Campo de la invención La invención descrita comprende la utilización terapéutica de la combinación de dos sustancias inmunoreguladoras, proteína inducible por interferon y de 10kD (IP-10) e interleucina-12 (IL-12), para combatir enfermedades de origen neoplásico y/o aumentar la intensidad de la respuesta inmunitaria de linfocitos T citotóxicos. Hemos comprobado que la combinación de ambas sustancias permite alcazar una eficacia antitumoral mayor que la obtenida con cada una de ellas por separado, que su uso combinado aumenta la actividad citotóxica especifica mediada por linfocitos T CD8+ frente a las células tumorales y que IP-10 aumenta el efecto antitumoral de IL-12 de forma sinérgica. Asimismo hemos demostrado que la administración de una combinación de dichas sustancias conlieva el rechazo de nódulos tumorales distantes no tratados y protege frente a ia aparición de nuevos nódulos tumorales siendo este un modelo de la enfermedad tumoral metastásica como por ejemplo el carcinoma de colon avanzado. La administración de ambas sustancias puede realizarse mediante la inyección de proteína recombinante o mediante el uso de sistemas de expresión o transferencia de genes que codifican para IP-10 e IL-12 de modo que se expresen. La invención descrita tiene aplicación en la preparación de fármacos o composiciones terapéuticas para el tratamiento de pacientes afectados por tumores malignos de cualquier tipo.

Estado de la técnica La proteína inducible por interferon gamma-10 (IP-10) (1, 2) cuyo análogo en ratones se denomina Crg-2 (3, 4), es una quimiocina que pertenece a la familia de las a-quimiocinas o CXC quimiocinas capaz de estimular al menos el

receptor de quimiocinas CXCR3 (5-7). El patrón de expresión del receptor CXCR3 explica que IP-10 sea capaz de atraer, al menos in-vitro, exclusivamente linfocitos T activados y células NK, pero no linfocitos vírgenes (5, 8-10). Líneas celulares tumorales capaces de expresar establemente IP-10 son rechazadas mediante mecanismos inmunitarios (11). Además, se ha demostrado que IP-10 posee propiedades antitumorales basadas en su capacidad para inhibir la angiogénesis tumoral (12-14). Dicho efecto angiostático parece que no esta mediado por el receptor CXCR3 (15) y tiene gran importancia en los efectos antitumorales de IL-12 en algunos modelos animales (16).

Otros genes de quimiocinas como el gen de linfotactina (17) o de MIP1-a (18) han sido transfectados en células tumorales donde, al expresarse y a pesar de atraer linfocitos T al tejido maligno, no se consigue el rechazo tumoral (17, 18). Sin embargo la combinación de dichas quimiocinas con otras citocinas o moléculas coestimuladoras con capacidad para activar linfocitos, tales como IL-2, B7-1 e IL-12, tiene como resultado un destacado efecto antitumoral (17, 19, 20).

La interleucina-12 es una citocina producida naturalmente por macrófagos (21) y céfutas dendríticas (22) que juega un papel central en la inducción de las respuestas inmunes celulares (23). Se ha observado que la IL- 12 es capaz de inducir efectos antitumorales importantes basados en la amplificación de actividad citolitica por linfocitos T citotóxicos (CTL), diferenciación Th1, activación de células NK (21), e inhibición de la vascularización tumoral (24). Desafortunadamente los primeros intentos para probar la IL-12 recombinante purificada en clinica fracasaron debido a toxicidad dosis-dependiente (25, 26).

Descripción Para estudiar los efectos antitumorales in-vivo de IP-10 y su combinación con IL-12, hemos optado por la transferencia génica mediada por adenovirus recombinantes defectivos. Para ello hemos generado un adenovirus

recombinante defectivo que expresa la proteina IP-10 murina (mlP-10), AdCMVIP-10, mediante el sistema Cre-lox (27), y empleado un adenovirus recombinante defectivo que expresa IL-12 murina (AdCMVIL-12) y un adenovirus recombinante defectivo que expresa el gen de ! a p-gaiactosidasa como adenovirus control, ambos generados en nuestro laboratorio anteriormente (28, 29). En los tres adenovirus citados el transgén está bajo control del promotor del Citomegalovirus (CMV). Como ejemplo de modelo tumoral in-vivo hemos utilizado la inyección subcutánea de células CT26 (linea celular de adeno-carcinoma de colon inducida por el carcinógeno N-nitroso-N- metiluretano en ratones BALB/c (H-2d) (30). Hemos demostrado experi- mentalmente que a resultas de un efecto sinérgico de la expresión combinada de los genes IP-10 e IL-12 transferidos a las células malignas mediante adenovirus recombinantes ocurre el rechazo de nódulos tumorales por un mecanismo inmunológico, de suerte que el efecto resultante de la combinación es cuantitativa y cualitativamente distinto del obtenido con la transferencia génica de IP-10 o IL-12 por separado.

Descripción detallada de la invención Cultivos celulares La linea celular 293 (células embrionarias de riñon humano transfectadas de forma estable con la región E1 perteneciente al adenovirus humano tipo 5, ECACC N° 85120602) permite que los adenovirus empleados, defectivos para esta región del genoma adenoviral, puedan replicarse en el interior de las células 293. La linea celular HepG2 es una linea de hepatoblastoma humano. La linea celular Cre8, derivada de 293, posee un casete de expresión basado en el promotor del gen de la p-actina que controla el gen de la recombinasa Cre con una señal de localización nuclear N-terminal integrado establemente en la linea celular 293, y fue cedida por el Dr. S. Hardy (Universidad de California, San Francisco, USA). EI medio de cultivo empleado para crecer estas lineas celulares fue DMEM completo (suplementado con suero de ternera fetal al 10 %

(FCS) inactivado a 56°C, glutamina 2 mM, estreptomicina 100 U/ml, penicilina 100 mg/ml). La linea celular CT26, gentilmente cedida por el Dr. K. Brand, Max- Planck-Institut fur Biochemie, Alemania, deriva de un adenocarcinoma colorectal de ratón BALB/c y fue inducida por el carcinógeno N-nitroso-N-metil-uretano. La linea celular YAC-1 (ATCC) deriva de un linfoma inducido por el virus transformado de la leucemia Moloney de un ratón A/Sn. La linea de mastocitoma humano P815 (H-2d) fue obtenida a través de la ATCC. Estas lineas celulares se cultivaron en medio RPMI 1640 completo (suplementado con suero de ternera fetal al 10 % (FCS) inactivado a 56°C, glutamina 2 mM, estreptomicina 100 U/ml, penicilina 100 mg/ml).

