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Title:
COMPONENTS AND METHOD FOR ENZYMATIC SYNTHESIS OF NUCLEIC ACIDS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2008/043426
Kind Code:
A3
Abstract:
The invention relates to nucleotide analogues containing a sterically-hindered macromolecular ligand and a marker. Said nucleotide analogues can be used for enzymatic synthesis and sequencing of nucleic acids.

Inventors:
BAEUML ENGLBERT (DE)
CHERKASOV DMITRY (DE)
Application Number:
PCT/EP2007/008198
Publication Date:
May 28, 2009
Filing Date:
September 20, 2007
Export Citation:
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Assignee:
GENOVOXX GMBH (DE)
BAEUML ENGLBERT (DE)
CHERKASOV DMITRY (DE)
International Classes:
C07H21/00; C07H19/10; C07H19/20; C12Q1/68
Domestic Patent References:
WO2005044836A22005-05-19
WO2006097320A22006-09-21
WO2003048178A22003-06-12
WO1988002784A11988-04-21
WO2004092331A22004-10-28
Foreign References:
US20030054396A12003-03-20
Attorney, Agent or Firm:
CHERKASOV, Dmitry (Maria-Göppert-Str. 1 ICL, Lübeck, DE)
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Claims:
Komponenten und Verfahren zur enzymatischen Synthese von Nukleinsäuren

Ansprüche

Anspruch 1: Nukleotid-Analoga (modifizierte Nuk-Makromoleküle), die folgende Komponenten einschließen: zumindest eine Nukleotid-Komponente (Nuk-Komponente), zumindest einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden, zumindest einen Marker, zumindest einen Linker.

Anspruch 2: Nukleotid-Analoga nach Anspruch 1, wobei der jeweilige Linker, der an die Nukleotid-Komponente gekoppelt ist, spaltbar ist.

Anspruch 3: Ein Reaktionsgemisch, das mindestens eines der Nukleotid-Analoga nach Anspruch 1 oder 2 einschließt

Anspruch 4: Eine Komposition, die mindestens eines der Nukleotid-Analoga nach Anspruch 1 oder 2 einschließt

Anspruch 5: Eine Nukleinsäurekette oder ein Gemisch von Nukleinsäureketten, die mindestens eines der Nukleotid-Analoga nach Anspruch 1 oder 2 als Monomer der Nukeinsäurekette einschließen, wobei sich die Nukleinsäureketten sowohl in der Lösung befinden können oder an einer festen Phase fixiert sein.

Anspruch 6: Eine Nukleinsäurekette oder ein Ein Gemisch von Nukleinsäureketten nach Anspruch 5, wobei diese Nukleinsäureketten eine Primerfunktion haben

Anspruch 7: Verfahren zur enzymatischen Synthese von Nukleinsäureketten, bei dem Nukleotid-Analoga nach Anspruch 1 oder 2 eingesetzt werden.

Anspruch 8: Ein Verfahren zur Synthese von Nukleinsäureketten, das folgende Schritte einschließt: o Bereitstellung von extensionsfähigen Matrize-Primer-Komplexen o Inkubation dieser Komplexe in einer Reaktionslösung, die eine oder mehrere Polymerase-Arten und zumindest eine Art der modifizierten

Nuk-Makromoleküle nach Anspruch 2 enthält, unter Bedingungen, die eine Primer-Verlängerung um ein modifiziertes Nuk-Makromolekül erlauben, wobei das modifizierte Nuk-Makromolekül in Art und Weise

modifiziert ist, dass sein Einbau zu einem Stopp in der weiteren enzymatischen Reaktion führt.

Anspruch 9: Kit zur Durchführung der enzymatischen Synthese von Nukleinsäureketten, das folgende Elemente einschließt: o Eine oder mehrere Arten der Polymerasen o Zumindes eins der Nukleotid-Analoga, nach Anspruch 1 oder 2

Anspruch 10: Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten, das folgende Elemente einschließt: o Eine oder mehrere Arten der Polymerasen o Zumindes eins der Nukleotid-Analoga, nach Anspruch 2

Anspruch 11: Ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleisäureketten, das folgende Schritte einschließt:

a) Bereitstellung von mindestens einer Population an extensionsfähigen Nukleinsäureketten-Primer-Komplexen (NSK-Primer-Komplexe)

b) Inkubation von mindestens einer Art der modifizierten Nuk-

Makromoleküle nach Anspruch 2 zusammen mit zumindest einer Art der Polymerase mit den im Schritt (a) bereitgestellten NSK-Primer- Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von komplementären modifizierten Nuk-Makromolekülen zulassen, wobei jede Art der modifizierten Nuk-Makromoleküle eine für sie charakteristische

Markierung besitzt.

c) Entfernung der nicht eingebauten modifizierten Nuk-Makromoleküle von den NSK-Primer-Komplexen

d) Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen

e) Abspaltung der Linker-Komponente sowie der Marker-Komponente und des makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden von den in die

NSK-Primer-Komplexe eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen

f) Waschen der NSK-Primer-Komplexe

gegebenenfalls Wiederholung der Schritte (b) bis (f),

Anspruch 12: Ein Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Nukleinsäureketten an eine feste Phase in zufälliger Anordnung gekoppelt sind und zumindes ein Teil dieser NSK- Primer-Komplexen optisch einzeln adressierbar ist

Anspruch 13: Ein Verfahren nach Anspruch 11 zur parallelen Sequenzanalyse von Nukleinsäuresequenzen (Nukleinsäureketten, NSKs), bei dem man

Fragmente (NSKFs) einzelsträngiger NSKs mit einer Länge von etwa 50 bis 1000 Nukleotiden erzeugt, die überlappende Teilsequenzen einer Gesamtsequenz darstellen können, man

die NSKFs unter Verwendung eines einheitlichen oder mehrerer unterschiedlichen Primer in Form von NSKF-Primer-Komplexen auf einer

Reaktionsoberfläche in einer zufälligen Anordnung bindet, wobei die Dichte der an die Oberfläche gebudenen NSKF-Primer-Komplexen eine optische Detektion der Signale von einzelnen eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen zuläßt, man

eine zyklische Aufbaureaktion des komplementären Stranges der NSKFs unter Verwendung einer oder mehrerer Polymerasen durchführt, indem man a) zu den auf der Oberfläche gebundenen NSKF-Primer-Komplexen eine Lösung zugibt, die eine oder mehrere Polymerasen und ein bis vier modifizierte Nuk-Makromoleküle nach Anspruch 2 enthält, die eine mit fluoreszierenden Elementen markierte Marker-Komponente haben, wobei die bei gleichzeitiger Verwendung von mindestens zwei modifizierte Nuk- Makromoleküle jeweils an die Marker-Komponente befindlichen fluoreszierenden Elementen so gewählt sind, dass sich die verwendeten modifizierten Nuk-Makromoleküle durch Messung unterschiedlicher Fluo- reszenzsignale voneinander unterscheiden lassen, wobei die modifizierten Nuk-Makromoleküle strukturell so modifiziert sind, dass die Polymerase nach Einbau eines solchen modifizierten Nuk-Makromoleküls in einen wachsenden komplementären Strang nicht in der Lage ist, ein weiteres Nuk-Nakromolekül in denselben Strang einzubauen, wobei die Linker-

Komponente mit der Marker-Komponente und dem makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden abspaltbar sind, man

b) die in Stufe a) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen inkubiert, die zur Verlängerung der komplementären Stränge geeignet sind, wobei die komplementären Stränge jeweils um ein modifiziertes Nuk- Makromolekül verlängert werden, man

c) die in Stufe b) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung nicht in einen komplementären Strang eingebauter modifizierter Nuk-Makromoleküle geeignet sind, man

d) die einzelnen, in komplementäre Stränge eingebauten modifizierten Nuk-Makromoleküle durch Messen des für den jeweiligen fluoreszierenden Elementen charakteristischen Signals detektiert, wobei man gleichzeitig die relative Position der einzelnen Fluoreszenzsignale auf der Reaktionsoberfläche bestimmt, man

e) zur Erzeugung unmarkierter NSKFs die Linker-Komponente und die Marker-Komponente, sowie den makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden von den am komplementären Strang angefügten modifizierten Nuk-Komponenten abspaltet, man

f) die in Stufe e) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung der Marker-Komponente geeignet sind, man

die Stufen a) bis f) gegebenenfalls mehrfach wiederholt,

wobei man die relative Position einzelner NSKF-Primer-Komplexe auf der Reaktionsoberfläche und die Sequenz dieser NSKFs durch spezifische Zuordnung der in Stufe d) in aufeinanderfolgenden Zyklen an den jeweiligen Positionen detektierten Fluoreszenzsignale zu den modifizierten Nuk-Makromolekülen bestimmt.

Anspruch 14: Ein Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus nur jeweils eine Art der modifizierten Nuk-Makromoleküle einsetzt.

Anspruch 15: Ein Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus jeweils zwei unterschiedlich markierte Arten der modifizierten Nuk- Makromoleküle einsetzt.

Anspruch 16: Ein Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus jeweils vier unterschiedlich markierte Arten der modifizierten Nuk- Makromoleküle einsetzt.

Anspruch 17: Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 11 bis 15, das folgende Elemente einschließt: o Eine oder mehrere Arten der Polymerasen o Zumindes eins der Nukleotid-Analoga, nach Anspruch 2 o Lösungen zur Durchführung von zyklischen Sequenzierungsschritten

Anspruch 18: Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach dem Verfahren von einem der Ansprüche 8 oder 11 bis 15, das einer oder mehrere der folgenden Kompositionen - vorliegend als Lösung in konzentrierter oder in verdünter Form oder auch als Gemisch von trockenen Substanzen - aus der folgenden Liste einschließt: o Eine oder mehrere Arten der Polymerasen o Zumindes eins der Nukleotid-Analoga, nach Anspruch 2 o Lösungen zur Durchführung von zyklischen Sequenzierungsschritten o Komposition für Einbaureaktion / Extensionsreaktion o Komposition für Waschen der festen Phase nach der Einbaureaktion o Komposition für optische Detektion der Signale an der festen Phase o Komposition für Abspaltung des Markers und des sterisch anspruchsvollen makromolekularen Liganden o Komposition für Waschen der festen Phase nach der Abspaltung des Markers und des sterisch anspruchsvollen makromolekularen Liganden o Komposition für Blockade des Linker-Rests o Komposition für Waschen der festen Phase nach der Blockade des Linker

Rests o Komposition zur Bindung von signalgebenden Marker-Einheiten an den Marker o Komposition mit signalgebenen Marker-Einheiten

Anspruch 19: Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach Anspruch 18, das weiterhin eine oder mehrere Elemente aus der folgende Liste einschließt: o Komposition mit nicht modifizierten Nukleotiden (dNTPs oder NTPs) o Komposition mit irreversibel Terminatoren (ddNTPs) o Komposition mit Terminaler Transferase o Komposition mit einem Puffer für Transferasen-Reaktion o Komposition mit einer Ligase

o Komposition von Oligonukleotiden, die als einheitliche Primer- Bindungsstelle an die Nukleinsäuren ligiert werden können. o Komposition mit einem Puffer für Ligsereaktion-Reaktion o Feste Phase und Reagenzien zur Preparation von Nukleinsäureketten zur Sequenzierung, o Feste Phase und Reagenzien zur Präparation von Polymerase zur Sequenzierung o Vorrichgung und Reagenzien zur Vorbereitung von Nukleotid-Analoga nach

Anspruch 2 zur Sequenzierung. o Komposition mit Blockierungsreagezien zur Unterdrückung von unspezifischen Adsorption von markierten Molekülen o Feste Phase zur Durchführung von zyklischen Einbaureaktionen

Anspruch 20: Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach einem der Ansprüche 9, 10, 17, 18 oder 19, das eine oder mehrere Polymerasen aus der folgenden Liste einschließt: o Reverse Transcriptasen: M-MLV, RSV, AMV, RAV, MAV, HIV o DNA Polymerasen: Klenow Fragment DNA Polymerase, Klenow Fragment exo minus DNA Polymerase, T7 DNA Polymerase, Sequenase 2, Vent DNA Polymerase, Vent exo minus DNA Polymerase, Deep Vent DNA

Polymerase, Deep Vent exo minus DNA Polymerase, Taq DNA Polymerase, TIi DNA Polymerase, Pwo DNA Polymerase, Thermosequenase DNA Polymerase, Pfu DNA Polymerase

Anspruch 21 : Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach einem der Ansprüche 9, 10, 17, 18 oder 19, in dem die Bestandteile der Kompositionen breits gemischt sind oder als getrennte Substanzen vorliegen.

Anspruch 22: Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach einem der Ansprüche 9, 10, 17, 18 oder 19, das eine oder mehrere feste Phasen zur Durchführung von zyklischen Sequenzierungsschritten aus der folgenden Liste einschließt: o Plane, transparente feste Phase o Plane, transparente feste Phase, die als Bestandteil einer Flow-Cell oder eines Chips bereitgestellt ist o Feste Phase in Form von Nano- oder Mikrokügelchen o Feste Phase in Form von Nano- oder Mikrokügelchen, die paramagnetisch sind o Feste Phase vorbereitet nach DE 101 49 786 o Feste Phase vorbereitet nach DE 10 2004 025 744

Anspruch 23: Ein Verfahren zur Synthese von Nukleinsäureketten, das folgende Schritte einschließt: a) Bereitstellung von extensionsfähigen Matrize-Primer-Komplexen b) Einbaureaktion: Inkubation dieser Komplexe in einer Reaktionslösung, die eine oder mehrere Polymerase-Arten und zumindest eine Art der modifizierten Nuk- Makromoleküle nach Anspruch 2 enthält, unter Bedingungen, die eine Primer- Verlängerung um ein modifiziertes ein Nuk-Makromolekül erlauben, wobei das modifizierte Nuk-Makromolekül in Art und Weise modifiziert ist, dass sein Einbau zu einem Stopp in der weiteren enzymatischen Reaktion führt. c) Inkubation der Matrize-Primer-Komplexe unter den Bedingungen die zur Trennung der oben genannten Primer mit eingebauten Nukleotid-Analoga von den Matrizen führen. d) Optionelle Wiederholung der Schritte (b) und (c) e) Applikation der erhaltenen markierten Primer auf ein Trennmedium oder in ein

Trennverfahren f) Gegebenenfalls Identifizierung der Art des eingebauten Nukleotid-Analoges

Die zyklischen Schritte können mehrmals wiederholt werden, beispielsweise 2 bis 10 mal, 10 bis 20 mal, 20 bis 100 mal, 100 bis 500 mal. Die Identifizierung der eingebauten Nukleotid-Analoga erfolgt durch den Marker.

Anspruch 24: Ein Verfahren zur Synthese von Nukleinsäureketten, das folgende Schritte einschließt: a) Bereitstellung von extensioinsfähigen Matrize-Primer-Komplexen, die adressierbare Positionen haben b) Einbaureaktion: Inkubation dieser Komplexe in einer Reaktionslösung, die zumindes eine Polymerase-Art und zumindest eine Art der modifizierten Nuk- Makromoleküle nach Anspruch 24 enthält, unter Bedingungen, die eine Primer- Verlängerung um ein modifiziertes Nuk-Makromolekül erlauben, wobei das modifizierte Nuk-Makromolekül in Art und Weise modifiziert ist, dass sein Einbau zu einem reversiblen Stopp in der weiteren enzymatischen Reaktion führt. c) Gegebenenfalls Verwendung von Reinigungsschritten von Matrize-Primer- Komplexen d) Gegebenenfalls Identifizierung der Art des eingebauten Nukleotid-Analoges durch Erfassung der Markereigenschaften, wobei eine örtliche Zuordnung der Signale zu bestimmen Primer-Matrize-Komplexen erfolgen kann e) Entfernung des zur Termination führenden makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden und gegebenenfalls des Markers

f) Falls erforderlich Verwendung von Reinigungsschritten von Matrize-Primer- Komplexen g) Gegenebenfalls Wiederholung der Schritte (b) bis (f) und anschließende Analyse der identifizierten Signale von eigebauten Nukleotid-Analoga.

Die zyklischen Schritte können mehrmals wiederholt werden, beispielsweise 2 bis 10 mal, 10 bis 20 mal, 20 bis 100 mal, 100 bis 500 mal. Die Identifizierung der eingebauten Nukleotid-Analoge erfolgt durch den Marker.

Anspruch 25: Nukleotid-Analoga (modifizierte Nuk-Makromoleküle) mit der Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei folgende Anordnungen der Komponenten eingeschlossen werden:

(Nuk-Linker l) n -(Ligand) k -(Marker) m (Nuk-Linker l) n -(Ligand-Linker 3) k -(Marker) m

(Nuk-Linker l) n -(Ligand) k -(Linker 3-Marker) m

(Nuk-Linker l) n -(Marker) m -(Ligand) k

(Nuk-Linker l-Ligand) n -(Marker) m

(Ligand-Linker 2-Nuk-Linker l) n -(Marker) m (Nuk-Linker l) n -(Marker/ügand) m

(Nuk-Linker l-Ligand) n -(Marker) m -(Linker 1-Nuk) n

wobei :

Nuk - eine Nuk-Komponente ist Linker - eine Linker-Komponente ist, wobei Linker 1 oder Linker 2 oder Linker

3 gleiche oder auch unterschiedliche Struktur haben können

Marker - eine Makrer-Komponente ist

Ligand - ein makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand ist

Marker/Ligand - eine Struktur, die sowohl Marker-Eigenschaften als auch Eigenschaften eines makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden hat

(n) - eine Zahl von 1 bis 100000 ist.

(m) - eine Zahl von 1 bis 1000

(k) - eine Zahl von 1 bis 1000

Wobei in einer Ausführungsform der Strukturen, die Verhältnisse im Molekül folgendermassen verteilt sind : (n)>=(m)>=(k), wobei die einzelnen Zahlen unabhängig von einander variiert werden können.

In einer weiteren Ausführungsform der Struktur, die Verhältnisse im Molekül folgendermassen verteilt sind : (n)>(m)>(k), wobei die einzelnen Zahlen unabhängig von einander variiert werden können.

In einer weiteren Ausführungsform der Struktur, die Verhältnisse im Molekül folgendermassen verteilt sind : (n) = <(m)>(k), wobei die einzelnen Zahlen unabhängig von einander variiert werden können.

Anspruch 26: Nukleotid-Analoga nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 25, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (Fig. 3A):

Wobei:

Base - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7- Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren Modifikationen, wobei L die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente darstellt (Kopplungseinheit L) und X die Kopplungsstelle der Kopplungseinheit L an der Base ist

R 1 - ist H

R 2 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Halogen, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe

R 3 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Halogen, PO 3 , SH, N 3 , NH 2 , 0-R 3-1 , P(O) m -R 3-1 (m ist 1 oder 2 ist), NH-R 3-1 , S-R 3-1 , Si-R 3-1 wobei R 3-1 eine chemisch, photochemisch oder enzymatisch spaltbare Gruppe ist, oder eine der folgenden Modifikationen einschließt: -CO-Y, -CH 2 -O-Y, -CH 2 -S-Y, -CH 2 -N 3 , - CO-O-Y, -CO-S-Y, -CO-NH-Y, -CH 2 -CH=CH 2 , wobei Y ein Alkyl ist, beispielsweise (CH 2 ) n -CH 3 wobei n zwischen O und 4 liegt, oder ein substituiertes Alkyl ist, beispielsweise mit Halogen, Hydroxy, Amino, Carboxy- Gruppen). R 4 - ist H oder OH R 5 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe OH, oder eine geschützte OH-

Gruppe, eine Monophosphat-Gruppe, oder eine Diphosphat-Gruppe, oder eine Triphosphat-Gruppe, oder eine Alpha-Thiotriphosphat-Gruppe ist.

Anspruch 27: Nukleotid-Analoga nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 25, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (Fig. 3B) :

Wobei :

Base - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7- Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren zu enzymatischen Reaktionen fähigen Modifikationen

R 1 - ist H

R 2 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, HaI, NH 2 , SH oder geschützte OH-Gruppe

R 3 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe O- R 3 - 2 -L / P(O) m - R 3 - 2 -L, wobei m 1 oder 2 ist, NH-R 3-2 -L, S-R 3-2 -L, Si-R 3-2 -L oder, wobei R 3-2 die Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid bzw. Nuk-Komponente ist und L - die Kopplungseinheit des Linkers (L) ist.

R 4 - ist H oder OH

R 5 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe OH, oder eine geschützte OH- Gruppe, eine Monophosphat-Gruppe, oder eine Diphosphat-Gruppe, oder eine Triphosphat-Gruppe, oder eine Alpha-Thiotriphosphat-Gruppe ist.

Anspruch 28: Nukleotid-Analoga nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 25, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (Fig. 3B):

Wobei :

Base - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7- Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren zu enzymatischen Reaktionen fähigen Modifikationen

Ri - ist H

R 2 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, HaI, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe

R 3 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, HaI, PO 3 , SH, NH 2 , O- R 3-i , P(0)m- R 3-I , NH-R 3-I , S-R 3-I , Si-R 3-I wobei R 3-I eine chemisch, photochemisch oder enzymatisch spaltbare Gruppe ist und m 1 oder 2 ist.

R 4 - ist H oder OH

R 5 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe O- R 5-I -L, oder P-(O) 3 - R 5-I -L (modifizierte Monophosphat-Gruppe), oder P-(O) 3 -P-(O) 3 -R 5 .i-L (modifizierte Diphosphat-Gruppe) oder P-(O) 3 -P-(O) 3- P-(O) 3 - R 5-I -L (modifizierte Triphosphat-Gruppe), wobei R 5-I die Kopplungsstelle der Kopplungseinheit L an das Nukleotid bzw. Nuk-

Komponente ist und Kopplungseinheit L die Verbindung zwischen der Nuk- Komponente und der Linker-Komponente ist.

Anspruch 29: Nukleotid-Analoga nach einem der Ansprüche 26 bis 28, wobei Kopplungseinheit L folgende strukturelle Elemente einschließt:

R 6 -NH-R 7 , R 6 -O-R 7 , R 6 -S-R 7 , R 6 -SS-R 7 , R 6 -CO-NH-R 7 , R 6 -NH-CO-R 7 , R 6 -CO-O-

R 7 , R 6 -O-CO-R 7 , R 6 -CO-S-R 7 , R 6 -S-CO-R 7 , R 6 -P(O) 2 -R 7 , R 6 -Si-R 7 , R 6 -(CH 2 ) n -R 7 ,

R 5 -(CH 2 ) n -R 7 , R 6 -A-(CH 2 ) n -R 7 , R 6 -(CH 2 ) n -B-R 7 ,

R 6 -(CH=CH-) n -R 7/ R 6 -(A-CH = CH-) n -R 7 , R 6 -(CH = CH-B-) n -R 7 , R 6 -(CH = CH-CH 2 -B- J n -R 7 , R 6 -A-CH = CH-(CH 2 -VR 7 , R 6 -(-CH=CH-CH 2 ) n -B-R 7 ,

R 6 -(C=C-) n -R 7 , R 6 -(A-CsO) n -R 7 , R 6 -(A-C C-CH 2 ) n -R 7 , R 6 -(CsC-B-J n -R 7 ,

R 6 -(C C-CH 2 -B-) n -R 7 , R 6 -A-C C-(CH 2 -) n -R 7 , R 6 -(-C C-CH 2 ) n -B-R 7 ,

R 6 -(-C C-CH 2 -CH 2 ) n -B-R 7

wobei R 6 - die Nuk-Komponente ist, R 7 - der Linkerrest ist und A und B unabhängig folgende strukturelle Elemente einschließen: -NH-, -O-, -S-, -SS-, - CO-NH-, -NH-CO-, -CO-O-, -0-C0-, -CO-S-, -S-CO-, -P(O) 2 -, -Si-, -(CH 2 ) n -, eine photolabile Gruppe, wobei n - gleich 1 bis 5 ist

Anspruch 30: Nukleotid-Analoga nach einem der Ansprüche 25 bis 28, wobei die Linker-Komponente ein wasserlösliches Polymer einschließt.

Anspruch 31 : Nukleotid-Analoga nach Anspruch 30, wobei die Linker-Komponente wasserlösliche Polymere unabhängig ausgewählt aus folgender Gruppe einschließt:

Polyethylen-glycol (PEG), Polysaccharide, Dextran, Polyamide, Polypeptide, Polyphosphate, Polyacetate, Poly(alkyleneglycole), Kopolymere aus Ethylenglycol und Propylenglycol, Poly(olefinische Alkohole),

Poly(Vinylpyrrolidone), Poly(Hydroxyalkylmethacrylamide), Poly(Hydroxyalkylmethacrylate), Poly(x-Hydroxy-Säuren), PoIy- Acrylsäure,

PoIy- Acrylamid, Poly(Vinylalkohol).

Anspruch 32: Nukleotid-Analoga nach einem der Ansprüche 1, 2, 25 bis 31, wobei die Linker-Komponente eine durchschnittliche Länge zwischen 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 10000, 10000 bis 100000, 100000 bis 500000 Atomen hat.

Anspruch 33: Nukleotid-Analoga nach einem der Ansprüche 1, 2, 25 bis 32, wobei der Marker oder eine Marker-Komponente eine signalgebende, signalvermittelnde, katalytische oder affine Funktion hat, oder die Funktion des makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden hat

Anspruch 34: Nukleotid-Analoga nach einem der Ansprüche 25 bis 33, wobei eine strukturelle Marker-Einheit unabhängig eines oder mehrere der folgenden strukturellen Elemente einschließt:

Biotin, Hapten, radioaktives Isotop, seltenes Erdenelement, Farbstoff, Fluoreszenzfarbstoff, fluoreszierende oder phosphoreszierende Substanz

Anspruch 35: Nukleotid-Analoga nach einem der Ansprüche 25 bis 33, wobei eine strukturelle Marker-Einheit unabhängig eines oder mehrere der folgenden Elemente einschließt: Nanokristalle oder deren Modifikationen, Proteine oder deren Modifikationen,

Nukleinsäureketten oder deren Modifikationen, Teilchen oder deren

Modifikationen.

Anspruch 36: Nukleotid-Analoga nach Anspruch 35, wobei eine strukturelle Marker- Einheit eines der folgenden Proteine einschließt:

Enzyme oder deren Konjugate oder Modifikationen,

Antikörper oder deren Konjugate oder Modifikationen,

Streptavidin oder seine Konjugate oder Modifikationen,

Avidin oder seine Konjugate oder Modifikationen

Anspruch 37: Nukleotid-Analoga nach einem der Ansprüche 1, 2, 25 bis 36, bei dem als makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand folgende Strukturen einschließet: Proteine, Dendrimere, Nanoteilchen, Mikroteilchen oder deren Modifikationen.

Description:

Komponenten und Verfahren zur enzymatischen Synthese von Nukleinsäuren

Beschreibung

1.1 Einordnung in das technologische Feld

Enzymatische Synthese von Nukleinsäuren hat einen wichtigen Platz in der modernen Industrie eingenommen. Für die Zukunft werden noch weitere Einsatzfelder antizipiert, z.B. in der Nanobiotechnologie.

Neben seit langem eingesetzten Verfahren zu einfacher Vervielfältigung der Nukleinsäureketten, wie PCR, werden zur Zeit Verfahren und Produkte entwickelt, die eine stufenweise erfolgende enzymatische Synthesereaktion als Grundlage haben, s. beispielsweise (www.genovoxx.com; www.illumina.com; www.helicosbio.com). Einsatz der Nukleinsäuren als Matrizen für die Synthese von nanobiologischen Komplexen mit multiplen Funktionen verspricht Fortschritte in Bereichen wie Nanomedizin und ultrastarke Speichersysteme. Die Fähigkeit, die enzymatische Synthese von Nukleinsäuren effektiv zu steuern, bildet eine Voraussetzung für die Qualität solcher Prozesse. Daher besteht nachhaltiger Bedarf für Mittel und Verfahren, die eine solche Steuerung ermöglichen.

In den letzten 20-30 Jahren wurde eine Fülle von chemischen Schutzgruppen für Nukleotide und deren Analoga entwickelt, die eine stufenweise erfolgende, gesteuerte chemische Synthese erlauben. Die darauf basierenden Verfahren beispielsweise für Oligonukleotidsynthesen sind seit langem bekannt. Im Gegensatz dazu, können Verfahren, die enzymatische Synthese als Grundlage haben, kaum von solchen Schutzgruppen profitieren. Die Aktualität dieses Themas wird durch die starke Förderung der Entwicklungen auf diesem Gebiet im Jahr 2004 und 2005 durch NIH (The National Institute of Health) hingewiesen. Dabei werden Vorhaben unterstützt, die weitere Entwicklung von modifizierten Bausteinen für enzymatische Nukleinsäuresynthesen anstreben.

1.2 Aufgabe der Erfindung

• Bereitstellung von Reagenzien, Kits und Verfahren zur Steuerung des Fortschretens der enzymatischen Synthese-Reaktion von Nukleinsäureketten.

• Bereitstellung von Reagenzien, Kits und Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten.

Die neuen Verfahren sind dadurch charakterisiert, dass makromolekulare sterisch anspruchsvolle Liganden an der Steuerung der enzymatischen Reaktion beteiligt sind. Die sterisch anspruchsvollen Liganden sind an die eingebauten modifizierten Nukleotide gekoppelt, wobei die Masse dieser Liganden größer als 2 kDa ist.

Detaillierte Beschreibung:

1.3 Begriffe / Definitionen:

1.3.1. Makromolekulare Verbindung - ein Molekül, oder ein Molekülkomplex, oder ein Nanokristall oder ein Nanoteilchen, dessen Masse zwischen 2kDa und 100 GDa liegt, insbesondere in Bereichen von 2kDa und 2OkDa, 2kDa und 5OkDa, 2kDa und 10OkDa, 10OkDa und 20OkDa, 20OkDa und 100OkDa oder IMDa und 100MDa oder 100 MDa und 100GDa liegt. Beispiele für makromolekulare Verbindungen sind Nukleinsäuren, wie Oligonukleotide mit einer Länge von mehr als 10 Nukleotiden, Polynukleotide, Polypeptide, Proteine oder Enzyme, Quantum Dots, Polymere wie PEG, Mowiol, Dextran, Polyacrylat, Nanoteilchen mit einem Durchmesser im Bereich von 10 bis 100 nm, 20 bis 200 nm, 30 bis 300 nm, 40 bis 400 nm, 50 bis 500 nm (z.B. Nanogold-Partikel, Polystyrene teilchen, paramagnetischen Teilchen auf Dextran-Basis), Mikroteilchen mit einem Durchmesser im Bereich von 0,5 bis 1 μm, 1 bis 5 μm, aber auch Komplexe, die aus mehreren Makromolekülen bestehen.

1.3.2. Niedermolekulare Verbindung - ein Molekül oder ein Molekülkomplex, dessen Masse kleiner 2000 Da (2kDa) beträgt, z.B. Biotin, natürliche Nukleotide, dATP, dUTP, viele Farbstoffe, wie Cy3, Rhodamine, Fluorescein und konventionell modifizierte Nukleotide, wie Biotin-16-dUTP.

1.3.3 Ein Nuk-Makromolekül und ein modifiziertes Nuk-Makromolekül

Ein Nuk-Makromolekül (siehe WO2005044836 und WO2006097320, der Inhalt dieser Anmeldungen ist eingeschlossen als Referenz (incorporated by reference im Sinne USPTO für die USA)) schließt zumindest eine Nuk-Komponente, zumindest eine Linker- Komponente, zumindest eine Marker-Komponente ein.

In dieser vorliegenden Erfindung werden modifizierte Nuk-Makromoleküle beschrieben. Ein modifiziertes Nuk-Makromolekül ist ein Nukleotid-Analog. Es schließt zumindest eine Nukleotid-Komponente (Nuk-Komponente), zumindest eine Linker-Komponente, zumindest eine Marker-Komponente und zumindest einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden ein (im weiteren Verlauf der Beschreibung werden sie als "modifizierte Nuk-Makromoleküle" genannt; einige Beispiele sind in Fig. 1 und 2 schematisch abgebildet):

A) (Nuk-Linker l) n -(Ligand) k -(Marker) m oder

B) (Nuk-Linker l) n -(Ligand-Linker 3) k -(Marker) m oder

C) (Nuk-Linker l) n -(Ligand) k -(Linker 3-Marker) m oder

D) (Nuk-Linker l) n -(Marker) m -(Ligand) k oder

E) (Nuk-Linker l-Ligand) n -(Marker) m oder F) (Ligand-Linker 2-Nuk-Linker l) n -(Marker) m oder G) (Nuk-Linker l) n -(Marker/Ligand) m

wobei: Nuk - eine Nuk-Komponente ist

Linker - eine Linker-Komponente ist, wobei Linker 1 oder Linker 2 oder Linker 3 gleiche oder auch unterschiedliche Struktur haben können

Marker - eine Makrer-Komponente ist

Ligand - ein makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand ist Marker/Ligand - eine Struktur, die sowohl Marker-Eigenschaften als auch Eigenschaften eines makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden hat

(n) - eine Zahl von 1 bis 100000 ist.

(m) - eine Zahl von 1 bis 1000

(k) - eine Zahl von 1 bis 1000

Wobei in einer Ausführungsform der Struktur die Verhältnisse im Molekül folgendermassen verteilt sind: (n)> = (m)> = (k), wobei die einzelnen Zahlen unabhängig von einander variiert werden können. In einer weiteren Ausführungsform der Struktur die Verhältnisse im Molekül folgendermassen verteilt sind: (n)>(m)>(k), wobei die einzelnen Zahlen unabhängig von einander variiert werden können. Weitere Kombinationen der Komponenten der Nuk-Makromoleküle sind für einen Fachmann nahe liegend.

In einer Ausführungsform der Erfindung ist Linker wasserlöslich. Seine Zusammensetzung ist nicht eingeschränkt, solange er die Einbaureaktion nicht komplett inhibiert. Seine Länge liegt zwischen 5 und 100.000 Kettenatome.

In einer weiteren Ausführungsform besteht die Linker-Komponente aus einer Kopplungseinheit L für die Kopplung des Linkers an die Nuk-Komponente, aus einem wasserlöslichen Polymer und aus einer Kopplungseinheit T für die Kopplung des Linkers an die Marker-Komponente. In dieser bevorzugten Ausführungsform hat ein modifiziertes Nuk-Makromolekül folgende Struktur:

(Nuk-L- Polymer-T) n -Ligand-Marker oder

(Nuk-L- Polymer-T) n - Marker-Ligand

wobei :

Nuk - ein Nukleotid- oder ein Nukleosid-Monomer ist (Nuk-Komponente)

L - ein Teil des Linkers ist, das die Verbindung zwischen Nuk und dem

Linkerrest darstellt (Kopplungseinheit L)

T - ein Teil des Linkers ist, das die Verbindung zwischen dem Linkerrest und dem Marker darstellt (Kopplungseinheit T)

Polymer - ein Teil des Linkers ist, das ein wasserlösliches Polymer mit einer durchschnittlichen Länge zwischen 5 und 100.000 Atome ist (Kopplungseinheit L, Polymerlinker, Kopplungseinheit T sind bei dieser Ausführungsform als Linker-Komponente zusammengefaßt) Marker - eine Marker-Komponente

Ligand - ein makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand ist

n - eine Zahl von 1 bis 1000000, wobei (n) einen durchschnittlichen Wert darstellen kann.

1.3.3.1 Nukleotid-Komponente oder Nuk-Komponente Die Nuk-Komponente ist ein modifiziertes Nukleotid, ist ein Bestandteil eines modifizierten Nuk-Makromoleküls und hat Substrateigenschaften für Polymerasen.

Die Nuk-Komponente schließt vorzugsweise eine Base-Komponente (Base), eine Zucker- Komponente (Zucker) und eine Phosphat-Komponente (Phosphat) ein. Base, Zucker und Phosphat können modifiziert sein, d.h. die Grundstruktur sieht den natürlichen Nukleotiden oder Nukleosiden ähnlich, trägt aber beispielsweise zusätzliche chemische Gruppen. Beispiele für Kombinationen aus verschiedenen Komponenten sind dem Fachmann bekannt. Solche Nuk-Komponenten können in vielen enzymatischen und chemischen Reaktionen eingesetzt werden (G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, S. 447-).

In einer Ausführungsform ist Nuk-Komponente ein Nukleotid-Monomer, das mit der Linker-Komponente gekoppelt ist. Prinzipiell können alle als Substrat für Nukleotid- akzeptierende Enzyme geeigneten konventionellen Nukleotid-Varianten als Nuk- Komponente des modifizierten Nuk-Makromoleküls dienen, so dass sowohl natürliche als auch modifizierte Nukleotide (Nukleotid-Analoga) für die Nuk- Komponente in Frage kommen. Bei modifizierten Nukleotiden können Base-, Zucker- oder Phosphat-Teile modifiziert sein, Fig. 3. Viele Beispiele für Nukleotid-Modifikationen sind dem Fachmann bekannt ("Advanced organic chemistry of nucleic acids", 1994, Shabarova, ISBN 3-527- 29021-4, "Nucleotide Analogs" Scheit, 1980, ISBN 0-471-04854-2, "Nucleoside and Nucleic Acid Chemistry", Kisakürek 2000, "Anti-HIV Nucleosides" Mitsuya, 1997, "Nucleoside Analogs in Cancer therapy", Cheson, 1997) im Text werden auch weitere Beispiele für die Modifikationen der Nukleotide angegeben.

1.3.3.1.1 Variationen am Phosphat

In einer Ausführungsform stellt die Nuk-Komponente ein Nukleosid-Triphosphat dar. Auch höhere Phosphat-Derivate (Tetraphosphat usw.) können verwendet werden. Wahlweise kann die Phosphat-Komponente Modifikationen einschließen, solche Modifikationen schließen beispielsweise in einer Ausführungsform einen Linker ein (D. Jameson et al. Methods in Enzymology 1997, V. 278, S. 363-, A. Draganescu et al. J. Biol.Chem. 2000 v.275, 4555-). In einer werteren Ausführungsform schließt die Phosphat-Komponente der Nuk-Komponente Thiotriphosphat-Verbindungen ein (Burges et al. PNAS 1978 v. 75, S. 4798-).

