DOMAINE TECHNIQUE

La présente invention concerne une matrice composite utile pour favoriser l'innervation, l’ostéogenèse et l’angiogenèse.

ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE

L’équipe des inventeurs (Silva et al, Cell Death and Disease, 2017 Dec 13 ;8( 12) :3209; Leroux et al., Cell Commun Signal. 2020 Oct 19; 18(1): 162) a démontré, à l’aide de modèles de co-cultures de neurones sensoriels, de cellules mésenchymateuses et de cellules endothéliales, l’impact de la communication entre ces trois types cellulaires et l'importance du dialogue neurovasculaire sur l’ostéogénèse. Forte de ces observations, cette équipe a développé un hydrogel à base de peptides d'élastine, capable de stimuler le recrutement de fibres nerveuses (Paiva dos Santos et al., Acta Biomaterialia, 2019 Nov; 99: 154-167; PCT/EP2019/055075), notamment des neurones sensoriels, et d'héberger d'autres types cellules. C'est toujours dans ce contexte que les inventeurs ont cherché à améliorer différentes propriétés dudit hydrogel, notamment sur le plan de l'homogénéité de colonisation cellulaire et de l'augmentation de la biodégradabilité du matériau, et proposent une matrice composite biocompatible, injectable, capable de stimuler l'innervation, la vascularisation de tissus et de présenter des propriétés ostéogéniques pour une application en ingénierie osseuse.

RESUME DE L'INVENTION

Les inventeurs ont développé un nouveau matériau composite comprenant une phase organique et une phase minérale. Ce matériau est biocompatible, injectable, capable de stimuler l'innervation, la vascularisation de tissus et de présenter des propriétés ostéogéniques pour une application en ingénierie osseuse. L'invention se rapporte plus particulièrement à une matrice composite associant une phase organique fonctionnalisée par des peptides bioactifs et une phase minérale comprenant du phosphate de calcium, la matrice composite selon l'invention selon l'invention est capable de recruter les neurones sensoriels et d'héberger des cellules ostéoformatrices et endothéliales.

DESCRIPTION DETAILLEE

La matrice composite selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend une phase organique comprenant un peptide de type élastine, au moins un peptide bioactif et une phase minérale comprenant du phosphate de calcium. 1. Peptides de type élastine

Le premier composant de la matrice composite selon l'invention est un peptide de type élastine (ou ELP pour Elastin-Like Polypeptide en anglais) comprenant au moins un résidu méthionine alcénylé avant formation de la matrice composite. Ce type de peptides, leur procédé de fabrication par génie génétique, et leur purification sont connus de l'homme du métier qui peut notamment se référer à la demande internationale WO2017021334 et aux articles Petitdemange et al. (Biomacromolecules. 2017 Feb 13 ; 18(2):544-550) et Petitdemange et al. (Bioconjug Chem. 2017 May 17;28(5): 1403-1412). L'homme du métier pourra aussi se référer aux exemples présentés ci-dessous pour la production de l'ELP désigné ELPM80.

Dans le cadre de la présente invention, le terme "résidu méthionine alcénylé" signifie que la chaîne latérale du résidu méthionine est liée de manière covalente à un groupement comprenant un groupe alcène, c'est-à-dire comprenant au moins une double liaison entre deux atomes de carbone. De manière préférée, le terme "groupe alcène" se réfère à la présence d'un groupe -CH=CH2 dans le groupement hé au résidu méthionine. Selon un mode particulier de réalisation, le groupement méthionine est lié au groupement de formule (I):

Selon un mode de réalisation, la synthèse d'un ELP alcénylé au moyen du groupement de formule (I) peut être réalisée par thioalkylation chimiosélective au niveau de chaînes latérales méthionines en utilisant un éther d'allyle et glycidyle selon la procédure décrite dans Petitdemange et al. (Bioconjug Chem. 2017 May 17;28(5): 1403-1412). L'homme du métier pourra notamment se référer aux exemples de la présente demande pour mettre en œuvre une thioalkylation du peptide ELP désigné ELPM80.

Selon un mode de réalisation, l'ELP alcénylé mis en œuvre dans le cadre de la présente invention comprend au moins une occurrence de la séquence d'acides aminés VPGMG dans laquelle le résidu méthionine est alcénylé.

Selon un mode particulier de réalisation, l'ELP alcénylé utilisé pour produire la matrice composite selon l'invention est un ELP de haut poids moléculaire, notamment supérieur à 20 kDa.

Dans un mode de réalisation, l'ELP alcénylé a une structure de formule (II) Z-[VPGXG] _n (II) dans laquelle:

Z est un peptide comprenant entre 1 et 20 acides aminés;

X représente un résidu glycine, un résidu valine ou un résidu méthionine alcénylé, notamment un résidu méthionine alcénylé de formule (III): n est un nombre entier compris entre 40 et 160, de manière encore plus particulière entre 60 et 100, plus particulièrement entre 70 et 90; et dans laquelle le rapport entre le ratio molaire valine / méthionine alcénylée en position X est compris entre 0: 1 et 10: 1, plus particulièrement entre 1 : 1 et 5 : 1 , en particulier entre 2 : 1 et 4 : 1 , ledit ratio étant plus particulièrement de 3 : 1.

Selon un mode de réalisation, X représente un résidu glycine ou un résidu méthionine alcénylé, notamment un résidu méthionine alcénylé de formule (III). Selon un autre mode de réalisation, préféré, X représente un résidu valine ou un résidu méthionine alcénylé, notamment un résidu méthionine alcénylé de formule (III).

Selon un mode de réalisation, n est un nombre entier compris entre 60 et 100, en particulier entre 70 et 90, plus particulièrement entre 76 et 84, n étant plus particulièrement égal à 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 ou 84. Plus particulièrement, n est égal à 80.

Selon un mode particulier de réalisation, Z est un peptide dont le résidu d'acide aminé à l'extrémité amino-terminale est une méthionine. Selon un autre mode de réalisation, les acides aminés compris dans Z immédiatement en amont du motif [VPGXG] _n correspondent au dipeptide MW. Z peut notamment être constitué du dipeptide MW ou comprendre ce dipeptide. Selon un mode particulier de réalisation, Z consiste en le dipeptide MW.