Las células descritas fueron cultivadas en cámaras incubadoras humidificadas a 37°C y en una atmósfera al 5% de CO2.

Los reactivos para los cultivos celulares son de Gibco (Basilea, Suiza), y las placas de cultivo son de Greiner Labortecknik (Frickenhausen, Alemania) y TPP (Trasadingen, Suiza).

Animales empleados En los estudios realizados se utilizaron ratones hembras BALB/c de entre 5 y 8 semanas (Charles Rives, Barcelona). Durante ei periodo de experi- mentación los animales fueron mantenidos en el animalario del Centro de Investigación en Farmacobiologia Aplicada (CIFA) de la Universidad de Navarra de acuerdo con las normas que rigen en la institución.

Construcción de un adenovirus que expresa mIP-10, AdCMVIP-10 Para la construcción de un adenovirus recombinante que exprese el gen murino IP-10 bajo control del promotor eucariótico del Citomegalovirus se utilizó el sistema Crelox (27). Células de bazo obtenidas de una ratona BALB/c de 8 semanas de edad se cultivaron in-vitro con medio RPMI completo en una placa de 10 cm de diámetro (TPP, Trasadingen, Suiza) y se estimularon durante 3 horas con lipopolisacárido a una concentración de 20 ng/ml (SIGMA, Madrid, España) mantenidas a 37°C y 5% de CO2.

A continuación se extrajo y purificó el ARN total de dichas células con la solución desnaturalizante de proteins Ultraspect (Biotecx Inc., Houston, TX, USA) seguida del método de Chomcznski y Sacchi (31). A partir de una muestra de 1pg de dicho RNA se realizo la técnica de transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) utilizando un termociclador (Perkin-Elmer Gene Amp PCR system 2400) para obtener y amplificar el ADN complementario (cADN) de mlP-10. El ARN total fue transcrito (60 minutos a 37°C) con 400 unidades de M-MuLV transcriptasa reversa (Gibco-BRL, Gaithersburg, Md, USA) en un volumen final de 40 ul de solución salina 5x (250mM Tris-HCI pH 8, 3, 374 mM KCI, 15mM MgCI2), suplementado con 5mM DTT, 0, 5mM desoxirribonucleótidos trifosfato (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania), 48 unidades de inhibidores de ARNsas (Promega Co., MD, USA) y 400 ng de hexámeros aleatorios (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania). Después de desnaturalizar la transcriptasa reversa (95°C, 1 minuto), una alicuota de 20 ul (1µg) del cADN fue utilizada para la amplificación de IP-10 murino por PCR en 60 il de buffer de PCR (160nM (NH4) 2SO4, 670mM Tris-HCI pH 8, 8, 0, 1% v/v Tween 20) suplementado con 1, 5 mM MgCI2, 2 unidades de Biotaq ADN polimerasa (Bioline, Londres, UK) y 1 , I 1 OmM de cebadores sentido y antisentido especificos de mlP-10 : SEQ ID NO : 1 y SEQ ID NO : 2.

La amplificación de cADN de mlP-10 se realizó con 25 ciclos (94°C, 64°C y 72°C durante 45 segundos por cada temperatura). 40 J del producto de PCR fueron separados mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1, 5% (p/v) teñido con bromuro de etidio. La banda obtenida se visualizó con una lámpara de luz ultravioleta, se corto y extrajo del gel, y el producto de la PCR se purifico mediante el kit de purificación de ADN, Ultrafree-DA (Amicon-Milipore, Madrid, España). El fragmento de 311 pares de bases correspondiente al cADN de mlP-10 se clonó en el plásmido pGEM-T utilizando el PGEM-T vector system (Promega Co. Wl, USA) mediante una reacción de ligación a 14°C durante 12 horas empleando una T4 ADN ligasa (Roche Diagnostics, Barcelona, España).

Con ei resultado de dicha ligación se transformaron bacterias competentes E. coli XL1-Blue Stratagen, La Jolla, Ca, USA) las bacterias transformadas se seleccionaron por su crecimiento en placas de Petri con medio LB con

ampicilina, ya que el vector contiene un gen de resistencia a este antibiótico. Se extrajo el ADN plasmidico de las bacterias positivas mediante la técnica de MiniPrep (Qiagen, Alemania) para, posteriormente, digerir 2ig de dicho plásmido con las enzimas Sphl/Sall (Roche Diagnostics) y separar por electroforesis el resultado de dicha digestión en un gel de agarosa al 1, 5% para comprobar la presencia del inserto. Los plásmidos con el fragmento de 311 pares de bases esperado se secuenciaron para descartar errores en la amplificación en un secuenciador automático ABI PRISM 310 (Perkin Elmer, Foster, CA, USA), utilizando el kit de secuenciación Dye Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer). El fragmento del plásmido PGEM-T/mIP- 10 conteniendo el cADN de mIP-10 con la secuencia SEQ ID NO : 3 coincidió con las secuencias SEQ ID NO : 4 y 5 descritas en la bibliografia (3, 4). Dicho fragmento se escindió mediante una digestión con las enzimas de restricción Sphl/Sall (Roche Diagnostics), el producto de la digestión se analizó en un gel de agarosa al 1, 5%, la banda conteniendo el fragmento con el cADN de mIP-10 se purificó con el Kit de purificación de ADN Ultrafree-DA (Amicon-Milipore). Los extremos se completaron mediante la enzima Klenow (Roche Diagnostics) y se subclonó en el plásmido pAdLox, previamente abierto con la enzima Bgl II (Roche Diagnostics y tratado con fosfatasa alcalina (Roche Diagnostics), mediante una ligación a 14°C durante 16 horas con la misma enzima y condiciones que en el caso anterior. Con el resultado se transformaron bacterias competentes E. coli DH-5a (Clontech, Palo Alto, CA, USA) se seleccionaron las resistentes a ampicilina y purificó el ADN plasmidico de colonias seccionadas siguiendo las técnicas descritas anteriormente. Se realizó un screening mediante una digestión con las enzimas de restricción Ncol y Smal (Roche Diagnostics) y ei producto se separó en un gel de agarosa al 1, 5% para comprobar la presencia y orientación del inserto (cADN de IP-10 murino).

El plásmido obtenido, pAdlox/mIP10, contiene un casete de expresión con mlP-10 bajo el control del promotor CMV seguido de la señal de poliadenilación (poliA), precedido por la secuencia de encapsidación del adenovirus tipo 5 humano. Una vez purificado, el pfásmido pAdlox/mIP-10 se cotransfectó en células Cre8 junto con el genoma purificado del adenovirus

recombinante defectivo y5 (figura 1A), de acuerdo con los métodos utilizados por Hardy et al. (30), para generar un adenovirus recombinante defectivo que contenga el gen de mIP-10, AdCMVIP-10 (figura 1A). EI sobrenadante resultado de dicha cotransfección se amplificó y analizó para comprobar la presencia de mlP-10 y descartar contaminación residual con el virus #5 según las técnicas descritas y empleadas por los mismos autores (30, 32).