Die genannten Phosphatmodifikationen können wie bei Nukleosid-Triphosphaten an der 5 " -Position oder auch an anderen Positionen des Zucker-Teils des Nukleotides sitzen, beispielsweise an der 3 ' -Position.

5 1.3.3.1.2 Variationen an der Base

Die Nuk-Komponente kann ein in der Natur in den Nukleinsäuren vorkommendes Nukleotid oder Nukleosid oder seine Analoga darstellen, vorzugsweise die an Watson- Crick-Paarbildung teilnehnem, beispielsweise Adenin, Guanin, Thymin, Cytosin, Uracil, Inosin, oder eine modifizierte Base, wie z.B. 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin, 6-Thio-

LO adenin, einschließen, Literatur s. oben. Wahlweise kann die Base Modifikationen einschließen, solche Modifikationen schließen beispielsweise in einer Ausführungsform einen an die Base gekoppelten Linker wie beispielsweise ein Amino-propargyl-Linker oder ein Amino-Allyl-Linker ein, weitere Beispiele für die Linker sind bekannt (Ward et al. US Pat 4711955, G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, S. 447-, Hobbs et al. US

L5 Patent 5.047.519 oder andere Linker z.B. Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US pat. 6211158, US pat. 4804748, EP 0286028, Hanna M. Method in Enzymology 1996 v.274, S.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 S.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nnucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704,

10 Odedra WO 0192284). In einer Ausführungsform stellt der an die Base gekoppelte Linker die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente der modifizierten Nuk-Makromoleküle dar. Weitere Modifikationen an der Base sind beispielsweise im Katalog von Trilink Biotechnologies, Inc. San Diego, USA, Ausgabe 2003 auf Seite 38 aufgeführt.

15

1.3.3.1.3 Variationen am Zucker

Dem Fachmann sind verschiedene Variationen der Zucker-Komponente der Nukleotide bekannt, die z.B. in der Diagnostik, Therapie oder Forschung eingesetzt werden. Solche Variationen schließen z.B. Ribose, 2 > -Deoxyribose oder 2 ' ,3 V -Dideoxyribose ein.

50 Wahlweise kann die Zucker-Komponente Modifikationen einschließen (M. Metzger et al. Nucleic Acid Research 1994, V. 22, 4259-, Tsien WO 91/06678), solche Modifikationen schließen beispielsweise in einer Ausführungsform einen Linker ein. Die modifizierende Gruppe oder Linker kann beispielsweise reversibel an die Zucker-Komponente gekoppelt sein (WO2007053719, Hovinen et al. J.Chem.Soc.Prking Trans. 1994, S. 211-, Canard 5 US Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Ju et al. US Pat. 6664079, Fahnestock et al. WO 91066678, Cheeseman US Pat. 5302509, Parce et al. WO 0050642, Milton et al. WO 2004018493, Milton et al. 2004018497, an der 2 ' -

Position (WO2007075967). Diese Anmeldungen sind hier eingebaut als Literaturquellen (incorporated by reference).

In einer Ausführungsform stellt der an die Zucker-Komponente gekoppelte Linker die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente der modifizierten Nuk-Makromoleküle dar.

In einer weiteren Ausführungsform schließt die Zuker-Komponente z.B. folgende Modifikationen ein: wahlweise kann die 3 ' - oder die 2 ' -OH-Gruppen durch folgende Atome oder Gruppen ersetzt werden: Halogenatome, Wasserstoff, Amino-, Merkapto- oder Azido-Gruppe (Beabealashvilli et al. Biochem Biophys Acta 1986, v.868, 136-, Yuzhanov et al. FEBS Lett. 1992 v. 306, 185-).

In einer weiteren Ausführungsform schließt die Nuk-Komponente azyklische Nukleotid- oder Nukleosid-Modifikationen ein (A. HoIy Current Pharmaceutical Design 2003 v. 9, 2567-, G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, S. 447-). In einer weiteren Ausführung kann die Zucker-Komponente eine Doppeltbindung einschließen. In der Anmeldung werden 2 > -Deoxynukleotide, beispielsweise 2 " -Deoxyuridin- Triphosphat, 2' -Deoxycytidin-Triphosphat, 2 " -Deoxyadenosin-Triphosphat, 2 λ - Deoxyguanosin-Triphosphat als dUTP, dCTP, dATP und dGTP bezeichnet.

1.3.3.1.4 Kopplung von Nuk-Komopente und Linker

Die Nuk-Komponente ist an einer Kopplungsstelle mit dem Linker verbunden. Die Kopplungsstelle des Linkers an die Nuk-Komponente kann sich an der Base, am Zucker (Ribose bzw. Deoxyribose), oder am Phosphat-Teil befinden. Es können mehrere Linker an eine Nukleotid-Komponente gebunden sein (siehe unten Abschnitt Linker).

Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und der Nuk-Komponente ist vorzugsweise kovalent. Wenn die Kopplungsstelle an der Base liegt, so befindet sie sich vorzugsweise an den Positionen 4 oder 5 bei Pyrimidin-Basen und an den Positionen 6,7,8 bei den Purin-Basen (Ward et al. US Pat 4711955, G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, S. 447-, Hobbs et al. US Patent 5.047.519 oder andere Linker z.B. Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US pat. 6211158, US pat. 4804748, EP 0286028, Hanna M. Method in Enzymology 1996 v.274, S.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 S.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704, Odedra WO 0192284). Am Zucker können die Positionen T , 3 \ 4 ' oder 5 ' die

Kopplungsstellen darstellen. Die Kopplung an die Phosphatgruppen kann an der alpha, beta, oder gamma-Phosphatgruppe erfolgen. Beispiele für die Kopplungsstelle an der Base sind in Short WO 9949082, Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382 (siehe auch kommerziell erhältliche Nukleotide (Amersham, Roche), an der 5 Ribose in Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363, Canard US Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642., an Phosphatgruppen in Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363 beschrieben.

LO Die Position der Kopplungsstelle hängt vom Einsatzgebiet der modifizierten Nuk- Makromoleküle ab. So werden beispielsweise für die Markierung von Nukleinsäuren, die am Nukleinsäurestrang verbleiben soll, vorzugsweise Kopplungsstellen am Zucker oder an der Base verwendet. Die Kopplung an die Gamma- oder Beta-Phosphatgruppen kann beispielsweise dann erfolgen, wenn die Markierung beim Einbau des modifizierten Nuk-

L5 Makromoleküls freigesetzt werden soll.

Die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente erfolgt beispielsweise über eine Kopplungseinheit (L), die ein Teil der Linker-Komponente ist.

JO Die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker kann in einer Ausführungsform widerstandsfähig sein, z.B. bei Temperaturen bis zu 130 0 C, für pH- Bereiche zwischen 1 und 14, und/oder resistent gegen hydrolytische Enzyme (z.B. Proteasen, Esterasen) sein. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker unter milden Bedingungen

£ spaltbar. Eine solche Gruppe kann auch innerhalb des Linkes vorliegen.

Diese spaltbare Verbindung ermöglicht die Entfernung der Linker- und der Marker- Komponenten. In einer Ausführungsform der Erfindung ermöglicht sich die Entfernung des sterisch anspruchsvollen Liganden ebenfalls. Dies kann beispielsweise in den Verfahren der

10 Sequenzierung durch die Synthese von Bedeutung sein, wie Pyrosequencing, BASS (Canard et al. US Patent 5.798.210, Rasolonjatovo Nucleosides & Nucleotides 1999, V.18 S.1021, Metzker et al. NAR 1994, V.22, S.4259, Welch et al. Nucleosides & Nucleotides 1999, V.18, S.19, Milton et al. WO 2004018493, Odedra at al. WO 0192284) oder Single molecule sequencing, Tcherkassov WO 02088382. Ihre Wahl ist nicht eingeschränkt,

5 sofern sie unter den Bedingungen der enzymatischen Reaktion stabil bleibt, keine irreversible Störung der Enzyme (z.B. Polymerase) verursacht und unter milden Bedingungen abgespalten werden kann. Unter "milden Bedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, die zum Beispiel Nukleinsäure-Primer-Komplexe nicht

zerstören, wobei z.B. der pH-Wert vorzugsweise zwischen 3 und 11 und die Temperatur zwischen O 0 C und einem Temperaturwert (x) liegt. Dieser Temperaturwert (x) hängt von der Tm des Nukleinsäure-Primer-Komplexes (Tm ist der Schmelzpunkt) und wird beispielsweise als Tm (Nukleinsäure-Primer-Komplex) minus 5°C errechnet (z.B. Tm ist 5 47°C, dann liegt die maximale Temperatur bei 42°C; unter diesen Bedingungen eignen sich besonders Ester-, Thioester-, Acetale, Phosphoester-, Disulfid-Verbindungen und photolabile Verbindungen als spaltbare Verbindungen).

Vorzugsweise gehört die genannte spaltbare Verbindung zu chemisch oder enzymatisch LO spaltbaren oder photolabilen Verbindungen. Als Beispiele von chemisch spaltbaren Gruppen sind Ester-, Thioester-, Disulfid-, Acetal-Verbindungen bevorzugt (Short WO 9949082, „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc., Herman et al. Method in Enzymology 1990 V.184 S.584, Lomant et al. J.Mol.Biol. 1976 V.104 243, "Chemistry of carboxylic acid and esters" S.Patai 1969 Interscience Publ.). L5 Beispiele für photolabile Verbindungen können in folgenden Literaturstellen gefunden werden: Rothschild WO 9531429, "Protective groups in organic synthesis" 1991 John Wiley & Sons, Inc., V. Pillai Synthesis 1980 S.l, V. Pillai Org. Photochem. 1987 V.9 S.225, Dissertation „Neue photolabile Schutzgruppen für die lichtgesteuerte Oligonucleotidsynthese" H.Giegrich, 1996, Konstanz, Dissertation „Neue photolabile 10 Schutzgruppen für die lichtgesteuerte Oligonucleotidsynthese" S. M. Bühler, 1999, Konstanz). Noch weitere spaltbare chemische Gruppen, die in der Nukleotid-Chemie realsiert wurden, sind in Milton et al. WO2004018493, Milton et al. WO2004018497 beschrieben.

15 1.3.3.1.5 Zahl der gekoppelten Nuk-Komponenten

In einer Ausführungsform der Erfindung ist pro ein modifiziertes Nuk-Makromolekül nur eine Nuk-Komponente gekoppelt. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind mehrere Nuk- Komponenten pro ein modifiziertes Nuk-Makromolekül gekoppelt. Mehrere Nuk-Komponenten können einheitlich oder unterschiedlich sein, wobei beispielsweise 50 durchschnittlich 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 25, 25 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 250, 250 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 10000, 10000 bis 100000 oder mehr Nuk-Komponenten pro ein modifiziertes Nuk-Makromolekül gekoppelt sein können.

1.3.3.2 Linker-Komponenten 5

Die Bezeichnung Linker oder Linker-Komponente wird synonym in der Anmeldung verwendet und bezieht sich auf strukturelle Abschnitte des modifizierten Nuk- Makromoleküls zwischen der Nuk-Komponente und entweder der Marker-Komponente

oder dem markromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden oder zwischen dem makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden und dem Marker.

Es wird unterschieden nach Linkern, die mit Nuk-Komponente in Verbindung stehen (Linker 1 und Linker 2) und Linker (3), der weitere Bestandteile von modifizierten Nuk-

Makromolekül verbinden (z.B. sterisch anspruchsvollen Ligand(en) und den/ die Marker).

Linker 3 kann in analoger Weise wie Linker 1 und 2 aufgebaut sein oder eine andere Struktur haben. Die Zusammensetzung des Linkers 3 ist nicht eingeschränkt, solange er die enzymatische Reaktion und die Eigenschaften des modifizierten Nuk-Makromoleküls nicht zerstört.

Im weiteren werden Linker 1 und 2 detailiert besprochen, dabei wird ein genereller Begriff „Linker" verwendet, da in den meisten Anwendungen nur eine Linker- Komponente an der Nuk-Komponente gebunden ist.

Der Linker ist vorzugsweise wasserlöslich. Die genaue Linkerzusammensetzung ist nicht eingeschänkt und kann variieren.

Die Linker-Länge wird betrachtet als die kürzeste Distanz (theoretisch bereichnete auf den ausgestreckten Zusand des Linkers) von der Nuk-Komponene bis zur nächsten makromolekularen Struktur (z.B. makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand oder auch makromolekularer Marker). Beispielhaft wird die Distanz zum Marker oder zum sterischen Hindernis berechnet.

In einer bevorzugten Form haben modifizierte Nuk-Makromoleküle einen kurzen Linker. Seine Länge beträgt zwischen 2 und 30 Kettenatomen. Solche Linker können funktionelle Gruppen tragen, wie beispielsweise Amino-, Carboxy-, Mercapto- und Hydroxygruppen. An diese Gruppen können weitere Moleküle, z.B. Makromoleküle, wie wasserlösliche Polymere, gekoppelt werden. Beispiele von kurzen Linkern gekoppelt an Nukleotide sind dem Fachmann bekannt (Ward et al. US Pat 4711955, G. Wright et al. Pharmac.Ther. 1990, V. 47, S. 447-, Hobbs et al. US Patent 5.047.519 oder andere Linker z.B. Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US pat. 6211158, US pat. 4804748, EP 0286028, Hanna M. Method in Enzymology 1996 v.274, S.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 S.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704, Odedra WO 0192284). Der Linker kann eine oder mehrere Einheiten von wasserlöslichen Polymeren enthalten, wie beispielsweise Aminosäuren,

Zucker, PEG-Einheiten oder Carbonsäuren. Weitere Beispiele für kurze Linker kann die Kopplungseinheit (L) eines langen Linkers dienen s.u. Linker mit der Länge zwischen 2 und 20 Atome, werden vorzugsweise in modifizierten Nuk-Makromolekülen eingesetzt, deren Marker-Komponente lineare wasserlösliche Polymere aufweist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein langer Linker eingesetzt, mit einer Länge von mehr als 30 Ketten-Atomen.

Nachfolgend werden Beispiele für die Zusammensetzung der Linker angeführt.

1.3.3.2.1 Linker-Bestandteile (Am Beispiel von Linker zwischen der Nuk-Komponente und der Marker-Komponente oder zwischen der Nuk-Komponente und dem sterisch anspruchsvollen Liganden).

Die Linker-Komponente stellt einen Teil des Nuk-Markromoleküls dar, der zwischen der jeweiligen Nuk-Komponente und der Marker-Komponente liegt.

Die Linker-Komponente hat in ihrer Struktur beispielsweise folgende Bestandteile: 1) Kopplungseinheit L 2) wasserlösliches Polymer 3) Kopplungseinheit T

Die Aufteilung der Linker-Komponente in einzelne Bestandteile ist rein funktionell und soll lediglich der Anschaulichkeit der Struktur dienen. Je nach Betrachtungsweise können einzelne Strukturen des Linkers zum einen oder zum anderen Bestandteil gerechnet werden.

Die Kopplungseinheit L hat die Funktion, die Linker-Komponente und die Nuk- Komponente zu verbinden. Bevorzugt sind kurze, unverzweigte Verbindungen, von 1 bis 20 Atome in der Länge. Die jeweilige Struktur der Kopplungseinheit L hängt von der Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid bzw. Nuk-Einheit und von dem jeweiligen Polymer des Linkers ab. Einige Beispiele für die Kopplungseinheiten L sind im Abschnitt Beispiele angegeben. Viele konventionell modifizierte Nukleotide tragen einen kurzen Linker, diese kurzen Linker dienen als weitere Beispiele für die Kopplungseinheit L, z.B. kurze Linker an der Base: Short WO 9949082, Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382(siehe auch kommerziell erhältliche Nukleotide (Amersham, Roche), kurze Linker an der Ribose in Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363, Canard US. Pat.

5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Ju et al. US Pat.

6664079, Parce WO 0050642., kurze Linker an Phosphatgruppen in Jameson et al.

Method in Enzymology, 1997, V. 278, S. 363 .

Noch weitere Beispiele für die Kopplungseinheit L sind nachfolgend angegeben:

R 6 -NH-R 7 , R 5 -O-R 7 , R 6 -S-R 7 , R 6 -SS-R 7 , R 6 -CO-NH-R 7 , R 6 -NH-CO-R 7 , R 6 -CO-O-R 7 , R 6 -O-CO-R 7 , R 6 -CO-S-R 7 , R 6 -S-CO-R 7 , R 6 -P(O) 2 -R 7 , R 5 -Si-R 7 , R 5 -(CH 2 ) n -R 7 , FV(CH 2 VR 7 , R 6 -A-(CH 2 ) n -R 7 , R 6 -(CH 2 J n -B-R 7 , R 6 -(CH=CH-VR 7 , R 5 -(A-CH=CH-VR 7 , R 6 -(CH = CH-B-) n -R 7 , R 6 -A-CH=CH-(CH 2 -VR 7 , R 6 -(-CH=CH-CH 2 ) n -B-R 7 , R 6 -(-CH=CH-CH 2 -CH 2 ) n -B-R 7 ,

R 6 -(C C-) n -R 7/ R 6 -(A-C C-) n -R 7 , R 6 -(C C-B-) n -R 7 , R 6 -A-C C-(CH 2 -VR 7 , R 5 -C-CsC-CH 2 VB-R 7 , R 6 -(-C C-CH 2 -CH 2 ) n -B-R 7 ,

wobei R 6 - die Nuk-Komponente ist, R 7 - de Polymer ist und A und B folgende strukturelle Elemente einschließen: -NH-, -0-, -S-, -SS-, -CO-NH-, -NH-CO-, -CO-

0-, -0-C0-, -CO-S-, -S-CO-, -P(O) 2 -, -Si-, -(CH 2 V, eine photolabile Gruppe, wobei n - gleich 1 bis 5 ist

Die Kopplungseinheit L ist auf einer Seite mit der Nuk-Komponente, auf der anderen mit Polymer kovalent verbunden. Die Art der Kopplung hängt von der Art des Polymers ab.

In bevorzugter Form hat das Polymer an seinen Enden reaktive Gruppen, beispielsweise

NH2 (Amino), OH (Hydroxy), SH (Mercapto), COOH (Carboxy), CHO (Aldehyd), Acryl- oder Maleimid, Halogen-Gruppen. Solche Polymere sind käuflich erwerblich (z.B. Fluka).

Einige Varianten für die Kopplung von Polymeren an die Kopplungseinheiten sind im Abschnitt Beispiele angegeben.

Das wasserlösliche Polymer bildet in einer bevorzugten Ausführungsform den Hauptanteil der Linker-Komponente. Es ist ein Polymer, vorzugsweise hydrophil, bestehend aus gleichen oder unterschiedlichen Monomeren. Beispiele für geeignete Polymere stellen Polyethylen-glycol (PEG), Polyamide (z.B. Polypeptide), Polysaccharide und deren Derivate, Dextran und seine Derivate, Polyphosphate, Polyacetate, Poly(alkyleneglycole), Kopolymere aus Ethylenglycol und Propylenglycol, Poly(olefinische Alkohole), Poly(Vinylpyrrolidone), Poly(Hydroxyalkylmethacrylamide),

Poly(Hydroxyalkylmethacrylate), Poly(x-Hydroxy-Säuren), Poly-Acrylsäure und ihre Derivate, Poly-Acrylamide in ihre derivate, Poly(Vinylalkohol), Polylactat Säure, polyglycolic Säure, Poly(epsilon-caprolactone), Poly(beta-hydroxybutyrate), Poly(beta- hydroxyvalerate), Polydioxanone, Poly(ethylene terephthalate), Poly(malic Säure),

Poly(tartronic Säure), Poly(ortho ester), Polyanhydride, Polycyanoacrylate, Poly(phosphoester), Polyphosphazene, Hyaluronidate, Polysulfones.

Dieses Polymer schließt in einer Ausführungsform verzweigte oder weiteren Ausführungsform nicht verzweigte Polymere ein. Das Polymer kann aus mehreren unterschiedlich langen Abschnitten bestehen, wobei jeder Abschnitt aus gleichen Monomeren besteht und Monomere in unterschiedlichen Abschnitten unterschiedlich sind. Einem Fachmann sollte naheliegend erscheinen, dass für einen makromolekularen Linker meistens nur eine durchschnittliche Masse bestimmt werden kann, so dass die Angaben zu den Molmassen einen Mittelwert darstellen ("Makromoleküle, Chemische Struktur und Synthesen", Band 1, 4, H. Elias, 1999, ISBN 3-527-29872-X). Aus diesem Grund kann für modifizierte Nuk-Makromoleküle oft keine exakte Massenangabe gemacht werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schließt die Linker-Komponente ein lineares, nicht verzweigtes Polymer ein und trägt keine sterisch anspruchsvollen chemischen Strukturen, wie beispielsweise Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, Liganden. Solche Linker ermöglichen eine geringe sterische Hinderung der enzymatischen Erkennung der Nuk-Komponenten.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Polymer der Linker-Komponente linear, die Linker-Komponente trägt jedoch eine oder mehrere sterisch anspruchsvollen chemischen Strukturen, wie beispielsweise niedermolekulare Farbstoffe. Weitere Beispiele für sterisch anspruchsvolle Gruppen sind im Abschnitt 1.3.19 angegeben.

Sterisch anspruchsvollen Liganden bzw. Strukturen können an unterschiedliche Linker- Abschnitte gekoppelt sein (s. auch Abschnitt 1.3.19 Sterisch anspruchsvoller Ligand). Die durchschnittliche Zahl der an den Linker gekoppelten sterisch anspruchsvollen Liganden kann variieren und liegt beispielsweise zwischen 1 und 3, 3 und 5, 5 und 20, 20 und 50. Die Kopplung von sterisch anspruchsvollen Gruppen sollte die Tatsache berücksichtigen, dass eine raumfordernde Struktur in der Nähe der Nukleotid- Komponente zur Aufhebung der Substrateigenschaften führen kann. Sterisch anspruchsvolle Liganden können gleichmäßig oder zufällig über die gesamte Länge des Linkers gekoppelt sein, oder in einem bestimmten Abstand von der Nuk-Komponte am Linker gekoppelt sein. Der minimale Abstand zwischen der Nuk-Komponente und dem makromolekularen sterischen Liganden beträgt beispielsweise 10 bis 15, 15 bis 20, 20 bis 25, 25 bis 30, 30 bis 35, 35 bis 40, 40 bis 45, 45 bis 50, 50 bis 55, 55 bis 60, 60 bis

70, 70 bis 80, 80 bis 90, 90 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 1000, 1000 bis 5000, 5000 bis 10000 Kettenatome.

Der sterisch anspruchsvolle Ligand kann auch als Teil des Linkers oder als Teil des Markers betrachtet werden. Die Betrachtugnsweise kann beispielsweise davon abhängen, ob sterisch anspruchsvolle Gruppe gewisse Signaleigenschaften aufweist oder nicht.

1.3.3.2.2 Linker-Länge (am Beispiel für einen Linker zwischen der Nuk-Komponente und der nächsten makromolekularen Struktur, wie sterisch anspruchsvoller Ligand oder makromolekularer Marker). Die durchschnittliche Linkerlänge beträgt zwischen 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 30, 30 bis 40, 40 bis 50, 50 bis 60, 60 bis 70, 70 bis 80, 80 bis 90, 90 bis 100, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 10.000, 10000 bis 100000 Atome (gezählt werden Ketten-Atome), somit beträgt die durchschnittliche Linker-Länge zwischen 0,5 nm und 1 nm, 1 nm bis 2 nm, 2 nm bis 3 nm, 3 nm bis 4 nm, 4 nm bis 5 nm, 5 nm bis 6 nm, 6 nm bis 7 nm, 7 nm bis 8 nm, 8 nm bis 9 nm, 9 nm bis 10 nm, 5 nm bis 10 nm, 10 nm bis 20 nm, 20 nm bis 50 nm, 50 nm bis 100 nm, 100 nm bis 200 nm, 200 nm bis 1000 nm (gemessen an einem potenziell maximal ausgestrecktem Molekül).

Da ein modifiziertes Nuk-Makromolekül mehrere Nuk-Komponenten und somit auch mehrere Linker einschließen kann, können diese Linker (d.h. Varianten von Linker 1) untereinander gleich oder auch unterschiedlich lang sein. Die oben angeführten Angaben zur Linker-Länge zeigen den kürzesten Linker im ganzen modifizierten Nuk- Makromolekül an.

Einige Abschnitte des Linkers können rigide Bereiche enthalten und andere Abschnitte können flexible Bereiche enthalten.

1.3.3.2.3 Linker-Kopplung in einem modifizierten Nuk-Makromolekül (am Beispiel der Kopplung zwischen der Nuk-Komponente und der Marker-Komponente)

Der Linker ist an einer Seite an die Nuk-Komponente und auf der anderen Seite an die Marker-Komponente gebunden. Dazu kann der Linker an seinen Enden Kopplungseinheiten haben, die diese Funktion erfüllen. Die Verbindung mit der Nuk- Komponenten wurde oben erörtert. Die Verbindung zwischen dem Linker und der Marker-Komponenten erfolgt über Kopplungseinheit T. Bevorzugt sind kurze, unverzweigte Verbindungen, bis max. 20 Atome in der Länge. Die jeweilige Struktur der Kopplungseinheit T hängt von der Kopplungsstelle an der Marker-Komponente und von dem jeweiligen Polymer des Linkers. Die Kopplungseinheit T ist mit dem Polymer

kovalent verbunden. Die Art der Kopplung hängt von der Art des Polymers ab. In bevorzugter Form hat das Polymer an seinen Enden reaktive Gruppen, beispielsweise NH2 (Amino), OH (Hydroxy), SH (Mercapto), COOH (Carboxy), CHO (Aldehyd), Acryl- oder Maleimid, Halogen-Gruppen. Solche Polymere sind kommerziell erhältlich (z.B. Fluka). Einige Beispiele für die Kopplungseinheiten L sind im Abschnitt Beispiele angegeben, Weitere Beispiele für die chemische und affine Kopplungen s. in der Literatur: „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993, "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996.

Der Linker kann auch andere funktionelle Gruppen, bzw. Abschnitte enthalten, beispielsweise eine oder mehrere unter milden Bedingungen spaltbare Gruppen s. z.B. WO2005044836.

Eine spaltbare Verbindung innerhalb des Linkers ermöglicht eine Entfernung eines Teils des Linkers und der Marker-Komponente. Nach der Spaltung verbleibt ein Linker-Rest an der Nuk-Komponente, Beispiele für spaltbare Verbindungen sind im Abschnitt 1.3.3.1.4 angegeben.

1.3.3.3 Marker-Komponente

Die Marker-Komponente kann unterschiedliche Strukturen haben. Die Strukturen im einzelnen sind nicht eingeschränkt, solange sie die Substrateigenschaften der Nuk- Komponenten für Enzyme nicht aufheben. Diese Struktur hat vorzugsweise eine signalgebende oder eine signalvermittelnde Funktion. Der Marker kann auch andere Funktionen haben, beispielsweise strukturturelle, antitoxische oder affine Funktion (beispielsweise in Arzneimittel oder Zuberetungen).

1.3.3.3.1 Die Zusammensetzung der Marker-Komponente (Marker)

Der Marker schließt in einer Ausführung eine niedermolekulare Marker-Einheit ein. In einer weiteren Ausführungsform schließt der Marker eine makromolekulare Marker- Einheit ein. In einer weiteren Ausführungsform schließt der Marker mehrere niedermolekulare Marker-Einheiten ein. In einer weiteren Ausführungsform schließt der Marker mehrere makromolekulare Marker-Einheiten ein. In einer weiteren Ausführungsform schließt der Marker eine Kombination aus niedermolekularen und makromolekularen Einheiten ein. Die Marker-Einheiten können eine signalgebende oder signalvermittelnde Funktion haben.

Diese Einheiten können Moleküle mit geringer Molekularmasse, z.B. unter 2000 Da, oder auch selbst Makromoleküle sein. Dabei schließt die Zahl der signalgebenden oder signalvermittelnden Einheiten, die zu einer Marker-Komponenten zusammengefaßt sind, folgende Bereichen ein: 1 und 2, 2 und 5, 5 und 20, 20 und 50, 50 und 100, 100 und 500, 500 und 1000. 1000 und 10000, 10000 und 100000.

Falls mehrere Marker-Einheiten in einem Marker zusammengefasst sind, sind diese Einheiten in einer Ausführungsform an ein Gerüst gebunden, die Kern-Komponente des Markers (Fig. 4b, c). Diese Kern-Komponente verbindet die Einheiten untereinander. Die Kern-Komponente kann die Verbindung zu einem oder mehreren Nuk-Linker- Komponenten herstellen (Fig 5). Die Kern-Komponente schließt niedermolekulare oder makromolekulare Verbindungen ein.

1.3.3.3.2 Struktur der signalgebenden oder der signalvermittelnden Einheiten des Markers

Die strukturellen Marker-Einheiten schließen folgende Gruppen ein:

1.3.3.3.2.1 Strukturen mit niedriger Molmasse:

Biotin-Moleküle, Hapten-Moleküle (z.B. Digoxigenin), radioaktive Isotope (z.B. P 32 , J 131 ), oder deren Verbindungen, seltene Erden , Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, Fluoreszenz-

Quencher (z.B. Dabsyl) (viele dieser Moleküle sind kommerziell erhältlich z.B. von

Molecular Probes, Inc., oder Sigma-Aldrich) mit gleichen oder unterschiedlichen spektralen Eigenschaften, Farbstoffe, die untereinander FRET eingehen. Thermochrome, photochrome oder chemolumineszente Substanzen (erhältlich z.B. bei Sigma-Aldrich), Chromogene Substanzen (z.B. als Substrate für Peptidasen beschrieben in „Proteolyse enzymes Tools and Targets", E. Sterchi, 1999, ISBN 3-540-61233-5).

Auch chemisch reaktive Gruppen, wie beispielsweise Amino-, Carboxy-, Merkapto-, Aldehyd-, Jodacetat-, Acryl-, Dithio-, Thioester-Verbindungen können als signalvermittelnde strukturelle Einheiten dienen. Nach dem Einbau können diese reaktiven Gruppen mit signalgebenden Elementen, wie beispielsweise Farbstoffe mit entsprechenden reaktiven Gruppen (beispielsweise NHS-Ester, Merkapto-, Amino- Gruppen) modifiziert werden. Allgemeine Grundlagen für die Wahl eines passenden Paares von reaktiven Gruppen sind in „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 dargestellt.

In einer speziellen Ausführungsform erfühlt die Kombination aus einer Nuk-Einheit, einer markomolekularen Linker-Komponente und einem Marker mit niedriger Molmasse bereits

die Anforderungen der vorliegenden Erfindung. Solche Verbindungen sind ebenfalls Gegenstand dieser Erfindung. Sie können sowohl als Zwischenprodukte für die chemische Synthese von modifizierten Nuk-Makromolekülen mit einem makromolekularen Marker, z.B. dUTP-PEG-Biotin, als auch selbständig in den enzymatischen Reaktionen verwendet werden, wie beispielsweise mit nur einem Farbstoff markierte Nukleotide.

Als Farbstoffe können verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe auftreten, ihre Wahl ist nicht eingeschränkt, solange sie die enzymatische Reaktion nicht wesentlich beeinflußen. Beispiele für Farbstoffe sind Rhodamine (Rhodamin 110, Tetramethylrhodamin, erhältlich bei Fluka-Sigma), Cyanin-Farbstoffe (Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7 von Amersham Bioscience), Coumarine, Bodipy, Fluorescein, AI exa- Farbstoffe: z.B. Alexa 532, Alexa 548, Alexa 555 (Molecular Probes). Viele Farbstoffe sind kommerziell erhältlich, beispielsweise von Molecular Probes Europe, Leiden, Niederlande (im weiteren als Molecucular Probes bezeichnet) oder von Sigma-Aldrich-Fluka (Taufkirchen, Deutschland). Beispiele für die Synthese eines Nuk-Makromoleküls mit einem niedermolekularem Marker ist in WO 2005044836 angegeben.

In einer Ausführungsform schließt ein Marker mehrere Marker-Einheiten ein. Dabei können die Marker-Einheiten untereinander gleiche oder verschiedene Eigenschaften haben. Beispielsweise können Fluoreszenzfarbstoffe mit unterschiedlichen Spektraleigenschaften eingesetzt werden. In einer Ausführungsform werden Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt, die FRET-Paare bilden.

1.3.3.3.2.2 Strukturen mit hoher Masse (Makromoleküle)

1.3.3.3.2.2.1 Nanokristalle

Nanokristalle, z.B. Quantum Dots können als Marker-Einheiten auftreten. Dabei können in einer Marker-Komponente Quantum Dots mit gleichen oder unterschiedlichen spektralen Eigenschaften verwendet werden, US Pat. 6.322.901, US Pat. 6.423.551, US Pat. 6.251.303, US Pat. 5.990.479).

1.3.3.3.2.2.2 Nano oder Mikro-Teilchen.

Nano oder Mikro-Teilchen können als Marker-Einheiten auftreten, wobei die größten Ausmaße dieser Teilchen von lnm bis 2nm, von 2nm bis 5nm, von 5nm bis lOnm, von lOnm bis 20 nm, von 20nm bis 50nm, von 50nm bis lOOnm, von 100 nm bis 200nm, von 200nm bis 500nm, von 500nm bis lOOOnm, von 1000 nm bis 5000 nm betragen. Das Material der Teilchen können beispielsweise reine Metalle wie Gold, Silber,

Aluminium (beispielsweise Teilchen mit surface plasmon resonance ), - Protein-Au- Konjugate: J. Anal.Chem. 1998, V. 70, S. 5177, - Nukleinsäure-Au-Konjugaten: J. Am. Chem. Soc. 2001, V. 123, S.5164, J. Am. Chem. Soc. 2000, V. 122, S. 9071 , Biochem. Biophys. Res. Commun 2000, V. 274, S. 817, Anal. Chem. 2001, V. 73, S. 4450), - Latex (z.B. Latex-Nanopartikel, Anal. Chem. 2000,V. 72, S. 1979) - Kunststoff (Polystyrene), - paramagnetische Verbindungen / Gemische Zhi ZL et al. Anal Biochem. 2003 JuI 15;318(2): 236-43, Dressman D et al. Proc Natl Acad Sei U S A. 2003 JuI 22; 100(15) :8817-22,, - Metall-Teilchen, - magnetische Verbindungen / Gemische Jain KK. Expert Rev Mol Diagn. 2003 Mar;3(2): 153-61, Patolsky F et al. Angew Chem Int Ed Engl. 2003 May 30;42(21) :2372-2376, Zhao X et al. Anal Chem. 2003 JuI 15;75(14) : 3144-51, Xu H et al. J Biomed Mater Res. 2003 Sep 15;66A(4):870-9, JOSEPHSON Lee et al. US Pat. 2003092029, KLICHE KAY-OLIVER et al. WO0119405. Mehrere solche Komponenten (z.B. funktionalisierte Beads) sind kommerziell erhältlich, z.B. von Miltenyi Biotech (z.B. paramagnetischen Teilchen, Streptavidin Microbeads) oder von Sigma-Aldrich oder BD Biosciences.

1.3.3.3.2.2.3 Proteinmoleküle,

Proteinmoleküle können als Marker-Einheiten auftreten, wobei sie folgende Gruppen schließen: Enzyme (z.B. Peroxidase, alkalische Phosphotase, Urease, beta- Galaktosidase, Proteinasen), - fluoreszierenden Proteine (z.B. aus GFP-Protein-Familie oder Phycobiliproteine (z.B. Phycoerythrin, Phycocyanin), erhältlich z.B. von Molecular Probes Inc.), Antigen-bindende Proteine (z.B. Antikörper, Tetramere, Affibodies (Nord et. AI Nature Biotechnology, V. 15 (S.772-777) oder deren Bestandteile (z.B. Fab- Fragmente), Nukleinsäurebindende Proteine (z.B. Transcriptionsfaktor)

1.3.3.3.2.2.4 Nukleinsäureketten,

Die Nukleinsäureketten einschließlich der Gruppe, Oligonukleotide, modifizierte Oligonukleotide, können als Marker-Einheiten auftreten. Die Länge der Nukleinsäureketten liegt vorzugsweise in folgenden Bereichen von 10 bis 20, von 20 bis 50, von 50 bis 100, von 100 bis 200, von 200 bis 500, von 500 bis 1000, 1000 bis 5.000, von 5.000 bis 10.000, von 10.000 bis 100.000 Nukleotiden. Es können DNA, RNA, PNA-Moleküle verwendet werden. Nukleinsäureketten können zusäzliche Modifikationen tragen, wie beispielsweise freie Aminogruppen, Farbstoffe und andere signalgebende Moleküle, z.B. makromolekulare Substanzen, z.B. Enzyme oder Nanokristalle (Fig. 6 a,c). Diese makromolekulare Susbtanzen können sterisch anspruchsvolle Liganden darstellen (Fig. 7) (s. Abschnitt „sterisches Hindersnis"). Modifizierte Nukleinsäureketten sind kommerziell zugängig, z.B. MWG-Biotech.

Weitere Beispiele für Makromoleküle oder Makromolekülkomplexe, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Marker oder Marker-Einheiten in der Marker-Komponente für die Signalverstärkung eingesetzt werden können, sind in US Pat. 4882269, US Pat. 4687732, WO 8903849, US Pat. 6017707, US Pat. 6627469 beschrieben.

Auch anderen Marker-Einheiten, wie Lektine; Wachstumsfaktoren, Hormone, Rezeptor- Moleküle können eingesetzt werden.