Selon un mode de réalisation, l'ELP employé est un peptide de formule Z-[VPGXG] _n dans laquelle le rapport entre le ratio molaire valine / méthionine alcénylée en position X est compris entre 1 : 1 et 5 : 1 , en particulier entre 2 : 1 et 4 : 1 , ledit ratio étant plus particulièrement de 3 : 1. Selon un autre mode de réalisation l'ELP employé est un peptide de formule Z- [(VPGVG)(VPGMG)(VPGVG) ₂ ] _X , en particulier MW[(VPGVG)(VPGMG)(VPGVG) ₂ ] _X dans laquelle x est un nombre entier compris entre 15 et 25, notamment entre 19 et 21, x étant plus particulièrement égal à 20.

Selon un mode de réalisation, l'ELP employé est dérivé du peptide MW[(VPGVG)(VPGMG)(VPGVG) ₂ ] ₂ O (ELPM80) décrit dans les exemples, ledit peptide comprenant au moins un résidu méthionine alcénylé. Selon un autre mode particulier de réalisation l'ELP employé est de formule MW[(VPGVG)(VPGMaG)(VPGVG) ₂ ] ₂ o (ELPM(alcène)-80) décrit dans les exemples, où Ma représente le résidu méthionine alcénylé de formule (III) ci-dessus.

Selon un mode particulier de réalisation, la matrice composite selon l'invention comprend de 0, 1 à 99,9 % (p/v) d'ELP. Selon un autre mode particulier de réalisation, pour une matrice composite de concentration comprise entre 3 et 5% (p/v) et pour un ratio thiol :alcène 1: 1, ladite matrice comprend de 1 à 4 % (p/v) d'ELP, notamment d'ELPM80.

2. Peptides bioactifs

La matrice composite peut également comprendre des peptides bioactifs. Les peptides bioactifs sont capables de remplir une fonction biologique lorsque la matrice composite est implantée dans un tissu ou organe d'un sujet. Un tel peptide bioactif peut notamment être un peptide d'adhésion, capable de lier une cellule d'intérêt, ou un peptide permettant la fixation du calcium.

Ces peptides bioactifs inclus dans la matrice composite de l'invention peuvent comprendre des résidus cystéine à chacune de leurs extrémités. Les résidus cystéines peuvent être liés de manière covalente directement à la séquence d’acides aminés du peptide, ou par l’intermédiaire d’espaceurs, notamment un espaceur peptidique ou pseudopeptidique. L’espaceur peut notamment être un acide aminé ou une séquence d’acides aminés (notamment un di- ou tripeptide), notamment un acide aminé bêta, plus particulièrement un acide aminé bêta-Ala.

Selon un mode particulier de réalisation, la quantité de peptides bioactifs dans la matrice composite selon l'invention est comprise entre 99,9 et 0,1 % (p/v). Selon un autre mode particulier de réalisation, pour une matrice composite de concentration comprise entre 3 et 5% (p/v) et pour un ratio thiol :alcène 1: 1, ladite matrice comprend de 0,1 à 3 % (p/v) du au moins un peptide bioactif.

2.1. Peptide d'adhésion Une première catégorie de peptides bioactifs susceptibles d'être utilisés dans la matrice composite de l'invention sont les peptides d'adhésion, capables de recruter des cellules neuronales, des cellules mésenchymateuses et/ou endothéliales. On peut notamment citer à titre de peptides capables de recruter des cellules endothéliales les peptides dérivés de la laminine, de la fibronectine ou du collagène de type I, plus particulièrement de la laminine. Ainsi, les peptides d'adhésion peuvent être choisis parmi les peptides REDV, RGD et GRGDSP dérivés de la fibronectine, IKLLI, IKVAV, PDSGR et YIGSR, dérivés de la laminine, et le peptide DGEA dérivé du collagène de type I. A titre de peptides capables de recruter des cellules neuronales, nous pouvons citer, notamment, les peptides YIGSR, RNIAEIIKDI et IKVAV dérivés de la laminine.

Dans un mode préféré de réalisation, la matrice composite comprend au moins un peptide d'adhésion choisi parmi IKVAV et YIGSR.

Selon un mode particulier de réalisation, le peptide d'adhésion et un peptide IKVAV. Le peptide IKVAV peut notamment être un peptide IKVAV de formule Cys-{espaceur}-Ile-Lys-Val-Ala-Val- {espaceur}-Cys, notamment le peptide de formule Cys-{Beta-Ala}-Ile-Lys-Val-Ala-Val-{Beta-Ala}- Cys.

Selon un autre mode particulier de réalisation, le peptide d'adhésion et un peptide YIGSR. Le peptide YIGSR peut notamment être un peptide YIGSR de formule Cys-{espaceur}-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg- {espaceur}-Cys, notamment le peptide de formule Cys-{Beta-Ala}- Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-{Beta-Ala}- Cys.

Selon un mode de réalisation encore plus préféré, la matrice composite comprend le peptide IKVAV et le peptide YIGSR.

Selon une variante préférée de réalisation, et ce afin d'optimiser et contrôler la réticulation de la matrice composite, cette dernière comprend un peptide d'adhésion unique comprenant au moins deux peptides d'adhésion, notamment un peptide biomimétique comprenant les peptides d'adhésion IKVAV et YIGSR. Les peptides composant le peptide d'adhésion unique peuvent être inclus dans n'importe quel ordre. Selon une variante de réalisation, le peptide d'adhésion unique comprend, de la partie amino-terminale à la partie carboxy-terminale, les peptides YIGSR et IKVAV. Selon une variante de réalisation, préférée, le peptide d'adhésion unique comprend, de la partie amino-terminale à la partie carboxy-terminale, les peptides IKVAV et YIGSR. Le peptide d'adhésion unique peut comprendre des résidus cystéine à chacune de ses extrémités. Les résidus cystéines peuvent être liés de manière covalente directement à la séquence d’acides aminés du peptide d'adhésion unique, ou par l’intermédiaire d’espaceurs, notamment un espaceur peptidique ou pseudopeptidique. L’espaceur peut notamment être un acide aminé ou une séquence d’acides aminés (notamment un di- ou tripeptide), notamment un acide aminé bêta, plus particulièrement un acide aminé bêta-Ala. Par ailleurs, les peptides composant le peptide d'adhésion unique peuvent être liés de manière covalente directement entre eux ou par l'intermédiaire d'espaceurs. L'espaceur entre les peptides composant le peptide d'adhésion unique peut notamment être un espaceur peptidique ou pseudopeptidique, notamment un acide aminé glycine, une diglycine ou une triglycine.

