el tratamiento con la combinación FA-CS tiene un efecto sobre la respuesta inflamatoria del huésped, que se correlaciona con una disminución en el diámetro del tumor y un mejor control de las metástasis confirmando el papel antitumoral de la combinación FA-CS de la invención.

EJEMPLO 6. El tratamiento con la combinación FA-CS favorece la muerte inmunogénica en células 4T1 .

El efecto del FA-CS sobre la liberación de diferentes señales de peligro que han sido involucradas en la generación de muerte celular inmunogénica, fue evaluado sobre células 4T1 . Para la evaluación en la expresión de la Calreticulina (CRT), células 4T1 fueron cultivadas en placas de 12 pozos y tratadas con el control negativo (etanol), la combinación FA-CS (34 μg/ml) y doxorrubicina (0.51 μg/ml) por 24 h. Las células fueron marcadas con el anticuerpo primario (anti-CRT, ab2907, abcam) diluido en buffer de bloqueo frió (SFB al 2% en PBS) por 30 min, lavadas e incubadas con el anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) en buffer de bloqueo por 30 min. Las células fueron adquiridas en un citómetro de flujo FACSAria I I (Becton Dickinson) para identificar la CRT en la membrana plasmática. La intensidad de fluorescencia de las células teñidas fue evaluada sobre una población aqua negativa. Los análisis fueron realizados utilizando el software FlowJo (Tree Star Inc).

Para la detección de la proteína HMGB1 , células 4T1 (1 x10 ⁴ ), fueron cultivadas sobre láminas de vidrio en placas de 12 pozos y tratadas con el control negativo (etanol), la combinación FA-CS (34 μg/ml) y doxorrubicina (0.51 μg/ml) por 24 h. Para la tinción intracelular de HMGB1 , las células fueron marcadas con el anticuerpo primario (anti- HMGB1 , ab18256, Abcam) por 60 min, lavadas 3 veces en PBS e incubadas por 30 min con el anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 (Molecular Probes). Finalizada esta incubación, las células fueron marcadas con DAPI (Molecular Probes) por 5 min y la fluorescencia fue preservada con el Prolong Antifade Kit (Molecular Probes) y analizadas en un microscopio de fluorescencia confocal (FluoView 1000).

La figura 8 muestra, que el tratamiento con la combinación FA-CS favorece el aumento en la expresión de la CRT en la membrana de las células tumorales 4T1 . De igual forma, este tratamiento favorece la translocación de la proteína HMGB1 del núcleo al citoplasma después del tratamiento. Con estos resultados podemos concluir que el tratamiento con el FA-CS induce muerte de las células tumorales de tipo inmunogénica EJEMPLO 7. La vacunación de ratones BALB/c con células 4T1 pre-tratadas con la combinación FA-CS favorece la generación de linfocitos T CD4+ productores de IL- 2, TNF- e IFN- y ex vivo.

Para evaluar el efecto de la vacunación de ratones BALB/c con células tumorales 4T1 pre- tratadas in vitro con la combinación FA-CS en la inducción de una respuesta inmune, células 4T1 fueron tratadas con el control negativo (etanol), la combinación FA-CS (34 μg/ml), o doxorubicina (0.51 ug/ml) por 48h. Después del tratamiento, las células fueron inyectadas en la almohadilla plantar de ratones BALB/c. 7 días después los nodulos linfoides poplíteos (NLP) fueron obtenidos y cultivados (1 X1 0 ⁶ ) por 1 h en presencia o ausencia de phorbol myristate acétate (PMA) /lonomicina (Becton dickinson), seguido de la adición de brefeldina A (6h a 37°C). Estas células fueron marcadas con un colorante de viabilidad (LIVE/DEAD Aqua fluorescent reactive dye, Molecular Probes) por 20 min a temperatura ambiente (TA) y con anticuerpos monoclonales específicos para: Rat anti- mouse CD3- Alexa Fluor 647 (clone 17A2), Rat anti-mouse CD4- PerCP (clone RM4-5), Rat anti-mouse CD8-PE (clone 53-6.7) (Becton Dickinson) por 30 min a 4°C. Después de esto, las células fueron fijadas y permeabilizadas utilizando el kit BD Cytofix/Cytoperm Plus (Becton Dickinson) y marcadas intracelularmente con: Rat anti-mouse IL-2-FITC, Rat anti-mouse TNF-PE Cy7 (clone MP6-XT22) y Rat anti-mouse I FN-y-Alexa Fluor 700 (clone XMG1 .2) (Becton Dickinson) por 30 min a 4°C. Las células fueron adquiridas en un citometro de flujo FACSAria I I y analizadas con el software FlowJo.

En la figura 9 podemos observar que los ratones que fueron vacunados con las células tumorales 4T1 pre-tratadas in vitro con la combinación FA-CS (t-FA-CS), generan un mayor número de linfocitos T CD4+ productores de IL-2, TNF-α e I FN-γ en comparación con los ratones vacunados con células 4T1 vivas (t-LIVE).

EJEMPLO 8. La vacunación de ratones BALB/c con células 4T1 pre-tratadas con la combinación FA-CS favorece la producción de IL-4 e IL-5 en respuesta al estímulo antigénico.

Para evaluar el efecto de la vacunación con células 4T1 pre-tratadas in vitro en ratones BALB/c, células 4T1 fueron tratadas con el control negativo (etanol), la combinación FA- CS (34 μg/ml), o doxorrubicina (0.51 ug/ml) por 48h. Después del tratamiento, las células fueron inyectadas en la almohadilla plantar de ratones BALB/c. 7 días después los nodulos linfoides poplíteos (NLP) fueron obtenidos y cultivados (1 X1 06) por 72h en medio RPMI 1640 suplementado y con 50mM 2- · mercaptoetanol en presencia de O^g/rnl anti- mouse CD28 (clone 37.51 , Becton Dickinson) y ^g/ml anti-mouse CD49d (Clone R1 -2, Becton Dickinson). En algunos pozos se hizo una re-estimulación con un lisado de células 4T1 (100 o con un mismo volumen de PBS. Después de las 72 horas, los sobrenadantes fueron recolectados y almacenados a -70 °C hasta su procesamiento. La producción de citocinas en el sobrenadante de cultivo fue evaluada por citometria de flujo usando el kit de arreglo de perlas (CBA) de BD para citocinas inflamatorias de ratón (Becton Dickinson). Las citocinas evaluadas fueron IL-4, IL-5, TNF-α o I FN- . Las citocinas fueron adquiridas usando un FACSAria I I y analizadas usando el programa FCAP Array (Becton Dickinson). Los tratamientos fueron realizados por triplicado y los resultados expresados como la mediana y los rangos de 3 experimentos independientes.

En la Figura 1 0, podemos observar que la vacunación de ratones BALB/c con t- FA-CS favorece la producción de la IL-4 e IL-5. Este aumento se evidencia mas claramente cuando las células fueron cultivadas en presencia de un lisado de células 4T1 , sugiriendo que la producción de estas citocinas es dependiente de antígeno.