1.3.3.3.3 Die Kern-Komponente der Marker-Komponente Die Kernkomponente hat die Funktion mehrere strukturelle Elemente der modifizierten Nuk-Makromoleküle zu binden. Beispielsweise bindet die Kern-Komponente mehrere Marker-Einheiten zusammen. In einer weiteren Ausführungsform können Linker- Komponenten an die Kern-Komponente gebunden werden s. Fig. 5. Der Begriff der Kern- Komponente ist funktionell und dient zur Erläuterung von möglichen Strukturen von modifizierten Nuk-Makromolekülen. Unterschiedliche chemische Strukturen, die Linker und Marker-Einheiten zusammenhalten, können als Kern-Komponente bezeichnet werden. Im Folgenden sind Beispiele für Bestandteile der Kernkomponente angegeben.

1.3.3.3.3.1 Bestandteile der Kernkomponente

In einer Ausführungsform besteht die Kern-Komponente aus einer oder mehreren niedermolekularen Verbindungen. Sie haben die Funktion, die Marker-Einheiten untereinander zu verbinden. Die Verbindung zwischen der Kern-Komponente und den Marker-Einheiten kann kovalent oder affin sein. Bei kovalenter Bindung können beispielsweise Verbindungen mit allgemeiner Struktur-Formel (F) m -R-(H) n als Ausgangsmateriel dienen, wo (F) und (H) - reaktive Gruppen darstellen, und R - eine Verbindungskomponente, wobei Zahl solcher Gruppen und ihre Anordnung stark variieren kann. Viele Beispiele sind dem Fachmann bekannt, z.B. Verbindungen aus der Gruppe Cross-Linker („Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc.). Die Struktur ist nicht eingeschränkt. Sie ist vorzugsweise wasserlöslich. Beispielsweise schließen (F) und (H) unabhängig von einander folgende Gruppen ein : NH2 (Amino), OH (Hydroxy), SH (Mercapto), COOH (Carboxy), CHO (Aldehyd), Acryl- oder Maleimid. Beispiele für (R) stellen wasserlösliche Polymere wie PEG oder Polypeptid-Ketten oder kurze aliphatische Ketten dar.

In einer weiteren Ausführungsform besteht die Kern-Komponente aus einem wasserlöslichen Polymer, dabei kann das Polymer aus gleichen oder unterschiedlichen Monomeren bestehen.

Beispiele für den Kern-Komponennte stellen folgende Polymere und deren Derivate dar: Polyamide (z.B. Polypeptide wie Poly(glutamin) oder Poly(Glutamin säure)) und deren Derivate, Poly-Acrylsäure und deren Derivate, natürliche oder synthetische Polysaccharide (z.B. Stärke, Hydroxy-Ethyl-Strärke), Dextran und seine Derivate (z.B. Aminodextran, Carboxy-Dextran), Dextrin, Poly-Acrylamide und deren Derivate (z.B. N- (2-hydroxypropyl)-methacdylamid) , Poly-Vinylalkohole und deren Derivate, Nukleinsäuren, Proteine. Diese Polymere können linear, globulär, z.B. Streptavidin oder Avidin, oder verzweigt sein, z.B. Dendrimere. Auch vernetzte lösliche Polymere, wie beispielswiese vernetzte Poly-Acrylamide (Crosslinker Bisacrylamid in Kombination mit Poly-Acrylamid), eingesetzt werden.

Da sowohl die Linker-Komponente als auch die Marker-Komponente wasserlösliche Polymere enthalten können, kann in einer Ausführungsform ein solches Polymer sowohl als Linker als auch als Kern-Komponente dienen. In diesem Fall kann ein Abschnitt eines solchen Polymers als Linker, ein anderer Abschnitt als Kern-Komponente betrachtet werden.

In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden lineare oder wenig verzweigte Polymere als Kernkomponenten eingesetzt, beispielsweise Polyamide (z.B. Polypeptide), Poly-Acrylsäure, Polysaccharide, Dextran, Poly-Acrylamide, Poly- Vinylalkohole. Das Polymer kann aus einheitlichen oder unterschiedlichen Monomeren bestehen. Insbesondere in dieser Ausführungsform kann die Linker-Komponente weniger als 50 Kettenatome aufweisen. So können auch Linker-Längen von ca. 5 bis 10, 10 bis 20 oder 20 bis 50 Kettenatome ausreichend sein, um die Substrateigenschaften der modifizierten Nuk-Makromoleküle für Enzyme zu bewahren. Eine solche Kern- Komponente des Markers erfüllt die Funktion der Linker-Komponente: sie schafft räumlichen Abstand zwischen sterisch anspruchsvollen Marker-Einheiten und aktiven Zentren der jeweiligen Enzyme.

Die wasserlöslichen Polymere haben vorzugsweise eine durchschnittliche Ketten-Länge von 20 bis 1.000.000 Kettenatomen. Beispielsweise liegt die durchschnittliche Kettenlänge zwischen 20 und 100, 100 und 500, 500 und 5000, 5000 und 100000, 100000 und 1000000 Kettenatome. In einer Ausführungsform liegt das Polymer in wässriger Phase bei pH zwischen 4 und 10 vorwiegend in einer neutralen Form vor (z.B. Dextran oder Polyacrylamid). In einer anderen Ausführungsform liegt das Polymer in einer wässrigen Phase bei pH zwischen 4

und 10 in einer geladen Form vor. Es kann sowohl positive (z.B. Polylysin) oder negative Ladungen (z.B. Polyacrylsäure) tragen.

Die Kopplung von Marker-Einheiten an ein wasserlösliches Polymer hängt von der Art des Polymers ab. Die für die Kopplung notwendigen reaktiven Gruppen können bereits

5 im Polymer vorhanden sein (z.B. Polylysin oder Polyacrylsäure) oder in einem getrennten

Schritt in das Polymer eingeführt werden. Beispielsweise bei Dextran sind viele Varianten der Einführung von reaktiven Gruppen und chemischen Kopplungen bekannt (Molteni L.

Methods in Enzymology 1985, v.112, 285, Rogovin A.Z. et al. J.Macromol Sei. 1972, A6,

569, Axen R. et al. Nature 1967, v. 214, 1302, Bethell G. S. et al. J. Biol.Chem. 1979,

10 v.254, 2572, Lahm O. et al. Carbohydrate Res. 1977, v. 58, 249, WO 93/01498, WO

98/22620, WO 00/07019 ) .

Die Kern-Komponennte hat vorzugsweise mehrere Kopplungsstellen, an die weitere Elemente gebunden werden können, z.B. strukturelle Marker-Einheiten oder Nuk-Linker- [5 Komponente.

Beispielsweise Poly-Lysin-Moleküle haben multiple freie Aminogruppen, an die mehrere Farbstoffmoleküle, Biotinmoleküle, Haptenmoleküle oder Nukleinsäureketten gekoppelt werden können. Poly-Lysine haben unterschiedliche Molmasse, z.B. 1000-2000, 2000- 10 10000, 10000-50000 Da können käuflich erworben werden.

Als weiteres Beispiel für die Kernkomponente dienen Nukleinsäurenstränge, wobei die Nukleinsäureketten eine Länge von 10 bis 20, von 20 bis 50, von 50 bis 100, von 100 bis 200, von 200 bis 500, von 500 bis 1000, 1000 bis 5000, von 5000 bis 10000 .5 Nukleotiden haben. Diese Nukleinsäuren dienen als Bindungspartner für sequenzkomplementäre Markereinheiten (Fig. 6b).

In einer weiteren Ausführungsform besteht die Kern-Komponente aus einem Dendrimer, z.B. Polypropylenimine, Polyaminoamine. Beispiele für andere Dendrimere sind bekannt:

50 Cientifica "Dendrimers", 2003, Technology white papers Nr. 6, Klajnert et al. Acta Biochimica Polonica, 2001, v. 48, S. 199, Manduchi et al. Physiol. Genomics 2002, V.10, S.169, Sharma et al. Electrophoresis. 2003, V. 24, S. 2733, Morgan et al. Curr Opin Drug Discov Devel. 2002 Nov;5(6):966-73, Benters et al. Nucleic Acids Res. 2002 Jan 15;30(2) : E10, Nilsen et al. J Theor Biol. 1997 JuI 21; 187(2) :273-84. Viele Dendrimere

35 sind kommerziell erwerblich (Genisphere, www.genisphere.com, Chimera Biotech GmbH).

Weitere Kombinationen für die Kern-Komponennte aus den oben dargestellten Bestandteilen sind einem Fachmann naheliegend.

1.3.3.3.3.2 Kopplung der Marker-Einheiten Marker-Einheiten können an die Kern-Komponente oder an die Linker-Komponente durch eine kovalente Bindung, beispielsweise über einen Cross-Iinker (Chemistry of protein conjugation and cross-linking, S. Wang,1993, ISBN 0-8493-5886-8, "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333- 58375-2), oder über eine affine Kopplung erfolgen, beispielsweise Biotin-Streptavidin- Verbindung oder Hybridisierung von Nukleinsäuresträngen oder Antigen-Antikörper- Wechselwirkung ("Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2).

Die Kopplung von Marker-Einheiten an die Kern-Komponente erfolgt in einer Ausführungsform bereits während der Synthese der modifizierten Nuk-Makromoleküle.

In einer anderen Ausführungsform erfolgt zunächst die chemische Synthese von modifizierten Nuk-Makromoleküle, bei denen die Markerkomponente nur aus der Kern- Komponente besteht. Die Kopplung von Marker-Einheiten an die Kern-Komponente erfolgt erst nach dem Einbau von modifizierten Nuk-Makromoleküle in die Nukleinsäurekette. Durch eine große Zahl der potenziellen Bindungsstellen am Kernteil ist die Wahrscheinlichkeit der Bindung der Marker-Einheiten an die Kern-Komponente und somit an die eingebaute Nuk-Komponente wesentlich größer im Vergleich zu konventionellen Nukleotid-Strukturen. Die Kopplungschemie im einzelnen hängt von der Struktur der Marker-Einheiten und der Struktur der Kern-Komponente ab.

Kovalente Kopplung: Die Verbindung zwischen den Marker-Einheiten und der Kern- Komponente kann in einer Ausführungsform widerstandsfähig sein, z.B. bei Temperaturen bis zu 100 0 C, für pH-Bereiche zwischen 3 und 12, und/oder resistent gegen hydrolytische Enzyme (z.B. Esterasen) sein. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker unter milden Bedingungen spaltbar. Beispiele für die Kopplung von Nukleinsäuren an Dendrimere (entspricht einer Kopplung von Marker-Einheiten an eine Kernkomponente) sind z.B. in Shchepinov et al. Nucleic Acids Res. 1999 Aug l ;27(15) : 3035-41, Goh et al. Chem Commun (Camb). 2002 Dec 21;(24) :2954 dargestellt.

1.3.3.3.3.3 Kopplung zwischen Linker und Marker

Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und dem Marker hängt von der jeweiligen Struktur der Marker-Einheiten bzw. der Struktur der Kern-Komponente ab. In einer Ausfϋhrungsform ist die Linker-Komponente direkt an die signalgebende oder signalvermittelnde Marker-Einheit gebunden, Fig. 4a . Dabei kann der Marker aus nur einer oder mehreren Marker-Einheiten bestehen.

In einer weiteren Ausführungsform sind ein oder mehrere Linker-Komponenten an die Kern- Komponente des Markers gebunden, Fig. 5d.

Die Bindung zwischen der Linker-Komponente und dem Marker kann sowohl kovalent als auch affine erfolgen. Viele Beispiele sind dem Fachmann bekannt, s. z.B. "Bioconjugation : protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2. „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc.).

Kovalente Kopplung: Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und dem Marker kann in einer Ausfϋhrungsform widerstandsfähig sein, z.B. bei Temperaturen bis zu 13O 0 C, für pH-Bereiche zwischen 1 und 14, und/oder resistent gegen hydrolytische Enzyme (z.B. Proteasen, Esterasen)sein . In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker unter milden Bedingungen spaltbar.

Die für die Markierung von Nukeotiden erfindugnsgemäß eingesetzten Makromolekulare Verbidungen schließen in einigen Ausführungsformen wasserlösliche Polymere ein (s.o.). Die Linker der Nukmakromoleküle schließen ebenfalls wasserlösliche Polymere ein (s.o.). Es ist für den Fachmann erkennbar, dass die Zuordung einzelner Polymere zum Linker oder zum Marker einen beschreibenden Charakter hat.

1.3.3.3.4 Das Verhältnis der Nuk- Komponenten in einem modifizierten Nuk- Makromolekül Ein modifiziertes Nuk-Makromolekül kann durchschnittlich 1 bis 2, 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 30, 30 bis 100, 100 bis 1000, 1000 bis 10000, 10000 bis 1000000 Nuk- Komponenten einschließen. Insbesondere bei Verwendung von Nanostrukturen bzw. Nano- oder Mirkokügelchen können sehr hohe Zahlen von Nuk-Komponenten an eine solche Struktur gekoppelt sein.

In einer Ausführungsform haben alle modifizierten Nuk-Makromoleküle eine gleiche Anzahl an Nuk- Komponenten pro ein modifiziertes Nuk-Makromolekül. Beispielsweise können pro ein Strepavidin-Molekül eins bis maximal vier Biotin-Moleküle gebunden

werden, bei sättigender Konzentration von N uk- Linker- Komponenten, eine einheitliche Population an modifizierten Nuk-Makromolekülen entsteht.

In einer anderen Ausführungsform haben die modifizierten Nuk-Makromoleküle einer

5 Population eine gleiche durchschnittliche Anzahl von Nuk- Komponenten pro modifiziertes Nuk-Makromolekül, in der Population selbst findet allerdings eine Verteilung der tatsächlichen Besetzung der Nuk-Makromoleküle mit Nuk- Komponenten statt. Die Verteilungsangaben von Nuk- Komponenten pro modifiziertes Nuk-Makromolekül stellen in diesem Fall einen Mittelwert dar.

10

1.3.3.3.5 Das Verhältnis von Marker-Einheiten in einem modifizierten Nuk- Makromolekül

Die Zahl der Marker-Einheiten in einem modifizierten Nuk-Makromolekül schließt folgende Bereiche ein: 1 und 2, 2 und 5, 5 und 20, 20 und 50, 50 und 100, 100 und

15 500, 500 und 1000. 1000 und 10000, 10000 und 100000.

In einer Ausführungsform der Erfindung haben modifizierte Nuk-Makromoleküle eine feste Anzal von signalgebenden Einheiten pro Marker.

In einer anderen Ausführunsform kann die Verteilung von Marker-Einheiten in einer modifizierten Nuk-Makromolekül-Population schwanken und muß nicht notwendigerweise

10 einen konstanten Wert für jedes einzelne modifizierte Nuk-Makromolekül darstellen.

In einer Ausführungsform haben alle modifizierten Nuk-Makromoleküle eine gleiche Anzahl der Marker-Einheiten pro ein modifiziertes Nuk-Makromolekül. Beispielsweise können pro ein Strepavidin-Molekül maximal 4 Biotin-Moleküle gebunden werden, 15 Avidin-Biotin-Technology, Methods in Enzymology v.184, 1990..

In einer anderen Ausführungsform haben die modifizierten Nuk-Makromoleküle einer Population eine definierte durchschnittliche Zahl der Marker-Einheiten pro modifiziertes Nuk-Makromolekül, in der Population selbst findet allerdings eine Verteilung der 50 tatsächlichen Besetzung der modifizierten Nuk-Makromoleküle mit Marker-Einheiten statt. Bei sättigenden Konzentrationen bei der Synthese von Marker-Komponenten findet eine zunehmend einheitlichere Besetzung der modifizierten Nuk-Makromoleküle mit Marker-Einheiten statt.

S5 So spielt beispielsweise in Bereichen, wo es um den qualitativen Nachweis geht, die exakte Zahl der Marker-Einheiten pro modifiziertes Nuk-Makromolekül eine untergeordnete Rolle. In solchen Fällen ist das Vorhandensein eines stabilen Signals an sich von Bedeutung.

Es sollte einem Fachmann naheliegend erscheinen, dass die angeführten Marker- Komponenten eine beträchtlich größere Molekül-Größe und -Masse haben, als die jeweilige Nuk-Komponente selbst. Weiterhin sollten andere Beispiele für 5 makromolekulare Marker-Komponenten einem Fachmann naheliegend erscheinen.

1.3.3.3.6 Substrateigenschaften der modifizierten Nuk-Makromoleküle

Die Nuk-Komponente(n) bildet die Grundlage für die Substrateigenschaften der 10 modifizierten Nuk-Makromoleküle. Diese Eigenschaften können durch sterisches Hindernis modifiziert werden (s. Abschnitt sterisches Hindernis).

1.3.3.3.7 Funktion der Marker

Die makromolekulare Marker-Komponente kann in einer Ausführungsform eine

15 signalgebende Funktion haben. In einer anderen Ausführungsform hat sie eine signalvermittelnde Funktion. In einer weiteren Ausführungsform hat sie eine katalytische

Funktion. In einer weiteren Ausführungsform hat sie eine affine Funktion. In einer weiteren Ausführungsform hat der Marker mehr als nur eine Funktion, sondern z.B. vereinigt sowohl signalgebende als auch eine signalvermitteldne Funktion. Weitere

10 Kombinationen sind nahe liegend.

Bei der signalgebenden Funktion enthält die Marker-Komponente Bestandteile, die bereits während der chemischen Synthese an modifizierten Nuk-Makromoleküle gebunden werden.

>5

Bei der signalvermittelnden Funktion trägt die Marker-Komponente Bestandteile, die erst durch eine Reaktion mit signalgebenden Molekülen ihre Signaleigenschaften entfalten, s. WO 2005 044836. Beispielsweise können mehrere Biotin-Moleküle, z.B. 100 Biotin-Moleküle, den Marker-

SO Teil bilden. Nach dem Einbau der modifizierten Nuk-Makromoleküle erfolgt eine Nachweisreaktion mit modifizierten Streptavidin-Molekülen. In einem anderen Beispiel haben die Nukleinsäureketten die signalvermittelnde Funktion. Nach dem Einbau von modifizierten Nuk-Makromoleküle, erfolgt eine Hybridisierung von einheitlichen Oligonukleotiden mit detektierbaren Einheiten, z.B. Fluoreszenzfarbstoffen (MWG-

15 Biotech) an die Marker-Komponente. In einem weiteren Beispiel haben Amino- oder Merkapto-Gruppen, beispielsweise 50 Aminogruppen pro Marker, die signalvermittelnde Funktion. Nach dem Einbau der modifizierten Nuk-Makromoleküle in die Nukleinsäurekette erfolgt eine chemische Modifikation mit reaktiven Komponenten, z.B.

mit Farbstoffen, wie beispielsweise für eingebaute Allyl-Amino-dUTP beschrieben, Diehl et al. Nucleic Acid Research, 2002, V. 30, Nr. 16 e79.

In einer anderen Ausführungsform hat die makromolekulare Marker-Komponente eine 5 katalytische Funktion (in Form eines Enzyms oder Ribozyms). Dabei können unterschiedliche Enzyme verwendet werden, z.B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase. Dank der Kopplung an die Nuk-Komponente kann das jeweilige Enzym durch den Einbau von modifizierten Nuk-Makromolekülen an den Nukleinsäurestrang kovalent gebunden werden. 10

In einer weiteren Ausführungsform hat die makromolekularer Marker-Komponente eine Affinitätsfunktionalität zu einem anderen Molekül. Beispiele für solche Marker bilden Streptavidin-Moleküle, Antikörper oder Nukleinsäureketten.

15 In einer weiteren Ausführungsform hat der Marker die Funtion des makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden und stellt das makromolekulare sterische Hindernis dar.

1.3.4. Niedermolekularer Marker - zum Stand der Technik gehörende Markierung von ZO Nukleotiden beispielsweise mit ein oder zwei Biotin-Molekülen, ein oder zwei Farbstoff- Molekülen, ein oder zwei Hapten-Moleküln (z.B. Digoxigenin).

1.3.5. Konventionell modifiziertes Nukleotid - ein Nukleotid mit einem Linker (durchschnittliche Länge zwischen 5 und 30 Atomen) und einem Marker. üblicherweise

15 trägt ein konventionell modifiziertes Nukleotid einen niedermolekularen Marker, z.B. ein Farbstoff- oder ein Biotinmolekül.

1.3.6. Enzyme (Polymerasen)

In einer Ausführungsform können die modifizierten Nuk-Makromoleküle als Substrate für 50 Enzyme eingesetzt werden. Polymerasen stellen in Anwendungen oft eingesetzte Enzyme, die Nukleotide als Substrate verwerden. Sie werden im weiteren beispielhaft und stellvertretend für andere Nukleotid-umsetzende Enzyme betrachtet. Eine der zentralen Fähigkeit der Polymerasen besteht in kovalenten Kopplung von Nukleotid-Monomeren zu einem Polymer. Dabei kann die Synthese sowohl matrizen-abhängig (wie z.B. DNA-oder >5 RNA-Synthese mit DNA- oder RNA-abhängigen Polymerasen) als auch matrizenunabhängig, z.B. durch Terminale Transferasen ("J Sambrook "Molecular Cloning" 3. Ed. CSHL Press 2001).

Falls RNA als Substrat (z.B. mRNA) in die Sequenzierungsreaktion eingesetzt wird, können handelsübliche RNA-abhängige DNA-Polymerasen eingesetzt werden, z.B. AMV-Reverse Transcriptase (Sigma), M-MLV Reverse Transcriptase (Sigma), HIV-Reverse Transcriptase ohne RNAse-Aktivität. Für bestimmte Anwendungen, können Reverse Transcriptasen von RNAse-Aktivität weitgehend frei sein ("Molecular cloning" 1989, Ed. Maniatis, CoId Spring Harbor Laboratory), z.B. bei mRNA-Makrierung für Hybridisierungsexperimente.

Falls DNA als Substrat (z.B. cDNA) verwendet wird, eignen sich als Polymerasen prinzipiell alle DNA-abhängigen DNA-Polymerasen mit oder ohne 3'-5' Exonuklease-Aktivität (DNA- Replication" 1992 Ed. A. Kornberg, Freeman and Company NY), z.B. modifizierte T7- Polymerase vom Typ "Sequenase Version 2" (Amersham Pharmacia Biotech), Klenow Fragment der DNA-Polymerase I mit oder ohne 3'-5' Exonukleaseaktivität (Amersham Pharmacia Biotech), Polymerase Beta verschiedenen Ursprungs (Animal Cell DNA Polymerases" 1983, Fry M., CRC Press Inc., kommerziell erhältlich bei Chimerx) thermostabile Polymerasen wie beispielsweise Taq-Polymerase, Vent-Polymerase, Vent exo minus Polymerase, Deep Vent -Polymerase, Deep Vent exo minus Polymerase, Pfu- Polymerase, Thermosequenase, Pwo-Polymerase usw. (die Herrsteller sind beispielsweise Promega GmbH, Amersham Biosciences (GE), Roche GmbH, New England Biolabs).

Auch DNA-abhängige RNA- Polymerasen können verwendet werden, z.B. E. coli RNA- Polymerase, T7-RNA-Polymerase, SP6 RNA Polymerase.

Die Polymerasen können eine 3 ' - oder eine 5 ' -Exonuklease-Aktivität aufweisen und in bestimmten Anwendungen eingesetzt werden (z.B. bei real-time PCR). In der Anmeldung werden DNA-abhängige DNA-Polymerasen als Beispiele für Polymerasen betrachtet.

1.3.7. Spaltbare Verbindung - Eine unter milden Bedingungen spaltbare Verbindung. Diese Verbindung kann einen Abschnitt im Linker darstellen und kann an einer oder an mehreren Stellen spaltbar sein. In einem solchen Fall ist der Linker spaltbar. Es kann sich um eine chemisch spaltbare Verbindung, wie z.B. eine Disulfid-, eine Ester-, eine Acetal-, eine Thioesterverbindung (Short WO 9949082, Tcherkassov WO 02088382) handeln. Es kann auch eine photochemisch spaltbare Verbindung, wie in (Rothschild WO 9531429) dargestellt sein. Es kann auch eine enzymatisch spaltbare Verbindung (beispielsweise eine Peptid- oder Polypeptide-Bindung, Odedra WO 0192284), spaltbar durch Peptidasen, eine PoIy- oder Oligosaccharid-Bindung, spaltbar durch Disaccharidasen) sein, wobei die Spaltung durch ein spezifisches Enzym zwischen bestimmten Monomeren der spaltbaren Stellen stattfinden kann.

Mehrere Beispiele für spaltbare Verbindungen sind bekannt. Die Kopplung einer solchen Verbindung ist beispielsweise beschrieben in (Tcherkassov 02088382, Metzker et al. Nucleic Acid Research 1994, V.22, S. 4259, Canard et al. Gene, 1994, V. 148, 1, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642, Milton et al. WO 2004018493, Milton et al. 2004018497, WO2007053719). Eine Spaltbare Verbindung kann ein Teil des Linkers sein oder die Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid bilden, oder die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und der Makrer- Komponente, oder die Verbindung zwischen den Marker-Einheiten und der Kern- Komponente.

1.3.8 DNA - Deoxyribonukleinsäure verschiedenen Ursprungs und unterschiedlicher Länge (z.B. Oligonukleotide, Polynukleotide, Plasmide, genomische DNA, cDNA, ssDNA, dsDNA)

1.3.9 RNA - Ribonukleinsäure

1.3.10 dNTP - 2'-deoxi-Nucleosid-Triphosphate, Substrate für DNA-Polymerasen und Reverse-Transkriptasen, z.B. dATP, dGTP, dUTP, dTTP, dCTP.

1.3.11 NTP - Ribonukleosid-Triphosphate, Substrate für RNA-Polymerasen, UTP, CTP, ATP, GTP.

1.3.12 Abkürzung "NT" wird auch bei der Längenangabe einer Nukleinsäuresequenz verwendet, z.B. 1.000 NT. In diesem Fall steht "NT" für Nukleosid-Monophosphate.

Im Text wird bei Abkürzungen die Mehrzahl durch Verwendung des Suffixes "s" gebildet, "NT" steht zum Beispiel für "Nukleotid", "NTs" steht für mehrere Nukleotide.

1.3.13 NSK - Nukleinsäurekette. DNA oder RNA

1.3.14 Gesamtsequenz - Summe aller Sequenzen im Ansatz, sie kann ursprünglich aus einer oder mehreren NSKs bestehen. Dabei kann die Gesamtsequenz Teile oder äquivalente einer anderen Sequenz oder von Sequenz-Populationen darstellen (z.B. mRNA, cDNA, Plasmid-DNA mit Insert, BAC, YAC) und aus einer oder unterschiedlichen Spezies stammen.

1.3.15 NSKF - Nukleinsäurekettenfragment (DNA oder RNA), das einem Teil der Gesamtsequenz entspricht, NSKFs - Nukleinsäurekettenfragmente. Die Summe der NSKFs bildet ein äquivalent zur Gesamtsequenz. Die NSKFs können beispielsweise

Fragmente von DNA- oder RNA-Gesamtsequenz sein, die nach einem Fragmentierungsschritt entstehen.

1.3.16 Primerbindungstelle (PBS) - Teil der Sequenz in der NSK oder NSKF, an den der Primer bindet.

1.3.17 Referenzsequenz - eine bereits bekannte Sequenz, zu der die Abweichungen in der zu untersuchenden Sequenz bzw. in den zu untersuchenden Sequenzen (z.B. Gesamtsequenz) ermittelt werden. Als Referenzsequenzen können in Datenbanken zugängliche Sequenzen verwendet werden, wie z.B. aus der NCBI-Datenbank.

1.3.18 Tm - Schmelztemperatur

1.3.19 Sterisches Hindernis (sterisch anspruchsvolle Gruppe oder Ligand oder Struktur)

Eine Gruppe oder eine chemische Struktur, die als Bestandteil des modifizierten Nuk- Makromolekül (als funktioneller Teil des modifizierten Nuk-Makromoleküls), die einen raumfordernden Effekt in einem gewissen Abstand vom Nukleiotid schafft. Diese chemische Struktur hat beispielsweise in einer bevorzugten Ausführungsform den Effekt, dass die Polymerase nur ein einziges komplementäres modifiziertes Nuk-Makromolekül in den Primer einbauen kann und der Einbau von weiteren komplementären modifizierten Nuk-Makromolekülen in direkter / unmettelbarer Nachbarschaft zum ersten eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekül gehindert wird.

1.3.19.1 Natur und Struktur des sterisch anspruchsvollen Liganden

Vorzugsweise werden Polymere (z.B. Proteine, Dendrimere) oder supramolekulare Strukturen (z.B. Nanoteilchen oder Mikroteilchen) mit einer kompakten dreidimensionalen (3D) Struktur als makromolekulare, sterisch anspruchsvolle Liganden eingesetzt. Für die Beschreibung der makromolekularen, sterisch anspruchsvollen Liganden sind die raumforderenden Eigenschaften von Bedeutung. Idealerweise nimmt ein solcher makromolekularer Ligand ein gewisses Volumen ein, wobei die Anwesenheit eines anderen makromolekularen Moleküls in diesem Volumen ausgeschlossen oder sehr unwahrscheinlich ist.

In einer bevorzugten Ausführungsrom der Anmeldung, stellen Proteine die Beispiele für sterisch anspruchsvolle Liganden im Sinne dieser Anmeldung dar, z.B. Streptavidin (SA), Avidin, Phycoerythrin (PE), Green Fluorescent Protein (GFP), Antiköper, Bovine serum albumine (BSA) oder ihre Derivate und Modifikationen (z.B. alkylierte, acetylierte, oder

mit weiteren wasserlöslichen Polymerasen modifizierte Formen der Proteine, oder gentechnisch veränderte Proteine, die andere spektrale Eigenschaften haben, oder Protein-Konjugate, wie z.B. Strepavidin-alkalische Phosphatase, Streptavidin-Peroxidase, Streptavidin-Antikörper, Streptavidin-Phycoerhytrin oder ganze Komplexe, wie z.B. Quantum-Dots mit Hülle aus polyacrylsäure modifiziert mit Streptavidin, (erwerblich bei Invitrogen).

In einer weiteren Ausführungsform der Anmeldung, stellen Dendrimere die Beispiele für sterisch anspruchsvolle Liganden im Sinne dieser Anmeldung dar (s. Abschnitt Marker)

In einer weiteren Ausführungsform der Anmeldung, stellen Nano- und Mikroteilchen die Beispiele für sterisch anspruchsvolle Liganden im Sinne dieser Anmeldung dar, z.B. paramagnetische Teilchen (s. Abschnitt Marker), Glas-Teilchen (s. Abschnitt Marker), Kunststoff-Teilchen (s. Abschnitt Marker).

In einer weiteren Ausführungsform der Anmeldung, stellen verzweigte Polymere die Beispiele für sterisch anspruchsvolle Liganden im Sinne dieser Anmeldung dar , z.B. Dextrane (s. Abschnitt Marker).

Masse / Abmessung / Durchmesser

Zur Vereinfachung der Klassifizierung der sterisch anspruchsvollen Liganden wird die Angabe der Masse (z.B. für Proteine) bzw. des druchschnittlichen Durchmessers (z.B. für Nanostrukturen) herangezogen. Diese Angabe dient als grobes Maß für die Differenzierung von sterisch anspruchsvollen Liganden nach ihrer Größe. Dabei werden kleinmolekulare sterisch anspruchsvolle Liganden (Molekulare Masse weniger als 2 kDa) und makromolekulare sterisch anspruchsvolle Liganden (Molekulare Masse größer als 2 kDa) unterschieden.

In einer Ausführungsform werden vorzugsweise Liganden mit einer Masse verwendet, die zwischen 2 und 1000 kDa liegt, im einzelnen sind folgende Bereiche für die Masse des sterischen Hindernisses vom Interesse: zwischen 2 und 10 kDa, 10 und 30 kDa, 30 und 100 kDa, 100 und 300 kDa, 300 und 1000 kDa.

In einer weiteren Ausführungsform werden Liganden verwendet, deren Durchmesser zwischen 1 und 3 nm, 3 und 10 nm, 10 und 30 nm, 30 und 100 nm, 100 und 300 nm, 300 nm und 1000 nm, 1000 nm und 5000 nm liegt.

In einer weiteren Ausführungsform werden sterisch anspruchsvolle Liganden mit niedriger Molekularer Masse an ein Gerüst gekoppelt und wirken in ihrer Gesamtheit (d.h. die Liganden an sich und das Gerüst) als makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand. Dabei kann die Anzahl der Liganden mit niedriger Masse, gekoppelt an ein Gerüst, beispielsweise zwischen 2 und 200 liegen.

Es ist einem Fachmann naheliegend, dass auch andere Klassifikationen, z.B. die Angabe der chemischen Struktur, Gesamtladung, Beschreibung der Oberflächeneigenschaften, Form, oder geometrischen Abmessungen, bzw. Volumens usw., zur Klassifizierung der Liganden verwendet werden können. Ebenfalls wird als bekannt vorausgesetzt, dass die Moleküle bzw. Nanostrukturen unterschiedliche chemische Gruppen einschließen können.

1.3.19.2.1 Position im des sterischen Hidernisses im modifizierten Nuk-Makromolekül und Kopplung

• In einer bevorzugten Ausführungsform ist der makromolekulare sterisch anspruchsvolle Ligand an den Linker gekoppelt. Die Kopplungsstelle des sterisch anspruchsvollen Liganden kann im Inneren des Linkers liegen oder am Ende des Linkers. In dieser Ausführungsform hat der Marker eine selbständige Kopplungsstelle am Linker, die abweichend von der Kopplungsstelle des sterisch anspruchsvollen Liganden ist.

• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der makromolekulare sterisch anspruchsvolle Ligand an den Linker gekoppelt. Der Marker ist seinerseits an diesen makromolekulare sterisch anspruchsvolle Ligand gekoppelt. In dieser

Ausführungsform dient der Ligand als Verbindungsglied zwischen dem Linker und dem Marker. Der Marker kann zum raumfordernden Effekt des sterisch anspruchsvollen Liganden beitragen.

• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der sterisch anspruchsvolle Ligand an den Marker gekoppelt. Der Marker kann zum raumfordernden Effekt des sterisch anspruchsvollen Liganden beitragen.

• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der sterisch anspruchsvolle Ligand ein Bestandteil des Markers. Beide Strukturen tragen zum raumfordernden Effekt des sterisch anspruchsvollen Liganden bei. Beispielsweise, kann der sterisch anspruchsvolle Ligand als der Kern-Komponente innerhalb von Marker auftreten.

• In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat der sterisch anspruchsvolle Ligand die Markerfunktion, d.h. der Marker und der sterisch anspruchsvolle Ligand sind identisch.

Die sterisch anspruchsvolle Gruppe kann auch als Teil des Linkers oder als Teil des Markers betrachtet werden. Die Betrachtugnsweise kann beispielsweise davon abhängen, ob sterisch anspruchsvolle Gruppe gewisse Signaleigenschaften aufweist oder nicht.

Die Zahl der an das modifizierte Nuk-Makromolekül gekoppelten makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden kann variieren und liegt beispielsweise zwischen 1 und 3, 3 und 5, 5 und 20, 20 und 50, 50 und 1000. Dabei kann diese Zahl eine exakte oder nur eine durchschnittliche Zahl darstellen.

Der minimale Abstand zwischen der Nuk-Komponente und dem am nächsten liegenden sterisch anspruchsvollen Liganden („sterischen Hindernis") kann variieren zwischen 10 und 10000 Kettenatome und schließt vorzugsweise folgende Bereiche ein: 10 bis 15, 15 bis 20, 20 bis 25, 25 bis 30, 30 bis 35, 35 bis 40, 40 bis 45, 45 bis 50, 50 bis 55, 55 bis

60, 60 bis 70, 70 bis 80, 80 bis 90, 90 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 1000, 1000 bis

5000, 5000 bis 10000 Kettenatome, bzw. 10 bis 15, 15 bis 20, 20 bis 25, 25 bis 30, 30 bis 35, 35 bis 40, 40 bis 45, 45 bis 50, 50 bis 55, 55 bis 60, 60 bis 70, 70 bis 80, 80 bis

90, 90 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 1000, 1000 bis 5000, 5000 bis 10000 Angström

(berechnet auf maximal gestreckten Zustand des Moleküls).

Allgemeine Bedeutung der Entfernung zwischen dem NT und sterischen Hindernis:

Der Linker schafft den Abstand zwischen der enzymatisch aktiven Nuk-Komponente und dem sterisch anspruchsvollen Liganden. Bei genügendem Abstand, kann die Nuk- Komponente durch die Polymerase in einen Primer (N) (der Primer( N) hat keinen anspruchsvollen Liganden) eingebaut werden. Da nun der Primer (N+ i) selbst einen sterisch anspruchsvollen Liganden an seinem 3 '-OH-Ende trägt, hindert dieser sterisch anspruchsvolle Ligand den Einbau von weiteren modifizierten Nuk-Makromolekülen mit sterisch anspruchsvollen Liganden (näheres s. Abschnitt enzymatische Eigenschaften von modifizierten Nuk-Makromolekülen)

1.3.19.2.2 Kopplung eines makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden an den Linker

Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und dem makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden kann ähnlich zur Kopplung zwischen dem Linker und dem Marker erfolgen. Sie kann sowohl kovalent als auch affine erfolgen. Viele Beispiele sind dem Fachmann bekannt, s. z.B. "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2. „Chemistry of protein conjugation and crosslinking" Shan S. Wong 1993 CRC Press Inc.). Kovalente Kopplung : Die Verbindung zwischen der Linker-Komponente und dem Marker kann in einer Ausführungsform widerstandsfähig sein, z.B. bei Temperaturen bis zu 130 0 C, für pH- Bereiche zwischen 1 und 14, und/oder resistent gegen hydrolytische Enzyme (z.B. Proteasen, Esterasen)sein . In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und dem Linker unter milden Bedingungen spaltbar.

Beispiele für Ausführungsformen, in denen der makromolekulare sterisch anspruchsvolle Ligand an den Linker gekoppelt ist und der Marker ist seinerseits an den Liganden gekoppelt bzw. der Ligand als Kern-Komponente des Markers auftritt, sind im Abschnitt Beispiele dargestellt.