En outre, le peptide d'adhésion unique comprenant au moins deux peptides d'adhésion peut également avantageusement inclure une ou plusieurs séquence(s) cible(s) d'une ou plusieurs métalloprotéases, notamment des métalloprotéases 2 et 9. A titre illustratif, nous pouvons citer les peptides:

- PVGLIG;

- les peptides QPQGLAK, GPLGLSLGK et GPLGMHGK décrits dans Jha et al., Biomaterials, mai 2016; 89; p. 136-47; et

- les peptides GPQGIAGQ, GPQGIWGQ et VPMSMRGG décrits dans Lin et al., Acta Biomaterialia, 10(12), Décembre 2014, p. 5106-5115.

Un tel peptide cible de métalloprotéases peut être introduit afin de permettre le clivage entre les peptides d'adhésion, qui restent liés à la matrice de l'invention tout en étant disponibles pour l'adhésion aux cellules. Par ailleurs, un peptide cible de métalloprotéases peut être utile pour déclencher une dégradation de la matrice, facilitant ainsi la colonisation cellulaire. Un peptide cible de métalloprotéase peut être inclus dans le peptide d'adhésion unique en toute position, notamment à son extrémité amino-terminale, entre deux peptides d'adhésion compris dans le peptide d'adhésion unique, ou à son extrémité carboxy-terminale. De préférence, le ou les peptides cibles de métalloprotéase (s) sont positionnés entre deux peptides d'adhésion dans le peptide d'adhésion unique.

Selon un mode particulier de réalisation le peptide d'adhésion unique inclus au moins une occurrence, en particulier une seule occurrence, de la séquence cible des métalloprotéases 2 et 9 PVGLIG.

Selon un mode particulier de réalisation, la matrice composite comprend un peptide d'adhésion unique comprenant les peptides IKVAV, PVGLIG et YIGSR. Selon un mode particulier de réalisation, ledit peptide d'adhésion unique est de formule:

IKVAV(espaceur)PVGLIG(espaceur) YIGSR;

YIGSR(espaceur)PVGLIG(espaceur) IKVAV ;

PVGLIG(espaceur)YIGSR(espaceur)IKVAV;

PVGLIG(espaceur)IKVAV(espaceur) YIGSR;

IKVAV(espaceur)YIGSR(espaceur)PVGLIG; ou

YIGSR(espaceur)IKVAV(espaceur)PVGLIG. De préférence, le peptide d'adhésion unique est de formule IKVAV(espaceur)PVGLIG(espaceur)YIGSR.

Les espaceurs désignés "(espaceur)" dans les séquences uniques listées ci-dessus peuvent être de séquence identiques ou différents, notamment identiques. En particulier, un espaceur peut être choisi parmi un résidu glycine, un dipeptide diglycine ou un tripeptide triglycine.

Selon une variante de réalisation, ledit peptide d'adhésion unique est de formule:

IKVAV-GGG-PVGLIG-GGG-YIGSR;

YIGSR-GGG-PVGLIG-GGG- IKVAV;

PVGLIG-GGG-YIGSR-GGG-IKVAV;

PVGLIG-GGG-IKVAV-GGG-YIGSR;

IKVAV-GGG-YIGSR-GGG-PVGLIG; ou

YIGSR-GGG-IKVAV-GGG-PVGLI.

De préférence, ledit peptide d'adhésion unique est de formule IKVAV-GGG-PVGLIG-GGG-YIGSR.

Avant réticulation et formation de la matrice composite, le peptide permettant l'introduction du peptide unique dans ladite matrice composite peut être de formule: CpA-IKVAV(espaceur)PVGLIG(espaceur)YIGSR- PAC;

CpA-YIGSR(espaceur)PVGLIG(espaceur) IKVAV- PAC;

CpA-PVGLIG(espaceur)YIGSR(espaceur)IKVAV- PAC;

CpA-PVGLIG(espaceur)IKVAV(espaceur)YIGSR- PAC;

CpA-IKVAV(espaceur)YIGSR(espaceur)PVGLIG- PAC; ou CpA-YIGSR(espaceur)IKVAV(espaceur)PVGLIG- PAC.

De préférence, avant réticulation et formation de la matrice composite, le peptide permettant l'introduction du peptide unique dans ledit hydrogel peut être de formule CpA- IKVA V (e spaceur)PV GLIG(espaceur) YIGSR- PAC .

Dans un mode préféré de réalisation, avant réticulation et formation de la matrice composite, le peptide permettant l'introduction du peptide unique dans ladite matrice composite est de formule: CPA-IKVAV-GGG-PVGLIG-GGG-YIGSR-PAC;

CPA-YIGSR-GGG-PVGLIG-GGG- IKVAV-pAC;

CPA-PVGLIG-GGG-YIGSR-GGG-IKVAV-PAC;

CPA-PVGLIG-GGG-IKVAV-GGG-YIGSR-PAC; C(3A-IKVAV-GGG-YIGSR-GGG-PVGLIG-(3AC; ou

CPA-YIGSR-GGG-IKVAV-GGG-PVGLIG-PAC.

De manière particulièrement préférée, le peptide avant réticulation et formation de la matrice composite, le peptide permettant l'introduction du peptide unique dans ladite matrice composite est de formule CpA-IKVAV-GGG-PVGLIG-GGG-YIGSR- PAC.