La técnica RT-PCR fue utilizada para clonar el cADN del gen IP-10 murino a partir de células de bazo de una ratona BALB/c estimuladas con LPS.

El cADN de mlP-10 fue subclonado a continuación del promotor eucariótico CMV y precediendo a una señal poliA en plásmido Padlox que contiene la señal de empaquetamiento adenoviral y y una región lox-P, todo el conjunto esta flanqueado por los ITR adenovirales. EI adenovirus recombinante AdCMVIP-10 fue generado mediante la co-transfección del plásmido Padlox/IP-10 y el genoma del virus y5 (adenovirus defectivo en E1 y E3) en la linea celular 293 que expresa la recombinasa CRE (CRE8). La recombinación a nivel de los sitios loxP catalizada por la recombinasa Cre dirige la generación de AdCMVIP-10.

Preparación del lote de adenovirus recombinante de trabajo.

EI medio sobrenadante obtenido, conteniendo AdCMVIP-10, se utilizó para amplificar el virus. Con 3ml de dicho sobrenadante por placa, se infectaron células 293 cultivadas en placas de 150 mm de diámetro (entre 20 y 40 placas) a una confluencia del 80% durante 30 minutos a 37°C y 5% de CO2. Cuando las células presentaron efecto citopático (2-4 días) fueron recolectadas y centrifugadas a 1500 r. p. m. durante 10 min a 4°C, resuspendidas en Tris (pH 8) 0. 1 M (18ml) y almacenadas a-80°C hasta el proceso de purificación del virus.

Purificación del adenovirus.

El adenovirus, AdCMVIP-10, producido se purificó mediante dos centrifugaciones en gradientes de cloruro de cesio y posterior diálisis del lisado de las células previamente infectadas. Las células infectadas con AdCMVIP-10 almacenadas se descongelaron y resuspendieron en 18-20 ml de Tris 0, 01M (pH 7, 4) con deoxicolato sódico (SDS) al 10% en una proporción 10/1 (v/v)

durante 30 minutos a temperatura ambiente, este procedimiento se emplea para lisar las células. La solución obtenida se sometió a un proceso de homogeneizado con un homogeneizador manual de cristal preenfriado, el proceso se realizó durante 5-10 minutos en hielo, una vez terminado el proceso, se obtiene una solución homogénea en la que las células quedan totalmente disgregadas y el virus queda liberado del interior celular. A la suspensión con el virus y restos celulares resultante se le añadieron 5, 8 mi de una solución saturada de cloruro de cesio por cada 10 ml de suspensión viral. Esta mezcla se distribuyó en tubos de polihalómero para centrifugación Quick-seal (Beckman Instruments, Ca, USA), los tubos fueron equilibrados con una error de + 0, 5mg y sellados con calor. Los tubos fueron centrifugados durante 21 horas a 35. 000 r. p. m. a 4°C en un rotor de anglo fijo Beckman 50Ti en una ultracentrifugadora Beckman. Tras la centrifugación los tubos se extrajeron y la banda conteniendo el virus (la banda tiene una densidad aproximada de 1, 35gr/ml) fue extraída con una jeringa de 10ml atravesando el tubo desde una zona inferior a la banda. Las bandas de los diferentes tubos se añadieron a otro tubo Quick-seal con una solución de cloruro de cesio saturada, de forma que el gradiente de densidad final abarcara desde 1, 25gr/ml hasta 1, 4gr/ml, y se sometió a una centrifugación idéntica a la anterior. La nueva banda obtenida se extrajo de la forma indicada y se dializó frente a 1 litro de solución Tris 0, 01 M (pH 8) durante 1-2 horas a 4°C en agitación por dos veces, este proceso permite eliminar los restos de cloruro de cesio tóxico para las células. A la solución de AdCMVIP-10 concentrada se le añadió glicerol estéril (ICN, USA) como protector criogénico hasta una concentración final del 0, 5% (v/v), alicuotada en tubos de 1ml (Costar) y almacenados a-80°C.

Determinación del titulo infectivo del adenovirus.

Para determinar el titulo infectivo (unidades formadoras de placa, ufp) de la solución de AdCMVIP-10 producida se empleó el método de dilución limite en placas de 96 pocillos (TPP) con células 293 (32). Con este sistema se infectan células 293 (104células por pocillo) con diluciones seriadas de la solución viral

para determinar la máxima dilución capaz de producir efecto citopático. La titulación se realiza por triplicado para cada virus. Los titulos obtenidos fueron : AdCMVIP-10 : 3, 2x10'2 ufp/ml AdCMVIL-12 : 4, 2x10'2 ufp/ml AdCMVLacZ : 2, 11x10'2 ufp/ml Análisis por Western Blot de la proteina expresada por AdCMVIP-10.

La expresión y secreción de mlP-10 por AdCMVIP-10 se analizó mediante un ensayo de Western Blot a partir del sobrenadante de células HepG2 infectadas con dicho adenovirus. Células HepG2 cultivadas en placas de 10 cm de diámetro y a una confluencia del 75-80% se infectaron con AdCMVIP- 10 (MOI : 65) durante 1 hora a 37°C y 5% de CO2 bien se transfectaron con Padlox/IP-10 con Fugen (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante o se dejaron sin infectar (control negativo), las 3 placas se mantuvieron con 2ml de medio 1640 sin suero durante 36 horas a 37°C y 5% de CO2 Los sobrenadantes con la proteina expresada se recogieron y concentraron usando Centricom YM-3 (Amicon, Milipore Co.). Las proteins de las muestras se separaron por SDS-PAGE al 15% usando una solución tampón Tris/Tricina (33) de acuerdo con el método de Laemmli (34) y se transfirieron de acuerdo con las instrucciones del fabricante a una membrana Hybond-P (Amersham- Pharmacia Biotech Inc., Madrid España), que se bloqueo en PBS con un 0, 1% (v/v) de Tween 20 (PBS-T) y un 5% (p/v) de leche desnatada (Nestlé, Barcelona, España) a 4°C durante 16 horas. Después de lavar la membrana 5 veces durante 3 minutos en agitación con 60 ml de PBS-T, la membrana se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con una dilución 1/1000 de anticuerpo IgG policlonal de cabra frente a IP-10 de ratón (Santa Cruz Biotechnology Inc.