1.3.19.2.3 Substrateigenschaften der modifizierten Nuk-Makromoleküle: Die Eigenschaften von Nuk-Komponenten gegenüber von Polymerasen können durch sterisch anspruchsvolle Liganden modifiziert werden.

Zur Anschaulichkeit (die Auffassung der Erfinder hat keinen Anspruch auf Vollständigkeit und soll lediglich schematisch die Grundprinzipien der raumfordenen Eigenschaften schildern) kann man die Substrateigenschaften der modifizierten Nuk-Makromoleküle gegenüber den Primer^-Matrize-Polymerase-Komplexen (Primer (N) hat keinen sterisch anspruchsvollen Liganden) dadurch erklären, dass die komplementäre Nuk-Komponente des modifizierten Nuk-Makromoleküls ausreichende Reichweite besitzt und das sterische Hindernis den Einbau dieser Nuk-Komponente in den Primer {N) -Matrize-Komplex durch die Polymerase nicht verhindert.

Nach dem Einbau des ersten modifizierten Nuk-Makromoleküls ändert sich die Situation

(Primer (N+1) ):

Das sterische Hindernis nimmt einen Raum in Anspruch, der nicht von einem anderen großen Struktur (z.B. ähnlich großer oder noch größerer sterisch anspruchsvoller Ligand) in Anspruch genommen werden kann. Der effektiv eingenommene Raum setzt sich aus dem Volumen des Moleküls und Einflüssen, die in der Lösung entstehen (z.B. Lösungsmittelhüllen die zu einem hydrodynamischer Durchmesser beitragen), so dass dieser Raum u.U. größer als das tatsächliche Volumen der molekularen Struktur sein kann.

Durch die Kopplung des sterischen Hindernisses an das modifizierte Nuk-Makromolekül wird der sterisch anspruchsvolle Ligand in der Nähe der 3 ' -OH Gruppe platziert.

Die Substrateigenschaften dieses Komplexes, bestehend aus Matrize, dem verlängerten Primer (N+1) , der Polymerase und dem an das endständige Nukleotid gebundene sterische Hindernis kann man folgenderweise zusammenfassen (Fähigkeit, das nächste komplementäre Nukleotid / die nächste komplementäre Nuk-Komponente einzubauen):

• niedermolekulare Nukleotide und deren Derivate haben weiterhin den Zugang zum aktiven Zentrum der Polymerasen (z.B. weitere komplementäre natürliche Nukleotide und deren niedermolekulare Derivate, z.B. mit einem Farbstoff markierte

Nukleotide, z.B. dCTP-Cy) und können eingebaut werden.

• komplementäre Nuk-Komponente der modifizierten Nuk-Makromoleküle haben keinen Zugang zum aktiven Zentrum der Polymerase, da der makromolekulare sterisch anspruchsvolle Ligand des modifizierten Nuk-Makromoleküls nicht in die Nähe der Polymerase gelangen kann weil die Reichweite der Nuk-Komponente durch die Linker-Länge begrenzt ist.

Mit steigenden Abstand vom sterisch anspruchsvollen Liganden, z.B. nach wiederholtem Einbau von natürlichen Nukleotiden in den Primer nach dem modifizierten Nuk- Makromolekül (Primer (N+X) ), verringert sich die Wirkung vom sterischen Hindernis, so dass weiteres modifizierten Nuk-Makromolekül erneut eingebaut werden kann. Nach Abspaltung des sterischen Hindernisses von der eingebauten Nuk-Komponente verliert der Primer-Matrize-Polymerase-Komplex (Primer (N+ i ) ) den raumfordenden Liganden, so dass die Zugängigkeit für eine weitere Nuk-Komponente des modifizierten Nuk-Makromoleküls wiederhergestellt wird.

1.3.20 Kompositionen

Als Bestandteil eines Kits, kann die Komposition zur Durchführung eines oder mehreren Verfahrensschritte eine Lösung von einer oder mehreren Substanzen oder auch ein trockes Gemisch sein, was vor dem Verfahrensschritt mit einer Lösung versetzt werden muss.

1.3.21 Feste Phase / Stationäre Phase /Reaktionsoberfläche

In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind die an der Reaktion teilnehmende Nukleinsäureketten an einer festen Phase gebunden. Die Bindung kann kovalent oder affin erfolgen. Begriffe „Feste Phase", „Stationäre Phase", "Reaktionsoberfläche" werden in diesem Zusammenhang als Synonyme verwendet, es sei denn, auf eine andere Bedeutung wird hingewiesen.

2. Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung schließt folgende Aspekte ein:

Aspekt 1: Nukleotid-Analoga (modifizierte Nuk-Makromoleküle), die folgende Komponenten einschließen: zumindest eine Nukleotid-Komponente (Nuk-Komponente), zumindest einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden, zumindest einen Marker, zumindest einen Linker.

Aspekt 2: Nukleotid-Analoga (modifizierte Nuk-Makromoleküle), die folgende Komponenten einschließen : zumindest eine Nukleotid-Komponente (Nuk-Komponente), zumindest einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden, zumindest einen Marker, zumindest einen Linker, wobei der jeweilige Linker, der an die Nukleotid- Komponente gekoppelt ist, spaltbar ist.

Aspekt 3: Ein Reaktionsgemisch, das mindestens eines der Nukleotid-Analoga nach Aspekt 1 oder 2 einschließt

Aspekt 4: Eine Komposition, die mindestens eines der Nukleotid-Analoga nach Aspekt 1 oder 2 einschließt: Das Verhältnis zwischen dem Gewichtsanteil des Nukleotid-Analogs und dem Gewicht der Komposition kann folgende Bereiche einschließen: 1: 1000000 bis 1: 100000, 1 : 100000 bis 1: 10000, 1: 10000 bis 1: 1000, 1 : 1000 bis 1:100, 1: 100 bis 1:10, 1 : 10 bis 1.

Aspekt 5: Eine Nukleinsäurekette oder ein Gemisch von Nukleinsäureketten, die mindestens eines der Nukleotid-Analoga nach Aspekt 1 oder 2 als Monomer der Nukeinsäurekette einschließen, wobei sich die Nukleinsäureketten sowohl in der Lösung befinden können oder an einer festen Phase fixiert sein.

Aspekt 6: Eine Nukleinsäurekette oder ein ein Gemisch von Nukleinsäureketten nach Aspekt 5, wobei diese Nukleinsäureketten eine Primer funktion haben.

Aspekt 7: Verfahren zur enzymatischen Synthese von Nukleinsäureketten, bei dem Nukleotid-Analoga nach Aspekt 1 oder 2 eingesetzt werden.

Aspekt 8: Ein Verfahren zur Synthese von Nukleinsäureketten, das folgende Schritte einschließt: o Bereitstellung von extensionsfähigen Matrize-Primer-Komplexen o Inkubation dieser Komplexe in einer Reaktionslösung, die eine oder mehrere Polymerase-Arten und zumindest eine Art der modifizierten Nuk- Makromoleküle nach Aspekt 2 enthält, unter Bedingungen, die eine Primer-

Verlängerung um ein modifiziertes Nuk-Makromolekül erlauben, wobei das modifizierte Nuk-Makromolekül in Art und Weise modifiziert ist, dass sein Einbau zu einem Stopp in der weiteren enzymatischen Reaktion führt.

Aspekt 9: Kit zur Durchführung der enzymatischen Synthese von Nukleinsäureketten, das folgende Elemente einschließt: o Eine oder mehrere Arten der Polymerasen o Zumindes eins der Nukleotid-Analoga, nach Aspekt 1 oder 2

Aspekt 10: Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten, das folgende Elemente einschließt: o Eine oder mehrere Arten der Polymerasen o Zumindes eins der Nukleotid-Analoga, nach Aspekt 2

Aspekt 11 : Ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleisäureketten, das folgende Schritte einschließt:

a) Bereitstellung von mindestens einer Population an extensionsfähigen Nukleinsäureketten-Primer-Komplexen (NSK-Primer-Komplexe)

b) Inkubation von mindestens einer Art der modifizierten Nuk-Makromoleküle nach Aspekt 2 zusammen mit zumindest einer Art der Polymerase mit den im Schritt (a) bereitgestellten NSK-Primer-Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von komplementären modifizierten Nuk-Makromolekülen zulassen, wobei jede Art der modifizierten Nuk-Makromoleküle eine für sie charakteristische Markierung besitzt.

c) Entfernung der nicht eingebauten modifizierten Nuk-Makromoleküle von den NSK-Primer-Komplexen

d) Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen

e) Abspaltung der Linker-Komponente sowie der Marker-Komponente und des makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden von den in die NSK- Primer-Komplexe eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen

f) Waschen der NSK-Primer-Komplexe

gegebenenfalls Wiederholung der Schritte (b) bis (f),

Ein weiterer Aspekt 12 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 11, wobei die Nukleinsäureketten an eine feste Phase in zufälliger Anordnung gekoppelt sind und zumindes ein Teil dieser NSK-Primer-Komplexen optisch einzeln adressierbar ist

Ein weiterer Aspekt 13 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 11 zur parallelen Sequenzanalyse von Nukleinsäuresequenzen (Nukleinsäureketten, NSKs), bei dem man

Fragmente (NSKFs) einzelsträngiger NSKs mit einer Länge von etwa 50 bis 1000 Nukleotiden erzeugt, die überlappende Teilsequenzen einer Gesamtsequenz darstellen können, man

die NSKFs unter Verwendung eines einheitlichen oder mehrerer unterschiedlichen Primer in Form von NSKF-Primer-Komplexen auf einer Reaktionsoberfläche in einer zufälligen Anordnung bindet, wobei die Dichte der an die Oberfläche gebudenen NSKF-Primer-Komplexen eine optische Detektion der Signale von einzelnen eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen zuläßt, man

eine zyklische Aufbaureaktion des komplementären Stranges der NSKFs unter Verwendung einer oder mehrerer Polymerasen durchführt, indem man

a) zu den auf der Oberfläche gebundenen NSKF-Primer-Komplexen eine Lösung zugibt, die eine oder mehrere Polymerasen und ein bis vier modifizierte Nuk-Makromoleküle nach Aspekt 2 enthält, die eine mit fluoreszierenden Elementen markierte Marker-Komponente haben, wobei die bei gleichzeitiger Verwendung von mindestens zwei modifizierte Nuk-Makromoleküle jeweils an die Marker-Komponente befindlichen fluoreszierenden Elementen so gewählt sind, dass sich die verwendeten modifizierten Nuk-Makromoleküle durch Messung unterschiedlicher Fluoreszenzsignale voneinander unterscheiden lassen, wobei die modifizierten Nuk-Makromoleküle strukturell so modifiziert sind, dass die Polymerase nach Einbau eines solchen modifizierten Nuk-

Makromoleküls in einen wachsenden komplementären Strang nicht in der Lage ist, ein weiteres Nuk-Nakromolekül in denselben Strang einzubauen, wobei die Linker-Komponente mit der Marker-Komponente und dem makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden abspaltbar sind, man

b) die in Stufe a) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen inkubiert, die zur Verlängerung der komplementären Stränge geeignet sind, wobei die komplementären Stränge jeweils um ein modifiziertes Nuk-Makromolekül verlängert werden, man

c) die in Stufe b) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung nicht in einen komplementären Strang eingebauter modifizierter Nuk-Makromoleküle geeignet sind, man

d) die einzelnen, in komplementäre Stränge eingebauten modifizierten

Nuk-Makromoleküle durch Messen des für den jeweiligen fluoreszierenden Elementen charakteristischen Signals detektiert, wobei man gleichzeitig die relative Position der einzelnen Fluoreszenzsignale auf der Reaktionsoberfläche bestimmt, man

e) zur Erzeugung unmarkierter NSKFs die Linker-Komponente und die Marker-Komponente, sowie den makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden von den am komplementären Strang angefügten modifizierten Nuk- Komponenten abspaltet, man

f) die in Stufe e) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung der Marker-Komponente geeignet sind, man

die Stufen a) bis f) gegebenenfalls mehrfach wiederholt,

wobei man die relative Position einzelner NSKF-Primer-Komplexe auf der Reaktions- Oberfläche und die Sequenz dieser NSKFs durch spezifische Zuordnung der in Stufe d) in aufeinanderfolgenden Zyklen an den jeweiligen Positionen detektierten Fluoreszenzsignale zu den modifizierten Nuk-Makromolekülen bestimmt.

Ein weiterer Aspekt 14 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 13, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus nur jeweils eine Art der modifizierten Nuk- Makromoleküle einsetzt.

Ein weiterer Aspekt 15 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 13, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus jeweils zwei unterschiedlich markierte Arten der modifizierten IMuk-Makromoleküle einsetzt.

Ein weiterer Aspekt 16 der Erfindung betrifft ein Verfahren nach Aspekt 13, dadurch gekennzeichnet, dass man die Stufen a) bis f) der zyklischen Aufbaureaktion mehrfach wiederholt, wobei man in jedem Zyklus jeweils vier unterschiedlich markierte Arten der modifizierten Nuk-Makromoleküle einsetzt.

Aspekt 17 : Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach dem Verfahren nach einem der Aspekte 8 oder 11 bis 15, das folgende Elemente einschließt: o Eine oder mehrere Arten der Polymerasen o Zumindes eins der Nukleotid-Analoga, nach Aspekt 2 o Lösungen zur Durchführung von zyklischen Sequenzierungsschritten

Aspekt 18 : Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach dem Verfahren von einem der Aspekte 8 oder 11 bis 15, das einer oder mehrere der folgenden Kompositionen - vorliegend als Lösung in konzentrierter oder in verdünter Form oder auch als Gemisch von trockenen Substanzen - aus der folgenden Liste einschließt: o Eine oder mehrere Arten der Polymerasen o Zumindes eins der Nukleotid-Analoga, nach Aspekt 2 o Lösungen zur Durchführung von zyklischen Sequenzierungsschritten o Komposition für Einbaureaktion / Extensionsreaktion o Komposition für Waschen der festen Phase nach der Einbaureaktion

o Komposition für optische Detektion der Signale an der festen Phase o Komposition für Abspaltung des Markers und des sterisch anspruchsvollen makromolekularen Liganden o Komposition für Waschen der festen Phase nach der Abspaltung des Markers und des sterisch anspruchsvollen makromolekularen Liganden o Komposition für Blockade des Linker-Rests o Komposition für Waschen der festen Phase nach der Blockade des Linker

Rests o Komposition zur Bindung von signalgebenden Marker-Einheiten an den Marker o Komposition mit signalgebenen Marker-Einheiten

Aspekt 19 : Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach Aspekt 18, das weiterhin eine oder mehrere Elemente aus der folgende Liste einschließt: o Komposition mit nicht modifizierten Nukleotiden (dNTPs oder NTPs) o Komposition mit irreversibel Terminatoren (ddNTPs) o Komposition mit Terminaler Transferase o Komposition mit einem Puffer für Transferasen-Reaktion o Komposition mit einer Ligase o Komposition von Oligonukleotiden, die als einheitliche Primer-Bindungsstelle an die Nukleinsäuren ligiert werden können. o Komposition mit einem Puffer für Ligsereaktion-Reaktion o Feste Phase und Reagenzien zur Preparation von Nukleinsäureketten zur

Sequenzierung, o Feste Phase und Reagenzien zur Präparation von Polymerase zur Sequenzierung o Vorrichgung und Reagenzien zur Vorbereitung von Nukleotid-Analoga nach

Aspekt 2 zur Sequenzierung. o Komposition mit Blockierungsreagezien zur Unterdrückung von unspezifischen

Adsorption von markierten Molekülen o Feste Phase zur Durchführung von zyklischen Einbaureaktionen

Aspekt 20 : Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach einem der Aspekte 9, 10, 17, 18 oder 19, das eine oder mehrere Polymerasen aus der folgenden Liste einschließt: o Reverse Transcriptasen : M-MLV, RSV, AMV, RAV, MAV, HIV o DNA Polymerasen : Klenow Fragment DNA Polymerase, Klenow Fragment exo minus DNA Polymerase, T7 DNA Polymerase, Sequenase 2, Vent DNA Polymerase, Vent exo minus DNA Polymerase, Deep Vent DNA Polymerase, Deep Vent exo minus DNA Polymerase, Taq DNA Polymerase, TIi DNA

Polymerase, Pwo DNA Polymerase, Thermosequenase DNA Polymerase, Pfu DNA Polymerase

Aspekt 21 : Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach einem der Aspekte 9, 10, 5 17, 18 oder 19, in dem die Bestandteile der Kompositionen breits gemischt sind oder als getrennte Substanzen vorliegen.

Aspekt 22: Kit zur Sequenzierung von Nukleinsäureketten nach einem der Aspekte 9, 10, 17, 18 oder 19, das eine oder mehrere feste Phasen zur Durchführung von zyklischen LO Sequenzierungsschritten aus der folgenden Liste einschließt: o Plane, transparente feste Phase o Plane, transparente feste Phase, die als Bestandteil einer Flow-Cell oder eines

Chips bereitgestellt ist o Feste Phase in Form von Nano- oder Mikrokügelchen

L5 o Feste Phase in Form von Nano- oder Mikrokügelchen, die paramagnetisch sind o Feste Phase vorbereitet nach DE 101 49 786 o Feste Phase vorbereitet nach DE 10 2004 025 744

Aspekt 23: Ein Verfahren zur Synthese von Nukleinsäureketten, das folgende Schritte 10 einschließt: a) Bereitstellung von extensionsfähigen Matrize-Primer-Komplexen b) Einbaureaktion: Inkubation dieser Komplexe in einer Reaktionslösung, die eine oder mehrere Polymerase-Arten und zumindest eine Art der modifizierten Nuk- Makromoleküle nach Aspekt 2 enthält, unter Bedingungen, die eine Primer-

.5 Verlängerung um ein modifiziertes ein Nuk-Makromolekül erlauben, wobei das modifizierte Nuk-Makromolekül in Art und Weise modifiziert ist, dass sein Einbau zu einem Stopp in der weiteren enzymatischen Reaktion führt. c) Inkubation der Matrize-Primer-Komplexe unter den Bedingungen die zur Trennung der oben genannten Primer mit eingebauten Nukleotid-Analoga von den Matrizen

50 führen. d) Optionelle Wiederholung der Schritte (b) und (c) e) Applikation der erhaltenen markierten Primer auf ein Trennmedium oder in ein Trennverfahren f) Gegebenenfalls Identifizierung der Art des eingebauten Nukleotid-Analoges 55

Die zyklischen Schritte können mehrmals wiederholt werden, beispielsweise 2 bis 10 mal, 10 bis 20 mal, 20 bis 100 mal, 100 bis 500 mal. Die Identifizierung der eingebauten Nukleotid-Analoga erfolgt durch den Marker.

Aspekt 24: Ein Verfahren zur Synthese von Nukleinsäureketten, das folgende Schritte einschließt: a) Bereitstellung von extensioinsfähigen Matrize-Primer-Komplexen, die adressierbare Positionen haben b) Einbaureaktion : Inkubation dieser Komplexe in einer Reaktionslösung, die zumindes eine Polymerase-Art und zumindest eine Art der modifizierten Nuk-Makromoleküle nach Aspekt 24 enthält, unter Bedingungen, die eine Primer-Verlängerung um ein modifiziertes Nuk-Makromolekül erlauben, wobei das modifizierte Nuk- Makromolekül in Art und Weise modifiziert ist, dass sein Einbau zu einem reversiblen Stopp in der weiteren enzymatischen Reaktion führt. c) Gegebenenfalls Verwendung von Reinigungsschritten von Matrize-Primer- Komplexen d) Gegebenenfalls Identifizierung der Art des eingebauten Nukleotid-Analoges durch Erfassung der Markereigenschaften, wobei eine örtliche Zuordnung der Signale zu bestimmen Primer-Matrize-Komplexen erfolgen kann e) Entfernung des zur Termination führenden makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden und gegebenenfalls des Markers f) Falls erforderlich Verwendung von Reinigungsschritten von Matrize-Primer- Komplexen g) Gegenebenfalls Wiederholung der Schritte (b) bis (f) und anschließende Analyse der identifizierten Signale von eigebauten Nukleotid-Analoga.

Die zyklischen Schritte können mehrmals wiederholt werden, beispielsweise 2 bis 10 mal, 10 bis 20 mal, 20 bis 100 mal, 100 bis 500 mal. Die Identifizierung der eingebauten Nukleotid-Analoge erfolgt durch den Marker.

Aspekt 25 der Erfindung betrifft Nukleotid-Analoga (modifizierte Nuk-Makromoleküle) mit der Zusammensetzung nach Aspekt 1 oder 2, wobei folgende Anordnungen der Komponenten eingeschlossen werden:

(N u k- Linker l) n -(Ligand) k -(Marker) m (Nuk-Linker l) n -(Ligand-Linker 3) k -(Marker) m (Nuk-Linker l) n -(Ligand) k -(Linker 3-Marker) m (Nuk-Linker l) n -(Marker) m -(Ligand) k (Nuk-Linker l-Ligand) n -(Marker) m (Ligand-Linker 2-Nuk-Linker l) n -(Marker) m (Nuk-Linker l) n -(Marker/Ligand) m

(Nuk-Linker l-Ligand) n -(Marker) m -(Linker 1-Nuk) n

wobei:

Nuk - eine Nuk-Komponente ist Linker - eine Linker-Komponente ist, wobei Linker 1 oder Linker 2 oder Linker 3 gleiche oder auch unterschiedliche Struktur haben können Marker - eine Makrer-Komponente ist

Ligand - ein makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand ist

Marker/Ligand - eine Struktur, die sowohl Marker-Eigenschaften als auch Eigenschaften eines makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden hat

(n) - eine Zahl von 1 bis 100000 ist.

(m) - eine Zahl von 1 bis 1000

(k) - eine Zahl von 1 bis 1000

Wobei in einer Ausführungsform der Strukturen, die Verhältnisse im Molekül folgendermassen verteilt sind: (n)> = (m)> = (k), wobei die einzelnen Zahlen unabhängig von einander variiert werden können.

In einer weiteren Ausführungsform der Struktur, die Verhältnisse im Molekül folgendermassen verteilt sind : (n)>(m)>(k), wobei die einzelnen Zahlen unabhängig von einander variiert werden können.

In einer weiteren Ausführungsform der Struktur, die Verhältnisse im Molekül folgendermassen verteilt sind: (n) = <(m)>(k), wobei die einzelnen Zahlen unabhängig von einander variiert werden können.

Ein weiterer Aspekt 26 der Erfindung betrifft Nukleotid-Analoga nach einem der Aspekte 1, 2 oder 25, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (Fig. 3A) :

Wobei:

Base - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren Modifikationen, wobei L die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente darstellt (Kopplungseinheit L) und X die Kopplungsstelle der Kopplungseinheit L an der Base ist

Ri - ist H

R 2 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Halogen, NH2, SH oder geschützte OH-Gruppe

R 3 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, Halogen, PO 3 , SH, N 3 , NH 2 , 0-R 3-1 , P(O) m -R 3- i (m ist 1 oder 2 ist), NH-R 3-1 , S-R 3-1 , Si-R 3-I wobei R 3-1 eine chemisch, photochemisch oder enzymatisch spaltbare Gruppe ist, oder eine der folgenden Modifikationen einschließt: -CO-Y, -CH 2 -O-Y, -CH 2 -S-Y, -CH 2 -N 3 , -CO-O- Y, -CO-S-Y, -CO-NH-Y, -CH 2 -CH=CH 2 , wobei Y ein Alkyl ist, beispielsweise (CH 2 ) n - CH 3 wobei n zwischen O und 4 liegt, oder ein substituiertes Alkyl ist, beispielsweise mit Halogen, Hydroxy, Amino, Carboxy-Gruppen). R 4 - ist H oder OH

R 5 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe OH, oder eine geschützte OH-Gruppe, eine Monophosphat-Gruppe, oder eine Diphosphat-Gruppe, oder eine Triphosphat- Gruppe, oder eine Alpha-Thiotriphosphat-Gruppe ist.

eiterer Aspekt 27 der Erfindung betrifft Nukleotid-Analoga nach einem der Aspekte der 25, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (Fig. 3B) :

Wobei :

Base - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren zu enzymatischen Reaktionen fähigen Modifikationen

R 1 - ist H

R 2 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, HaI, NH 2 , SH oder geschützte OH-Gruppe

R 3 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe O- R 3-2 -L, P(0) m - R 3-2 -L, wobei m 1 oder 2 ist, NH-R 3-2 -L, S-R 3-2 -L, Si-R 3-2 -L oder, wobei R 3-2 die Kopplungsstelle des Linkers an das Nukleotid bzw. Nuk-Komponente ist und L - die Kopplungseinheit des Linkers (L) ist.

R 4 - ist H oder OH

R 5 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe OH, oder eine geschützte OH-Gruppe, eine Monophosphat-Gruppe, oder eine Diphosphat-Gruppe, oder eine Triphosphat-

Gruppe, oder eine Alpha-Thiotriphosphat-Gruppe ist.

eiterer Aspekt 28 der Erfindung betrifft Nukleotid-Analoga nach einem der Aspekte der 25, wobei die Nuk-Komponente folgende Strukturen einschließt (Fig. 3B) :

Wobei : Base - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe von Adenin, oder 7-Deazaadenin, oder Guanin, oder 7-Deazaguanin, oder Thymin, oder Cytosin, oder Uracil, oder deren zu enzymatischen Reaktionen fähigen Modifikationen

R 1 - ist H R 2 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, HaI, NH2, SH oder geschützte

OH-Gruppe

R 3 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe H, OH, HaI, PO 3 , SH 7 NH 2 , O- R 3-I , P(0)m- R 3 -i, NH-R 3 - I , S-R 3 - I , Si-R 3-I wobei R 3 - I eine chemisch, photochemisch oder enzymatisch spaltbare Gruppe ist und m 1 oder 2 ist.

R 4 - ist H oder OH

R 5 - ist unabhängig gewählt aus der Gruppe O- R 5 - 1 -L, oder P-(O) 3 - R 5 - 1 -L (modifizierte Monophosphat-Gruppe), oder P-(O) 3 -P-(O) 3 -R 5-I -L (modifizierte

Diphosphat-Gruppe) oder P-(O) 3 -P-(O) 3 -P-(O) 3 - R 5-I -L (modifizierte Triphosphat-Gruppe), wobei R 5-I die Kopplungsstelle der Kopplungseinheit L an das Nukleotid bzw. Nuk-Komponente ist und Kopplungseinheit L die Verbindung zwischen der Nuk-Komponente und der Linker-Komponente ist.

eiterer Aspekt 29 der Erfindung betrifft Nukleotid-Analoga nach einem der Aspekte 28, wobei Kopplungseinheit L folgende strukturelle Elemente einschließt:

R 6 -NH-R 7 , R 6 -O-R 7 , R 6 -S-R 7 , R 6 -SS-R 7 , R 6 -CO-NH-R 7 , R 6 -NH-CO-R 7 , R 6 -CO-O-R 7 , R 6 -O-CO-R 7 , R 5 -CO-S-R 7 , R 6 -S-CO-R 7 , R 6 -P(O) 2 -R 7 , R 6 -Si-R 7 , R 6 -(CH 2 ) n -R 7 ,

R 6 -(CH 2 ) n -R 7 , R 6 -A-(CH 2 ) n -R 7 , R 6 -(CH 2 ) n -B-R 7 ,

R 6 -(CH=CH-VR 7 , R 6 -(A-CH=CH-) n -R 7 , R 6 -(CH = CH-B-) n -R 7 , R 6 -(CH=CH-CH 2 -B-V

R 7 , R 6 -A-CH=CH-(CH 2 -VR 7 , R 6 -(-CH = CH-CH 2 ) n -B-R 7 ,

R 6 -(C C-) n -R 7 , R 6 -(A-C C-) n -R 7 , R 6 -(A-C^C-CH 2 VR 7 , R 6 -(C C-B-) n -R 7 , R 6 -(C C-CHz-B-) n -R 7 , R 6 -A-C C-(CH 2 -) n -R 7 , R 6 -(-C C-CH 2 ) n -B-R 7 ,

R 6 -(-C C-CH 2 -CH 2 ) n -B-R 7

wobei R 6 - die Nuk-Komponente ist, R 7 - der Linkerrest ist und A und B unabhängig folgende strukturelle Elemente einschließen: -NH-, -0-, -S-, -SS-, -CO-NH-, -NH- CO-, -CO-O-, -0-C0-, -CO-S-, -S-CO-, -P(O) 2 -, -Si-, -(CH 2 ) n -, eine photolabile Gruppe, wobei n - gleich 1 bis 5 ist

Ein weiterer Aspekt 30 der Erfindung betrifft Nukleotid-Analoga nach einem der Aspekte 25 bis 28, wobei die Linker-Komponente ein wasserlösliches Polymer einschließt.

Ein weiterer Aspekt 31 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekt 30, wobei die Linker-Komponente wasserlösliche Polymere unabhängig ausgewählt aus folgender Gruppe einschließt:

Polyethylen-glycol (PEG), Polysaccharide, Dextran, Polyamide, Polypeptide, Polyphosphate, Polyacetate, Poly(alkyleneglycole), Kopolymere aus Ethylenglycol und Propylenglycol, Poly(olefinische Alkohole), Poly(Vinylpyrrolidone),

Poly(Hydroxyalkylmethacrylamide), Poly(Hydroxyalkylmethacrylate), Poly(x- Hydroxy-Säuren), Poly-Acrylsäure, Poly-Acrylamid, Poly(Vinylalkohol).

Ein weiterer Aspekt 32 der Erfindung betrifft Nukleotid-Analoga nach einem der Aspekte 1, 2, 25 bis 31, wobei die Linker-Komponente eine durchschnittliche Länge zwischen 5 und 10, 10 bis 20, 20 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 200, 200 bis 500, 500 bis 1000, 1000 bis 2000, 2000 bis 10000, 10000 bis 100000, 100000 bis 500000 Atomen hat.

Ein weiterer Aspekt 33 der Erfindung betrifft Nukleotid-Analoga nach einem der Aspekte 1,2, 25 bis 32, wobei der Marker oder eine Marker-Komponente eine signalgebende, signalvermittelnde, katalytische oder affine Funktion hat, oder die Funktion des makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden hat

Ein weiterer Aspekt 34 der Erfindung betrifft Nukleotid-Analoga nach einem der Aspekte 25 bis 33, wobei eine strukturelle Marker-Einheit unabhängig eines oder mehrere der folgenden strukturellen Elemente einschließt:

Biotin, Hapten, radioaktives Isotop, seltenes Erdenelement, Farbstoff, Fluoreszenzfarbstoff.

Ein weiterer Aspekt 35 der Erfindung betrifft Nukleotid-Analoga nach einem der Aspekte 25 bis 33, wobei eine strukturelle Marker-Einheit unabhängig eines oder mehrere der folgenden Elemente einschließt:

Nanokristalle oder deren Modifikationen, Proteine oder deren Modifikationen, Nukleinsäureketten oder deren Modifikationen, Teilchen oder deren Modifikationen.

Ein weiterer Aspekt 36 der Erfindung betrifft makromolekulare Verbindungen nach Aspekt 35, wobei eine strukturelle Marker-Einheit eines der folgenden Proteine einschließt:

Enzyme oder deren Konjugate oder Modifikationen, Antikörper oder deren Konjugate oder Modifikationen, Streptavidin oder seine Konjugate oder Modifikationen, Avidin oder seine Konjugate oder Modifikationen

Aspekt 37 der Erfindung betrifft Nukleotid-Analoga nach einem der Aspekte 1, 2 25 bis 36, bei dem als makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand folgende Strukturen einschließet: Proteine, Dendrimere, Nanoteilchen, Mikroteilchen oder deren Modifikationen.

Oben angeführte Verfahren können in besonderen Ausführungsformen zur Identifizierung von Nukleinsäuren oder zur Identifizierung der Zusammensetzung, d.h. Abfolge der Nukleotide, der Nukleinsäuren eingesetzt werden.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung können die Verfahren durchgeführt werden, indem man die Stufen der Einbaureaktion, Schritt (b), mehrfach wiederholt, wobei man a) in jedem Schritt nur jeweils ein markiertes modifiziertes Nuk-Makromoleküls, b) in jedem Schritt jeweils zwei unterschiedlich markierte modifizierte Nuk- Makromoleküle oder c) in jedem Schritt jeweils vier unterschiedlich markierte modifizierte Nuk- Makromoleküle

verwendet. Bei mehrfachen Kombinationen von modifizierten Nuk-Makromolekülen, trägt jede Art der modifizierten Nuk-Makromolekülen eine für sie spezifische Markierung.

Die Aufteilung der Verfahren in einzelne Schritte ist funktionell und soll anschaulich die Struktur des Verfahrens abbilden. Jeder von den oben genannten Schritten kann als einzelner selbständiger Schritt im Verfahren durchgeführt werden oder in weitere Schritte zerlegt werden.

Matrize:

Die Matrize kann DNA oder RNA Moleküle darstellen. Die Matize kann eine einheitliche Population von Nukleinsäuremolekülen darstellen oder ein Gemisch von Nukleinsäuren mit unterschiedlichen Sequenzen sein.

5 Vorzugsweise liegt die Matrize in einzelsträngiger Form vor. Falls eine doppelsträngige Matrize vorliegt, können Matrizen-Primer-Komplexe durch Denaturierung der Matrize und eins anschließende Hybridisierung des Primers erfolgen.

Die Matrize schließt unter anderem folgende Nukleinsäure ein: definierte Amplifikate (z.B. PCR- Produkte), cDNA, Fragmente der genomischen DNA oder RNA (auch Produkte der

LO Amplifikationsreaktionen), mRNA. Es können virale, bakterielle oder eukaryontische Nukleinsäureketten verwendet werden.

In einer Ausführugsform liegt die Matrize frei in der Lösung vor. In einer andren Ausführungsform ist die Matrize an einer festen Phase gebunden (durch kovalente, affine oder eine andere Art der Kopplung). Die Fixierung an der festen Phase kann dabei in einer

L5 bestimmten Anordnung wie z.B. bei Microarray oder unter Verwendung von Beads mit spezieller Kodierung erfolgen ("Microarray biochip technology" 2000 M.Schena Eaton Publishing, "DNA Microarrays" 1999 M. Schena Oxford University Press, Fodor et al. Science 1991 v.285 S.767, Timofeev et al. Nucleic Acid Research (NAR) 1996, v.24 S.3142, Ghosh et al. NAR 1987 v.15 S.5353, Gingeras et al. NAR 1987 v.15 S.5373, Maskos et al. NAR

10 1992 v.20 S.1679), oder in zufälliger Anordnung erfolgen, wie z.B. in WO 02088382, DE 10 2004 025 696, DE 101 20 798, DE 102 14 395.

Primer bzw. Oligonukleotide mit der Primer-Funktion:

Der Primer stellt ein Oligodeoxinukelotid oder ein Oligoribonukleotid dar. i5 In einer Ausführungsform des Verfahrens werden einheitliche Primer verwendet. In einer anderen Ausführungsform werden Primer mit unterschiedlichen Sequenzen verwendet. Die Zusammensetzung und die Länge des Primers sind nicht eingeschränkt. Außer der Startfunktion kann der Primer auch andere Funktionen übernehmen, wie z.B. eine Verbindung zur Reaktionsoberfläche zu schaffen. Der Primer kann beispiesweise Abschnitte

SO der Nukleinsäuren enthalten, die nicht zu Matrize komplementär sind und beispielsweise zu Bindung des Primers an einer feste Phase dienen. Primer sollten so an die Länge und Zusammensetzung den Primerbindungsstellen in den Matrizen angepaßt werden, dass der Primer den Start der Sequenzierungsreaktion mit der jeweiligen Polymerase ermöglicht. In einer Ausführungsfrom der Erfidung bindet der Primer komplementär an die

55 entsprechende Primerbindungsstelle in der Matrize. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung hat der Primer zumindest eine nicht komplementäre Stelle zu der Primerbindungsstelle in der Matrize.

Bei der Verwendung unterschiedlicher, beispielsweise natürlich in der ursprünglichen Gesamtsequenz vorkommender Primerbindungsstellen, werden die für die jeweilige Primerbindungsstelle sequenzspezifischen Primer verwendet. Bei einer einheitlichen, beispielsweise durch die Ligation an die NSKFs angekoppelten Primerbindungsstelle kann ein einheitlicher Primer verwendet werden.

Vorzugsweise beträgt die Länge des Primers zwischen 6 und 100 NTs, optimalerweise zwischen 10 und 50 NTs. Der Primer kann eine Funktionsgruppe tragen, die zur Immobilisierung des Primes oder Primer-Matrize dient, beispielsweise ist eine solche Funktionsgruppe eine Biotingruppe. Die Synthese eines solchen Primers kann z.B. mit dem DNA-Synthesizer 380 A Applied Biosystems ausgeführt werden oder aber als Auftragssynthese bei einem kommerziellen Anbieter, z.B. MWG-Biotech GmbH, Germany erstellt werden).

Die Oligonukleotide können mit verschiedenen Techniken fixiert oder direkt auf der Oberfläche synthetisiert werden, beispielsweise nach (McGaII et al. US Patent 5412087, Barrett et al. US Patent 5482867, Mirzabekov et al. US Patent 5981734, "Microarray biochip technology" 2000 M.Schena Eaton Publishing, "DNA Microarrays" 1999 M. Schena Oxford University Press, Fodor et al. Science 1991 v.285 S.767, Timofeev et al. Nucleic Acid Research (NAR) 1996, v.24 S.3142, Ghosh et al. NAR 1987 v.15 S.5353, Gingeras et al. NAR 1987 v.15 S.5373, Maskos et al. NAR 1992 v.20 S.1679).

Die Primer können auf der Oberfläche beispielsweise in einer Dichte zwischen 10 bis 100 pro 100 μm 2 , 100 bis 10.000 pro 100 μm 2 oder 10.000 bis 1.000.000 pro lOOμm 2 gebunden werden.