Selon un mode particulier de réalisation, la quantité de peptide permettant l'introduction du peptide unique dans la matrice composite selon l'invention est comprise entre 99,9 et 0,1 % (p/v). Selon la composition du peptide unique, et la présence d'autres peptides bioactifs, et pour une concentration de matrice composite donnée l'homme du métier sera bien entendu en capacité d'ajuster la quantité du peptide unique.

2.2. Peptides capables d'induire la nucléation de phosphate de calcium

Les peptides capables d'induire la nucléation de phosphate de calcium constituent une deuxième catégorie de peptides bioactifs susceptible d'être introduits dans la matrice composite selon l'invention. Les expériences présentées ci-dessous montrent que dans une matrice composite selon l'invention, la rétention et l'homogénéité de distribution du phosphate de calcium sont améliorées en présence d'un tel peptide capable d'induire la nucléation de phosphate de calcium. Il est notamment montré que, de manière inattendue, en présence du peptide SNA 15 environ 10 fois plus de particules d'hydroxyapatite sont retrouvées dans les matrices, ce qui peut se traduire avantageusement sur les propriétés ostéoconductrices et/ou ostéoinductrices, des matrices composites

Pour les besoins de la formation de la matrice composite, ils peuvent être inclus dans un peptide unique comprenant par ailleurs au moins un peptide d'adhésion, ou constituer un peptide indépendant. Selon un mode préféré de réalisation, le peptide capable d'induire la nucléation de phosphate de calcium est un peptide qui n'est pas lié à un peptide d'adhésion, avant formation de la matrice composite.

A titre illustratif, nous pouvons citer parmi les peptides capables d'induire la nucléation de phosphate de calcium:

- les peptides dérivés de la stathérine, notamment DDDEEKFLRRIGRFG (SNA 15), et les analogues de SNA15, plus particulièrement les peptides DSSEEKFLRRIGRFG (SNS15) et EFLRRIGRFG (SN11) décrit dans Raj et al. JBC, volume 267(9), 25 mars 1992, Pages 5968-5976;

- le peptide DHTKE (Sun et al. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2017 65 (44), 9782-9789);

- le peptide SSSEEIVPN (Meisel et al. Biol Chem Hoppe Seyler. décembre 1988;369( 12): 1275-9); - le peptide DEGEQPRPFPFP (Lv et al. Food Chemistry, Volume 141(3), 2013, Pages 1645-1650);

- le peptide WEWLHYW (Charoenphun et al. Eur Food Res Technol 236, 57-63 (2013));

- le peptide DGDDGEAGKIG (Chen et al. Journal of Functional Foods, Volume 6, 2014, Pages 575- 584);

- le peptide GPAGPHGPPG (Guo et al. Food Chemistry, Volume 173, 2015, Pages 536-542);

- le peptide VLSGGTTMYASLYAG (Jung et al. Eur Food Res Technol 224, 763-767 (2007));

- le peptide TCH (Huang et al. Eur Food Res Technol 232, 281-287 (2011));

- le peptide VLGYIQIR. (Hou et al. Food Chemistry, Volume 243, 2018, Pages 389-395); et

- le peptide DNLPNPEDNKNYQ (Choi et al. Food Sci Biotechnol 21, 1663-1667 (2012))

Selon un mode préféré de réalisation, le peptide capable d'induire la nucléation de phosphate de calcium et un peptide dérivé de la stathérine, plus particulièrement un analogue de SNA 15, encore plus particulièrement un peptide choisi parmi SNA15, SNS15 et SN11. De préférence, le peptide capable d'induire la nucléation de phosphate de calcium est le peptide SNA15.

Le peptide capable d'induire la nucléation de phosphate de calcium peut comprendre des résidus cystéine à chacune de ses extrémités. Les résidus cystéines peuvent être liés de manière covalente directement à la séquence d’acides aminés du peptide, ou par l’intermédiaire d’espaceurs, notamment un espaceur peptidique ou pseudopeptidique. L’espaceur peut notamment être un acide aminé ou une séquence d’acides aminés (notamment un di- ou tripeptide), notamment un acide aminé bêta, plus particulièrement un acide aminé bêta-Ala. Selon un mode préféré de réalisation, avant réticulation et formation de l'hydrogel, le peptide permettant l'introduction du peptide capable d'induire la nucléation de phosphate de calcium dans la matrice composite de l'invention peut être de formule CpA- DDDEEKFLRRIGRFG-PAC.

Selon un mode particulier de réalisation, la quantité de peptide capable d'induire la nucléation de phosphate de calcium dans la matrice composite selon l'invention est comprise entre 99,9 et 0,1 % (p/v). Comme nous le notions ci -dessus, selon un mode particulier de réalisation, pour une matrice composite de concentration comprise entre 3 et 5% (p/v) et pour un ratio thiobalcène 1: 1, ladite matrice peut notamment comprendre de 0, 1 à 3 % (p/v) du au moins un peptide bioactif.

3. Phosphate de calcium

La matrice composite selon l'invention comprend en outre une phase minérale comprenant du phosphate de calcium. A titre illustratif, nous pouvons citer le phosphate de calcium sous forme d'apatite, de tri-calcium phosphate, de bi-calcium phosphate et les mélanges de ceux-ci. Ces sources de phosphates de calcium peuvent être utilisées sous toute forme cristalline disponible. Par ailleurs, des dérivés de ces sources de phosphate de calcium, notamment des dérivés carbonés, peuvent également employés. Selon un mode particulier de réalisation, ledit phosphate de calcium est sous forme d' apatite, plus particulièrement d'hydroxyapatite. Avantageusement, une telle source de phosphate de calcium permet d'augmenter les propriétés ostéogéniques de la matrice composite.

Selon un mode particulier de réalisation, la matrice composite selon l'invention comprend entre 0, 1 et 50 % (p/v) de phosphate de calcium. Selon un mode particulier de réalisation, la matrice composite selon l'invention comprend entre 0,1 et 50 % (p/v) d'hydroxyapatite. Plus particulièrement, la matrice composite peut comprendre entre 0,2 et 20 % (p/v) d'hydroxyapatite, plus particulièrement entre 0,5 et 4 % (p/v), notamment entre 2 et 3 % (p/v). Selon un mode particulier de réalisation, la matrice composite comprend 2,5 % (p/v) d'hydroxyapatite.