CA, USA) en PBS (Sigma) con un 0, 01 % de Tween 20 (Sigma) (PBS-T) y un 1 % de leche desnatada (Nestlé) La membrana fue lavada de la forma citada anteriormente e incubada con una dilución 1/5000 de anticuerpo de burro frente a IgG de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) (Santa Cruz Biotechnologies Inc.) durante 1 hora a temperatura ambiente y lavada de la misma manera. Las membranas se revelaron con el kit de detección ECL Plus

de Amersham-Pharmacia de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los resultados (figura 1 B) muestran que la infección de células HepG2 con AdCMVIP-10 da lugar a la expresión de mlP-10 y su liberación al medio sobrenadante que es detectado con anticuerpos policlonales frente a mlP-10 (calle 3). También es posible detectar mlP-10 tras la transfección, mediante complejos de liposoms, del plásmido Padlox/IP-10 (calle 4). La proteína no es detectada en células no infectadas (calle 1). 10 ng de IP-10 recombinante de ratón (R&D Systems, MN, USA) se emplearon como control positivo (calle 2).

Análisis de la biofuncionalidad de mlP-10 expresado por AdCMVIP-10.

Los ensayos de migración de células a través de una membrana permiten evaluar la capacidad quimiotáctica de una substancia. Para verificar que la proteina expresada por AdCMVIP-10 es biológicamente activa, se realizaron ensayos de migración de células T activadas, a través de membra- nas de policarbonato, en respuesta a sobrenadantes de células HepG2 infectadas con AdCMVIP-10. Células de bazo obtenidas de ratones BALB/c se cultivaron en placas de cultivo de 10 cm de diámetro durante 2 horas a 37°C y 5% de CO2 con medio RPMI 1640 completo. Tras este periodo de tiempo se recogió el medio que contiene las células de bazo no adherentes, esta suspensión de células se hizo pasar por columns de lana de nylon siguiendo el protocolo que aparece publicado en Current Protocols in Immunology (Wisley, USA) de forma que la solución final obtenida solo contiene linfocitos T y células NK. Estas células T se cultivaron con RPMI1640 completo suplementado con IL- 2 (20 lU/ml) (Peprotech) y activadas mediante la adición al medio de cultivo de 2 pLg/ml de Con A (SIGMA), tras 2 dias las células se recogieron, lavaron y resuspendieron en medio RPMI 1640 al 0, 5% de suero de ternera fetal y una concentración de 6x106 células/ml. Células HepG2 al 70-80% en placas de 10 cm de diámetro se infectaron a una MOI= 65 con AdCMVLacZ, AdCMVIP-10 o se mantuvieron sin infectar en medio RPMI 1640 al 0, 5% de suero de ternera fetal. A las 48 horas se recogió el medio de las células infectadas y no infectadas. Los ensayos de migración se realizaron en cámaras de cultivo Transwell cell culture chambers (Costar Corp., Cambridge, MA, USA) a través

de membranas de policarbonato de 6 pm de diámetro, 10 Hm de grosor, y 5 um de tamaño de poro siguiendo el protocolo descrito por Vicente-Manzanares et al. (35). En la cámara superior de cada pocillo se depositaron las cellas T activadas (100 pl a 6x106 células/ml) y en la cámara inferior los diferentes sobrenadantes obtenidos, IP-10 recombinante de ratón (100 ng/ml) o sobre- nadante de cellas infectadas con AdCMVIP-10 con anticuerpos monoclonales neutralizante frente a IP-10 de ratón (R&D) (2sug/ml). EI ensayo se mantuvo durante 2 horas a 37°C y en una atmósfera del 5% de CO2 Las membranas se fijaron en una disolución al 1% (v/v) de glutaraldehido en PBS durante 1 hora y teñidos, a continuación, en azul de toluidina al 0. 5% (p/v) en una solución de EtOH al 30% (v/v) en PBS. La cuantificación de células T que migran se Ileva a cabo contando el número de células adheridas a la cara inferior de las membranas de policarbonato ; se contaron 10 campos microscópicos por pocillo.

EI experimento se realizó por triplicado.

Como se muestra en la figura 2 el número de células T activadas atraidas por los sobrenadantes de células infectadas con AdCMVIP-10 fue signifi- cativamente mayor que en los grupos control. Este efecto es neutralizado cuando se añade anticuerpo monoclonal frente a mlP-10 y no se aprecia en los sobrenadantes de células infectadas con AdCMVLacZ. Las diferencias significativas con una p<0. 01 de acuerdo con el test de Mann-Whitney con ajuste de Bonferroni se indican con **.

Tratamiento in-vivo de tumores establecidos con AdCMVIP-10.

Para analizar la eficacia antitumoral de la transferencia génica de IP-10 mediante AdCMVIP-10 se establecieron tumores mediante la inyección sub- cutánea, con jeringas de insulina (Becton-Dickinson, España), de 5x105 células de adenocarcinoma de colon CT26 resuspendidas en 501ll de solución salina (PBS) en el flanco derecho de ratones singénicos BALB/c. Después de 10 días, cuando los tumores alcanzaron un diámetro medio de 5-8mm, se dividieron aleatoriamente los animales en grupos y fueron tratados con 109 ufp de AdCMVIP-10 en un volumen de 50 ul de solución salina (PBS), 109 ufp de adenovirus control (AdCMVLacZ) diluido en 50 pI de solución salina (PBS) o con

50 pI de solución salina (PBS) mediante su inyección intratumoral con una jeringa de precisión de 501 Hamilton. El crecimiento de los tumores fue monitorizado durante más de 60 dias midiendo dos diámetros perpendiculares del tumor empleando un calibrador de precisión. Aquellos animales con tumores que sobrepasaron 1. 5 cm en ambos diámetros tumorales o 2 cm en uno de sus diámetros fueron sacrificados por razones éticas reguladas institucionalmente y se consideró como muerte del animal. La inyección intratumoral de AdCMVIP-10 indujo la regresión tumoral completa en dos de los catorce ratones tratados y se apreció un leve retraso en el crecimiento de algunos tumores en comparación con los animales que recibieron suero salino o AdCMVLacZ, todos los tumores terminaron causando la muerte de los ratones en estos dos grupos.

En la figura 3 se puede apreciar el seguimiento individual del diámetro tumoral medio de los animales de cada grupo.