Der Primer oder das Primergemisch wird mit Matrize unter Hybridisierungsbedingungen inkubiert, die ihn selektiv an die Primerbindungsstelle des Matrize binden lassen. Die Optimierung der Hybridisierungsbedingungen hängt von der genauen Struktur der Primerbindungsstelle und des Primers ab und läßt sich nach Rychlik et al. NAR 1990 v.18 S.6409 berechnen. Im folgenden werden diese Hybridisierungsbedingungen als standardisierte Hybridisierungsbedingungen bezeichnet.

Die Reaktionsgemische im Einbauschritt / Extensionsschritt können folgende Komponenten einschließen:

• eine wässrige Lösung,

• optionales Vorliegen geeigneter Puffersubstanzen (z.B. Tris-Puffer, Phosphat-Puffer, Acetat-Puffer, HEPES-Puffer, MOPS-Puffer, Borat-Puffer); Die Konzentration der

Substanzen liegt vorzugsweise zwischen 10 mM und 200 mM, der pH-Wert der Lösung liegt vorzugsweise zwischen 5 und 10.

• optionales Vorliegen von monovalenten Metallionen (Na+, K+, Li+)

• optionales Vorliegen von divalenten Metallionen (z.B. Mg2+, Mn2+ oder Co2+) • optionales Vorliegen von organischen Lösungsmittel (z.B. DMF, DMSO) oder weiteren organischen Substanzen die üblicherweise bei Einbaureaktionen eingetzt werden, wie Glycerin, Tween 20, (weitere Angaben s. Hersteller-Hinweise für einzelne Polymerasen).

• optionales Vorliegen von nicht modifizierten Nukleotiden (z.B. dCTP, dATP, dGTP, dTTP, dUTP, ATP, CTP, GTP, UTP) oder konventionell modifizierten Nukleotide (z.B.

Biotin-16-dUTP, Cy3-dCTP oder Digoxigenin-dUTP)

• optionales Vorliegen einer oder mehreren Polymerase-Arten, die ein Nukleotid in einer matrizenabhängigen enzymatischen Reaktion an den Primer im Primer- Matrizen-Komplex ankoppeln können. Die Polymerasen können prozessive oder distributive Eigenschaften bei der Synthese aufweisen.

• Vorliegen von modifizierten Nuk-Makromolekülen, wobei o nur jeweils ein markiertes modifiziertes Nuk-Makromoleküls, o jeweils zwei unterschiedlich markierte modifizierte Nuk-Makromoleküle oder o jeweils vier unterschiedlich markierte modifizierte Nuk-Makromoleküle * vorliegen.

• Optionales Vorliegen eines oder mehreren weiteren Proteine, die an einen von den Reaktionkomponenten binden können, z.B. Signle Strand binding Protein, z.B. Elongationsfaktoren.

• Optionales Vorliegen von Marker-Einheiten oder Marker-Komponenten.

Temperatur-Bedingungen können zwischen einzelnen Schritten der erfindungsgemäßen Verfahren gleich bleiben oder sich unterscheiden. Sie liegen vorzugsweise zwischen 10 0 C und 95°C.

Reinigungsschritte

Diese Schritte stellen eine optionale Reinigung von Matrize-Primer-Komplexen mit eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen von den freien modifizierten Nuk- Makromolekülen in der Lösung dar. Diese Reinigung kann beispielsweise durch Waschen der an einer festen Phase gebundenen genannten Matrize-Primer-Komplexen mit eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen erfolgen. Das Waschen kann beispielsweise mit einer Pufferlösung erfolgen.

Die im Schritt (b) eingesetzten modifizierten Nukleotid-Analoga (modifizierten Nuk- Makromolekülen) in den oben genannten Verfahren sind modifizierten Nuk-Makromoleküle, die zumindest einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden einschließen, der nach dem Einbau eines modifizierten Nuk-Makromoleküls den weiteren enzymatischen Einbau von solchen modifizierten Nuk-Makromolekiilen stoppt oder maßgeblich behindert. Die Effeizienz der Hinderung des weiteren Fortschreitens der Einbaureaktion ist vorzugsweise höher als 70%.

Für Sequenzierungsverfahren werden reversible Terminatoren mit Terminationseffizienzen bevorzugt, die folgende Bereiche einschließen: 80 - 100%, 90 - 100%. Besonders bevorzugt sind reversible Terminatoren mit Terminationseffizienzen in Bereichen von 95 - 100%, 97-100%, 99-100%.

Trennmedium oder Trennverfahren (Aspekt 23)

Das Ziel der Trennung kann beispielsweise die Analyse von Einbauereignissen von modifizierten Nuk-Makromolekülen an Primern darstellen. Bei Vorliegen mehrerer unterschiedlicher Oligonukleotide (mit Primerfunktion) in der Reaktion ist eine gleichzeigite

Analyse der Ergebnisse angestrebt. Als Trennmedium kann beispielsweise eine feste Phase mit immobilisierten Oligonukleotiden dienen, die spezifische Sequenzen im Oligonukleotid

(das als Primer aufgetreten ist) erkennen können. Eine solche feste Phase kann beispielsweise als ein- oder zweidimensionales Array (z.B. Microarray) vorliegen. Die

Reinigung der festen Phase erfolgt somit durch Waschen des Arrays.

Als weiteres Trennmedium können Gele (z.B. Agarose oder Polyacrylamid-Gele) auftreten.

Als Trenverfahren können Ultrafiltraiton, unterschiedliche Arten der Chromatographie (z.B.

Affinitätschromatographie) oder Spektroskopie (z.B. Massenspektroskopie).

Stand der Technik zu Möglichkeiten der Reaktionskontrolle von Polymerasen:

1. Blockade der 3 '-Position

Eine weitere Möglichkeit, enzymatische Reaktion zu kontrollieren, besteht in der Verwendung von modifizierten Substraten, beispielsweise Dideoxy-Nukleotiden. Die Verwendung von markierten Dideoxy-Nukleotiden führt zu einem Einbau von nur einem Nukleotid, da die für eine weitere Synthese notwendige 3 " -OH-Gruppe fehlt. Der größte Nachteil dieser Methode der Reaktionskontrolle besteht in einer irreversiblen Blockade der Synthese am gegebenen Strang der Nukleinsäure. Die naheliegende überlegung, an die 3 " -Hydroxylgruppe eine leicht abspaltbare Gruppe zu koppeln und dadurch eine Umkehr in der Termination zu verwirklichen, führte bei vielen Arbeitsgruppen nicht zum gewünschten Erfolg. Viele derart modifizierten Nukleotide verloren ihre Substrateigenschaften für die Polymerasen. Andere modifizierte Nukleotide überstanden die Bedingungen der enzymatischen Reaktion nicht und verloren ihre Marker während der Synthese (Canard et al. PNAS 1995 v.92 S.10859). Die engen räumlichen Verhältnisse im aktiven Zentrum von Polymerasen stellen sehr hohe Ansprüche an die modifizierte Nukleotide.

2. Sterisches Hindernis Viele in der modernen Forschung eingesetzten kleinmolekulare Marker stellen ein sterisches Hindernis für die Enzyme dar. Biotin, Digoxigenin und Fluoreszenzfarbstoffe wie Fluoreszein, Tetramethylrhodamine, Cy3-Farbstoff stellen Beispiele einer sterisch anspruchsvollen Gruppe dar (Zhu et al. Cytometry 1997, v.28, S.206, Zhu et al. NAR 1994, v.22, S.3418, Gebeyehu et al., NAR 1987, v.15, S.4513, Wiemann et al. Analytical Biochemistry 1996, v.234, S.166, Heer et al. BioTechniques 1994 v.16 S.54). Die Distanz zwischen dem Marker (sterisch anspruchsvollen Gruppe) und dem enzymatisch aktiven Teil des Moleküls (die Nukleotid-Einheit) beträgt dabei nur wenige Angström, da üblicherweise Unker von 5 bis 20 Kettenatomen verwendet werden. Je nach Position und Zugängigkeit des aktiven enzymatischen Zentrums des Enzyms (das aktive Zentrum kann tief im Inneren des Enzyms oder an seiner Oberfläche liegen) haben die kleinmolekularen Marker einen direkten Kontakt zum aktiven Zentrum oder stehen in unmittelbarer Nähe zu ihm. Der direkte Kontakt oder auch die Nähe kann zur Beeinträchtigung des enzymatischen Prozesses führen, im Falle von Polymerasen zur Behinderung der weiteren Synthese. Durch den direkten Kontakt bzw. die Nähe der kleinmolekularen Marker kann auch der Einfluss von Marker-Molekülen auf den enzymatischen Prozess erklärt werden (Tcherkassov WO 02088382).

Zusammenfassend kann man feststellen, dass bisher nur die Möglichkeiten der Steuerung der Reaktion innerhalb der Polymerase (entweder durch Modifizierung von Nukleotid- Bestandteilen am Zucker (z.B. an der 3 ' -Positioin) oder an der Basen durch niedermolekulare Liganden ausgetestet wurde: terminierenden Gruppen waren entweder direkt im aktiven Zentrum der Polymerase oder in ihrer unmittelbaren Nähe. Dabei haben diese chemischen Gruppen ein niedriges Molekulargewicht.

Einzelne molekulare Strukturen haben ihre Abmessungen (z.B. Länge, Breite, Höhe, Volumen usw.) im Bereich von einzelnen Nanometern bzw. Bruchteilen davon. Daher können sogar Unterschiede von wenigen Angström bzw. Nanometer einen deutlichen Effekt hervorrufen. Zur differenzierten Betrachtung von potenziellen Mechanismen zur Steuerung von biologisch aktiven Molekülen (im gegebenen Fall können Polymerasen als molekulare Kopiermaschienen betrachtet werden) müssen diese Dimensionen herangezogen werden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es gelungen, den Prozess der enzymatischen Einbaureaktion durch makromolekulare Liganden kontrolliert zu beeinflussen, wobei die Makromoleküle nicht in unmittelbaren Umgebung des aktiven Zentrums der Polymerase liegen. Insbesondere im neuen Bereich der Bionanotechnologie und der Arbeit mit einzelnen Molekülen erscheint der Einsatz der vorliegenden Erfindung besonders wichtig.

Die Erfindung besteht in einer Ausführungsform darin, dass ein Verfahren zur Steuerung der enzymatischen Synthese-Reaktion bereitgestellt wird. Dieses Verfahren ist charakterisiert durch die Anwendung von modifizierten Nuk-Makromolekülen, die makromolekulare sterisch anspruchsvolle Liganden tragen, in der enzymatischen Synthese-Reaktion. Die makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden haben erfindungsgemäß eine Masse, die mehr als 2 kDa beträgt. In dieser Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Kontrolle der enzymatischen Synthese durch einen sterisch anspruchsvollen makromolekularen Liganden, der sich nach dem Einbau der Nukleotid- Komponente außerhalb des Polymerase-Moleküls befindet.

Schematisch sind diese Verhältnisse in Fig. 8 bis 11 dargestellt.

Die Zeichnungen sollen lediglich schematisch den erfinderischen Gedanken illustrieren und erheben keinen Anspruch auf Vollständigkeit der Angaben.

Das eingebaute modifizierte Nuk-Makromolekülenträgt einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden. Dieser sterisch anspruchsvolle Ligand lässt keinen weiteren Liganden in die Nähe der Polymerase. Bei einer entsprechend gewählten Linker-Länge kann kein weiteres modifiziertes Nuk-Makromolekül eingebaut werden. Der Linker ist schematisch in einem ausgedehnten Zustand in voller Länge gezeigt. Mit anderen

Worten die raumforderenden Eigenschffen des sterisch anspruchsvollen Liganden (bedingt beispielsweise durch seine Größe) hindert weitere modifizierte Nuk- Makromoleküle mit ähnlich großen Liganden daran, in die Nähe des aktiven Zentrums der Polymerase zu gelangen. Die weitere Reaktion wird blockiert.

änderung der räumlichen Verhätnisse um die Polymerase herum, beispielsweise durch Bindung weiterer Proteinen an die DNA oder Polymerase, kann eventuell zu notwendigen änderungen in der Linker-Länge zwischen der Nukleotid-Komponente und dem sterischen Hindernis führen.

In vielen Fällen kann folgende Regel für das räumliche Potenzial für die Linker-Länge angewendet werden: je größer die Linker-Länge zwischen der Nukleotid-Komponente und dem sterisch anspruchsvollen Liganden, desto größerer sterisch anspruchsvoller Ligand wird für die Hinderung der weiteren Synthese benötigt. Die kleineren Liganden können ihre Wirkung mit der zunehmenden Linker-Länge zwischen der Nukleotid- Komponente und sterischem Liganden verlieren.

Das Prinzip des Verfahrens zur Steuerung des enzymatischen Einbaus durch modifizierte Nuk-Makromoleküle wird am Beispiel eines Models für die Primer-Extension-Reaktion erklärt. Dieses Model wird schematisch dargestellt und dient lediglich der Anschaulichkeit.

• An der Primer-Extensions-Reaktion sind folgende Komponenten beteiligt: o Matrize-Primer-Komplex (Primer (N) ) o DNA-Polymerase o Nukleotide (nicht modifiziert oder modifiziert mit einem sterisch anspruchsvollen Liganden). o Lösung mit Puffer-Substanzen und divalenten Metallionen

• Die Steuerung des Fortschrittes der enzymatischen Reaktion erfolgt durch den Einsatz von modifizierten Nuk-Makromolekülen. • Nach dem Einbau eines solchen Nukleotid-Analogs verhindert der sterisch anspruchsvolle Ligand die Annäherung eines anderen sterisch anspruchsvollen Liganden an das nukleotidbindende Zentrum der Polymerase. Da aber ein weitere Nuk-Komponente mit einem solchen Liganden über einen relativ kurzen Linker gekoppelt ist, wird gleich auch die Annäherung des Nukleotides gehindert. Dadurch wird der Einbau eines weiteren modifizierten Nuk-Makromoleküls unmöglich.

• Dabei ist die Kombination der Linker-Länge und der sterischen Eigenschaften des Liganden wichtig. Die genaue Kombination kann variieren, wobei als Richtlinien

für die Wahl der passenden Kombination folgende Optimierungsstrategien dienen können. Sowohl der sterisch anspruchsvolle Ligand als auch Linker können angepasst werden:

• Strategie I: Ausgangsparameter ist der sterisch anspruchsvolle Ligand. o Bei einem gegebenen anspruchsvollen Liganden, sollten unterschiedliche

Linker-Längen ausgetestet werden:

■ Bei einem geeigneten Linker wird nur ein solches Nukleotid-Analog eingebaut

■ Bei einem zu kurzem Linker ist der Einbau komplett gehemmt ■ Bei einem zu langem Linker können mehrere Nukleotid-Analoge mit sterisch anspruchsvollen Gruppen eingebaut werden.

• Strategie II: Ausgangsparameter ist der Linker. o Bei einem gegebenen Linker, sollten unterschiedliche Größen des sterisch anspruchsvollen Liganden ausgetestet werden: ■ Bei einem geeigneten Liganden wird nur ein solches Nukleotid-

Analog eingebaut

Bei einem zu kleinem Liganden können mehrere Nukleotid-Analoge mit sterisch anspruchsvollen Gruppen eingebaut werden.

Im Rahmen einer Reaktion können alle modifizierten Nuk-Makromoleküle gleiche oder auch unterschiedliche sterisch anspruchsvolle Liganden tragen. Das Entscheidende für die Reaktionskontrolle ist dabei die Effektivität der blockierenden Wirkung der Liganden untereinander.

Die Kontrolle der Reaktion beinhaltet in einer Ausführungsform die Möglichkeit der Reversibilität der Blockade der Reaktion. Unter Verwendung von bekannten spaltbaren Gruppen zwischen dem Linker und dem makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden, kann die Reversibilität der Blockade der weiteren Reaktion erreicht werden.

Anwendungen

Das erfindungsgemäße Verfahren zur schrittweise ablaufenden enzymatischen Synthesereaktion von Nukleinsäuren kann beispielsweise in Technologien zur Analyse der genetischen Information eingesetzt werden (WO 02088382, DE 10 2004 025 696, DE 101 20 798, DE 102 14 395). Diese Analyse verläuft in einer bevorzugten Ausführungsform auf Einzelmolekülabene, d.h. Sequenzen von einzelnen Molekülen von Nukleinsäuren werden identifiziert.

In einer besonderen Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren beim Verfahren zur parallelen Sequenzanalyse von Nukleinsäuresequenzen bzw. Nu- kleinsäureketten, NSKs verwendet, das folgende Schritte einschließt:

1. Bereitstellung einer festen Phase

2. Bindung von zu analysierenden Nukleinsäureketten an die feste Phase unter Ausbildung extensionsfähiger Primer-Matrize-Komplexe,

3. Durchführung einer zyklischen Reaktion mit den auf der festen Phase fixierten Primer-Matrize-Komplexen, die folgende Schritte einschließt:

3.1 enzymatischer Einbau von modifizierten Nuk-Makromoleküle an den gebildeten Primer-Matrize-Komplexen mittels einer Polymerase,

3.2 Waschen der festen Phase

3.3 Detektion der Markierung von eingebauten markierten modifizierten Nuk-Makromolekülen, wobei relative Koordinaten einzelner Signale identifiziert werden 3.4 Entfernung der Signale von eingebauten modifizierten Nuk-

Makromolekülen,

3.5 Waschen der festen Phase

3.6 gegebenenfalls Wiederholung der Schritte 3.1 bis 3.5

4. Rekonstruktion der Sequenzen von einzelnen Nukleinsäureketten aus den unter Schritt 3.3 erhaltenen Signalen

Die zyklischen Schritte können mehrmals wiederholt werden, beispielsweise 2 bis 10 mal, 10 bis 20 mal, 20 bis 100 mal, 100 bis 500 mal. Die Identifizierung der eingebauten modifizierten Nuk-Makromoleküle erfolgt durch den Marker.

Die Reaktionsbedingungen des Schrittes (3) in einem Zyklus werden so gewählt, dass die Polymerasen an mehr als 50% der an der Sequenzierungsreaktion beteiligten NSKFs

(extensionsfähige NSKF-Primer-Komplexe) in einem Zyklus ein modifiziertes Nuk- Makromolekül einbauen können, vorzugsweise an mehr als 80% oder an mehr als 90% der extenstionsfähigen Komplese. Dabei können Zeit und / oder Puffer- oder Temperaturbedingungen und / oder Konzentrationen von Reagentien variert werden

In einer Ausführungsform des Verfahrens befinden sich Polymerasen und modifizierten Nuk-Makromoleküle in derselben Lösung oder Komposition, die zu den an die feste Phase gebundenen extensionsfähigen Komplexen zugegeben wird.

In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens werden Polymerasen und modifizierten Nuk-Makromoleküle in getrennten Lösungen oder Kompositionen bereitgestelt. Die Lösungen oder Kompositionen werden getrennt zu den an die feste Phase gebundenen extensionsfähigen Komplexen zugegeben. Dabei wird vorzugsweise zunächt eine Lösung oder Komposition mit Polymerase zugegeben und anschließend eine Lösung oder Komposition mit einem modifizierten Nuk-Makromolekül (s. Beispiel 15).

In einigen Anwendungen kann eine Komposition mit einer oder mehreren Polymerase- Arten in einem Schritt zugegeben werden und in weiteren Schritten werden Kopositionen mit modifizierten Nuk-Makromolekülen zugegeben.

In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung wird ein Verfahrens zur parallelen Sequenzanalyse von Nukleinsäuresequenzen (Nukleinsäureketten, NSKs) bereitgestellt, bei dem man

Fragmente (NSKFs) einzelsträngiger NSKs mit einer Länge von etwa 50 bis 1000 Nukleotiden erzeugt, die überlappende Teilsequenzen einer Gesamtsequenz darstellen können, man

die NSKFs unter Verwendung eines einheitlichen oder mehrerer unterschiedlichen Primer in Form von NSKF-Primer-Komplexen auf einer Reaktionsoberfläche in einer zufälligen Anordnung bindet, man

eine zyklische Aufbaureaktion des komplementären Stranges der NSKFs unter Verwendung einer oder mehrerer Polymerasen durchführt, indem man

a) zu den auf der Oberfläche gebundenen NSKF-Primer-Komplexen eine Lösung zugibt, die eine oder mehrere Polymerasen und ein bis vier modifizierte Nuk- Makromoleküle enthält, die mit Markern (Fluoreszenzmarker) markiert sind, wobei die

bei gleichzeitiger Verwendung von mindestens zwei Nukleotid-Analoga jeweils an den Nukleotid-Analoga befindlichen Marker so gewählt sind, dass sich die verwendeten Nukleotid-Analoga durch Messung unterschiedlicher Fluoreszenzsignale voneinander unterscheiden lassen, wobei die Nukleotid-Analoga einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden einschließen, dass die Polymerase nach Einbau eines solchen modifizierten Nuk-Makromoleküls in einen wachsenden komplementären Strang nicht in der Lage ist, ein weiteres modifiziertes Nuk-Makromolekϋl in denselben Strang einzubauen, wobei der Marker abspaltbar ist und die strukturelle Modifikation ein abspaltbarer makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand ist, man

b) die in Stufe a) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen inkubiert, die zur Verlängerung der komplementären Stränge geeignet sind, wobei die komplementären Stränge jeweils um ein modifiziertes Nuk-Makromolekül verlängert werden, man

c) die in Stufe b) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung nicht in einen komplementären Strang eingebauter Nukleotid-Analoga geeignet sind, man

d) die einzelnen, in komplementäre Stränge eingebauten Nukleotid-Analoga durch Messen des für den jeweiligen Marker (Fluoreszenzmarker) charakteristischen

Signals detektiert, wobei man gleichzeitig die relative Position der einzelnen Fluoreszenzsignale auf der Reaktionsoberfläche bestimmt, man

e) zur Erzeugung unmarkierter (NTs oder) NSKFs die Marker und die makromolekulare sterisch anspruchsvollen Liganden von den am komplementären

Strang angefügten Nukleotid-Analoga abspaltet, man

f) die in Stufe e) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung der Marker und der Liganden geeignet sind, man

die Stufen a) bis f) gegebenenfalls mehrfach wiederholt,

wobei man die relative Position einzelner NSKF-Primer-Komplexe auf der Reaktionsoberfläche und die Sequenz dieser NSKFs durch spezifische Zuordnung der in Stufe d) in auf- einanderfolgenden Zyklen an den jeweiligen Positionen detektierten Fluoreszenzsignale zu den NTs bestimmt.

Die zyklischen Schritte können mehrmals wiederholt werden, beispielsweise 2 bis 10 mal, 10 bis 20 mal, 20 bis 100 mal, 100 bis 500, 500 bis 2000 mal. Die Identifizierung der eingebauten modifizierten Nuk-Makromoleküle erfolgt durch den Marker.

Eine passenden Oberfläche für solche Verfahren kann nach DE 101 49 786 oder DE 10 2004 025 744 hergestellt werden. Die Materialvorbereitung und die Detektion können nach WO 02088382, DE 10 2004 025 696, DE 101 20 798, DE 102 14 395, DE 102 46 005 durchgeführt werden.

Beispiele

Die angeführten Beispiele und Ausführungsformen hatten den Zweck, die Erfindung zu erklären. Die vorliegende Erfindung ist nicht limitiert auf die hier beschiriebenen 5 Ausführungsformen und Beispiele. Viele verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den hier beschriebenen werden einem Fachmann nahe liegend erscheinen. Solche Modifikationen sind ebenfalls dieser Erfindung anzurechnen.

Die dargestellten einzelnen Ausführungsformen sollten in ihrer Gesamtheit betrachtet 10 werden und können untereinander und miteinader kombiniert werden.

Allgemeine Hinweise für die Synthesen von modifizierten Nuk-Makromolekülen

Die erfindungsgemäßen modifizierten Nuk-Makromoleküle können auf unterschiedliche Art und Weise synthetisiert werden. Die Reihenfolge der Kopplungsschritte kann

L5 variieren. Beispielsweise kann zunächst eine Linker-Komponente an die Nuk- Komponente gekoppelt werden, anschließend wird die Marker-Komponente zusammen mit einem makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden gekoppelt. Andererseits können ein oder mehrere Linker an den sterisch anspruchsvollen Liganden gekoppelt werden und anschließend der / die Nuk-Komponenten und erst danach wird

10 der Marker gekoppelt.

Die Kopplung zwischen einzelnen Komponenten der modifizierten Nuk-Makromoleküle kann kovalent oder affin erfolgen. Wobei sowohl chemische als auch enzymatische Kopplung zur Verknüpfung einzelner Komponenten eingesetzt werden kann. Kopplungen

.5 an Amino- und Thiolgruppen dienen als Beispiele für kovalente Kopplungen (D. Jameson et al. Methods in Enzymology 1997, V. 278, S. 363-, "The chemistry of the amino group" S. Patai, 1968, "The chemistry of the thiol group" S. Patai, 1974). Biotin- Streptavidin-Bindung oder Hybridisierung zwischen komplementären

Nukleinsäuresträngen oder Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen stellen Beispiele für

50 affine Kopplungen dar.

Ein makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand und ein makromolekularer Marker bieten oft eine Vielfalt an Kopplungsmöglichkeiten. Ein makromolekularer Ligand kann mehrere Kopplungsstellen für Linker haben, beispielsweise mehrere Bindungsstellen für )5 Biotin, wie es bei Streptavidin der Fall ist. Ein makromolekularer Marker oder ein makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand kann auch mehrere Amino- bzw. Thiol-Gruppen aufweisen. Die Kern-Komponente des Markers kann mit unterschiedlicher Zahl von signalgebenden oder signalvermittelnden Einheiten modifiziert werden. Die

genauen Verhältnisse zwischen Marker-Einheiten können variieren. Beispiele für die Modifikation von Polymeren mit Farbstoffen sind bekannt (Huff et al. US Pat. 5661040, D. Brigati US Pat. 4687732). Falls Nukleinsäuren als makromolekulare Marker eingesetzt werden, so können diese unterschiedliche Abschnitte zur Kopplung anderer Makromoleküle besitzen. An einen makromolekularen Marker können andere Makromoleküle gebunden werden, z.B. Enzyme.

Ein modifiziertes Nuk-Makromolekül kann makromolekulare Marker mit unterschiedlichen Detektionseigenschaften tragen, beispielsweise kann ein modifiziertes Nuk-Makromolekül sowohl mehrere Farbstoffmoleküle als auch Stellen zur affinen Bindung (z.B. durch Hybridisierung) weiterer Makromoleküle tragen.

Die Kopplung zwischen der Nuk-Komponenten und der Linker-Komponenten erfolgt vorzugsweise kovalent. Viele Beispiele für eine kovalente Kopplung an Nukleotide oder deren Analoga sind bekannt (Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Short US Pat. 6579704, Odedra WO 0192284). Dabei kann die Kopplung beispielsweise an Phosphat, Amino-, Hydroxy- oder Mercaptogruppen erfolgen.

Oft kann die Linker-Komponente in mehreren Schritten aufgebaut werden. Beispielsweise wird im ersten Schritt ein kurzer Linker mit einer reaktiven Gruppe an das Nukleotid oder Nucleosid angekoppelt, z.B. Propargylamin-Linker an Pyrimidine Hobbs et al. US Patent 5.047.519 oder andere Linker z.B. Klevan US Pat. 4,828,979, Seela US pat. 6211158, US pat. 4804748, EP 0286028, Hanna M. Method in Enzymology 1996 v.274, S.403, Zhu et al. NAR 1994 v.22 S.3418, Jameson et al. Method in Enzymology, 1997, v. 278, S. 363-, Held et al. Nucleic acid research, 2002, v. 30 3857-, Held et al. Nucleosides, nucleotides & nucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Short US Pat. 6579704, Ward et al. US Pat 4711955, Engelhardt et al. US Pat 5241060 Taing et al. US Pat 6811979, Odedra WO 0192284, Herrlein et al. Helvetica Chimica Acta, 1994, V. 77, S. 586, Canard US. Pat. 5798210, Kwiatkowski US Pat. 6255475, Kwiatkowski WO 01/25247, Parce WO 0050642, Faulstich et al. DE 4418691, Phosphoroamidite (Glen Research Laboratories, http://www.glenres.com/, Trilink Biotechnologies, S. Agrawal "Protocols for oligonucleotide conjugation", Humana Press 1994, M.Gait "Oligonucleotide synthesis: a practical approach" IRL Press, 1990), Dissertation "Synthese basenmodifizierter Nukleosidtriphosphate und ihre enzymatische Polymerisation zu funktionalierter DNA", Oliver Thum, Bonn 2002. Einige Verbindungen kann man käuflich erwerben, z.B. bei Trilink Biotechnologies, Eurogentec, Jena Bioscience.

Diese kurzen Linker dienen als Kopplungseinheiten L oder deren Teile, und sind ein Bestandteil der Linker-Komponente im fertigen modifizierten Nuk-Makromolekül.

Im zweiten Schritt kann die Kopplung des Nukleotides oder Nucleosides mit einem kurzen Linker an das Linker-Polymer erfolgen. Polymere mit reaktiven funktionellen Gruppen können käuflich erworben werden (Fluka).

Nach der Kopplung des Nukleotids an das Polymer kann nun die Marker-Komponente als letzter Schritt gekoppelt werden.

Oft ist es vorteilhaft, an ein Nukleosid einen kurzen Linker zu koppeln, dann, falls erforderlich, dieses modifizierte Nucleosid in ein Nucleosid-Triphosphat umzuwandeln (Synthesen von Triphosphaten können beispielsweise in folgenden Literaturstellen gefunden werden : Held et al. Nucleosides, nucleotides & nnucleic acids, 2003, v. 22, S. 391, Faulstich et al. DE 4418691, T. Kovacs, L. ötvös, Tetrahedron Letters, VoI 29, 4525-4588 (1988) oder Dissertation "Synthese basenmodifizierter Nukleosidtriphosphate und ihre enzymatische Polymerisation zu funktionalierter DNA", Oliver Thum, Bonn 2002). Weitere Modifikationen können am Nukleosid-Triphosphat-Analog durchgeführt werden.

Vorstufen für modifizierte Nukleoside können sind beispielsweise bei Trilink Biotechnologies (San Diego, CA, USA) oder bei Chembiotech (Münster, Deutschland) kommerziel erhältlich.

Kopplung von makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden kann auf unterschiedliche Art und Weise erfolgen. Beispielsweise werden makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden zunächst an die Struktur bestehend aus Nuk-Linker gekoppelt und erst anschließend erfolgt die Kopplung an den Marker. Ein anderer Ansatz ist die primäre Kopplung von sterisch ansoruchsvollen Liganden an den Marker (z.B. Kopplung von Streptavidin an Phycoerhytrin) und anschließend an die Struktur bestehend aus Nuk-Linker. Der makromolekulare sterisch anspruchsvolle Ligand kann auch als Bestandteil des Markers, z.B. als Kern-Komponente auftreten. In diesem Fall können niedermolekulare Substanzen (z.B. Farbstoffe, z.B. Cy3) an den Liganden direkt oder indirekt (z.B. über einen weiteren Linker) gekoppelt werden, siehe Beispiele.

Die Kopplung zwischen der Linker-Komponente und der Marker-Komponente kann beispielsweise zwischen reaktiven Gruppen an der Linker-Komponente und der Marker- Komponente erfolgen. Reagenzien für solche Kopplungen sind in "Chemistry of protein conjugation and cross-linking", S. Wang,1993, ISBN 0-8493-5886-8, ausführlich dargestellt. Die Verfahren zur Handhabung und zur Kopplung von mehreren Makromolekülen sind für unterschiedliche Typen von Makromolekülen auch in oben genannten Patenten dargestellt. Weitere Beispiele für Kopplungen an die und zwischen

den Makromolekülen sind für Proteine in "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2; "Reactive dyes in protein an enzyme technology", D. Clonis, 1987, ISBN 0-333-34500-2; "Biophysical labeling methods in molecular biology" G. Likhtenshtein, 1993, 1993, ISBN 0-521- 43132-8; "Techniques in protein modification" R. Lundblad, 1995, ISBN 0-8493-2606-0; "Chemical reagents for protein modification" R. Lundblad, 1991, ISBN 0-8493-5097-2; für Nukleinsäuren in "Molecular-Cloning", J. Sambrook, band 1-3, 2001, ISBN 0-87969- 576-5, für andere Polymerarten "Makromoleküle, Chemische Struktur und Synthesen", Band 1, 4, H. Elias, 1999, ISBN 3-527-29872-X beschrieben.

Da die Marker-Komponente meistens viele Kopplungsstellen aufweist, können weitere Modifikationen an kompletten modifizierten Nuk-Makromolekülen vorgenommen werden. Beispielsweise können überschüssige Amino-Gruppen abgeblockt werden oder durch weiterführende Modifikationen verändert werden.

Je nach Einsatzgebiet und Reaktionsbedingungen, unter denen modifizierten Nuk- Makromoleküle verwendet werden, können unterschiedliche chemische Bindungsarten zwischen einzelnen Teilen der Makromoleküle von Vorteil sein.

Nachfolgend sollen beispielhaft einige Möglichkeiten zur Synthese von modifizierten Nuk- Makromolekülen dargestellt werden. Diese dienen nicht zur Einschränkung der möglichen Synthesewege und nicht zur Einschränkung der möglichen modifizierten Nuk- Ma kromolekü strukturen. In folgenden Beispielen werden modifizierte Nuk-Makromoleküle mit Polyethylenglycol (PEG) als Linker-Komponente angegeben. Beispiele für die Kopplungen von PEG an andere Moleküle sind in "Poly(ethylene glycol) : chemistry and biological applications", 1997 beschrieben. Im einzelnen können sehr unterschiedliche reaktive Gruppen zur Kopplung eingesetzt werden: N-succinimidyl carbonate ( US Pat.. 5,281,698, US Pat. 5,468,478), Amine (Buckmann et al. Makromol. Chem. V.182, S.1379 (1981), Zalipsky et al. Eur. Polym. J. V.19, S. 1177 (1983)), succinimidyl propionate und succinimidyl butanoate (Olson et al. in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, 170- 181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D. C, 1997; U.S. Pat. No. 5,672,662), Succinimidyl succinate (Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. v. 7, S.175 (1984), Joppich et al., Makromol. Chem. Iv. 80, S.1381 (1979), Benzotriazole carbonate (U.S. Pat. No. 5,650,234), Glycidylether (Pitha et al. Eur. J. Biochem. v. 94, S.11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. v.13, S. 354 (1991), Oxycarbonylimidazole (Beauchamp, et al., Anal. Biochem. v.131, S. 25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release v. l, S.251 (1985)), p-nitrophenyl carbonate (Veronese, et al., Appl. Biochem.

Biotech., v.ll, S.141 (1985); and Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., v.27, S.45 (1991)), Aldehyde (Harris et al. J. Polym. Sei. Chem. Ed. v.22, S. 341 (1984), US. Pat. 5824784, US. Pat. 5252714), Maleimide (Goodson et al. Bio/Technology v.8, S. 343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins v.2, S.29 (1984)), and Kogan, Synthetic Comm. v.22, S.2417 (1992)), Orthopyridyl-disulfide (Woghiren, et al. Bioconj. Chem. v. 4, S. 314 (1993)), Acrylol (Sawhney et al., Macromolecules, v. 26, S.581 (1993)), Vinylsulfone (U.S. Pat. No. 5,900,461). Weitere Beispiele für Kopplungen von PEG an andere Moleküle sind in Roberts et al. Adv. Drug Deliv. Reviews v. 54, S. 459 (2002), US Pat. 2003124086, US Pat. 2003143185, WO 03037385, US Pat. 6541543, US Pat. 2003158333, WO 0126692 zu finden.

Andere ähnliche Polymere können in ähnlicher Art gekoppelt werden. Beispiele für solche Polymere stellen andere Poly(Alkylenglykole), Copolymere aus Ethylenglykol und Propyleneglykol, Poly(olefiniische Alkohole), Poly(Vinylpyrrolidone), Poly(Hydroxyalkylmethacrylamide), Poly(Hydroxyalkylmethacrylate), Poly(saccharide), Poly(x-Hydroxy-Säuren), Poly(Acrylsäure), Poly(Vinylalkohol).

Die Aufreinigung der Nuk-Komponenten der modifizierten Nuk-Makromoleküle erfolgt mit konventionellen Mitteln der Nukleotidchemie: beispielsweise mit Kieselgel- Chromatographie in einem Wasser-Ethanol-Gemisch, Ionenaustausch-Chromatographie in einem Salz-Gradienten und Reverse-Phase-Chromatographie in einem Wasser- Methanol-Gradienten. Für die Nukleotid-Aufreinigung optimierte Chromatographie- Säulen werden z.B. von der Firma Sigma-Aldrich angeboten. Die Aufreinigung von makromolekularen Linker-Komponenten und Marker- Komponenten kann durch Ultrafiltration, Gel-Elektrophorese, Gelfiltration und Dialyse erfolgen, siehe "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2.

Die Masse der modifizierten Nuk-Makromoleküle unterscheidet sich wesentlich von der Masse der Nukleotide. Aus diesem Grund ist es vorteilhaft, bei den Endreinigungsschritten die Ultrafiltration einzusetzen. Da für die modifizierten Nuk- Makromoleküle nur eine durchschnittliche Masse bereichnet wird, eignet sich Ultrafiltration auch als analytische Methode zu Trennung von Syntheseprodukten.

Zur Charakterisierung der modifizierten Nuk-Makromoleküle können unterschiedliche Methoden der makromolekularen Chemie angewendet werden, z.B. UV-Vis- Spektroskopie, Fluoreszenzmessung, Massenspektroskopie, Fraktionierung,

Größenausschlußchromatographie, Ultrazentrifugation und elektrophoretische Techniken,

wie IEF, denaturierende und nicht denaturierende Gel-Elektrophorese ("Makromoleküle, Chemische Struktur und Synthesen", Band 1, 4, H. Elias, 1999, ISBN 3-527-29872-X, "Bioconjugation: protein coupling techniques for the biomedical sciences", M. Aslam, 1996, ISBN 0-333-58375-2).