Selon un autre mode particulier de réalisation, la matrice composite selon l'invention comprend entre 1 et 3 % (p/v), plus particulièrement 2 % (p/v), d'hydroxyapatite.

4. Modes de réalisation illustratifs de la matrice composite selon l'invention

La matrice composite selon l'invention peut notamment comprendre un peptide de type élastine, au moins un peptide bioactif, et du phosphate de calcium.

Selon un mode de réalisation, la concentration de matrice composite est comprise entre 1 et 10 % en masse volumique (p/v), en particulier entre 3 et 5 % (p/v).

Selon un autre mode de réalisation, le ratio thiol :alccnc est compris entre 3: 1 et 1:3 en moles, plus particulièrement entre 2: 1 et 1:2, ce ratio étant plus particulièrement égal à 1: 1.

Selon un mode particulier de réalisation, la matrice composite comprend:

(i) un peptide de type élastine;

(ii) au moins un peptide d'adhésion;

(iii) au moins un peptide capable d'induire la nucléation de phosphate de calcium; et

(iv) du phosphate de calcium.

Les composants (i) à (iv) peuvent être choisis parmi les composants décrits dans les parties 1 à 3 ci- dessus.

Plus particulièrement, la matrice composite selon l'invention peut comprendre:

(i) un peptide dérivé du peptide de type élastine ELPM80; (ii) un peptide IKVAV et un peptide YIGSR;

(iii) le peptide SNA 15 ou un peptide analogue de SNA15; et

(iv) de l'hydroxyapatite.

De manière préférée, la matrice composite selon l'invention comprend:

(i) un peptide ELPM80;

(ii) un peptide IKVAV(espaceur)PVGLIG(espaceur) YIGSR;

(iii) le peptide SNA15; et

(iv) de l'hydroxyapatite.

De manière particulièrement préférée, la matrice composite selon l'invention comprend:

(i) un peptide ELPM80;

(ii) un peptide IKVAV-GGG-PVGLIG-GGG- YIGSR;

(iii) le peptide SNA15; et

(iv) de l'hydroxyapatite.

5, Procédé de préparation de la matrice composite

La matrice composite de l'invention peut être fabriqué par mélange de ses différents composants, et de tout autre élément optionnel. Les composants de la matrice composite et la quantité de ces composants sont choisis afin de préparer une matrice composite présentant des propriétés physiques et de support adaptées à la problématique de son utilisateur.

L'homme du métier est familier avec les techniques de réticulation employée dans l'état de l'art pour fabriquer une matrice composite par réticulation. Ainsi, la formation de la matrice composite par réticulation peut notamment être réalisée sous l'action d'un stimulus tel qu'une modification de température, de pH, ou au moyen d'un agent de réticulation, notamment un agent de réticulation photosensible (ou photoinitiateur). On peut ainsi citer à titre illustratif l'induction d'une photopolymérisation au moyen d'un photoinitiateur tel que le composé Irgacure 2959, notamment utilisé à une masse volumique de 0,5 % (p/v) dans le mélange, et activé par lumière UV-visible (Z=305 - 405 nm, notamment à 305 nm) pendant 5 à 12 minutes, plus particulièrement entre 6 et 10 minutes, notamment pendant environ 8 minutes. Dans une autre variante, le photoinitiateur peut être notamment choisi parmi le phényl-2,4,6-triméthylbenzoylphosphinate de lithium (LAP) et la riboflavine. La concentration de LAP peut varier de 0,005 % à 0,5 % (p/v) dans le mélange, et sa photoinitiation peut être déclenchée à une longueur d’onde comprise entre 365 et 475 nm pendant 5 à 12 minutes, plus particulièrement entre 6 et 10 minutes, notamment pendant environ 8 minutes. Avantageusement, l'homme du métier pourra aussi se référer au procédé de préparation décrit dans les exemples de la présente demande, dans lesquels l'hydrogel est produit par formation d'une cryomatrice. Selon une variante de ce mode de réalisation, une solution de prématrice, comprenant les différents composants de la matrice, est congelée pour former des cristaux d'eau. A mesure que les réactifs de réticulation (i.e. les composants portant les groupements thiols et alcènyles) entourent les dits cristaux d'eau, et lorsque la solution est soumise à un rayonnement UV, les groupements alcènes et thiols des différents composants du mélange réagissent à l'interface desdits cristaux. Lorsque la solution décongèle, l'espace occupé par les cristaux d'eau devient un pore dans la matrice. Cette étape peut être suivie d'une étape de lyophilisation. Par exemple, après réticulation, les matrices peuvent être réhydratées, notamment pendant 24 heures, et lyophilisées sous vide après surgélation, sublimant ainsi la glace sans la fondre, et générant ainsi de nouveaux pores. La combinaison de ces deux techniques a pour avantage de permettre la formation d'une distribution étendue de tailles de pores, permettant la colonisation de différents types cellulaires utiles pour l'induction d'une angiogenèse, innervation et ostéogenèse.

Ainsi, selon un mode particulier de réalisation du procédé selon l'invention, l'étape de congélation est réalisée à une température comprise entre 0 et -80°C, plus particulièrement à une température d'environ -20°C, pendant au moins 2 h, notamment pendant environ 24 h. La prématrice peut être ensuite soumise à un rayonnement UV adapté à l'induction d'une photopolymérisation, notamment pendant environ 5 à 12 minutes, plus particulièrement pendant environ 6 à 10 minutes, notamment pendant environ 8 minutes. Après réticulation, et selon un mode particulier de réalisation, une étape de réhydratation peut être mise en œuvre, notamment pendant au moins 2 h, notamment pendant environ 24 h. Cette étape de réhydratation peut être suivie d'une étape de surgélation à environ -80°C pendant au moins 1 h, notamment pendant environ 24 h, puis d'une étape de lyophilisation d'une durée d'environ 24 à 48 h.