Tratamiento in-vivo de tumores establecidos mediante la combinación AdCMVIP-10 + AdCMVIL-12 Se ha descrito por los inventores de esta patente un potente efecto terapéutico antitumoral con la transferencia génica de la IL-12 mediante AdCMVIL-12 frente a adenocarcinoma de colon derivado de células CT26 empleando dosis de 109 ufp y 108 ufp (36, 37). Bajo estas condiciones, la inyección intratumoral de AdCMVIL-12 permite la erradicación tumoral en un 60- 80% de los casos. Con vistas a evaluar la eficacia antitumoral de la combinación de la transferencia génica de IP-10 e IL-12 se probó la eficacia antitumoral de la inyección de AdCMVIP-10 con dosis subterapéuticas de AdCMVIL-12 de forma que la sinergia entre ambas sustancias fuera más evidente. Para ello se establecieron tumores mediante la inyección subcutánea de 5x105 células de adenocarcinoma de colon CT26 resuspendidas en 50 1ll de solución salina (PBS) en el flanco derecho de ratones singénicos BALB/c. Después de 10 dias, cuando los tumores alcanzaron un diámetro medio de 5-8mm, se dividieron los animales en grupos y fueron tratados con : -7, 5x107 ufp de AdCMVIL-12 en un volumen de 50 pI de solución salina (PBS),

-5x108 ufp de AdCMVIP-10 + 7, 5x10' ufp de AdCMVLacZ en un volumen de 50 pI de solución salina (PBS) -7, 5x10' ufp de AdCMVIL-12 + 5x108 ufp de AdCMVLacZ en un volumen de 50 ßI de solución salina (PBS) -5x10'ufp de AdCMVIP-10 + 7, 5x10' ufp de AdCMVIL-12 en un volumen de 50 111 de solución salina (PBS) -5x108 ufp de AdCMVIP-10 + 5x10'ufp de AdCMVIL-12 en un volumen de 50 ll de solución salina (PBS) -o con 50 pI de solución salina PBS Los resultados obtenidos, figura 4, demuestran que con la dosis subterapéutica de AdCMVIL-12 (7, 5x10' ufp) silo se consiguió la desaparición tumoral en 4 de 11 ratones tratados y al retraso del crecimiento tumoral en algunos casos. Por contra, la inyección intratumoral con una combinación de AdCMVIP-10 + AdCMVIL-12 result6 en la regresión tumoral de todos los tumores tratados con las dos dosis de AdCMVIL-12 utilizadas, 7, 5x10' ufp (10 de 10) y 5x10'ufp (5 de 5). Para descartar que estos resultados puedan estar relacionado con la combinación de dos adenovirus independientemente de los transgenes expresados, se trataron otros dos grupos de animales, uno con AdCMVIP-10 + AdCMVLacZ y otro con AdCMVIL-12 + AdCMVLacZ en sus dosis correspondientes (figura 4). En el grupo de animales tratados con la combinación AdCMVIP-10 + AdCMVLacZ no se produjo ningún rechazo tumoral, tan solo un retraso en el crecimiento tumoral en 3 de 10 casos. En el grupo de animales tratados con AdCMVIL-12 + AdCMVLacZ se obtuvo una regresión tumoral en el 40% de los casos (2 de 5) en concordancia con los resultados obtenidos con la inyección de AdCMVIL-12 a la misma dosis. Estos datos demuestran que la combinación de la transferencia génica de IP-10 en combinación con la transferencia génica de IL-12 tiene como resultado una respuesta antitumoral muy importante que permite alcanzar el 100% de erradicación tumoral en este modelo, y que la administración de IP-10 potencia significativamente el efecto antitumoral de la IL-12.

Efecto a distancia de la combinación IP-10 + tL-12.

Para comprobar si la combinación IP-10+ IL-12 permite obtener ! a misma eficacia antitumoral en tumores distantes no tratados, se desarrolló otro modelo experimental mediante la inoculación bilateral de 5x105 células CT26 resus- pendidas en 50 pI de solución salina (PBS) en ambas regiones dorsolaterales, con el objeto de obtener dos tumores de manera simultánea. Dicho modelo reproduce la situación de un adenocarcinoma diseminado. Cuando estos nódulos tumorales alcanzaron un diámetro aproximado de 5-6 mm, se dividieron en grupos, se procedió a la administración intratumoral, en el tumor del lado derecho del animal, de AdCMVIL-12 (7, 5x107 ufp), AdCMVIP10 (5x108 ufp) + AdCMVIL-12 (7, 5x107 ufp) o solución salina y solución salina en todos los tumores del flanco izquierdo, el volumen inoculado fue 50 en todos los tumores. Tras el tratamiento, los tumores fueron medidos dos veces por semana, durante 90 días, para evaluar la regresión tumoral. Como se puede observar en la Tabla I, todos los ratones tratados con la combinación IP-10 + IL- 12 (6 de 6) rechazaron tanto los tumores tratados como los no tratados. Sin embargo en el grupo de ratones tratados con 7, 5x107 ufp de AdCMVIL-12 en el tumor derecho solo se produjo una remisión tumoral completa en dicho tumor tratado (1 de 6) y ninguna en los nodules distantes. En el grupo control tratado con PBS no se observó ningún rechazo tumoral. Podemos afirmar que la combinación de IP-10 + IL-12 permite obtener un potente efecto terapéutico frente a nódulos tumorales distantes no tratados directamente lo que constituye una valiosa herramienta en el tratamiento de la enfermedad metastásica diseminada.

La transferencia génica de IP-10 e IL-12 tiene un efecto sinérgico en la inducción de actividad citotóxica especifica frente al tumor.

Se ha demostrado que la transferencia génica de IL-12 induce la activación de una respuesta citotóxica frente a las células tumorales (36, 37).

Para comprobar si la combinación de IP-10 + IL-12 permite aumentar dicha respuesta se realizaron los siguientes experimentos. Ratones con tumores subcutáneos inducidos mediante la inyección de 5x105 células CT26 en 50 zI de