Eigenschaften der Biotin-Streptavidin-Bindung sind z.B. in Gonzalez et al. Journal Biolog. Chem. 1997, v. 272, S. 11288 beschrieben.

Synthesen von modifizierten Nukleotiden

Trennungsmethoden:

Dünnschichtchromatographie, DC: Analytisch : „DC-Alufolien 20 x 20 cm Kieselgel 60 F 254" (VWR), beschichtet mit Fluoreszenzindikator. Visualisierung erfolgt mittels UV-Licht. Laufmittel Ethanol-Wasser- Gemisch (70:30) (Laufmittel, LM 1) oder Ethanol-Wasser-Gemisch (90: 10) (LM 2). Präparativ: Kieselgel-Glasplatten mit Sammelschicht (VWR). LM 1 oder LM 2.

Umkehrphasen-Chromatographie (RP-Chromatographie), RP-18:

C-18 Material (Fluka), Säulenvolumen 10ml, Wasser-Methanol-Gradient. Fraktionen je

ImI wurden gesammelt und mit UV-Vis-Spektrometer analysiert. Fraktionen mit ähnlichen Spektren wurden vereinigt und lyophilisiert.

HPLC-Säulen mit ähnlichem Material können verwendet werden (Sigma).

Ionenaustausch-Chromatographie

DEAE-Zellulose (VWR), Gradient NH 4 HCO 3 20mmol/l - lmol/l, Fraktionen wurden unter

UV/Vis -Kontrolle gesammelt und auf Grundlage gleicher Spektren vereinigt.

Die Affinitätsisolierung von modifizierten Nuk-Makromolekϋlen kann beispielsweise eingesetzt werden, wenn modifizierte Nuk-Makromoleküle Oligonukleotide Bestandteil der Marker-Komponente sind. Durch die Hybridisierung an eine komplementäre, auf einer festen Phase fixierte Nukleinsäure können sie selektiv isoliert werden.

Die Bestimmung der Ausbeuten für farbstoffmarkierte Produkte erfolgte an UV-Vis- Spektrometer.

Die Vollständigkeit der Kopplung an Strepavidin wurde durch eine Kontrolltitration mit einem Biotin -Farbstoff (Biotin-4-Fluoreszein, Sigma) 100 μmol/l in 50 mmol/l Borat, pH 8, 5 min bei RT durchgeführt. Bei einer kompletten Besetzung von Biotin-Bindungsstellen an Strepavidin während der Synthese erfolgt keine Markierung von Streptavidin. Bei einer nicht ausreichenden Reaktion erfolgt eine Bindung an SA. Analyse mit UV-Vis.

Material: dUTP-AA (dUTP-Allylamine, Jena-Bioscience), dCTP-PA (dCTP-Propargyl-Amin, Jena Bioscience), dATP-PA (7-(3-Amino-l-propynyl)-2 * deoxy-7-deazaadenosin-5 ' -Triphosphat) (Auftragssynthese von JenaBioscience), dGTP-PA (7-(3-Amino-l-propynyl)-2 * deoxy-7- deazaguanosin-5 ' -Triphosphat, (Auftragssynthese von JenaBioscience), PDTP (3-(2- Pyridinyl-dithio)-propionsäure, Fluka), 7-(3-Phthalimido-l-propynyl)-2 ' -desoxy-7- deazaguanosin und 7-(3-Phthalimido-l-propynyl)-2 '-desoxy-7-deazaadenosin

(Chembiotech), Streptavidin-beschichtete Polystyrene-Beads mit einem Durchmesser von 0,86 μm 1% w/v (Kisker GbR, Germany), PDTP-NHS (3-(2-Pyridinyl-dithio)-propionsäure-N- hydroxysuccinimidyl-ester, Sigma), Cy3-I\IHS (CyS-N-hydroxysuccinimidyl-ester,

Amerscham Bioscience), MEA ( Mercaptoethylamine, Sigma), DTT (1,4-Dithio-DL-threit, Sigma), CA (Cystamine, Sigma), TCEP - (Tris-(2-carboxyethyl)phosphine, Sigma), Biotin- NHS (Biotin-N-hydroxysuccinimidyl-ester, Sigma). J-Ac (Iodoacetat, Sigma), Iodacetamid (Sigma), EDA (Ethylendiamin, Sigma), CDI (1,1 ' -Carbonyldiimidazol, Sigma), EDC N-(3- Dimethylaminopropyl)-N-Ethylenecarbodiimide (Sigma), NH2-PEG-Biotin (Länge: 30 Atome, Sigma), Biotin-PEG-NHS (Masse: 5000 Da, Nektar), SA ( Streptavidin, Promega), SA-PE (Streptavidin-Phycoerythrin, Molecular Probes Inc.), Biotin-PEG(8)-SS-PEG(8)-Biotin (Kat.No.PEG1064, IRIS Biotech GmbH), Fluorescein-PEG-NHS (5000 Da, Nektar), BOC-PEG- NHS (3000 Da, Nektar), Fmoc-PEG-NHS (5000 Da, Nektar), d UTP- 16- Biotin (Roche), nicht modifizierte, natürliche Nukleotide (Roth)

Lieferanten und Firmenverzeichnis:

Aldrich - s. Sigma

Amersham - Amerscham Bioscience, Freiburg, Deutschland Chembiotech - Chembiotech, Münster, Deutschland

Fluka - s. Sigma

Jena-Bioscience - Jena-Bioscience, Jena, Deutschland

Molecular Probes - Molecular Probes Europe, Leiden, Niederlande

MWG - MWG-Biotech, Ebersberg bei München, Deutschland, Nektar - Nektar Molecular engineering, früher Shearwater Corporation,

Huntsville, AL, USA

Quantum Dot - Quantum Dot Hayward, CA, USA

Roche - Roche, Mannheim, Deutschland

Sigma - Sigma-Aldrich-Fluka, Taufkirchen, Deutschland, Trilink - Trilink Biotechnologies Inc. San Diego, CA, USA,

Lösungsmittel wurden, wenn nötig, absolutiert verwendet (Fluka) oder nach Standardverfahren getrocknet. Bei Lösungsmittelgemischen beziehen sich die angegebenen Mischungsverhältnisse auf die eingesetzten Volumina (v/v).

Synthesen einzelner Komponenten

Beispiel 1 dUTP-AA-PDTP, Fig. 12

(Synthese erfolgte ähnlich wie in WO 2005 044836 beschrieben) 20 mg dUTP-AA wurden in ImI Wasser gelöst und der pH-Wert mit NaOH auf 8.5 eingestellt. Zur dUTP-AA - Lösung wurde PDTP-NHS 60 mg in 0.5 ml Methanol, tropfenweise unter Rühren zugegeben. Reaktion wurde 2 h bei 40 0 C durchgeführt. DC- Kontrolle: dUTP-AA-PDTP ( in LM 1 Rf 0.45). Die Trennung von überschüssigem PDTP-NHS und PDTP erfolgte auf präparativen Kieselgel-Platten, LM 2. Das Produkt, dUTP-AA-PDTP, und dUTP-AA bleiben auf der Startlinie. Die Nukleotide wurden von der Platte mit Wasser eluiert und eingeengt. Dieses dUTP-Analog trägt nun eine Disulfid-Bindung, die in einer Thiolaustauschreaktion mit anderen Thiolen reagieren kann und eine unter milden Bedingungen spaltbare Verbindung darstellt.

Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 7-Deaza- Aminopropargyl-Desoxy-Guanosin-Triphosphat und 7-Deaza-Aminopropargyl Desoxy- Adenosin-triphosphate, 5-Amino-Propargyl-Desoxy-Uridin-Triphosphate, 5-Amino-Allyl- Desoxy-Uridin-Triphosphate, 5-Amino-Propargyl-Desoxy-Cytidin-Triphosphate können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden.

Beispiel 2 dUTP-AA-Propionat-SH, Fig. 13 (Synthese erfolgte ähnlich wie in WO 2005 044836 beschrieben)

Zu 200μl 40 mmol/l Lösung von dUTP-AA-PDTP wurde ImI TCEP-Lösung 250mmol/l, pH

8, eingestellt mit NaOH, zugegeben und 10 min bei RT gerührt.

Die Trennung der Nukleotide von anderen Reagenzien erfolgte auf präparativen

Kieselgel-Platten, LM 2. Produkt, dUTP-AA-Propionat-SH, bleibt auf der Startlinie. Die modifizierten Nukleotide wurden von der Platte mit Wasser eluiert und eingeengt.

Dieses dUTP-Analog trägt eine reaktive SH-Gruppe, die leicht modifiziert werden kann, beispielsweise unter Ausbildung von Disulfid-Bindung.

Beispiel 3

Biotin-PEG-Ethyl-SH, Fig. 14

Zu 200 μl wässriger CA-Lösung (lOOmmol/l), pH 8.5, eingestellt mit NaOH, wurden 10 mg Biotin-PEG-NHS (5000 Da, Nektar) zugegeben und bei 40°C 18 Stunden gerührt. Anschließend wurde 200 μl TCEP-Lösung (0.5 mol/l), pH 8.0, zugegeben und weitere 10 min bei RT gerührt. Das Produkt wurde durch Ultrafiltration auf 3.000 MWCO (Molecular weight cut off) von anderen Reagenzien getrennt.

Das Produkt trägt eine reaktive SH-Gruppe, die leicht modifiziert werden kann, beispielsweise unter Ausbildung von Disulfid-Bindung.

Ein weiteres Beispiel für die Einführung von SS-Bindung bzw. Kopplung einer Mercaptogruppe an PEG :

NH2-PEG-Biotin, 10 mg, (PEG-Linker hat 30 Atome, Sigma-Aldrich) wurden in 280 μl 50 mM Borat-Puffer aufgelöst und pH auf 9 eingestellt. Zu dieser Lösung wurden zwei

äquivalente von PDTP-NHS in 100 μl DMF zugegeben. Nach 1 Stunde bei RT wurde der

überschuss von PDTP-NHS mit überschuss von NH 4 HCO 3 abreagiert. Das Produkt stellt folgende Verbindung dar: Biotin-PEG-PDTP.

Dieses Produkt kann durch Thiolaustausch an ein weiteres Molekül gekoppelt werden. Durch Spaltung der SS-Bindung kann eine freie SH-Gruppe bereitgestellt werden.

Weitere Linker mit reaktiven Gruppen wie Carboxy-, Thiol- oder Disulfid-Gruppen und einem PEG-Spacer (z.B. Biotin-PEG(8)-SS-PEG(8)-Biotin) können von IRIS-Biotech

GmbH (Germany) erhalten werden.

Beispiel 4 dUTP-AA-PEG-Biotin, Fig. 15

(Synthese erfolgte ähnlich wie in WO 2005044836 beschrieben)

Zu lOOμl wässriger Lösung dUTP-AA, 50mmol/l, pH 8.0, wurden 10mg Biotin-PEG-NHS (5000 Da, Nektar) gegeben und bei 40 0 C 18 Stunden gerührt. Anschließend wurde das nicht umgesetzte Nukleotid durch Ultrafiltration, 3.000 MWCO, abgetrennt und das

Produkt der Reaktion, das dUTP-AA-PEG-Biotin, mehrmals mit Wasser gewaschen.

Diese Verbindung trägt eine Nukleotid-Funktionalität und einen makromolekularen

Linker. Biotin dient als Kopplungseinheit T. An diese Kopplungseinheit T können makromolekulare Strukturen gekoppelt werden, z.B. Streptavidin oder mit Streptavidin modifizierte Proteine oder Beads.

Das Produkt der Reaktion ist eine Zwischenstufe eines modifizierten Nuk-Makromoleküls. Dieses Beispiel zeigt eine generelle Möglichkeit, an Nukleotiden weitere Modifikationen vorzunehnem. Weitere basenmodifzierte Nukleotidanaloga, wie z.B. 5-Propargylamino- dCTP, 7-Deaza-Aminopropargyl-dGTP, 5-Amino-Propargyl-dUTP und 7-Deaza- Aminopropargyl-dATP können wie oben angeführt ebenfalls modifiziert werden. Es können sowohl Ribonukleotide, 2 t -Deoxyribonukleotide als auch 2 V ,3 * - Deoxyribonukletide verwendet werden (Fig. 16, 21 - 24).

Beispiel 5 dUTP-AA-SS-PEG-Biotin, Fig. 17

Zu lOOμl, lOmmol/l Biotin-PEG-Ethyl-SH (5000 Da) in 5OmM Borat, pH 9.5, wurde 50μl 30mmol/l dUTP-AA-PDTP in 5OmM Borat, pH 9.5 zugegeben. Reaktion wurde 18 Stunden bei RT gerührt. Die Trennung erfolgt ähnlich wie für die Synthese von dUTP-AA-PEG- Biotin, Beispiel 4 beschrieben.

Diese Verbindung trägt eine Nukleotid-Funktionalität und einen makromolekularen Linker. Biotin dient als Kopplungseinheit T. An diese Kopplungseinheit T können makromolekulare Strukturen gekoppelt werden, z.B. Streptavidin. über Streptavidin können auch weitere makromoleküle, beispielsweise Enzyme oder Nukleinsäurenge koppelt werden.

Die Linker-Komponente kann zusammen mit der Marker-Komponente von der Nuk- Komponente unter milden Bedingungen abgespalten werden. Dies kann beispielsweise von Vorteil sein, wenn eine Sequenzierung durch Synthese (Balasubramanian WO 03048387, Tcherkassov WO 02088382, Quake WO0132930, Kartalov WO02072892 ) durchgeführt wird, wobei nach jedem Detektionsschritt eine Entfernung der Marker notwendig ist.

Beispiel 6 dCTP-PA-SS-(PEG) 8 -Botin

Schritt 1 : Zunächst wurde dCTP-PA mit PDTP-NHS modifiziert, so dass dCTP-PA-PDTP resulierte. Die Synthese wurde ähnlich wie für dUTP durchgeführt, siehe Beispiel 1. Schritt 2: Eine wässrige TCEP Lösung (10 μl, 300 mmol/l, pH 7, eingestellt mit NaOH) wurde zu einer wässrigen Lösung von Biotin-PEG(8)-SS-PEG(8)-Biotin (50 μl, 100 mmol/l, pH6, Iris Biotech GmbH) zugegeben. Dabei wird etwa die Hälfte der Disulfid- Brücken gespalten.

Wässrige Lösung von dCTP-PA-PDTP (20 μl, 20 mmol/l, pH 9.5, eingestellt mit NaOH) wurde zu der in Schritt 2 erhaltenen Lösung zugegeben und 1 Stunde bei RT inkubiert.

Das Produkt wurde mitttels Dünnschichtchromatographie in LM 1 isoliert. Die Nukleotide wurden von der Platte mit Wasser eluiert und eingeengt.

Beispiel 7 Synthese von makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden

In diesem Beispiel soll zur Demonstrationszwecken die Variierung der Größe und der Markierung des makromolekualren sterisch anspruchsvollen Liganden demonstriert werden. Es werden folgende Modifikationen von Streptavidin synthetisiert: SA-(PEG(B-OOO-BOC) n , SA-(PEG(5.000-Fmoc)) n ,

SA-(PEG(5.000-Fluorescein)) n

Als Ausgangssubstanzen dienten Streptavidin (Promega Inc.) und BOC-PEG-NHS (3000 Da, Nektar), Fmoc-PEG-NHS (5000 Da, Nektar) und Fluorescein-PEG-NHS (5000 Da, Nektar). Zur einer Streptavidin (5 mg/ml in 50 mmol/l Borat-Puffer, pH 9) wurden PEG- Derivaten bis zur Konzentration von 10% (w/v) zugegeben und ca. 2 hr bei RT inkubiert. Das modifizierte Streptavidin wurde mittels Ultrafiltration vom überschuß PEG-Derivaten gereinigt. Durchschnittlich wurde jedes SA-Molekül mit 10 PEG-Molekülen modifiziert (n=10). In ähnlicher Weise können auch andere Protein-Konjugate in ihrer Größe abgestuft geändert werden, wobei höhermolekulare PEG-Derivate verwendet werden können.

Nukleotid-Analoga mit einem makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden. Die kontrollierte enzymatische Synthese von Nukleinsäuren (schrittweise Primer- Verlängerung) beinhaltet einen kontrollierten Stop, gegebenenfalls Reinigung der Nukleinsäuren, Auhebung des Stops und die Fortsetzung der Synthese. Der Stop in der Synthese wird durch den Einbau von erfindungsgemäßen Nukleotid-Analoga mit makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden verursacht: Die Zusammgenhänge zwischen der Linker-Länge und dem Ausmaß der sterischen Hinderung sollen an einigen Bespielen der Nukeotid-Analoga demonstriert werden.

Beispiel 8

(dUTP-16-Biotin) 4 -SA, Zu 200μl einer Lösung von Biotin-16-dUTP (Linker-Länge 16 Atome) 200μmol/l in 5OmM Tris-HCI, pH 8.0, wurden 200μl einer Streptavidin-Lösung, lmg/ml, in 5OmM Tris-HCI, pH 8.0, zugegeben. Nach 1 Stunde bei RT wurde das (dUTP-16-Biotin)4-SA vom nicht umgesezten Biotin-16-dUTP durch Ultrafiltration, 50.000 MWCO, abgetrennt.

Es wurde eine Verbindung erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität und einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden trägt. Dieser Ligand kann auch als Marker betrachtet werden. Diese Verbindung wird von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase und Terminaler Transferase) als Substrat nicht akzeptiert. Die Modifikation führt zum Verlust der Substrateigenschaften.

Bei der Beurteilung der Nukleotid-Struktur hat dieser Linker für diese makromolekulare Struktur (Streptavidin) eine zu geringe Länge. In dieser Kombination lässt das Streptavidin, als makromolekularer Ligand, die Nukleotid-Komponente nicht genug nah an das aktive Zentrum des Klenow-Fragments heran.

Beispiel 9

Synthese von dUTP-AA-PEG-Biotin-SA-Derivate In der Synthese wurden folgende Streptavidin-Derivate (SA-Derivate) verwendet: SA- (PEG(3.000-BOC) n , SA-(PEG(5.000-Fmoc)) n, SA-(PEG(5.000-Fluorescein)) n Zu einer Lösung von dUTP-AA-PEG-Biotin (lOOμl, ca. 150 μmol/l) wird eine Lösung mit zwei äquivalenten von einem Streptavidin-Derivaten zugegeben und bei RT 1 h gerührt. Danach wird das Produkt durch Ultrafiltration, 50.000 MWCO, gereinigt und zwei mal mit Wasser gewaschen. Es werden Verbindungen erhalten, die eine Nukleotid-Funktionalität, einen langen makromolekularen Linker und einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Ligand einschließen.

In einer ähnlichen Weise wird die Verbindung von dUTP-AA-PEG-Biotin-SA*PE erhalten.

(Es ist vorteilhaft, eine einzige Nuk-Komponente an SA-Derivate zu koppeln. Dies kann bespielsweise durch überschuß an SA-Derivaten erreicht werden. Die Population stellt dabei ein Gemisch von SA-Derivaten, Nukleotid-SA-Derivaten, und (Nukleotid)n-SA- Derivaten dar, wobei bei entsprechender Wahl der molaren Verhältnisse die Form von Nukleotid-SA über (Nukleotid) n -SA prävaliert. Das Verhältnis zwischen dem Nukleotid- Anteil und dem modifizierten Streptavidin (dNTP:SA) kann beispielsweise in folgenden Bereichen liegen: von 0,01 : 1 bis 0,1 : 1; von 0,1 : 1 bis 0,5: 1; von 0,5: 1 bis 1 : 1; von 1 : 1 bis 2: 1, von 2: 1 bis 3: 1; von 3: 1 bis 4: 1. Da solche Nukleotidverbindungen noch freie Biotin-bindende Valenzen für Biotin haben, können weitere Strukturen, z.B. Biotin tragende signalgebende Strukturen, wie beispielsweise Farbstoffe oder Quantumdots, darüber gekoppelt werden.)

Es resultieren Verbindungen:

OUTP-AA-PEG-BiOtJn-SA-(PEG(B-OOO-BOC) n dUTP-AA-PEG-Biotin-SA-(PEG(5.000-Fmoc)) n dUTP-AA-PEG-Biotin-SA-(PEG(5.000-Fluorescein)) n d(JTP-AA-PEG-Biotin-SA*PE

In ähnlicher Weise werden die Verbindungen für dCTP-Derivaten synthetisiert. Die Verbindung dUTP-AA-PEG-Biotin-SA-(PEG(5.000-Fluorescein)) n hat einen makromolekularen Liganden, der mit Farbstoffen (Fluorescein) modifiziert ist. Auch andere Farbstoffe können gekoppelt werden entweder an as Streptavidin direkt oder über die Linker. SA-(PEG(5.000-Fmoc)) n kann beispielsweise nach Abspaltung von Fmoc- Schutzgruppen an frei gewordenen Amino-Gruppen mit NHS-Derivaten von Farbstoffen modifiziert werden. Auf diese Weise kann der makromolekulare sterisch anspruchsvolle Ligand auch Marker-Funktion haben.

Diese Verbindungen werden von Polymerasen, z.B. Klenow-Exo minus Polymerase, Sequenase, Vent Exo minus, Taq-Polymerase, Pwo Polymerase, Reverse Transcriptase (MMLV (Promega), ImProm II ™ (Promega)), als Substrat akzeptiert.

Die Effektivität des Hinderung der enzymatischen Synthese wird am Beispiel mit homopolymeren Bereichen in der Matrize und mit der Polymerase Vent exo minus Polymerase getestet: Während der enzymatischen Synthese an komplementären Matrizen-Positionen, wo ein potenziell mehrfacher Einbau von diesen Nukleotid-Analoga erfolgen könnte (z.B. -AAA- Strecken, Homopolymere), kann der Einbau von bis zu drei nacheinander folgenden modifizierten Nukleotid-Analoga dUTP-AA-PEG-Biotin-SA- (PEG(3.00O)-BOC) n nachgewiesen werden. Der Anteil der Primer, an denen eine mehrfache Verlängerung stattgefunden hat, ist allerdings geringfüg (Terminieungseffizienz in homopolymeren Bereichen über 90%).

Ein kompletter Stop kann bei gegebener Linker-Länge durch Vergrößerung des sterisch Anspruchsvollen Liganden erzielt werden. Die Analoga dUTP-AA-PEG-Biotin-SA- (PEG(5.000-Fluorescein)) n und dUTP-AA-PEG-SA*PE werden von Vent exo minus nur einmal an homopolymeren Strecken eingebaut. Der Einbau eines nächsten komplementären Nukleotid-Analogs wird durch den sterisch anspruchsvollen Liganden des bereits eingebauten Nukleotid-Analogs komplett blockiert (Terminierungseffizienz in homopolymeren Bereichen größer 99%).

Nicht nur gleiche makromolekulare sterisch anspruchsvolle Liganden, sondern auch ähnlich große führen zur Hinderung des Einbaus von modifizierten Nukleotid-Analoga.

Bei gleichzeitiger Verfügbarkeit von dUTP-AA-PEG-Biotin-SA-(PEG(3.00O)-BOC) n und OCTP-AA-PEG-BiOtJn-SA-(PEG(S. O00-Fluorescein)) n in einer Reaktionslösung, führt das dUTP-Analog zur Hinderung des Einbaus vom dCTP-Analogs an Strecken, wo an den Primer zunächt ein dU und dann ein dC eingebaut werden sollte. Dies zeigt, dass mehrere modifizierten Nuk-Makromoleküle gleichzeitig im Reaktionsansatz vorliegen können und trotzdem nur ein komplementäres modifiziertes Nuk-Makromolekül in den Primer eingebaut wird.

Beispiel 10 Bead-(SA-(dUTP-AA-PEG-Biotin))n

1000 μl einer 1% Suspension von Streptavidin-beschichteten Polystyrene-Beads mit einem Durchmesser von 0,86 μm werden mit 10 μl 1 mM Lösung von dUTP-AA-PEG- Biotin 10 min bei RT inkubiert. Die Reinigung der Beads erfolt durch Zentrifugation für 5 min bei 10000 rpm und einen Puffer-Austausch (10 x mit 200 μl Tris-HCI 50 mM, pH 8,5).

Die resultierten Nukleotid-modifizierten Beads können von Klenow Fragment an eine Nukleinsäurekette eingebaut / gekoppelt werden.

Der Einfluß eines solchen sterischen Hindernisses unterscheidet sich von der Wirkung der sterisch anspruchsvollen Liganden mit einer Masse zwichen 20.000 Da und 10.000.000 Da (z.B. Proteine und ihre Komplexe). Da die Raumforderung eines Nano-Kügelchen / oder eines Nanoteilchen mehrer Hundert Nanometer betreffen kann, kann ein solcher sterisch anspruchsvoller Ligand nicht nur unmittelbar anschließende Bereiche der Nukleinsäure, sondern auch wesentlich größere Bereiche der Nukleinsäure für die Kopplung eines weiteren ähnlich großen modifizierten Moleküls unzugängig machen.

Beispiel 11

Herstellung eines Nukleotid-Analogs mit einem makromolekularen sterischen Hindernis (Linker 43 Atome). dCTP-PA-SS-(PEG) 8 -Biotin-SA-Cy3, dCTP-PA-SS-(PEG) 8 -Biotin-SA-PE

Die Kopplung von dCTP-PA-SS-(PEG) 8 -Biotin an Streptavidin wurde ähnlich wie für dUTP- AA-PEG-Biotin beschrieben durchgeführt. Ein äquivalent von dCTP-PA-SS-(PEG) 8 -Biotin wurde zu 1,5 äquivalenten von Streptavidin (wässrige Lösung, 5mg/ml, in 5OmM Tris- HCI, pH 8.0) zugegeben. Nach 1 Std. bei RT wurde das resultierte dCTP-PA-SS-(PEG) 8 -

Biotin-SA von niedermolekularen Substanzen durch Ultrafiltration mit MWCO 50.000 gereinigt.

Anschließend wurde das dCTP-PA-SS-(PEG) 8 -Biotin-SA mit Cy3-NHS im Borat Puffer (50 mmol/l, pH 8,5) modifiziert, so dass durchschnittlich 3 bis 5 Cy3-Moleküle pro ein Streptavidin-Molekül gekoppelt wurden (Fig. 18). Es resultiert ein Gemisch von mehreren Modifikationen von dCTP-PA-SS-(PEG) 8 -Biotin-SA-Cy3. Dieses Gemisch wurde nicht weiter getrennt.

Dieses Nukleotid-Analogs wird von mehreren Polymerasen (z.B. von Klenow Fragment exo minus Polymerase, Sequenase 2, Vent exo minus, Taq Polymerase, Pwo Polymerase) als Substrat akzeptiert.

Während der enzymatischen Synthese an komplementären Matrizen-Positionen, wo ein potenziell mehrfacher Einbau von diesen Nukleotid-Analoga erfolgen könnte (z.B. -GGG- Strecken, homopolymere Bereiche in der Matrize), konnte der Einbau von nur einem Nukleotid-Analog nachgewiesen werden (s. Beispiel 15). In diesem Fall übt der sterisch anspruchsvolle makromolekulare Ligand (in diesem Beispiel Streptavidin) auf die weitere enzymatische Reaktion eine hemmende Wirkung aus: weitere Nukleotid-Analoga (in diesem Fall dCTP-PA-SS-(PEG) 8 -Biotin-SA) konnten nicht in der anschließenden Position am Primer (N+2) eingebaut werden. Nach der Spaltung des Linkers durch Reduktion der Disulfid-Bindung und anschließender Blockade der SH-Gruppe mit Iodacetamid konnte ein weiteres dCTP-PA-SS-(PEG) 8 -Biotin-SA eingebaut werden. Beispiel für die Durchführung einer solchen Reaktion siehe Beispiel 15.

An das Streptavidin können weitere Moleküle gekoppelt werden. Statt Streptavidin können in der oben genannten Synthese käufliche Streptavidin-Konkugate eingesetzt werden, beispielsweise Streptavidin-PE (Molecular Probes Inc. Invitrogen) , Streptavidin- AP, Streptavidin-HRP oder Fluoreszenzfarbstoff-Konjugate (Fig. 19).

Beispielsweise die Synthese von dCTP-PA-SS-(PEG) 8 -Biotin-SA-PE wurde Analog zu dCTP-PA-SS-(PEG) 8 -Biotin-SA durchgeführt: Ein äquivalent von dCTP-PA-SS-(PEG) 8 - Biotin wurde zu einem äquivalenten von Streptavidin-PE, Molecular Probes, (wässrige Lösung, lmg/ml, im Hersteller-Puffer) zugegeben. Nach 1 Std. bei RT wurde das resultierte dCTP-PA-SS-(PEG) 8 -Biotin-SA*PE von niedermolekularen Substanzen durch Ultrafiltration mit MWCO 100.000 gereinigt.

Dieses Nukleotid-Analog wird ebenfalls von vielen Polymerasen (s. oben) akzeptiert und führt nach einem Einbau (z.B. in homopolymeren Bereichen) zur Hinderung des Einbaus eines weiteren dCTP-PA-SS-(PEG) 8 -Biotin-SA*PE in der unmittelbarer Nähe.

Beispiel 12

Weiteres Beispiel für die Synthese von modifizierten Nuk-Makromolekülen

SA-(dGTP-PA-SS-PEG-Biotin) n

Herstellung eines Nukleotid-Analogs mit einem makromolekularen sterischen Hindernis

(Linker 43 Atome), (n) liegt zwischen 1 und 4. Zu 200 μl einer 50 μM Streptavidin-Lösung in 50 mM Borat-Puffer, pH 9, werden 5 äquivalente von Biotin-PEG-PDTP (PEG-Linker 30 Atome; Synthese s. Beispiel 3) zugegeben und 10 Minuten inkubiert. Streptavidin-(Biotin-PEG-PDTP) n wird durch Ultrafiltration an MWCO 30000 von niedermolekularen Komponenten durch mehrmaliges Waschen mit Borat-Puffer getrennt. Zu 200 μl 50 μM Streptavidin-(Biotin-PEG-PDTP)n Lösung in Borat-Puffer werden mit 100 μl 10 mM Lösung von TCEP, pH 8, zugegeben. Nach 30 min wird Streptavidin-(Biotin-PEG-R-SH)n erneut durch Ultrafiltration an MWCO 30000 von niedermolekularen Komponenten durch mehrmaliges Waschen mit Borat- Puffer getrennt.

dGTP-PA wird mit PDTP-NHS modifiziert, ähnlich wie im Beispiel 1 dargestellt, das Produkt ist dGTP-PA-PDTP. 50 μl einer 100 mM Lösung von dGTP-PA-PDTP in 50 mM Borat-Puffer, pH 9, werden zu 200 μl 50 μM Streptavidin-(Biotin-PEG-R-SH) 4 in 50 mM Borat Puffer zugegeben. Nach 30 min RT werden makromolekulare Produkte u.a. SA-(dGTP-PA-SS-PEG-Biotin) n durch Ultrafiltration an MWCO 30000 von niedermolekularen Komponenten durch mehrmaliges Waschen mit Borat-Puffer getrennt.

Das resultierende Produkt SA-(dGTP-PA-SS-PEG-Biotin) n hat einen Linker von 43 Atomen zwischen Nuk-Komponente und dem Biotin. Dieses modifizierten Nuk-Makromolekül hat eine spaltbare SS-Bidung in seinem Linker und kann von Klenow Fragment in eine Nukleinsäurekette eingebaut werden.

Während der enzymatischen Synthese (Klenow Exo minus Polymerase) an komplementären Matrizen-Positionen, wo ein potenziell mehrfacher Einbau von diesen Nukleotid-Analoga erfolgen könnte (z.B. -CCC- Strecken in der Matrize), konnte der Einbau von nur einem Nukleotid-Analog nachgewiesen werden. In diesem Fall übt der sterisch anspruchsvolle makromolekulare Ligand (Streptavidin) auf die weitere enzymatische Reaktion eine hemmende Wirkung aus: weitere Nukleotid-Analoga (in diesem Fall SA-(dGTP-PA-SS-PEG-Biotin) n ) konnten nicht in unmittelbarer Nähe

eingebaut werden. Die Linker-Komponente und der sterisch ansruchsvoller Ligand können von der Nuk-Komponente unter milden Bedingungen abgespalten werden.

An das' Streptavidin können weitere Moleküle gekoppelt werden. Statt Streptavidin können in der oben genannten Synthese käufliche Streptavidin-Konkugate eingesetzt werden, beispielsweise Streptavidin-AP, Streptavidin-HRP oder Fluoreszenzfarbstoff- Konjugate (ähnlich wie in Fig. 18 oder 19). Diese Konkugate, gekoppelt an ein modifizierte Nuk-Makromolekül, haben ein ähnliches Verhalten, wie Streptavidin selbst.

Beispiel 13

Die Kombination von Biotin tragenden modifizierten Linkern und modifizierten Streptavidinen als sterisch anspruchsvollen Liganden stellt ein Beispiel für Synthese weiterer modifizierter Nukleltide dar:

dUTP-AA-SS-PEG-Biotin (Synthese s. Beispiel 5) und in ähnlicher Weise synthetisierte dCTP-PA-SS-PEG-Biotin, dATP-PA-SS-PEG-Biotin und dGTP-PA-SS-PEG-Biotin können mit verschiedenen Varianten des sterischen Hindernisses und Markern kombiniert werden :

Modifikation mit SA-(PEG-X) N :

Wo N = 3-12 und und (X) schließt beispielsweise einen Farbstoff, z.B. FITC, Cy3, Cy5 Rhodamine (Beispiele für weitere Farbstoffe siehe Katalog von Dyomics GmbH, Jena, Germany oder Molecular Probes, Invitrogen), oder eine Schutzgruppe, z.B. Fmoc, oder eine Aminogruppe ein. Die Farbstoffe können sowohl über PEG als auch direkt an das Streptavidin gekoppelt sein. Auch weitere SA-Modifikationen (z.B. SA*PE) können durch Modifikation mit Polymeren (wie z.B. PEG, verschiedene PEG-Derivate kommerziell erhältlich, z.B. Sigma-Aldrich-Fluka, Iris Biotech, ihre Größen könne variieren z.B. zwischen 500 und 10000 Da) in ihrer Größe abgestufft verändert werden, sowie durch weitere Modifikationen, z.B. durch Kopplung von Farbstoffen, erweitert werden.

Folgende Verbindungen stellen Beispiel für reversible Terminatoren mit makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden dar:

dUTP-AA-SS-PEG-Biotin-SA-(PEG-X) N , dCTP-PA-SS-PEG-Biotin-SA-(PEG-X) N , dATP-PA-SS-PEG-Biotin-SA-(PEG-X) N , dGTP-PA-SS-PEG-Biotin-SA-(PEG-X) N ,

Modifikation mit SA*PE dUTP-AA-SS-PEG-Biotin-SA*PE dCTP-PA-SS-PEG-Biotin-SA*PE dATP-PA-SS-PEG-Biotin-SA*PE dGTP-PA-SS-PEG-Biotin-SA*PE

Diese Verbindungen werden von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase, Sequenase, Vent Exo minus Polymerase, Taq-Polymerase, Pwo Polymerase, Reverse Transcriptase (M-MLV, (Promega), ImProm II ™ (Promega)) als Substrat akzeptiert und können in der Sequenzierungsreaktion eingesetzt werden.

Das bei der Synthese resultierende Gemisch von beispielsweise dATP-PA-SS-PEG-Biotin- SA-(PEG-X) N und SA-(PEG-X) N kann als ganzes in die Sequenzierungsreaktion eingesetzt werden.

Solche modifizierte Nukleotid-Analoga schließen einen spaltbaren Linker, einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden (modifiziertes Streptavidin- Molekül) und einen Marker, wobei der Marker aus mehreren Farbstoffen mit geringer molekularer Masse (z.B. Cy3, FITC, Cy5) oder aus einem makromolekularen Marker, wie PE (phycoerhytrin), bestehen kann. Möglichkeit, unterschieliche Farbstoffe an das Streptavidin oder seine Modifikationen (z.B. PEG-modifiziertes Streptavidin, SA-PE- Konjugat) erlaubt unterschiedliche Farbkodierungen für einzelne modifizierte Nuk- Makromoleküle vorzunehmen.

Solche modifizierten Nuk-Makromoleküle (Nukleotid-Analoga) stellen Beispiele für reversible Terminatoren mit makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden dar und können in Sequenzierungsverfahren wie (WO02088382) eingesetzt werden. Für Sequenzierungsverfahren werden reversible Terminatoren mit Terminationseffizienzen bevorzugt, die folgende Bereiche einschließen: 80 - 100%, 90 - 100%. Besonders bevorzugt sind reversible Terminatoren mit Terminationseffizienzen in Bereichen von 95 - 100%, 97-100%, 99-100%. Nach dem Einbau eines solchen modifizierten Nuk- Makromoleküls kann kein weiteres modifiziertes Nuk-Makromolekül eingebaut werden. Nach der Spaltung des Linkers mit reduzierenden Substanzen (z.B. TCEP) und der Blockade der Mercapto-Gruppe (z.B. mit Iodacetamid), kann ein weiteres komplementäres modifiziertes Nuk-Makromolekül eingebaut werden, das ebenfalls zu einem reversiblen Stopp führt.