Comme nous l'indiquions ci-dessus, ces étapes permettent la formation d'une matrice composite comprenant des pores dont la distribution de tailles de pores est étendue et contrôlée. La matrice composite selon l'invention peut notamment présenter des macropores de taille moyenne supérieure à 100 pm.

6, Utilisation de la matrice composite selon l'invention

Avantageusement, les propriétés de la matrice composite peuvent être très finement définies. Par ailleurs, ladite matrice composite selon l'invention est biodégradable et présente une structure poreuse adaptée à la colonisation par différents types cellulaires utiles pour l'induction d'une angiogenèse, innervation et ostéogenèse. Les inventeurs ont aussi pu montrer que la matrice composite selon l'invention n'est pas cytotoxique. Il rassemble ainsi toutes les propriétés avantageuses utiles au développement d'un outil adapté à la régénération tissulaire.

La matrice composite selon l'invention est donc capable de supporter efficacement la culture in vitro de différents types cellulaires. En conséquence, selon un mode particulier de réalisation, l'invention concerne un nouveau support tridimensionnel capable d’héberger in vitro différentes cellules d'intérêt pour la régénération osseuse, notamment neuronales, osseuses ou endothéliales. L’invention met donc à disposition de l'homme du métier un système particulièrement avantageux de culture cellulaires 3D permettant aux cellules de se développer dans un environnement favorable, mais également d'étudier les interactions de différents types cellulaires entre eux. Ce paramètre est important pour étudier les phénomènes de régénération qui peuvent nécessiter des dialogues complexes entre différents types cellulaires. Le support de l'invention peut notamment être utilisé pour héberger des cellules ostéoformatrices et endothéliales, et pour étudier l'effet angiogénique, ostéogénique et 'innervation dans une méthode de culture cellulaire in vitro, comprenant la mise en culture de cellules dans un support tel que défini ci-dessus. L’utilisation du support selon l'invention peut comprendre par ailleurs l'ajout d'un agent à la culture, tel qu'un facteur de croissance ou toute autre agent ayant un effet biologique ou susceptible d'avoir un effet biologique (agent candidat) pour déterminer son effet sur un ou plusieurs paramètres et réponses cellulaires tels que la croissance des cellules, l'induction d'une quiescence, d'une mort cellulaire, de la sécrétion de protéine, ou d'autres molécules, ou d'ions (notamment ions calcium, potassium), ou encore l'expression de certains gènes.

Selon un autre aspect, la matrice composite de l'invention est utilisée dans une méthode de traitement, notamment comme implant. La matrice composite est notamment utilisée dans une méthode de traitement de médecine régénérative. Elle peut notamment être utilisée pour stimuler l’innervation d’un tissu, notamment un tissu osseux, et est notamment utilisable en ingénierie osseuse. Avantageusement, la matrice composite selon l’invention favorise l'innervation, notamment dans un contexte de régénération. Plus particulièrement, la matrice composite selon l’invention peut avantageusement être utilisée pour recruter et stimuler le système nerveux sensoriel, plus particulièrement pour favoriser la régénération osseuse. La matrice composite selon l'invention peut également être employée afin d'optimiser ou de restaurer la vascularisation et l'innervation d'un tissu.

Selon un autre mode de réalisation, la matrice composite selon l'invention est utilisée pour la réparation de lésions complexes qui présentent un endommagement vasculaire et nerveux.

Par ailleurs, la matrice composite selon l'invention peut également être utilisée pour régénérer l'interface avec le système nerveux périphérique, et pour contrôler le développement osseux et sa réparation. Selon un autre mode de réalisation, la matrice composite peut être utilisé comme véhicule de thérapie cellulaire. Ainsi, une matrice composite tel que défini ci -dessus peut préalablement être colonisée par des cellules d'intérêt thérapeutique, par exemple au moyen de cellules souches, notamment de cellules souches induites dans un lignage d'intérêt, des cellules souches hématopoïétiques, des cellules souches mésenchymateuses stromales dérivées de la moelle osseuse ou du tissu adipeux, des cellules souches neuronales, ou un mélange de cellules de lignages différents. Une telle matrice composite est utilisable dans une méthode de traitement par régénération cellulaire ou tissulaire.

La matrice composite selon l'invention peut également être utilisée pour modifier des systèmes d'implant, mais également pour améliorer leur biocompatibilité et leur intégration.

LEGENDE DES FIGURES

Figure 1: Diffusion de la fluorescence et quantification de la taille des pores des matrices hydratées. A) ELPM80 + Quantification de la taille des pores des hydrogels hydratés YIGSR. N=2-5 hydrogels (502<pores<2100) Kruskal-Wallis; post-hoc de Dunn; p<0,001. C) Classification de la taille des pores des hydrogels ELPM80 + YIGSR en micropores (nécessaires à l’angiogenèse et à l’innervation) et en macropores (nécessaires à la formation osseuse).

Figure 2: Quantification des vaisseaux et des structures nerveuses formés à l’intérieur de la structure d’hydrogel de la composition IKVAV +YIGSR et de sa version scramble VKAIV + GYSRI. Chaque implantation est représentée par un point et la moyenne est représentée par une barre (n = 5-6). Notez qu’au sein d’un même groupe, une grande variabilité est observée, confirmant une colonisation cellulaire hétérogène au sein de la structure de l’hydrogel. Aucune différence statistique n’a été détectée.

Figure 3: Etapes de la production de matrice : (1) préparation des solutions pré-matricielles, congelées à -20 °C pendant 24 heures avant (2) réticulation sous lumière UV. (3) Le cryogel est hydraté pendant 24 heures avant (4) la lyophilisation.

Figure 4: Quantification de la structure et de la taille des pores de matrices déshydratées à 4 % (p/v) avec HA à 0 % ou 5 % (p/v). La taille des pores a été quantifiée à l’aide d’ImageL Les données sont représentées sous forme de ± ET, 10<n<32, avec des différences statistiques indiquées *** p<0,001 (ANOVA avec test de Bonferroni post-hoc). Figure 5: Structure et taille des pores des matrices déshydratées produites à 8 min de temps de réticulation avec différentes concentrations massiques finales (% p/v) et différentes concentrations d’HA (% p/v). Quantification de la taille des pores. Les données sont représentées comme moyennes ± ET, 7<n<26, aucune différence statistique n’a été observée (ANOVA avec test de Bonferroni comme test post-hoc ou test de Mann-Whitney).