solución salina en el flanco derecho fueron tratados, 10 dias después de dicha inducción, con diferentes combinaciones de adenovirus (2-3 ratones por grupo) : -7, 5x10' ufp de AdCMVIL-12 en un volumen de 50 pI de solución salina (PBS), -5x108 ufp de AdCMVIP-10 + 7, 5x10' ufp de AdCMVIL-12 en un volumen de 50 µl de solución salina (PBS) - 5x108 ufp de AdCMVIP-10 en un volumen de 50 pI de solución salina (PBS) 15 dias después del tratamiento los bazos de estos animales y sus células utilizadas para medir la inducción de actividad citotóxica especifica frente a células CT26. Para ello los bazos de cada grupo de animales se disgregaron mediante el empleo de dos portas de vidrio esmerilado. A continuación se lisaron los glóbulos rojos mediante la suspensión celular en 2 mi de solución tampón de lisis ACK (PBS con 0, 83% (p/v) de (NH4)KCl2). El homogeneizado de células de bazo se lav6 mediante 3 centrifugaciones de 7 minutos a 340 g en un tubo de 50ml con 30 mi de medio RPMI 1640 limpio por lavado. A continuación se procedió a la re-estimulación de las células durante 6-7 dias en placas de 24 pocillos cultivas con medio RPMI1640 completo. En cada pocillo se re-estimularon 7-8 x106 células de bazo con 7-8x105 células CT26 tratadas previamente, para inhibir su crecimiento, con 150 pg/ml de Mitomicina C (Sigma, Madrid, España) durante 1 hora a 37°C. Después de 6-7 dias de re-estimulación se midi6 la actividad citotóxica de las células re-estimuladas mediante un ensayo de liberación del isótopo radioactivo Cr5', previamente cargado en las células diana Cuando las células diana son lisadas por las células T citotóxicas especificas frente a los antigens que dicha célula diana presenta asociados a las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad de Clase # (38) las células liberan el iótopo radioactivo intracelular. Para su marcaje las células CT26 diana fueron incubadas con 100 µCi de Na2Cr51O4 por cada 106 células durante 1 hora a 37°C. Después de la captación de esta sal de Cr5'radioactivo las células se lavaron mediante 3 centrifugaciones de 5 minutos a 280 g en un tubo de 50mi con 30 mi de medio RPMI 1640 limpio por centrifugación. Las células diana se resuspendieron en medio RPMI 1640 completo a una concen- tración de 5x104células/ml y se sembraron 100 pI/pocillo de esta suspensión en placas de 96 pocillos (5x103 células/pocillo). A continuación se añadieron

diferentes cantidades de células T citotóxicas efectoras por pocillo de forma que las pro-porciones finales célula efectora/célula diana (E : D) fueron 100 : 1, 33 : 1, 11 : 1 por cada grupo de tratamiento. En cada experimento se sembraron tres replicas por tratamiento y proporción E : D. Las células diana incubadas junto con las efectoras se incubaron durante 5 horas a 37°C en una atmósfera con un 5% de CO2, después se recogieron 501l1 de medio sobrenadante de cada pocillo y se midió la radioactividad (cuentas por minuto, cpm) en un contador estándar de radiación-y (Packard). Se determinó la liberación espontánea de Cr5'a partir de células diana cultivadas en ausencia de células efectoras en un mismo volumen final de medio e incubadas en las mismas condiciones y la liberación máxima de Cr5'a partir de células diana en las mismas condiciones que las anteriores, pero incubadas con un detergente que las lisa liberando todo el Cr"captado (Triton-X al 0. 8%). El porcentaje de lisis celular especifica se calcul6 empleando la siguiente fórmula matemática : % de lisis = 100x (cpm muestra-cpm espontánea)/ (cpm máxima-cpm espontánea).

Los resultados obtenidos se muestran en la figura 5A, se observa que la combinación de la transferencia génica de IP-10 + IL-12 induce la generación de una actividad citotóxica que ronda el 60% cuando se aplica un ratio E : D de 100 a 1. Sin embargo, la transferencia génica de IL-12 o IP-10 de forma independiente, en las mismas dosis que cuando son combinados, inducen tan solo niveles del 7-9% con un ratio de 100 a 1. La combinación de IP-10+ IL-12 permite obtener una actividad citotóxica especifica mucho mayor cuando son administradas de forma combinada que cuando cada sustancia es administrada de forma aislada e individual.

Experimentos similares se Ilevaron a cabo para demostrar que la actividad citotóxica detectada es especifica frente a cellas CT26. Células efectoras extraidas de bazos de animales con tumores similares tratados con 5x108 ufp de AdCMVIP-10 + 7, 5x10' ufp de AdCMVIL-12 en un volumen de 501 I de solución salina (PBS) se enfrentaron, en las mismas proporciones E : D, durante el mismo tiempo y mismas condiciones, frente a células P815, cellas P815 incubadas durante el ensayo con el péptido AH1, células P815 incubadas

durante el ensayo con el péptido P815AB y células YAC-1 todas ellas marcadas con Cr5'de la forma descrita anteriormente. Los péptidos AH1 (SEQ ID NO : 6) (38) y P815AB (SEQ ID NO : 7) (39), restringidos a H-2Ld fueron sintetizados siguiendo la técnica FMOC (40) y su pureza analizada por cromatografia liquida de alta afinidad (HPLC). Los niveles de liberación de Cr"se realizaron de la misma manera que el experimento anterior. Los resultados (figura 5B) muestran que se detecta actividad citotóxica exclusivamente frente a las células P815 incubadas con el péptido AH1 (determinante antigénico especifico de células CT26) mientras que frente al resto de células diana no se detecta actividad citotóxica. Con estos resultados queda demostrado que la actividad citotóxica inducida por la combinación IP-10 + IL-12 es especifica frente al tumor tratado y se reconoce uno de los antigens identificados en él (38) y presentado por la molécula del CMH-I H 2Ld Para estudiar la generación de inmunidad protectiva frente a una nueva administración de cellas tumorales, se realizó la inoculación de 5 x 105 células CT26 en 50 ul de solución salina 2 meses después de la desaparición del primer tumor en 10 animales tratados con IP-10 + IL-12. Como grupo control se utili- zaron animales sanos a los cuales se les inoculó la misma cantidad de células tumorales. En ninguno de los 10 ratones que previamente ya rechazaron el primer tumor se detectaron nódulo tumoral alguno. Todos los animales del grupo control desarrollaron tumores. Con este experimento queda demostrado el desarrollo de inmunidad sistémica protectiva después de la transferencia génica de IP-10 e IL-12.

Descripción de las figuras Figura 1A : Construcción del adenovirus recombinante defectivo que contiene el gen murino IP-10 (AdCMVIP-10).

Figura 1B : Análisis mediante la técnica de Western Blotting con un anticuerpo policlonal frente a la proteína murina IP-10 de sobrenadantes de células HepG2 no transfectadas (1), infectadas con AdCMVIP-10 a una MOI de 65 (3), trans-

fectadas con el plásmido pAdloxlP-10 (4) y proteína IP-10 recombinante de ratón como control positivo (2).