Beispiel 14

Die enzymatischen Einbaureaktionen werden bei üblichen Bedingungen für die Einbaureaktionen von modifizierten Nuk-Makromolekülen durchgeführt. Beispielsweise können folgende Bedingnugen eingesetzt werden : Puffer-Lösungen:

Tris-HCI (20 mM - 100 mM), pH 7-8,5

(Als Puffer können auch Phosphat, MOPS, HEPES, Acetat, Borat-Puffer verwendet werden) MgCI 2 z.B. 1,5 bis 10 mM (oder auch Mn 0,2 - 1 mM)

NaCI 20 bis 100 mM

Glycerin ca. 10 - 30 %

• Primer (Oligonukleotide) mit einer Länge von 17 bis 50 Nukleotide, die eine ausreichende spezifische Hybridisierung an die Matrize aufweisen. Konzentration ca . von 0,02 bis 2 μM

• Matrizen (PCR- Produkte, Oligonukleotide)

• DNA-Polymerasen (Klenow-Fragment, Taq-Polymerase, Vent-Polymerase, Vent exo minus Polymerase, Deep Vent exo minus Polymerase, Pwo-Polymerase, Sequenase II, Reverse Transcriptasen, AMV, M-MLV, RAV, HIV, ImProm II (TM) Reverse Transcriptase)

• modifizierten Nuk-Makromoleküle werden in Konzentrationen vorzugsweise zwischen 0,1 μM bis 50 μM verwendet.

Für die Reaktionen an der festen Phase sind geeignet Mikrotiter-Platten, Beads (z.B. Streptavidin beschichtete Polysterene Beads oder paramagnesiche Teilchen auf Dextran- Basis, z.B. von Promega) oder DNA-Chips von verschiedenen Herstellern. Die Fixierung der Nukleinsäuren an den festen Phasen erfolgt je nach Experiment durch Affinitätskopplung oder Kovalent. Der Nachweis erfolgt entsprechend dem eingesetzten Marker: z.B. Fluoreszenz oder enzymatische Farbentwicklung. Als Trennmedien und Verfahren werden z.B. Gel-Elektrophorese, Gel-Filtration, Ultrafiltration, Affinitätsisolierung verwendet.

Enzymatische Reaktionen wurden für ca. 2 bis 60 min bei RT bis 60 0 C durchgeführt. Die Spaltungsreaktion der Disulfid-Bindung werden beispielswiese bei folgenden Bedingungen durchgeführt: • 50 mM Borat Puffer, pH 8.5-9.0, + 50 mM NaCI

• Als reduzierende Substanzen werden TCEP, Beta-Merkaptoethanol oder DTT verwendet.

• Die Reaktionsdauer kann zwischen 5 und 60 min bei RT variieren.

Beispiel 15: Reversible Terminierung mittels dCTP-PA-SS-(PEG) 8 -Biotin-SA-Cy3 Demonstration der reversiblen Terminierung am Beispiel der Synthese eines homopolymeren Bereichs in einer künstlichen Sequenz. Detektion erfolgt mittels Fluoreszenzmessung der Signale von modifizierten Nuk-Makromoleküle nach einer GeI- Elektrophorese von verlängerten Primern.

Materialien: Lösungen:

Puffer l : 50 mmol/l Tris HCl, pH 8,5; 50 mmol/l NaCI, 5 mmol/l MgCI 2 , Glycerin 10 % v/v

Puffer 2: Borat Puffer 50 mmol/l pH 9,0; 100 mmol/l NaCI, 5 mmol/l MgCI 2

Nukleotide und Nukleotid-Analoga: dATP (wurde bei Firma Roth erworben) und als Lösung von lmmol/l verdünnt. dCTP-PA-SS-(PEG) 8 -Biotin-SA-Cy3 (im Weiteren als dC-Analog bezeichnet). dC-Analog (eine wässrige Lösung, 100 μmol/l) ist in diesem Beispiel Bestandteil eines Gemisches. Das Gemisch wurde erhalten wie in Beispiel 11 dargestellt, wobei das dC- Analog von nicht konjugierten SA-Cy3 nicht getrennt wurde.

Feste Phase: Streptavidin Magnesphere Paramagnetic particles (Kat.No. Z5481) Promega. Können mit Hilfe eines Magneten aus der Lösung isoliert werden (siehe Anleitung des Herstellers). Das Waschen der festen Phase wurde durch mehrmaligen Austausch einer Lösung durchgeführt (einmaliges Volumen der Lösung 200 μl). Zur Vereinfachung der Beschreibung wird als „feste Phase" Folgendes bezeichnet: Beads selbst und alle daran gebundenen Elemente, z.B. Nukleinsäuren, Nukleotide usw.

Während der zyklischen Reaktion werden zu verschiedenen Zeitpunkten (wie indiziert im Text) Aliquoten aus dem Hauptansatz entnommen.

Polymerase: Vent exo minus Polymerase (New England Biolabs), wird als Polymerase bezeichnet.

Nukleinsäuren:

Künstliches Oligonukleotide mit folgenden Sequenzen: Oligonukleotid-1 : Biotin-(T) 48 Oligonukleotid-2: (Matrize)

5 ' (A) 5O TCCCGTTTCGTCTCGTTCCGCAGGGTCCTATAGTGAGTCGTATTA 3 ' Oligonukleotid-3: (Primer) 5 ' TAATACG ACTCACTATAG G 3 ' Alle Oligonukleotide wurden bei MWG Biotech, Deutschland, erhalten.

Allgemeine Reaktionsbedinungen:

Die Primer-Extentionsreaktion wird bei 37 0 C für 15 min im Puffer 1 durchgeführt. Unter diesen Bedingungen bei angezeigten Polymerase- und Nukleotid-Konzentrationen 5 werden in einem Zyklus von 15 min über 95% aller extensionsfähigen Primer-Matrize- Komplexe verlängert.

Vorbereitung der festen Phase für die zyklischen Reaktionen:

Drei Violen mit paramagnetischen Teilchen werden vereinigt und in Puffer 1 gewaschen, LO danach wird feste Phase in 200 μl Puffer 1 als Suspension aufgelöst. Anschließend wird Oligonukleotid-1 an die feste Phase gebunden : eine Lösung mit Oligonukleotid-1 (7 μl 100 μM in Wasser) wird zu der festen Phase zugegeben und für 10 min bei RT gerührt. Anschließend wird feste Phase mit Puffer 1 gewaschen. Anschließend wird eine Lösung mit Oligonukleotid-2 (5 μl 100 μM in Wasser) zusammen mit einer Lösung mit L5 Oligonukleotid-3 (5 μl 100 μM in Wasser) zur festen Phase zugegeben und bei 37°C für 10 min inkubiert. Anschließend wird die feste Phase in Puffer 1 gewaschen. Eine solche feste Phase kann in enzymatischen Reaktionen verwendet werden, sie schließt eine Matrize (Oligonukleotid-2) und einen Primer (Oligonukleotid-3) ein.

10 ES wird ein Aliquot dieser festen Phase (15% von der Gesamtmenge der festen Phase) entnommen (Probe 1). Zu diesem Aliquot wird Puffer 1 bis zum Volumen von 90 μl zugegeben. Anschließend wird ein Gemisch mit dC-Analog (10 μl 100 μmol/l Nukleotid- Anteil im Puffer 1) zugegeben und 15 min bei 37 0 C inkubiert. Anschließend, wird die feste Phase mit Puffer 1 mehrmals gewaschen. Diese Probe 1 dient als Kontrolle der

15 unspezifischen Bindung von dC-Analog an die feste Phase.

Zyklische Reaktionen:

Alle Inkubationsschritte mit Polymerasen und Nukleotid-Analoga werden in einem Volumen von 100 μl im Puffer 1 durchgeführt. 10

1. Bindung der Polymerase:

Eine Lösung mit Polymerase (5 μl im Herstellerpuffer) wird zur festen Phase zugegeben und 5 min bei RT inkubiert. Anschließend wird die feste Phase mit Puffer 1 gewaschen. Polymerasen bleiben dabei an den Nukleinsäuren gebunden. Die feste Phase wird in 100 15 μl Puffer 1 suspendiert.

2. Zugabe von Nukleotiden und Nukleotid-Analoga:

Es wird eine Lösung von dATP (5 μl 1 mmol/l) sowie dC-Analog (10 μl 100 μmol/l) im Puffer 1 zur festen Phase zugegeben. Die feste Phase wird mit genannten Komponenten bei 37°C für 15 min inkubiert. Anschließend wird die feste Phase mit Puffer 1 gewaschen und ein Aliquot entnommen (Probe 2). Die Probe 2 enthält an die Primer (N+2 ) gekoppelten dC-Analoga. Es ist nur ein einziges dC-Anaiog eingebaut, da der markomolekulare sterisch anspruchsvolle Ligand, den weiteren Synthesefortschreiten inhibiert.

3. Abspaltung des makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden und Modifikation des Linker- Rest: Die feste Phase wird nun mit Puffer 2 gewaschen. Anschließend wird die feste Phase zunächst mit einer Lösung mit DTT (100 μl 50 mmol/l in Puffer 2) für 10 min bei RT und danach mit einer Lösung mit Iodacetamid (100 μl 0,2 mol/l in Puffer 2) für 10 min bei RT inkubiert. Es wird ein weiteres Aliquot entnommen (Probe 3). Die Probe 3 enthält die Primer (N+2) mit Linker-Rest am eingebauten dC-Analog, der sterisch anspruchsvolle Ligand wurde abgespalten und die freie Merkaptogruppe wurde modifiziert.

4. Bindung der Polymerase:

Anschließend wird die feste Phase mit Puffer 1 gewaschen und es wird Schritt 1 wiederholt: weitere 5 μl Vent exo minus Polymerase im Herstellerpuffer werden zugegeben. Nach 5 min bei RT wird die feste Phase mehrmals mit Puffer 1 gewaschen.

5. Zugabe von Nukleotid-Analoga:

Es wird dC-Analog (10 μl 100 μmol/l) im Puffer 1 zur festen Phase zugegeben. Die feste Phase wird bei 37°C für 15 min inkubiert. Anschließend wird die feste Phase mit Puffer 1 gewaschen und ein Aliquot entnommen (Probe 4). Die Probe 4 enthält an die Primer (N+3 ) gekoppelten dC-Analoga. Es ist nun ein weiteres dC-Analog eingebaut.

6. Abspaltung des makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden und Modifikation des Linker-Rest (s.oben). Es wird ein Aliquot entnommen (Probe 5). Die Probe 5 enthält die Primer (N+3) mit Linker-Rest am eingebauten dC-Analog, der sterisch anspruchsvolle Ligand wurde abgespalten und die freie Merkaptogruppe wurde modifiziert.

7. Bindung der Polymerase:

Anschließend wird die feste Phase mit Puffer 1 gewaschen und es wird Schritt 1 wiederholt: weitere 5 μl Vent exo minus Polymerase im Herstellerpuffer werden zugegeben. Nach 5 min bei RT wird die feste Phase mehrmals mit Puffer 1 gewaschen.

8. Zugabe von Nukleotid-Analoga :

Es wird dC-Analog (10 μl 100 μmol/l) im Puffer 1 zur festen Phase zugegeben. Die feste Phase wird bei 37°C für 15 min inkubiert. Anschließend wird die feste Phase mit Puffer 1 gewaschen und ein Aliquot entnommen (Probe 6). Die Probe 6 enthält an die Primer (N+4 ) gekoppelten dC-Analoga. Es ist nun ein weiteres dC-Analog eingebaut.

Die elektrophoretische Trennung von Proben 1 bis 6 erfolgte mittels 6% (w/v)

Polyacrylamid-Gel in 50 mmol/l Tris-HCI, pH 8,5, bei 200 V auf Apparatur Miniprotean

(Biorad, Deutschland). Die Elektrophorese erfolgte bei 60 0 C.

Legende zur Fig. 20:

Spur 1 : Leiter (dC-Analog (obere Bande) und Oligonukleotid-3, markiert mit Cy3-

Farbstoff am 3 ' -Ende (untere Bande)

Spur 2 = Probe 1 (Kontrolle der unspezifischen Bindung von dC-Analog an die feste Phase)

Spur 3 = Probe 2 (Einbau des l.dC-Analogs)

Spur 4 = Abspaltung von sterisch anspruchsvollen Liganden mit Markern

Spur 5 = Probe 2 (Einbau des 2.dC-Analogs)

Spur 6 = Abspaltung von sterisch anspruchsvollen Liganden mit Markern Spur 7 = Probe 2 (Einbau des 3.dC-Analogs)

In diesem Beispiel ist die reversible Terminierung der Synthese mittels erfindungsgemößen modifizierten Nuk-Makromolekülen mit einem makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden demonstriert.

ähnlich zu dCTP-AA-SS-(PEG) 8 -Biotin-SA-Cy3 und dCTP-AA-SS-(PEG) 8 -Biotin-SA*PE

(siehe Beispiel 11) können auch andere Nukleotide modifiziert werden. Folgende

Verbindungen stellen Beispiele für reversible Terminatoren mit makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden dar: dUTP-AA-SS-(PEG) 8 -Biotin-SA dCTP-PA-SS-(PEG) 8 -Biotin-SA dATP-PA-SS-(PEG) 8 -Biotin-SA dGTP-PA-SS-(PEG) 8 -Biotin-SA

dUTP-AA-SS-(PEG) 8 -Biotin-SA*PE dCTP-PA-SS-(PEG) 8 -Biotin-SA*PE dATP-PA-SS-(PEG) 8 -Biotin-SA*PE dGTP-PA-SS-(PEG) 8 -Biotin-SA*PE

Diese Verbindungen werden von Polymerasen (z.B. Klenow-Exo minus Polymerase, Sequenase, Vent Exo minus Polymerase, Taq-Polymerase, Pwo Polymerase) als Substrat akzeptiert und können als reversible Terminatoren in Sequenzierungsreaktionen eingesetzt werden.

Beispiel 16

Beispiele für Anwendungen von modifizierten Nuk-Makromolekülen bei der

Sequenzierung auf Einzelmolekülebene. Es sind mehrere Patentanmeldungen veröffentlicht, die verschiedene Anwendungen und Ausführungsformen der Sequenzierung durch die Synthese beschreiben (WO02088382, DE 102004025746, DE 10120798, DE 10246005, EP1692312, EP1766090, WO2007100637). Diese Dokumente sind hier zitiert und eingebaut in vollem Umfang als Literaturstellen (im Sinne „incorporated by reference" in vollem Umfang). Nachfolgend, sollen einige beispielhafte Ausführungsformen beschrieben werden, in denen modifizierte Nuk-Makromoleküle mit sterisch anspruchsvollen makromolekularen Liganden eingesetzt werden können.

Bei solchen Verfahren geht es um Ausbildung von extensionfährigen Primer-Matrize- Komplexen an einer festen Phase, deren Primer in zyklischen Schritten verlängert werden und Signale von eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen detektiert werden. Die feste Phase kann in Form einer planen Oberfläche oder in Form von Nano- oder Mikroteilchen (z.B. Kügelchen) vorliegen. Die Kügelchen können auch an einer planen Oberfläche verteilt sein, so dass ein zweidimensionales Array entsteht. Solche feste Phasen sind vorzugsweise Bestandteile von Kits zur Sequenzierung.

Die einzelnen extesionsfähige Primer-Matrize-Komplexe (ein Matrizenmolekül bindet ein Primer-Molekül) sind vorzugsweise an die feste Phase in einer Dichte gebunden, die optische Zuordnung von Einbauereignissen (z.B. Fluoreszenzsignale von eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen) an einzelnen Primer-Matrize-Komplexen erlaubt (WO02088382, DE 102004025746,). Als Detektionsvorreichtug können beispielsweise Fluoreszenzmikroskope dienen (DE 10246005). Die auf diese Weise vorbereitete feste Phase ermöglicht Betrachnung von zyklischen Reaktionen an der festen Phase auf dem Niveau von einzelnen Molekülen (z.B. DE 102004025746). Dabei wird die Oberfläche abgescannt und die Position einzelner Signale auf der Oberfläche detektiert, so dass jeder extesionsfähige Primer-Matrize-Komplex die für ihn charakteristische Position mit Koordiaten (X, Y) auf der Oberfläche erhält. Bei wiederholten Scann-Zyklen können Signale den jeweiligen Primer-Matrize-Komplexen zugewiesen werden.

Als Material können verschiedene Nukleinsäureketten verwendet werden: Es können sowohl vorselektionierte DNA-Sequenzen (z.B. isolierte PCR-Fragmente, in YAC-, PAC-, oder BAC-Vektoren (R. Anand et al. NAR 1989 v.17 S.3425, H. Shizuya et al. PNAS 1992 v.89 S.8794, "Construction of bacterial artificial chromosome libraries using the modified PAC System" in "Current Protocols in Human genetics" 1996 John Wiley & Sons Inc.) klonierte Abschnitte eines Genoms) als auch nicht vorselektionierte DNA (z.B. genomische DNA, cDNA-Gemische, PCR-Fragmenten Gemische, mRNA Gemische, Oligonucleotid- Bibiotheken) verwendet werden. Durch eine Vorselektion ist es möglich, im Vorfeld relevante Informationen, wie z.B. Sequenz-Abschnitte aus einem Genom oder Populationen an Genprodukten, aus der große Menge genetischer Informationen herauszufiltern und damit die Menge der zu analysierenden Sequenzen einzuschränken.

Vorbereitung des Materials Ziel der Materialvorbereitung ist es, gebundene einzelsträngige NSKFs mit einer Länge von vorzugsweise 50-1000 NTs, einer einzelnen Primerbindungsstelle und einem hybridisierten Primer (gebundene NSKF-Primer-Komplexe) zu erhalten. Im einzelnen können sehr variable Konstruktionen aus dieser allgemeinen Struktur abgeleitet werden. Zur Verbesserung der Anschaulichkeit folgen nun einige Beispiele, wobei die angeführten Methoden einzeln oder in Kombination eingesetzt werden können.

Erzeugung kurzer Nukleinsäurekettenfragmente (50-1000 NTs) (Fragmentierungsschritt) Wichtig ist, dass die Fragmentierung der NSKs so erfolgt, dass Fragmente erhalten werden, die überlappende Teilsequenzen der Gesamtsequenzen darstellen. Dies wird durch Verfahren erreicht, bei denen unterschiedlich lange Fragmente als Spaltprodukte in zufallsmäßiger Verteilung entstehen.

Erfindungsgemäß kann die Erzeugung der Nukleinsäurekettenfragmente (NSKFs) durch mehrere Methoden erfolgen, z.B. durch die Fragmentierung des Ausgangsmaterials mit Ultraschall oder durch Endonukleasen oder durch Einwirkung von Säuren (z.B. HCL) ("Molecular cloning" 1989 J.Sambrook et al. CoId Spring Harbor Laborotary Press), wie z.B. durch unspezifische Endonukleasegemische. Erfindungsgemäß wird die Ultraschall-Fragmentierung bevorzugt. Man kann die Bedingungen so einstellen, dass Fragmente mit einer durchschnittlichen Länge von 100 bp bis 1 kb entstehen. Diese Fragmente werden an- schließend an ihren Enden durch das Klenow-Fragment (E.coli-Polymerase I) oder durch die T4-DNA-Polymerase aufgefüllt ("Molecular cloning" 1989 J.Sambrook et al. CoId Spring Harbor Laborotary Press).

Ausserdem können aus einer langen NSK unter Verwendung randomisierter Primer komplementäre kurze NSKFs synthetisiert werden. Besonders bevorzugt wird diese Methode bei der Analyse der Gen-Sequenzen. Dabei werden an der mRNA einzelsträngige DNA-Fragmente mit randomisierten Primern und einer reversen Transkriptase gebildet (Zhang-J et al. BiochemJ. 1999 v.337 S.231, Ledbetter et al. J.Biol.Chem. 1994 v.269 S.31544, KoIIs et al. Anal.Biochem. 1993 v.208 S.264, Decraene et al. Biotechniques 1999 v.27 S.962).

Einführung einer Primerbindungsstelle in das NSKF.

Die Primerbindungsstelle (PBS) ist ein Sequenzabschnitt, der eine selektive Bindung des Primers an das NSKF ermöglichen soll.

In einer Ausführungsform können die Primerbindungsstellen unterschiedlich sein, so dass mehrere unterschiedlche Primer verwendet werden müssen. In diesem Fall können bestimmte Sequenzabschnitte der Gesamtsequez als natürliche PBSs für spezifische Primer dienen. Diese Ausführungsform ist besonders für die Untersuchung bereits bekannter SNP- Stellen geeignet.

In einer anderen Ausführungsform ist es aus Gründen der Vereinfachung der Analyse günstig, wenn eine einheitliche Primerbindungsstelle in allen NSKFs vorhanden ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Primerbindungsstellen daher in die NSKFs extra eingeführt. Auf diese Weise können Primer mit einheitlicher Struktur für die Reaktion eingesetzt werden.

Im folgenden wird diese Ausführungsform detailliert beschrieben.

Die Zusammensetzung der Primerbindungsstelle ist nicht eingeschränkt. Ihre Länge beträgt vorzugsweise zwischen 20 und 50 NTs. Die Primerbindungsstelle kann eine funktionelle Gruppe zur Immobilisation des NSKF tragen. Diese funktionelle Gruppe kann z.B. eine Biotingruppe sein.

Als Beispiel für die Einführung einer einheitlichen Primerbindungsstelle werden im folgenden die Ligation und das Nukleotid-Tailing an DNA-Fragmente beschrieben.

a) Ligation:

Dabei wird ein doppelsträngiger Oligonukleotidkomplex mit einer Primerbindungsstelle verwendet. Dieser wird mit kommerziell erhältlichen Ligasen an die DNA-Fragmente ligiert ("Molecular cloning" 1989 J.Sambrook et al. CoId Spring Harbor Laborotary Press). Es ist wichtig, dass nur eine einzige Primerbindungsstelle an das DNA-Fragment ligiert wird. Das erreicht man z.B. durch eine Modifikation einer Seite des Oligonukleotidkomplexes an beiden Strängen. Die modifizierenden Gruppen am Oligonukleotidkompex können zur Immobilisation dienen. Die Synthese und die Modifikation eines solchen Oligonukleotidkomplexes kann nach standardisierten Vorschriften durchgeführt werden. Zur Synthese kann z.B. der DNA-Synthesizer 380 A Applied Biosystems verwendet werden. Oligonucleotide mit einer bestimmten Zusammensetzung mit oder ohne Modifikationen sind aber auch als Auftragssynthese kommerziell erhältlich, z.B. von MWG-Biotech GmbH, Germany.

b) Nukleotid-Tailing:

Statt der Ligation mit einem Oligonukleotid kann man mit einer terminalen Deoxynucleotidyltransferase mehrere (z.B. zwischen 10 und 20) Nukleosid-monophosphate an das 3'-Ende eines ss-DNA-Fragments anknüpfen ("Molecular cloning" 1989 J.Sambrook et al. CoId Spring Harbor Laborotary Press, "Method in Enzymology" 1999 v.303, S.37-38), z.B. mehrere Guanosin-Monophosphate ((G)n-Tailing genannt). Das entstehende Fragment wird zur Bindung des Primers, in diesem Beispiel eines (C)n-Primers, verwendet.

Einzelstrang-Vorbereitung

Für die Sequenzierungsreaktion werden einzelsträngige NSKFs benötigt. Falls das Ausgangsmaterial in doppelsträngiger Form vorliegt, gibt es mehrere Möglichkeiten, aus doppelsträngiger DNA eine einzelsträngige Form zu erzeugen (z.B. Hitze-Denaturierung oder Alkali-Denaturierung) ("Molecular cloning" 1989 J.Sambrook et al. CoId Spring Harbor Laborotary Press).

Primer für die Sequenzierungsreaktion

Dieser hat die Funktion, den Start an einer einzigen Stelle des NSKF zu ermöglichen. Er bindet an die Primerbindungsstelle im NSKF. Die Zusammensetzung und die Länge des Pri- mers sind nicht eingeschränkt. Außer der Startfunktion kann der Primer auch andere Funktionen übernehmen, wie z.B. eine Verbindung zur Reaktionsoberfläche zu schaffen. Primer sollten so an die Länge und Zusammensetzung der Primerbindungsstelle angepaßt

werden, dass der Primer den Start der Sequenzierungsreaktion mit der jeweiligen Polymerase ermöglicht.

Bei der Verwendung unterschiedlicher, beispielsweise natürlich in der ursprünglichen Gesamtsequenz vorkommender Primerbindungsstellen, werden die für die jeweilige Primerbindungsstelle sequenzspezifischen Primer verwendet. In diesem Fall wird für die Sequenzierung ein Primergemisch eingesetzt.

Bei einer einheitlichen, beispielsweise durch die Ligation an die NSKFs angekoppelten Primerbindungsstelle wird ein einheitlicher Primer verwendet.

Vorzugsweise beträgt die Länge des Primers zwischen 6 und 100 NTs, optimalerweise zwischen 15 und 30 NTs. Der Primer kann eine Funktionsgruppe tragen, die zur Immobilisierung des NSKF dient, beispielsweise ist eine solche Funktionsgruppe eine Biotingruppe (s. Abschnitt Immobilisierung). Sie soll die Sequenzierung nicht stören. Die Synthese eines solchen Primers kann z.B. mit dem DNA-Synthesizer 380 A Applied Biosystems ausgeführt werden oder aber als Auftragssynthese bei einem kommerziellen Anbieter, z.B. MWG-Biotech GmbH, Germany erstellt werden).

Der Primer wird in einer Ausführungsform auf der Oberfläche fixiert, wie in dieser Anmeldung beschrieben ist. Der Primer oder das Primergemisch wird mit NSKFs unter Hybridisierungsbedingungen inkubiert, die ihn selektiv an die Primerbindungsstelle des NSKF binden lassen. Diese Primer-Hybridisierung (Annealing) kann vor (1), während (2) oder nach (3) der Bindung der NSKFs an die Oberfläche erfolgen. Die Optimierung der Hybridisierungsbedingungen hängt von der genauen Struktur der Primerbindungsstelle und des Primers ab und läßt sich nach Rychlik et al. NAR 1990 v.18 S.6409 berechnen. Im folgenden werden diese Hybridisierungsbedingungen als standardisierte Hybridisierungsbedingungen bezeichnet.

Falls eine für alle NSKFs gemeinsame Primerbindungsstelle mit bekannter Struktur beispielsweise durch Ligation eigeführt wird, können Primer mit einheitlicher Struktur eingesetzt werden. Die Primerbindungsstelle kann an ihrem 3'-Ende eine funktionelle Gruppe tragen, die z.B. zur Immobilisation dient. Beispielsweise ist diese Gruppe eine Biotin-Gruppe. Der Primer hat eine zur Primerbindungsstelle komplementäre Struktur. Fixierung von NSKF-Primer-Komplexe an die Oberfläche (Bindung bzw. Immobilisierung von NSKFs).

Ziel der Fixierung (Immobilisierung) ist es, NSKF-Primer-Komplexe auf einer geeigneten planen Oberfläche in einer Art und Weise zu fixieren, dass eine zyklische enzymatische Sequenzierungsreaktion ablaufen kann. Dies kann beispielsweise durch Bindung des Primers (s.o.) oder des NSKF an die Oberfläche erfolgen.

Die Reihenfolge der Schritte bei der Fixierung von NSKF-Primer-Komplexen kann variabel sein: l)Die NSKF-Primer-Komplexe können zunächst in einer Lösung durch Hybridisierung

(Annealing) gebildet und anschließend an die Oberfläche gebunden werden. 2)Primer können zunächst auf einer Oberfläche gebunden werden und NSKFs anschließend an die gebundenen Primer hybridisiert werden, wobei NSKF-Primer- Komplexe entstehen (NSKFs indirekt an die Oberfläche gebunden) 3)Die NSKFs können zunächst an die Oberfläche gebunden werden (NSKFs direkt an die Oberfläche gebunden) und im anschließenden Schritt die Primer an die gebundenen NSKFs hybridisiert werden, wobei NSKF-Primer-Komplexe enstehen.

Die Immobilisierung der NSKFs an die Oberfläche kann daher durch direkte oder indirekte Bindung erfolgen.

Falls die Fixierung der NSKF-Primer-Komplexe auf der Oberfläche über die NSKFs erfolgt, kann dies beispielsweise durch die Bindung der NSKFs an einem der beiden Ketten-Enden erfolgen. Dies kann durch entsprechende kovalente, affine oder andere Bindungen erreicht werden. Beispiele für Fixierung von Nukleinsäureketten sind bekannt (McGaII et al. US Pat.

Nr. 5412087, Nikiforov et al. US Pat. Nr. 5610287, Barrett et al. US Pat. Nr. 5482867,

Mirzabekov et al. US Patent 5981734, "Microarray biochip technology" 2000 M.Schena Eaton Publishing, "DNA Microarrays" 1999 M. Schena Oxford University Press, Rasmussen et al. Analytical Biochemistry v.198, S.138, Allemand et al. Biophysical Journal 1997, v.73,

S.2064, Trabesinger et al. Analytical Chemistry 1999, v.71, S.279, Osborne et al. Analytical

Chemistry 2000, v.72, S.3678, Timofeev et al. Nucleic Acid Research (NAR) 1996, v.24

S.3142, Ghosh et al. NAR 1987 v.15 S.5353, Gingeras et al. NAR 1987 v.15 S.5373, Maskos et al. NAR 1992 v.20 S.1679).

Nachdem die Primer-Matrize-Komplexe vorbereitet sind, wird eine zyklische Reaktion gestartet. Dabei werden die modifizierten Nuk-Makromoleküle eingesetzt. Die Reaktion verläuft in mehreren Zyklen:

• Inkubation von mindestens einer Art der modifizierten Nuk-Makromoleküle nach Aspekten 1 bis 25 zusammen mit einer Art der Polymerase nach Aspekt 31 mit den in Schritten a und b bereitgestellten NSK-Primer-Komplexen unter Bedingungen, die den Einbau von komplementären modifizierten Nuk-Makromolekülen zulassen, wobei jede Art der modifizierten Nuk-Makromoleküle eine für sie charakteristische

Markierung besitzt.

• Entfernung der nicht eingebauten modifizierten Nuk-Makromoleküle von den NSK- Primer-Komplexen

• Detektion der Signale von in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen

• Entfernung der Linker-Komponente, des sterisch anspruchsvollen Liganden sowie der Marker-Komponente von den in die NSK-Primer-Komplexe eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen

• Waschen der NSK-Primer-Komplexe

Diese Schritte können mehrmals wiederholt werden, so dass aus der Reihenfolge der detektierten Signale von eingebauten Nukleotid-Analoga die komplementäre Sequenz der Matrize rekonstruiert werden kann. Die Wiederholung kann beispielsweise 1 bis 2, 2 bis 5, 5 bis 10, 10 bis 20, 20 bis 30, 30 bis 50, 50 bis 100, 100 bis 2000 mal durchgeführt werden.

Die Inkubationszeiten in einem Zyklus werden so gewählt, dass die Polymerasen an mehr als 50% der an der Sequenzierungsreaktion beteiligten NSKFs (extensionsfähige NSKF- Primer-Komplexe) in einem Zyklus ein markiertes modifiziertes Nuk-Makromolekül einbauen können, vorzugsweise an mehr als 90%.

Die farbigen Kodierungsschema für modifizierte Nuk-Makromoleküle können unterschiedlich sein : Einen Zyklus kann man durchführen mit:

a) vier verschieden markierten modifizierten Nuk-Makromolekülen b) zwei verschieden markierten modifizierten Nuk-Makromolekülen c) einem markierten modifizierten Nuk-Makromolekülen d) zwei verschieden markierten modifizierten Nuk-Makromolekülen und zwei unmarkierten modifizierten Nuk-Makromolekülen,

d.h.

a) Man kann alle 4 modifizierte Nuk-Makromoleküle mit verschiedenen Farbstoffen markieren und alle 4 gleichzeitig in die Reaktion einsetzten. Dabei erreicht man die Sequenzierung einer Nukleinsäurekette mit einer minimalen Anzahl von Zyklen. Diese Variante der Erfindung stellt allerdings hohe Anforderungen an das Detektionssystem : 4 verschiedene Farbstoffsignale müssen in jedem Zyklus identifiziert werden.

b) Zur Vereinfachung der Detektion kann eine Markierung mit zwei Farbstoffen gewählt werden. Dabei werden 2 Paare von modifizierten IMuk-Makromolekülen gebildet, die jeweils verschieden markiert sind, z.B. A und G tragen die Markierung "X", C und U tragen die Markierung "Y". In die Reaktion in einem Zyklus (n) werden 2 unterschiedlich markierte Nukleotid-Analoga gleichzeitig eingesetzt, z.B. C * in Kombination mit A * , und im darauffolgenden Zyklus (n+1) werden dann U * und G * zugegeben.

c) Man kann auch nur einen einzigen Farbstoff zur Markierung aller 4 modifizierte Nuk-Makromoleküle verwenden und pro Zyklus nur ein modifiziertes Nuk-Makromolekül einsetzen.

Zyklen, in denen modifizierte Nuk-Makromoleküle (im Sinne dieser Anmeldung) eingesetzt werden, können sich mit Zyklen abwechseln, in denen nicht modifizierte Nukleotide eingesetzt werden.

Beispielsweise werden zunächst 5 bis 500 zyklische Schritte mit modifizierten Nuk- Makromolekülen durchgeführt, anschließend 1 bis 500 zyklische Schritte mit nicht modifizierten Nukleotiden (z.B. mit natürlich vorkommenden Nukleotiden, dATP, dGTP, dTTP, dCTP oder mit deren Analoga, wie dUTP, dITP oder mit anderen Nukleotid- Analoga, die keinen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden tragen), daraufhin wiederum 10 bis 500 Schritte mit modifizierten Nuk-Makromolekülen usw.

Die Reihnfolge der zugegebenen Nukleotide und die Zykluszahl können variieren. Die Kombinationsmöglichkeiten für Einsatz von modifizierten Nuk-Makromolekülen und die Zykluszahlen wurden oben bereits besprochen (s. Farbiges Kodierungsschema). Die nicht modifizierten Nukleotide können ebenfalls jeweils einzeln, zu zweit oder zudritt zusammen mit einer entsprechenden Polymerase unter Bedingungen, die Extension von Primer-Matrize-Komplexen erlauben, zugegeben werden. Durch limitierte Substrazzufuhr wird eine schrittweise ablaufende Primer-Verlängerung ermöglicht. Es können mehrere Zyklen mit jeweils unterschiedlicher Zusammensetzung von natürlichen Nukleotiden durchgeführt werden, beispielsweise in einem Zyklus werden dATP, dGTP und dCTP zugegeben, im weiteren Zyklus werden dATP, dGTP und dTTP zugegeben, im noch weiteren Zyklus werden dCTP, dGTP und dTTP zugegeben. Weitere Kombinationen sind

nahe liegend. Auch alle 4 natürliche Nukleotide können eingesetzt werden, vorausgesetzt, eins davon wird in einer limitierten oder stark verringerten Konzentration zugegeben.

5 Die Zahl der Abwechselungen zwischen den einzelnen Zyklen mit modifizierten und nicht modifizierten Nukleotiden schließt Bereiche von 2 bis 500.

Der Einsatz von Kombinationen aus Schritten mit modifizierten Nuk-Makromolekülen und nicht modifizierten Nukleotiden bietet die Möglichkeit, längere Bereiche der Matrize ohne

10 Verbrauch von reversibel terminierenden Nukleotiden zu überwinden. Dies kann, z.B. von Vorteil sein, wenn ein Primer aus technischen Gründen (z.B. wegen höherer Spezifität) relativ weit von dem zu sequenzierenden Bereich der Matrize hybridisiert wird. Ein weiteres Beispiel für die Einsatzmöglichkeit dieser Ausführungsform des Sequenzierverfahrens ist ein Screening von mRNA- oder cDNA-Molekülen auf

15 Vollständigkeit: die Identifizierung von Exons kann durch die Sequenzierung von relativ kurzen Fragmenten erreicht werden, die überwindung von für die Analyse irrelevanten Abschnitten kann durch Einbau von natürlichen Nukleotiden erfolgen.

Insgesamt schließt die Anzahl der zyklischen Schritte, in denen reversibel terminierende 2.0 Nukleotid-Analoga mit einem makromolekularen sterischen Hindernis eingesetzt werden, den Bereich zwischen 2 und 10000 ein.

In einer Ausführungsform schließt ein solchen Verfahren folgende Chrakteristika ein: Die Einbaureaktion von NT-Makromolekülen erfolgt gleichzeitig an einer Population

.5 unterschiedlicher, an der festen Phase fixierter Nukleinsäuremoleküle, wobei diese Nukleinsäuremoleküle in einer zufälligen Anordnung an die feste Phase gebunden sind (Tcherkassov WO 02088382). Bei diesem Verfahren werden Sequenzen von einzelnen Nukleinsäurekettenmolekülen ermittelt. Die an der enzymatischen Reaktion teilnehmende Primer-Nukleinsäurekomplexe sind in einer Dichte fixiert, die die

50 Detektion der Signale von einzelnen modifizierten Nuk-Makromolekülen ermöglicht, die an ein einzelnes Nukleinsäure-Molekül gekoppelt sind, wobei die Dichte der fixierten Primer oder Nukleinsäuren wesentlich höher liegen kann. Beispielsweise beträgt die Dichte der an der Einbaureaktion teilnehmenden Primer-Nukleinsäurekomplexe von 1 bis 10 Komplexe auf 10μm 2 , von 1 bis 10 Komplexe auf lOOμm 2 , von 1 bis 10 Komplexe auf

55 lOOOμm 2 , von 1 bis 10 Komplexe auf lO.OOOμm 2 .

Beispiele der Fixierung der Nukleinsäuren an die feste Phase mit einer Auflösung, die Analysen an einzelnen Molekülen erlaubt sind in WO0157248, US Pat. 2003064398, US

Pat.2003013101 und WO 02088382 dargestellt. Eine passende Detektionsapparatur ist in der Anmeldung WO 03031947 beschrieben.