Figure 6: Porosité interne des matrices hydratées à 3 % (p/v) et 4 % (p/v) avec différentes concentrations d’HA. (B) la taille des pores a été quantifiée à l’aide d’hnageJ. Les données sont représentées sous forme de ± ET, 21<n<65, avec des différences statistiques indiquées par * p<0,05 et *** p<0,001 (ANOVA avec test de Bonferroni, post-hoc). Barres: 100 pm.

Figure 7: Potentiel de minéralisation de matrices de 3 % p/v sans HA ou contenant 1 %, 2 % et 2,5 % p/v HA implantés par voie sous-cutanée chez la souris pendant 2 et 4 semaines. Quantification des acquisitions de microCT à l’aide du logiciel MicroView au jour 0 (le jour de l’implantation), et à 2 et 4 semaines. Il convient de noter que le volume de tissu minéralisé augmente avec le temps et que les matrices contenant 2 % et 2,5 % p/v HA ont produit un volume plus élevé de tissu minéralisé que les matrices sans HA et contenant 1 % p/v HA. Les données sont représentées sous forme de ± ET moyenne, n = 4-5 souris par groupe, avec des différences statistiques indiquées par * p<0,05 et ** p<0,01 (ANOVA avec test de Bonferroni, post-hoc).

Figure 8: Microscopie électronique à balayage couplée à l'analyse EDX sur des matrices ELPs + peptides IKVAV/YIGSR contenant ou non le peptide SNA 15. Les matrices ELPs + peptides IKVAV / YIGSR contenant 0, 1, 2 et 2,5 % p/v HA contenant ou non le peptide SNA 15 ont été lyophilisées et coupées en 2. L'intérieur des matrices coupées a été analysé. Le signal sous forme de points blancs correspond aux particules de calcium constituant 1 ’hydroxyapatite. Les barres indiquées sur la figure correspondent à 2 mm.

Figure 9: Suivi longitudinal de la minéralisation des matrices par micro-CT. Images micro-CT représentatives de l'implantation sous-cutanée des matrices sans HA ou contenant 1 %, 2 % et 2,5 % (p/v) d’HA après 0, 15 et 30 jours d’implantation. Le volume minéral/volume total (MV/TV) a été mesuré à partir d'images micro-CT tridimensionnelles reconstruites à l'aide du logiciel Microview®. Le test statistique ANOVA suivi du test post hoc de Bonferroni avec * p<0.05 et ** p<0.01 a été réalisé.

Figure 10 : Suivi de la minéralisation par micro-CT de la matrice ELPs contenant 2 % (p/v) HA implantée en sous-cutané avec le logiciel MicroView®. Figure 11: Analyse histologique des matrices implantées en site ectopique et colorées au Trichrome de Masson. Les matrices comprenant 0 %, 1 %, 2 % et 2,5% d’HA ont été implantées en sous-cutané et colorées au Trichrome de Masson. Analyse quantitative des tissus ostéoïde formés (15 < n < 23 par échantillon) avec un test de comparaison multiple de Kruskal-Wallis avec p ** < 0.01 et p *** < 0.001.

Figure 12: Immunomarquage des réseaux vasculaires et des structures nerveuses dans les matrices composites contenant 2 % d’HA après 0, 3, 7, 15 et 30 jours d’implantation en site ectopique. (A) Quantification de la surface occupée par les vaisseaux sanguins rapportée à la surface de la matrice x 1000. (B) Quantification de la surface occupée par les structures nerveuses rapportée à la surface de la matrice x 1000. Analyse quantitative avec un test de comparaison multiple de Kruskal- Wallis.

Figure 13 : Analyse par micro-CT de la minéralisation induite par les matrices composites dans un modèle de lésion osseuse du condyle fémoral chez le rat. (A) Images micro-CT représentatives des lésions osseuses après 7, 15, 30 et 60 jours d’implantation et en fonction des groupes : lésion laissée vide, comblée avec les matrices ELPs contenant 2 % d’HA et le contrôle positif le Collapat®. (B) Le volume minéral/volume total (MV/TV) a été mesuré à partir d'images micro-CT tridimensionnelles reconstruites à l'aide du logiciel Microview® pour les trois groupes (vide, ELPs, Collapat®) et pour tous les temps d’implantation (J7, J15, J30 et J60). Analyse quantitative de la minéralisation avec un test de comparaison multiple de Kruskal-Wallis avec p * < 0.1 et ns = non significatif.

Figure 14: Coupe histologique d’une lésion réalisée dans le condyle fémoral comblé avec la matrice ELP/peptides contenant 2 % d’HA. Coloration au Trichrome de Masson d’une lésion osseuse comblée avec la matrice composite après 7 jours d’implantation. La zone correspondant à la lésion est délimitée par un cercle en pointillé en noir.

Figure 15: Minéralisation de matrices dans le modèle de lésion mandibulaire. Images micro-CT en 3D représentant la reconstruction du défaut mandibulaire en présence de la matrice composite.

EXEMPLES

Exemple 1 : préparation d'un hydrogel aux propriétés améliorées

Récemment, l'équipe des inventeurs a évalué un biomatériau tenant compte de l'importance de la vascularisation et de l'innervation et au cours de la régénération osseuse (Paiva dos Santos et al., Acta Biomater. 2019, 99, 154). Le but de ces travaux était de développer un hydrogel acellulaire et sans facteur de croissance, favorisant l'angiogenèse et l'innervation. Des hydrogels comprenant ELPM40, du polyéthylène glycol (PEG), et différentes concentrations du peptide d'adhésion IKVAV (25 % p/p et 50 % p/p) ont été produits, caractérisés et évalués. Des essais in vitro ont pu montrer que la composition à 50 % de IKVAV présentait un potentiel plus important de support de l'ostéogenèse, de l'angiogenèse et de l'innervation. In vivo, cette composition n'a pas provoqué de réaction inflammatoire, et a permis d'induire une densité vasculaire plus élevée et la formation de terminaisons nerveuses dans les tissus environnants, après implantation sous-cutanée chez la souris. Cette étude précédente présente toutefois certaines limitations. En premier lieu, la porosité de l'hydrogel ne s'est pas avérée suffisante pour permettre une colonisation cellulaire homogène dans l'implant. Par ailleurs, l'hydrogel ne semble pas se dégrader après implantation, probablement en raison du PEG qui n'est pas entièrement biodégradable à long terme.