Figura 2 : Ensayo de biofuncionalidad de IP-10 codificada por AdCMVIP-10 mediante la cuantificación de la capacidad para atraer linfocitos T activados : Ensayo de transmigración a través de una membrana de policarbonato con poros de 5pm de diámetro que separa dos cámaras, en la inferior se encuentra la sustancia quimiotáctica y en la superior blastos de células T activadas con ConA. La actividad quimiotáctica de proteina IP-10 recombinante (rlP-10) de ratón purificada a una concentración de 10ng/ml, sobrenadante de células HepG2 infectadas 48 horas antes con AdCMVLacZ, AdCMVIP-10 (con o sin anticuerpos neutralizantes anti IP+10 MAb) o células no infectadas, control (C) en abcisas, es cuantificada mediante el recuento por campo microscópico de blastos del número de células T estimuladas con Con-A adheridas a la cara inferior de la membrana (número celúlas/campo (40x) en ordenadas).

Figura 3 : Efectos de la inyección intratumoral con AdCMVIP-10.

Nódulos tumorales inducidos en ratones BALB/c mediante la inoculación subcutánea de 5x106 cellas CT26 en el flanco derecho fueron inyectados intra- tumoralmente 9 dias después con B) AdCMVIP-10 (109 upf), C) AdCMVLacZ (109 upf) o A) con solución salina (PBS), como control. La evolución individual (en dias, abcisas) de los tumores fue evaluada midiendo dos diámetros perpendiculares. El valor representado en ordenadas es la media aritmética de ambos diámetros, en mm.

Figura 4 : Combinación de AdCMVIP-10 e AdCMVIL-12.

Grupos de ratones con tumores subcutáneos de cellas CT26 recibieron una inyección intratumoral 9 dias después de la inducción tumoral con los adenovirus : B) AdCMVIL-12, C) AdCMVIP-10 + AdCMVLacZ, D) AdCMVIP-10 + AdCMVIL-12, E) AdCMVLacZ + AdCMVIL-12, F) AdCMVIP-10 + AdCMVIL-12 o A) solución salina. La evolución del diámetro tumoral fue monitorizada individualmente (dias postratamiento en abcisas). Las dosis administradas y la

fracción de animales cuyos tumores fueron rechazados,-en quebrado y %- aparecen también indicados.

Figura 5 : La transducción intratumoral con IP-10 e IL-12 permite aumentar los linfocitos T citotóxicos especificos frente al tumor A. Se extrajeron los bazos de ratones Balb/c con tumores subcutáneos de células CT26 tratados con los adenovirus indicados. Las células de dichos bazos fueron re-estimulados in-vitro durante 6 días con células CT26 tratadas con Mitomicina-C para, posteriormente, medir su actividad citotóxica frente a células CT26 mediante ensayos de liberación de Crude 5 horas de duración.

Los datos representan en ordenadas la media de los niveles de lisis especifica (%) + EEM a diferentes proporciones de células efectoras frente a células diana (E : D), en abcisas, a partir de tres experimentos independientes.

B. Células de bazo de ratones que rechazaron tumores de células CT26 después del tratamiento con AdCMVIP-10 y AdCMVIL-12 se cultivaron in- vitro durante 6 días con células CT26 tratadas con Mitomicina-C. Se estudio la actividad citotóxica de los linfocitos de dichos bazos frente a células P815, YAC-1, P815 + 10ng/ml de los octapéptidos indicados AH1 o P815AB (péptido control) mediante ensayos de liberación de Cr'. Los datos representan en ordenadas la media de lisis especifica EEM de dos experimentos. Con respecto al ratio (E : D) en abcisas, de células efectoras frente a células diana.

Bibüoeraiia 1. Luster, A. D., and J. V. Ravetch 1987. Genomic characterization of a gamma- interferon-inducible gene (IP-10) and identification of an interferon-inducible hypersensitive site. Mol Cell Biol 7:3723.

2. Farber, J. M. 1997. Mig and IP-10 : CXC chemokines that target lymphocytes. J Leukoc Biol 61 : 246.

3. Ohmori, Y., and T. A. Hamilton. 1990. A macrophage LPS-inducible early gene encodes the murine homologue of IP-10. Biochem Biophys Res Cominun 168 : 1261.

4. Vanguri, P., and J. M. Farber. 1990. Identification of CRG-2. An interferon- inducible mRNA predicted to encode a murine monokine. J Biol Chem 265:15049.

5. Loetscher, M., P. Loetscher, N. Brass, E. Messe, and B. Moser. 1998. Lymphocyte specific chemokine receptor CXCR3 : regulation, chemokine binding and gene localization. Eur JImmunol 28 : 3696.

6. Weng, Y., S. J. Siciliano, K E. Waldburger, A. Sirotina-Meisher, M. J. Stank B.

L. Daugherty, S. L. Gould, M. S. Springer, and J. A. DeMartino. 1998. Binding and functional properties of recombinant and endogenous CXCR3 chemokine receptors J Biol Chem 273:18288.

7. Tamaru, M., Y. Tominaga, K. Yatsunami, and S. Naomi. 1998. Cloning of the murine interferon-inducible protein 10 (IP-10) receptor and its specific expression in lymphoid organs. Biochem Biophys Res Commun Z51 : 41.

8. Taub, D. D., A. R. Lloyd, K. Conlon, J. M. Wang, J. R. Ortaldo, A. Harada, K.

Matsushima, D. J. Kelvin, and J. J. Oppenheim. 1993. Recombinant human interferon-inducible protein 10 is a chemoattractant for human monocytes and T

lymphocytes and promotes T cell adhesion to endothelial cells. J Exp Med 177.-1809.

9. Loetscher, P., M. Seitz, I. Clark-Lewis, M. Baggiolini, and B. Moser. 1996.

Activation of NK cells by CC chemokines. Chemotaxis, Ca2+ mobilization, and enzyme release. J Immunol 156:322.

10. Taub, D. D., T. J. Sayers, C. R. Carter, and J. R Ortaldo. 1995. Alpha and beta chemokines induce NK cell migration and enhance NK-mediated cytolysis. J Immunol 155 : 3877.

11. Luster, A. D., and P. Leder. 1993. IP-10, a -C-X-C- chemokine, elicits a potent thymus-dependent antitumor response in vivo. J Exp Med 178:1057.

12. Sgadari, C., A. L. Angiolillo, B. W. Chemey, S. E. Pike, J. M. Farber, L. G.

Koniaris, P. Vanguri, P. R-Burd, N. Sheikh, G. Gupta, J. Teruya-Feldstein, and G.

Tosato. 1996. Interferon-inducible protein-10 identified as a mediator of tumor necrosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S a 93:13791.

13. Angiolillo, A. L., C. Sgadari, D. D. Taub, F. Liao, J. M. Farber, S. Maheshwari, K K. Kleinman, G. H. Reaman, and G. Tosato. 1995. Human interferon-inducible protein 10 is a potent inhibitor of angiogenesis in vivo. J Exp Med 182:155.