Die Zahl der parallel zu analysierenden einzelnen Nukleinsäuremoleküle liegt beispielsweise zwischen 1000 und 100.000, 10.000 bis 1.000.000, 100.000 bis

100.000.000 Moleküle. Wobei die Marker-Komponente oder ihre einzelnen Komponenten mit oder ohne Linker- Komponente des modifizierten Nuk-Makromoleküls während der Einbaureaktion oder nach der Einbaureaktion von der Nuk- Komponente abgetrennt wird.. Dieses Verfahren zur parallelen Sequenzanalyse von Nukleinsäuresequenzen (Nukleinsäureketten, NSKs) schließt folgende Schritte ein, man :

- Fragmente (NSKFs) einzelsträngiger NSKs mit einer Länge von etwa 50 bis 1000 Nukleotiden erzeugt, die überlappende Teilsequenzen einer Gesamtsequenz darstellen können, man

- die NSKFs unter Verwendung eines einheitlichen oder mehrerer unterschiedlichen Primer in Form von NSKF-Primer-Komplexen auf einer Reaktionsoberfläche in einer zufälligen Anordnung bindet, wobei die Dichte der an die Oberfläche gebudenen NSKF-Primer-Komplexen eine optische Detektion der Signale von einzelnen eingebauten modifizierten Nuk-Makromolekülen zuläßt, man

- eine zyklische Aufbaureaktion des komplementären Stranges der NSKFs unter Verwendung einer oder mehrerer Polymerasen durchführt, indem man

a) zu den auf der Oberfläche gebundenen NSKF-Primer-Komplexen eine Lösung zugibt, die zumindest eine oder mehrere Polymerasen und ein bis vier modifizierte Nuk-Makromoleküle enthält, die eine mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte Marker-Komponente haben, wobei die bei gleichzeitiger Verwendung von mindestens zwei modifizierte Nuk-Makromoleküle jeweils an die Marker-

Komponente befindlichen Fluoreszenzfarbstoffe so gewählt sind, dass sich die verwendeten modifizierten Nuk-Makromoleküle durch Messung unterschiedlicher Fluoreszenzsignale voneinander unterscheiden lassen, wobei die modifizierten Nuk-Makromoleküle einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden einschließen, wobei die Linker-Komponente mit der

Marker-Komponente und dem makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden abspaltbar sind, man

b) die in Stufe a) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen inkubiert, die zur Verlängerung der komplementären Stränge geeignet sind, wobei die komplementären Stränge jeweils um ein modifiziertes Nuk-Makromolekül verlängert werden, man

c) die in Stufe b) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung nicht in einen komplementären Strang eingebauter modifizierter Nuk-Makromoleküle geeignet sind, man

d) die einzelnen, in komplementäre Stränge eingebauten modifizierten Nuk-Makromoleküle durch Messen des für den jeweiligen Fluoreszenzfarbstoff charakteristischen Signals detektiert, wobei man gleichzeitig die relative Position der einzelnen Fluoreszenzsignale auf der Reaktionsoberfläche bestimmt, man

e) zur Erzeugung unmarkierter (NTs oder) NSKFs die Linker-Komponente und die Marker-Komponente von den am komplementären Strang angefügten

Nuk-Komponenten abspaltet, man

f) die in Stufe e) erhaltene stationäre Phase unter Bedingungen wäscht, die zur Entfernung der Marker-Komponente geeignet sind, man

die Stufen a) bis f) gegebenenfalls mehrfach wiederholt,

wobei man die relative Position einzelner NSKF-Primer-Komplexe auf der Reaktionsoberfläche und die Sequenz dieser NSKFs durch spezifische Zuordnung der in Stufe d) in aufeinanderfolgenden Zyklen an den jeweiligen Positionen detektierten Fluoreszenzsignale zu den modifizierten Nuk-Makromolekülen bestimmt.

Beispiel 17 Vorbereitung der Reaktionsoberfläche

Oberfläche und Reaktionsoberfläche sind vorliegend als gleichwertige Begriffe aufzufassen, außer wenn explizit auf eine andere Bedeutung hingewiesen wird. Als Reaktionsoberfläche dient die Oberfläche einer festen Phase eines beliebigen Materials. Dieses Material ist vorzugsweise enzymatischen Reaktionen gegenüber inert und verursacht keine Störungen der Detektion. Silicon, Glas, Keramik, Kunststoff (z.B. Polycarbonate oder Polystyrole),

Metall (Gold, Silber, oder Alluminium) oder beliebiges anderes Material, das diesen funktionellen Anforderungen genügt, kann verwendet werden. Vorzugsweise ist die

Oberfläche nicht verformbar, denn sonst ist mit einer Verzerrung der Signale bei der wiederholten Detektion zu rechnen.

Die verschiedenen Zyklusschritte erfordern einen Austausch der unterschiedlichen Reaktionslösungen über der Oberfläche. Die Reaktionsoberfläche ist vorzugsweise Bestandteil eines Reaktionsgefäßes. Das Reaktionsgefäß ist wiederum vorzugsweise Bestandteil einer Reaktionsapparatur mit Durchflußvorrichtung. Die Durchflußvorrichtung ermöglicht einen Austausch der Lösungen im Reaktionsgefäß. Der Austausch kann mit einer durch einen Computer gesteuerten Pumpvorrichtung oder manuell erfolgen. Wichtig dabei ist, dass die Oberfläche nicht austrocknet. Vorzugsweise beträgt das Volumen des Reaktionsgefäßes weniger als 50 μl. Idealerweise beträgt sein Volumen weniger als 5 μl.

Falls die Fixierung der NSKF-Primer-Komplexe auf der Oberfläche über die NSKFs erfolgt, kann dies beispielsweise durch die Bindung der NSKFs an einem der beiden Ketten-Enden erfolgen. Dies kann durch entsprechende kovalente, affine oder andere Bindungen erreicht werden (DE 102004025745). Es sind viele weitere Beispiele der Immobilisierung von Nukleinsäuren bekannt (McGaII et al. US Patent 5412087, Nikiforov et al. US Patent 5610287, Barrett et al. US Patent 5482867, Mirzabekov et al. US Patent 5981734, "Microarray biochip technology" 2000 M.Schena Eaton Publishing, "DNA Microarrays" 1999 M. Schena Oxford University Press, Rasmussen et al. Analytical Biochemistry v.198, S.138, Allemand et al. Biophysical Journal 1997, v.73, S.2064, Trabesinger et al. Analytical Chemistry 1999, v.71, S.279, Osborne et al. Analytical Chemistry 2000, v.72, S.3678, Timofeev et al. Nucleic Acid Research (NAR) 1996, v.24 S.3142, Ghosh et al. NAR 1987 v.15 S.5353, Gingeras et al. NAR 1987 v.15 S.5373, Maskos et al. NAR 1992 v.20 S.1679).

Die Fixierung kann auch durch eine unspezifische Bindung, wie z.B. durch Austrocknung der NSKFs enthaltenden Probe auf der planen Oberfläche erreicht werden.

Die NSKFs werden auf der Oberfläche beispielsweise in einer Dichte zwischen 10 und 100 5 NSKFs pro 100 μm 2 , 100 bis 10.000 pro 100 μm 2 , 10.000 bis 1.000.000 pro lOOμm 2 gebunden.

Die für die Detektion notwendige Dichte von extensionsfähigen NSKF-Primer-Komplexen beträgt in einer Ausführungsform ca. 1 bis 100 pro 100 μm 2 . Sie kann vor, während oder 10 nach der Hybridisierung der Primer an die NSKFs erreicht werden.

Beispielhaft werden im folgenden einige Methoden zur Bindung von NSKF-Primer- Komplexen näher dargestellt: In einer Ausführungsform erfolgt die Immobilisierung der NSKFs über Biotin-Avidin oder Biotin-Streptavidin-Bindung. Dabei wird Avidin oder

15 Streptavidin auf der Oberfläche kovalent gebunden, das 5'-Ende des Primers enthält Biotin. Nach der Hybridisierung der markierten Primer mit den NSKFs (in Lösung) werden diese auf der mit Avidin/Streptavidin beschichteten Oberfläche fixiert. Die Konzentration der mit Biotin markierten Hybridisierungs-Produkte sowie die Zeit der Inkubation dieser Lösung mit der Oberfläche wird so gewählt, dass eine für die Sequenzierung geeignete Dichte bereits in

ZO diesem Schritt erreicht wird.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die für die Sequenzierungsreaktion geeigneten Primer vor der Sequenzierungsreaktion auf der Oberfläche mit geeigneten Methoden fixiert (s.o.). Die einzelsträngigen NSKFs mit jeweils einer Primerbindungsstelle

15 pro NSKF werden damit unter Hybridisierungsbedingungen inkubiert (Annealing). Dabei binden sie an die fixierten Primer und werden dadurch gebunden (indirekte Bindung), wobei Primer-NSKF-Komplexe entstehen. Die Konzentration der einzelsträngigen NSKFs und die Hybridisierungsbedingungen werden so gewählt, dass man eine für die Sequenzierung geeignete Immobilisationsdichte von 1 bis 100 extensionsfähigen NSKF-Primer-

50 Komplexen pro 100 μm 2 erreicht. Nach der Hybridisierung werden ungebundene NSKFs durch einen Waschschritt entfernt. Bei dieser Ausführungsform wird eine Oberfläche mit einer hohen Primerdichte bevorzugt, z.B. ca. 1.000.000 Primer pro lOOμm 2 oder noch höher, da die gewünschte Dichte an NSKF-Primer-Komplexen schneller erreicht wird, wobei die NSKFs nur an einen Teil der Primer binden.

)5

In einer anderen Ausführungsform werden die NSKFs an die Oberfläche direkt gebunden (s.o.) und anschließend mit Primern unter Hybridisierungsbedingungen inkubiert. Bei einer Dichte von ca. 1 bis 100 NSKFs pro lOOμm 2 wird man versuchen alle verfügbaren NSKFs

mit einem Primer zu versehen und für die Sequenzierugnsreaktion verfügbar zu machen. Dies kann z.B. durch hohe Primerkonzentration, beispielsweise 1 bis 100 mmol/l, erreicht werden. Bei einer höheren Dichte der fixierten NSKFs auf der Oberfläche, beispielsweise 10.000 bis 1.000.000 pro lOOμm 2 , kann die für die optische Detektion notwendige Dichte der NSKF-Primer-Komplexe während der Primer-Hybridisierung erreicht werden. Dabei sind die Hybridisierungsbedingungen (z.B. Temperatur, Zeit, Puffer, Primerkonzentration) so zu wählen, dass die Primer nur an einen Teil der immobilisierten NSKFs binden.

Falls eine gelartige feste Phase (Oberfläche eines Gels) verwendet wird, so kann dieses Gel z.B. ein Agarose- oder Polyacrylamidgei sein (DE 101 49 786). Durch die Bindung der NSKF-Primer-Komplexe auf der Oberfläche ist die Detektion der Fluoreszenzsignale von eingebauten Nukleotid-Analoga möglich. Das Gel ist vorzugsweise auf einer festen Unterlage befestigt. Diese feste Unterlage kann Silicon, Glas, Keramik, Kunststoff (z.B. Polycarbonate oder Polystyrole), Metall (Gold, Silber, oder Alluminium) oder beliebiges anderes Material sein. Für Beispiele der Vorbereitung der festen Unterlage siehe DE 102004025746 .

Weitere Beispiele für Herstellung einer Reaktionsoberfläche sind bekannt (US2005244863, EP1105529)

Die Reatkionsoberfläche kann als eine kontinuierliche Oberfläche oder als diskontinuierliche, aus einzelnen kleinen Bestandteilen zusammengesetzte Oberfläche hergestellt werden(z.B. Primer-Matrizenkomplexe können an Agarose-Kügelchen oder Dextran-Kügelchen gebunden werden). Die Dichte der Kügelchen auf der Oberfläche liegt beispielsweise in folgenden Bereichen zwischen 1 und 10 pro 100 μm 2 , 10 und 100 pro 100 μm 2 , 100 bis 10.000 pro 100 μm 2 , 10.000 bis 1.000.000 pro lOOμm 2 .

Die Reaktionsoberfläche muß groß genug sein, um die notwendige Anzahl der NSKFs bei entsprechender Dichte immobilisieren zu können. Die Reaktionsoberfläche sollte vorzugsweise nicht größer als 20 cm 2 sein.

Falls die Oberfläche einer festen Phase (z.B. Silikon oder Glas) zur Immobilisation verwendet wird, kann sie beispielsweise nach DE 102004025745 vorbereitet werden.

Die Detektion kann erfolgen wie in WO02088382 oder DE10246005 beschrieben.

Die Analyse von Nukleinsäuren kann unterschiedliche Fragestellungen einschließen :

(Am Beispiel der Sequenzanalyse mit vier gleich markierten modifizierten Nuk- Makromolekülen)

3A. Rekonstruktion der ursprünglichen Sequenzen nach dem Schrotschuß-Prinzip ("Automated DNA sequencing and analysis" S. 231 ff. 1994 M. Adams et al. Academic

Press, Huang et al. Genom Res. 1999 v.9 S.868, Huang Genomics 1996 v.33 S.21, Bonfield et al. NAR 1995 v.23 S.4992, Miller et al. J.Comput.Biol. 1994 v.l S.257). (Dieses Prinzip ist insbesondere bei der Analyse neuer, unbekannter Sequenzen geeignet.)

3A-1 Sequenzierung eines langen DNA-Stücks

Im folgenden soll anhand der Sequenzierung eines IMb langen DNA-Stückes schematisch die Sequenzierung langer Nukleinsäureketten dargestellt werden. Der Sequenzierung liegt das Shotgun-Prinzip zugrunde ("Automated DNA sequencing and analysis" S. 231 ff. 1994 M. Adams et al. Academic Press, Huang et al. Genom Res. 1999 v.9 S.868, Huang Genomics 1996 v.33 S.21, Bonfield et al. NAR 1995 v.23 S.4992, Miller et al. J.Comput.Biol. 1994 v.l S.257). Das zu analysierende Material wird für die Sequenzierungsreaktion vorbereitet, indem es in Fragmente von vorzugsweise 50 bis 1000 bp Länge zerlegt wird. Jedes Fragment wird anschließend mit einer Primerbindungsstelle und einem Primer versehen. Dieses Gemisch aus verschiedenen DNA-Fragmenten wird nun auf einer planen Oberfläche fixiert. Die nicht gebundenen DNA-Fragmente werden durch einen Waschschritt entfernt. Danach wird die Sequenzierungsreaktion an der gesamten Reaktionsoberfläche durchgeführt. Zur Rekonstruktion einer 1 Mb langen DNA-Sequenz sollten die Sequenzen von

NSKFs durchschnittlich von etwa 100 NTs lang sein.

Insgesamt ist zur Rekonstruktion der ursprünglichen Sequenz die etwa 10- bis 100- fache Menge an Rohsequenzen erforderlich. Die ermittelten NSKF-Sequenzen stellen eine Population von überlappenden

Teilsequenzen dar, die sich mit kommerziell erhältlichen Programmen zur Gesamtsequenz der NSK zusammenfügen lassen ("Automated DNA sequencing and analysis" S. 231 ff. 1994 M. Adams et al. Academic Press , Huang et al. Genom Res. 1999 v.9 S.868, Huang Genomics 1996 v.33 S.21, Bonfield et al. NAR 1995 v.23 S.4992, Miller et al. J.Comput.Biol. 1994 v. l S.257).

A-2 Sequenzierung der Genprodukte am Beispiel der cDNA-Sequenzierung

In einer bevorzugten Ausführungsform können statt einer Sequenz mehrere Sequenzen in einem Ansatz analysiert werden. Die ursprünglichen Sequenzen können aus den gewonnen Rohdaten z.B. nach dem Schrotschuß-Prinzip rekonstruiert werden.

Zunächst werden NSKFs erzeugt. Man kann z.B. mRNA in eine doppelsträngige cDNA überführen und diese cDNA mit Ultraschall fragmentieren. Anschließend werden diese NSKFs mit einer Primerbindungsstelle versehen, denaturiert, immobilisiert und mit einem Primer hybridisiert. Zu beachten ist bei dieser Variante der Probenvorbereitung, dass die cDNA-Moleküle unvollständige mRNA-Sequenzen darstellen können (Method in Enzymology 1999, v.303, S.19 und andere Artikel in diesem Band, "cDNA library protocols" 1997 Humana Press).

Eine andere Möglichkeit bei der Generierung einzelsträngiger NSKFs von mRNA besteht in der reversen Transkription der mRNA mit randomisierten Primern. Dabei werden viele relativ kurze antisense DNA-Fragmente gebildet (Zhang-J et al. Biochem.J. 1999 v.337 S.231, Ledbetter et al. J.Biol.Chem. 1994 v.269 S.31544, KoIIs et al. Anal.Biochem. 1993 v.208 S.264, Decraene et al. Biotechniques 1999 v.27 S.962). Diese Fragmente können anschließend mit einer Primerbindungstelle versehen werden (s.o). Weitere Schritte entsprechen oben beschriebenen Vorgängen.

Mit dieser Methode können komplette mRNA-Sequenzen (vom 5 1 - bis zum 3'-Ende) analysiert werden, da die randomisierten Primer über die gesamte Länge der mRNA binden.

Immobilisierte NSKFs werden mit einer der oben angeführten Ausführungsformen der

Sequenzierung analysiert.

Die Anzahl der NSKFs, die analysiert werden müssen, errechnet sich nach denselben Prinzipien wie bei einer Schrotschuß-Rekonstruktion einer langen Sequenz.

Aus NSKF-Sequenzen werden nach den Prinzipien des Schrotschuß-Verfahrens die ursprünglichen Gensequenzen rekonstruiert.

Diese Methode erlaubt die gleichzeitige Sequenzierung von vielen mRNAs ohne vorherige Klonierung.

Analyse von Sequenzvarianten

Die Bestätigung einer bereits bekannten Sequenz oder der Nachweis von Varianten dieser Sequenz stellt sehr viel geringere Ansprüche an die Länge und Redundanz der ermittelten NSKF-Sequenzen. Auch die Sequenzbearbeitung ist in diesem Fall einfacher. Die Vollsequenz braucht nicht neu rekonstruiert zu werden. Die NSKF- 5 Sequenzen werden vielmehr mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Programms der

Vollsequenz zugeordnet und eventuelle Abweichungen detektiert. Einem solchen Programm kann z.B. BLAST oder FASTA Algorithmus zugrunde liegen ("Introduction to computational Biology" 1995 M. S. Waterman Chapman & Hall).

10 Die zu analysierende Sequenz wird mit einer der oben genannten Methoden in NSKFs überführt. Diese NSKFs werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sequenziert, wobei man sowohl einen einheitlichen Primer und eine einheitlihe Primerbindungsstelle als auch unterschiedliche, sequenzspezifische Primer und natürliche, in der zu untersuchenden Gesamtsequenz vorkommende

L5 Primerbindngsstellen verwenden kann. Anschließend werden die ermittelten

Sequenzen von NSKFs nicht nach dem Schrotschuß-Verfahren zusammengestzt, sondern mit der Referenzsequenz verglichen und auf diese Weise ihren Positionen in der Vollsequenz zugeordnet. Dabei kann es sich um genomische oder cDNA- Sequenzen handeln.

>0

Im Gegensatz zu einer Rekonstruktion nach dem Schrotschuß-Verfahren braucht man für die Analyse einer Sequenzvariante erheblich weniger Rohsequenzdaten. So kann die 5- bis 10- fache Rohsequenzmenge ausreichend für die Wiederherstellung einer neuen Variante einer Vollsequenz sein. Mit dem Schrotschuß-Verfahren wird für eine

15 Wiederherstellung eine 10- bis 100-fache Menge an Rohsequenzen benötigt

("Automated DNA sequencing and analysis" S. 231 ff. 1994 M. Adams et al. Academic Press, Huang et al. Genom Res. 1999 v.9 S.868, Huang Genomics 1996 v.33 S.21, Bonfield et al. NAR 1995 v.23 S.4992, Miller et al. J.Comput.Biol. 1994 v.l S.257).

iθ Die Länge der ermittelten NSKF-Sequenzen soll für eine eindeutige Zuordnung zu einer bestimmten Position in der Referenzsequenz ausreichend sein, so können z.B bereits Sequenzen mit einer Länge von 20 NTs (z.B. aus nicht repetitiven Abschnitten im menschlichen Genom) eindeutig identifiziert werden. Für die Vergleichsanalyse der repetitiven Abschnitte werden längere Sequenzen benötigt. Die genaue Länge der

>5 Sequenzen hängt dabei von der Aufgabenstellung ab. Vorzugsweise beträgt die Länge der ermittelten NSKF-Sequenzen bei der Analyse von nicht repetitiven Abschnitten mehr als 20 NTs. Für die Analyse der repetitiven Abschnitte liegt sie vorzugsweise über 500 NTs.

Die ermittelte Gesamtsequenzlänge kann dabei aus Abschnitten bestehen, in denen jedes Nukleotid sequenziert wurde und Abschnitten, wo nicht markierte Nukleotide in bekannten Kombinationen zugegeben wurden, so dass eine kalkulierte Primer- Extension stattgefunden hat.

Die Zielsetzungen bei der Sequenzierung neuer Varianten einer bereits bekannten Vollsequenz können sehr unterschiedlich sein. Meist wird ein Vergleich der neu ermittelten Sequenz mit der bekannten Vollsequenz/Referenzsequenz angestrebt. Dabei können die beiden Sequenzen aus evolutionär unterschiedlich weit auseinanderliegenden Spezies stammen. Verschiedene Parameter der Zusammensetzung dieser beiden Sequenzen können verglichen werden. Als Beispiele für eine solche Analyse dienen: Mutations- oder Polymorphismusanalysen und die Analyse von alternativ gespleißten Genprodukten.

Nachfolgend soll schematisch und beispielhaft ein Vergleich der zu untersuchenden Sequenz mit einer Referenzsequenz ohne vorherige Rekonstruktion der zu analysierenden Sequenz betrachtet werden. Ein solcher Vergleich kann z.B. zur Mutations- oder SNP-Analyse dienen.

B-1

Eine lange, zu analysierende Sequenz, z.B. 1 Mb, wird in NSKFs mit einer der oben genannten Methode geteilt. Diese NSKFs werden unter Verwendung einheitlicher Primer mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sequenziert. Die ermittelten

Sequenzen von jedem einzelnen NSKF werden direkt mit der Referenzsequenz verglichen. Die Referenzsequenz dient dabei als Grundlage für die Zuordnung ermittelter NSKF-Sequenzen, so dass die aufwendige Rekonstruktion nach dem Schrotschuß-Verfahren entfällt. Vorzugsweise beträgt die Länge der ermittelten NSKF-Sequenzen bei der Analyse von nicht-repetitiven Abschnitten mehr als 20 NTs.

Für die Analyse der repetitiven Abschnitte liegt sie vorzugsweise über 500 NTs. Die Anzahl der zu analysierenden NSKFs richtet sich dabei nach der Gesamtlänge der zu untersuchenden Sequenz, der durchschnittlichen Länge der NSKF-Sequenzen und der notwendigen Genauigkeit der Sequenzierung . Bei einer durchschnittlichen Länge der ermittelten NSKF-Sequenz von 100 NTs, einer Gesamtlänge der zu untersuchenden

Sequenz von 1 Mb und einer Genauigkeit, die der Rohsequenzermittlung entspricht (d.h. jede Stelle soll möglichst nur einmal sequenziert werden) benötigt man z.B. die ca. 5-fache Menge an Rohsequenzen, d.h. 5 Mb, weil die Verteilung der NSKFs über

die Gesamtsequenz zufällig erfolgt. Insgesamt müssen 50.000 NSKFs analysiert werden, um mehr als 99% der Gesamtstrecke abzudecken.

Anschließend werden die ermittelten NSKF-Sequenzen mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Programms der Vollsequenz zugeordnet und eventuelle Abweichungen detektiert. Einem solchen Programm kann z.B. BLAST oder FASTA Algorithmus zugrunde liegen ("Introduction to computational Biology" 1995 M. S. Waterman Chapman &. Hall).

Beispiel 18

Zusammensetzung von Kit für Sequenzierung von Nukleinsäuren.

Generell, ein oder mehrere Kits schließen Komponenten (z.B. Einzelsubstanzen,

Kompositionen, Reaktionsgemische) ein, die für die Durchführung von enzymatischen

Einbaureaktionen mit erfindungsgemäßen modifizierten Nuk-Makromolekülen notwendig sind.

Die Zusammensetzung der Kits kann nach Anwendung variieren, wobei die Anwendugen können von einfacher Primer-Extensionsreaktion bis zu zyklischen Sequenzierung reichen auf Einzelmolekülebene reichen.

Beispielsweise Kits, die für zyklische Sequenzierung verwendet werden, können Polymerasen, modifizierte Nuk-Makromoleküle sowie Lösungen für die zyklischen Schritte einschließen.

Die Kits können wahlweise positive und / oder negative Kontrollen einschließen,

Anleitungen zur Durchführung von Verfahren.

Optional können Kits Materialien und Reagentien zur Vorbereitung von Bestandteilen des Kits zur biochemischen Reaktionen oder des genetischen Materials einschließen, z.B. feste Phase für Material-Präparation, feste Phase für Polymerase-Applikation,

Ultrafiltrationsmembran für Umpufferung von modifizierten Nuk-Makromolekülen.

Die Kit-Komponenten sind üblicherweise in handelsüblichen Reaktionsgefäßen bereitgestellt, wobei das Volumen der Gefäße zwischen 0,2 ml und 1 I variieren kann. Es können auch Gefäßarrays, z.B. Mikrotiter-Platten mit Komponenten beladen sein, was eine automatische Zufuhr von Reagentien ermöglicht.

Ein Kit kann folgende Komponenten einschließen: • Eine oder mehrere Polymerasen aus folgender Liste: Klenow Fragment Polymerase,

Klenow exo minus Fragment, T7 DNA Polymerase, Sequenase 2™, Taq Polymerase, Vent™ Polymerase, Deep Vent™ Polymerase, Vent™ exo minus DNA Polymerase, Deep Vent™ exo minus DNA Polymerase, Pwo DNA Polymerase, reverse

Transcriptasen, z.B. Moloney Murine Lekemia Virus (M-MLV), Rous Sarcoma Virus (RSV), Avian Myeloblastosis Virus (AMV), Rous Assocciated Virus (RAV), Myeloblastosis Assocciated Virus (MAV), Human Immunodeficiency Virus (HIV). Die Polymerasen werden vorzugsweise in einer Aufbewahrungslösung bereitgestellt, Diese Aufbewahrungslösung kann beispielsweise folgende Substanzen einschließen: o Puffer Tris-HCI, HEPES, Borat, Phosphat, Acetat (Konzentration liegen beispielsweise zwischen 10 mM und 200 mM) o Salze, z.B. NaCI, KCl, NH4CI, die Konzentrationen liegen beispielsweise zwischen 10 mM und 500 mM. o PEG oder anderes inertes Polymer, z.B. Mowiol in Konzentration von 1 bis

50% (w/v) o Glycerin in Konzentration zwischen 1% und 70% o Reduzierende Agentien, z.B, DTT in Konzentration zwischen 0,1 und 50 mM o Weitere Substanzen können in einer Aufbewahrungslösung enthalten sein, die zur Stabilität des Enzyms beitragen. Bespiele für solche Substanzen sind bekannt, siehe Beschriebung von Produkten von Enzym-Herstellern, z.B. Promega, Invitrogen, Roche usw.

• modifizierten Nuk-Makromoleküle (Nukleotid-Analoga), die als Säure oder als Salze vorliegen können (beisielsweise Natrium, Kalium, Ammonium oder Litium können als Ionen verwendet werden). Die modifizierten Nuk-Makromoleküle können in trockender Form oder in Form einer Lösung bereitgestellt werden, z.B. im Wasser oder in einem Puffer, z.B. Tris-HCI, HEPES, Borat, Phosphat, Acetat, oder in einer Aufbewahrungslösung, die folgende Komponenten einzeln oder in Kombination einschließen kann: o Puffer Tris-HCI, HEPES, Borat, Phosphat, Acetat (in Konzentration die beispielsweise zwischen 10 mM und 200 mM liegt) o Salze, z.B. NaCI, KCl, NH4CI, MgCI2, o PEG oder anderes inertes Polymer, z.B. Mowiol in Konzentration von 1 bis

20% (w/v) o Glycerin in Konzentration zwischen 1% und 50% o Marker oder Marker-Einheiten von modifizierten Nuk-Makromolekülen, insbesondere in den Ausführungsformen, in denen zwischen Linker und Marker oder Marker und Kore-Komponente affine Kopplung besteht.

• Buffer-Kompositionen für enzymatische Reaktion, Spaltung, Blockade, Detektion,

Waschschritte:

o Spaltungsreagentien, bereitgestellt z.B. als Konzentrierte gepufferte Lösung. Z.B. DTT oder TCEP in Ausführungsformen, in denen der Linker eine spaltbare Disulfid-Brücke einschließt.

o Modifizierende Reagentien bereitgestellt z.B. als Konzentrierte gepufferte

Lösung. Z.B. Iodacetamid oder Iodacetat für Ausführungsformen, in denen der Linker eine Mercaptogruppe nach der Spaltung hat.

o Detektionsreagentien, Signalgebende Marker-Einheiten (für Ausführungsform, in der Marker von modifizierten Nuk-Makromolekülen eine signalvermittelnde

Funktion hat),

■ Beispielsweise schließen modifizierte Nuk-Makromoleküle ein oder mehrere Biotinmoleküle ein. In diesem Fall können z.B. signalgebende Streptavidin-Konjugate (siehe Abschnitt signalgebende

Marker-Einheiten) an solche modifizierten Nuk-Makromoleküle vor dem Detektionsschritt gebunden werden.

Beispielsweise schließen modifizierte Nuk-Makromoleküle Streptavidin ein, das noch freie Valenzen für die Bindung von Biotin aufweist. In diesem Fall können biotin-tragende Strukturen (siehe Abschnitt signalgebende Marker-Einheiten) an das modifizierte Nuk- Makromolekül ebenfalls vor dem Detektionsschritt gebunden werden.

o Blockierungsreagentien: zur Unterdrückung von unsepzifischen Adsorption von modifizierten Nuk-Makromolekülen an die Oberflächen der festen Phase, können wahlweise verschiedene Substanzen, z.B. acetyliertes BSA oder PEG 2000 bis PEG 10.000 oder Mowiol oder ähnliche Polymere (verhalten sich gegenüber der enzymatischen Reaktion neutral) im Kit enthalten sein.

• Vorrichtung und Mittel zur Vorbereitung von modifizierten Nuk-Makromolekülen für die Sequenzierungsreaktion. Die Nukleotidanaloga mit makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden können vor dem Gebrauch durch Ultrafiltration vom Aufbewahrungspuffer gereinigt werden. Dafür eignen sich z.B. Ultrafiltrationsvorreichtungen mit MWCO von 50.000 Da (erhältlich z.B. von Millipore oder Sigma-Aldrich). Damit kann nicht nur der Aufbewahrungspuffer sondern auch die eventuell vorliegenden Zerfallsprodukte entfernt werden. Nach der einmaligen

Zentrifugation werden die modifizierten Nuk-Makromoleküle im frisch angesetzten Einbaupuffer aufgelöst.

• Mittel zur Vorbereitung von Polymerasen für die Sequenzierungsreaktion.

5 Optionall können Polymerasen von der Hersteller-Lösung befreit werden.

Beispielsweise, kann die Reinigung der Polymerasen durch Absorption an die mit Nukleinsäuren belandenen paramagnetischen Teilchen erfolgen (z.B. Oligonucleotide gebunden an Streptavidin belandene paramagnetische Kügelchen, Promega). Nach der Bindung von Polymerasen an die Nukleinsäuren wird die feste Phase mit

10 Einbaupuffer gewaschen. Die Applikation der Polymerasen in die Reaktion kann entweder direkt mit der festen Phase erfolgen oder die Polymerasen können von der festen Phase bei höherer Salzkonzentration freigesetzt werden. Anstatt fon Bindung an die Nukleinsäuren kann auch die Bindung an einen Anionenaustauscher, z.B. DEAE-Zellulose erfolgen (Batch-Isolierungsmethode zur Umpufferung von

15 Proteinen). Auch eine Gel-filtration (z.B. mit Sephadex 25) oder eine Ultrafiltration kann zur Umpufferung eingesetzt werden. Einem Fachmann sollten weitere Methoden zum Pufferwechsel nahe liegend erscheinen.

• Nukeltide ohne makromolekularen sterischen Hindernis (z.B. dATP, dGTP, dCTP, 2.O dTTP, dUTP, dITP) oder irreversible Terminatoren (z.B. ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP, ddUTP)

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Kit zur Durchführung des Verfahrens der Sequenzierung von Nukleinsäureketten, das eine Reaktionsoberfläche, zur

-5 Durchführung des Verfahrens erforderliche Reaktionslösungen, eine oder mehrere

Polymerasen, und modifizierte Nuk-Makromoleküle enthält, von denen ein bis vier mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, wobei die modifizierten Nuk-Makromoleküle ferner strukturell so modifiziert sind , dass die Polymerase nach Einbau eines solchen modifizierten Nuk-Makromoleküls in einen wachsenden komplementären Strang nicht in

50 der Lage ist, ein weiteres modifiziertes Nuk-Makromolekül in denselben Strang einzubauen, wobei der Marker abspaltbar ist und die strukturelle Modifikation ein abspaltbarer makromolekularer sterisch anspruchsvoller Ligand ist. Bei den Nukleotiden handelt es sich vorzugsweise um die oben genannten erfindungsgemäßen modifizierten Nuk-Makromoleküle.

$5

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung enthält das Kit ferner zur Erzeugung von Einzelsträngen aus Doppelsträngen erforderliche Reagenzien, einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle, die als PBS in die NSKFs eingeführt werden,

Oligonukleotid-Primer, zur Abspaltung der Fluoreszenzfarbstoffe und sterisch anspruchsvollen Liganden erforderliche Reagenzien und/oder Waschlösungen.

Alle Publikationen, Patente und Patentanmeldungen, die hier zitiert wurden, sind 5 eingebaut in diese Anmeldung in vollem Umfang (auch wenn dies bei jeweiliger Publikation nicht expliziert genannt wurde) und unterliegen laut USPTO den Regelungen für „incorporated by reference" für alle Zwecke in den USA.

Legenden für Figuren:

10 Fig. 8

A) schematische Darstellung einer Polymerase

• DNA-bindender Bereich (1) der Polymerase (Bindung von Primer und Matrize)

• Das aktive Zentrum der Polymerase zur Kopplung von Nukleotiden an den Primer

• Nukleotidbindender Bereich der Polymerase L5

B) Schematische Darstellung eines extensionsfähigen Komplexes aus Polymerase- Primer-Matrize: Matrize-Primer (4)

C) Schematische Darstellung des Komplexes mit einem eingebauten Nukleotid im 10 aktiven Zentrum

• Ein an den Primer gekoppeltes nicht modifiziertes Nukleosid-Monophosphat (5)

• Freie nicht modifizierte Nukleosidtriphosphate (6)

Das eingebaute Nukleotid trägt keine Modifizierung. Freie Nukleotide haben einen ungehinderten Zugang zum nukleotidbindenden Bereich der Polymerase 15 Fig. 9

Schematische Darstellung des Komplexes mit einem eingebauten Nukleotid im aktiven Zentrum

• Ein an den Primer gekoppeltes modifiziertes Nuk-Makromolekül (7).

• freie modifizierte Nuk-Makromoleküle (8) (schematische Darstellung der 10 Nukleiotid-Komponente, des Linkers und des sterisch anspruchsvollen Liganden).

Das eingebaute modifizierte Nuk-Makromolekül trägt einen makromolekularen sterisch anspruchsvollen Ligand. Freie modifizierte Nuk-Makromoleküle haben keinen freien Zugang zum nukleotidbindenen Zentrum der Polymerase. Der sterisch anspruchsvolle Ligand lässt keinen weiteren Liganden in die Nähe dieses >5 Zentrums der Polymerase. Bei einer entsprechend gewählten Linker-Länge zwischen der Nukleotid-Einheit und dem sterischen Liganden kann kein weiteres modifiziertes Nuk-Makromolekül eingebaut werden. Der Linker ist schematisch im gestreckten Zustand in voller Länge gezeigt.

Fig. 10

A) Schematische Darstellung des Primer-Matrize-Komplexes mit einer eingebauten Nukleotid-Komponente im aktiven Zentrum • Der sterisch anspruchsvolle Ligand des modifizierten Nuk-Makromoleküls beansprucht einen Raum in unmittelbarer Nähe der Polymerase. Die Linien (9) zeigen schematisch den beanspruchten Raum.

B) änderung der räumlichen Verhätnisse um die Polymerase herum, beispielsweise durch Bindung weiterer Proteine an die DNA oder Polymerase, kann eventuell zu notwendigen änderungen in der Linker-Länge zwischen der Nukleotid- Komponente und dem sterischen Hindernis führen.

Fig. 11 Schematische Darstellung des Primer-Matrize-Komplexes mit einer eingebauten

Nukleotid-Komponente im aktiven Zentrum

• Je länger der Linker zwischen der Nukleotid-Komponente und dem makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden ist, desto größerer sterisch anspruchsvolle Ligand für die Hinderung der weiteren Synthese sein sollte. Die kleineren Liganden können ihre Wirkung mit der zunehmenden Linker-Länge zwischen der Nukleotid-Komponente und dem makromolekularen sterisch anspruchsvollen Liganden verlieren.

• Potenzieller sterisch anspruchsvoller Ligand (10), der einen hemmenden Effekt auf die Synthese hat.

Fig. 20

Abbildung von Signalen von zyklischen Schritten in Beispiel 15

Spur 1 : Leiter (dC-Analog (obere Bande) und Oligonukleotid-3, markiert mit Cy3-

Farbstoff am 3 ' -Ende (untere Bande) Spur 2 = Probe 1 (Kontrolle der unspezifischen Bindung von dC-Analog an die feste Phase)

Spur 3 = Probe 2 (Einbau des l .dC-Analogs)

Spur 4 = Abspaltung von sterisch anspruchsvollen Liganden mit Markern

Spur 5 = Probe 2 (Einbau des 2.dC-Analogs) Spur 6 = Abspaltung von sterisch anspruchsvollen Liganden mit Markern

Spur 7 = Probe 2 (Einbau des 3.dC-Analogs)