14. Angiolillo, A. L., C. Sgadari, and G. Tosato. 1996. A role for the interfaon- inducible protein 10 in inhibition of angiogenesis by interleulan-12. Ann N YAcad Sci 795 : 158.

15. Luster, A. D., S. M. Greenberg, and P. Leder. 1995. The IP-10 chemokine binds to a specific cell surface heparan sulfate site shared with platelet factor 4 and inhibits endothelial cell proliferation. J Exp Med 182:219.

16. Kanegane, C., C. Sgadari, H. Kanegane, J. Teruya-Feldstein, L. Yao, G. Gupta, J.

M. Farber, F. Liao, L. Liu, and G. Tosato. 1998. Contribution of the CXC chemokines IP-10 and Mig to the antitumor effects of IL-12. J Leukoc Biol 64:384.

17. Dilloo, D., K. Bacon, W. Holden, W. Zhong, S. Burdach, A. Zlotnik, and M.

Brenner. 1996. Combined chemokine and cytokine gene transfer enhances antitumor immunity [see comments]. Nat Med 1 : 1090.

18. Maric, M., L. Chen, B. Sherry, and Y. Liu. 1997. A mechanism for selective recruitment of CD8 T cells into BV transfectod plasmacytoma role of macrophage-inflammatory protein 1alpha. J Immunol 159 : 360.

19. Ramarathinam, L., M. Castle, Y. Wu, and Y. Liu. 1994. T cell costimulation by B7/BB1 induces CD8 T cell-dependent tumor rejection : an important role of B7/BB1 in the induction, recruitment, and effector function of antitumor T cells. I Exp Med 179 : 1205.

20. Emtage, P. C., Y. Wan, M. Hitt, F. L. Graham, W. J. Muller, A. Zlotnik, and J.

Gauldie. 1999. Adenoviral vectors expressing lymphotactin and intoricukin 2 or lymphotactin and interleulån 12 synergie to facilitate tumor regression in munne breast cancer models (see comments]. Hum Gene Ther 10 : 697.

21. Trinchieri, G. 1998. Interieukin-12 : a cytokine at the interface of inflammation and immunity. Adv Immunol 70 : 83.

22. Johnson, L. L., and P. C. Sayies. 1997. Interleukin-12, dendritic cells, and the initiation of host-protective mechanisms against Toxoplasma gondii [comment]. J Exp Med 186 : 1799.

23. Ma, X., M. Aste-Amezaga, G. Gri, F. Gerosa, and G. Trinchicri. 1997 Immunomodulatory functions and molecular regulation of IL-12. Chem Immwto, 68 : 1.

24. Voest, E. E., B. M. Kenyon, M. S. O'Reilly, G. Truitt, R J. D'Amato, and J.

Folkman. 1995. Inhibition of angiogenesis in vivo by interieukin 12 [see commet. J Natl Cancer Inst 87 : 581.

25. Car, B. D., V. M. Eng, J. M. Lipman, and T. D. Anderson. 1999. The toxicology of interleukin-12 : a review. Toxicol Pathol 27 : 58.

26. Lotze, M. T., L. Zitvogel, R Campbell, P. D. Robbins, E. Elder, C. Haluszczak, D.

Martin, T. L. Whiteside, W. J. Storkus, and H. Tahara. 1996. Cytokine gene therapy of cancer using interleukin-12 : munne and clinical trials. Am N Y Acad Sci 795 : 440.

27. Hardy, S., M. Kitamura, T. Harris-Stansil, Y. Dai, and M. L. Phipps. 1997.

Construction of adenovirus vectors through Cre-lox recombination. J Virol 71:1842.

28. Qian, C., M. Idoate, R Bilbao, B. Sangro, 0. Bruna, J. Vaquez, and J. Prieto. 1997.

Gene transfer and therapy with adenoviral vector in rats with diethylnitrosamine- induced hepatocellular carcinoma. Hum Gene Ther 8 : 349.

29. Qian, C., R Bilbao, O. Bnma, and J. Prieto. 1995. Induction of sensitivity to ganciclovir in human hepatoceüular carcinoma cells by adenovirus-mediated gene transfer of herpes simpiex virus thymidine kinase. Hepatology 22:118.

30. Brattain, M. G., J. Strobel-Stevens, D. Fine, M. Webb, and A. M. Sarrif. 1980.

Establishment of mouse colonic carcinoma cell lines with different metastatic properties. Cancer Res 40:2142.

31. Chomczynsky P ; Sacchi N. 1987. Single-step of RNA isolation by acid guanidin thiocyanate-phenol-cloroform extraction. Anal. Biochem. 162 : 156-159 32. Hitt, M et al. 1995 In Methods in Molecular Genetics, ei Adolph, KW Vol 7 33. Schagger, H., and G. von Jagow. 1987. Tricine-sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem 166 : 368.

34. Laemmli, U. K. 1970. Nature 227 : 680-685.

35. Vicente-Manzanares, M., M. C. Montoya, M. Mellado, J. M. Frade, M. A. dei Pozo, M. Nieto, M. O. de Landazuri, A. C. Martin= and F. Sanchez-Madrid. 1998. The chemokme SDF-lalpha triggers a chemotactic response and induces cell polarization in human B lymphocytes. Eur Jimmunol 28 : 2197.

36. Mazzolini G. et al. 1999. Regression of colon cancer and induction of antitumor immunity by intratumoral injection of adenom enressing interlebl2. Cancer Gene Ther. 1999 Nov-Dec ; 6 (6) : 514-22.

37. Mazzolini G. et al. 2000. Adenoviral gene transfer of interleukin 12 into tumors synergizes with adoptive T cell therapy both at the induction and effector level.

Hum Gene Ther. Jan 1 ; l 1 (1) : 113-25.

38. Huang, A. Y., P. H. Gulden, A. S. Woods, M. C. Thomas, C. D. Tong, W. Wang, V.

H. Engelhard, G. Pastesnack, R Cotter, D. Hunt, D. M. Pardoll, and E. M. Jaffee.

1996. The immunodomìnant major histocompatibility complex class I-restricted antigen of a murine colon tumor derives from an endogenous retroviral gene product. Proc lÇatl Acod Sci USA 93. 9730.

39. Van den Eynde, B., B. Lethe, A. Van Pei, E. De Plaen, and T. Boon. 1991. The gene coding for a major tumor rejection antigen of tumor P815 is identical to the normal gene of syngeneic DBA/2 mice. J Exp Med 173:1373.

40. Borras-Cuesta, F., A. Petit-Camurdan, and Y. Fedon. 198 ?. Engineering of immunogenic peptides by co-linear synthesis of determmants recognized by B and T cells. Eur JImmunol 17 : 1213.