Les inventeurs ont donc cherché à modifier la composition et la structure de l'hydrogel afin d'améliorer l'homogénéité de colonisation cellulaire et la biodégradabilité du matériau. l'induction d'une porosité améliorée

En premier lieu, les inventeurs ont recherché la meilleure méthode pour induire une porosité dans les matrices d'hydrogel et permettre leur colonisation par des cellules. Ces structures ont été analysées par microscopie électronique à balayage (MEB).

Des hydrogels selon l'état de la technique, composés d'ELPM40 et de PEG, ont été produits et la taille de leurs pores a été caractérisée.

La première méthode d'induction de pores utilisée, appelée "CryoUV" ci-dessous, consiste en la formation d'une cryomatrice. Une solution de prématrice a été congelée pour former des cristaux d'eau. A mesure que les réactifs de réticulation entourent lesdits cristaux d'eau, et lorsque la solution est soumise à un rayonnement UV, les groupements alcènes et thiols des différents composants du mélange réagissent à l'interface desdits cristaux. Lorsque la solution décongèle, l'espace occupé par les cristaux d'eau devient un pore dans la matrice.

L'autre méthode utilisée est basée sur la production de matrices selon la méthode CryoUV, suivie d'une étape de lyophilisation (méthode désignée "CryoUV + Lyoph" ci -dessous). Après réticulation, les matrices ont été réhydratées pendant 24 heures, et lyophilisées sous vide après surgélation pendant 24 h, sublimant ainsi la glace sans la fondre, et générant ainsi de nouveaux pores. La combinaison de ces deux techniques a pour avantage de permettre la formation d'une distribution étendue de tailles pores, permettant la colonisation de différents types cellulaires utiles pour l'induction d'une angiogenèse, innervation et ostéogenèse. Les inventeurs ont évalué la structure externe des matrices au moyen d'une MEB environnementale. Des hydrogels CryoUV ont été produits et, avant analyse par MEB, leur contenu en eau a été évaporé afin de permettre une visualisation par MEB. S'agissant de la méthode CryoUV + Lyoph, la lyophilisation a permis le maintien de la structure tridimensionnelle de l'hydrogel. Les résultats montrent que les deux méthodes permettent de produire des hydrogels avec une structure poreuse.

Les inventeurs ont ensuite explorer la possibilité de modifier la composition des hydrogels afin d'améliorer les propriétés de colonisation et de biodégradabilité évoquées ci-dessus.

Production du peptide ELPM(alcène)-80

Le plasmide ELPM40-pUC19 codant ELPM40 MW[(VPGVG)(VPGMG)(VPGVG) ₂ ] I ₅ décrit précédemment (Petitdemange et al., Biomacromolecules. 2017 Feb 13; 18(2):544-550) a été digéré par l'enzyme de restriction BsmFl afin de le linéariser, puis déphosphorylé en 5' par la phosphatase Antarctic. La séquence nucléotidique codant la séquence en acides aminés [(VPGVG)(VPGMG)(VPGVG)2]5 a été extraite d'un plasmide pUC19 codant ELPM20 également décrit précédemment, par digestion avec les enzymes de restriction BsmFl et BtgZI. Cette séquence a été utilisée comme insert introduit par ligation dans le plasmide ELP M40-pUC19 linéarisé, permettant ainsi d'obtenir des plasmides pUC19-ELPM60 et pUC19-ELPM80 codant respectivement les ELPM60 et ELPM80. La séquence codant ELPM80 a ensuite été transférée, après digestion du plasmide pUC19-ELPM80 avec les enzymes de restriction Ndel et BamHI, dans le vecteur d'expression pET44a, permettant une expression inductible à l'IPTG d'ELPM80. L’article Petitdemange et al. (Biomacromolecules. 2017 Feb 13 ; 18(2) :544-550) décrit la construction du vecteur d’expression du peptide MX[VPGVGVPGMG(VPGVG)2]IO (ELPM40), son expression dans E. coli, son isolement à partir des lysats bactériens, sa purification et sa caractérisation. Ces conditions ont été adaptées pour la production et la purification d'ELPM80. Une structure et une masse moléculaire correctes ont été confirmée par RMN 1H et spectrométrie de masse MALDI.

Un groupement alcène a ensuite été ajouté au peptide ELPM80 par thioalkylation chimiosélective des chaînes latérales méthionine du peptide ELPM80, toujours selon les conditions décrites dans Petitdemange 2017, en utilisant l’éther d’allyle et glycidyle afin de produire le peptide ELPM(alcène)- 80, désigné ELPMa-80 dans la suite. La structure du peptide alcénylé ainsi produit a été confirmée par RMN 1H.

Production et caractérisation d'une matrice composite comprenant ELPM80

Afin d'améliorer la composition de l'hydrogel, les inventeurs ont remplacé ELPM40 inclus dans les compositions de l'état de la technique par le peptide de type élastine ELPM80. Par ailleurs, le peptide d'adhésion YIGSR a également été introduit dans la composition de l'hydrogel. Sa version scramble GYSRI a été utilisée comme contrôle. Les compositions d'hydrogels produits sont présentées dans le tableau 1.

Tableau 1: compositions d'hydrogels comprenant ELPM80 et le peptide d'adhésion YIGSR

La diffusion de FITC-dextran 500 kDa dans la structure de la matrice et l'évaluation de la fluorescence dans le cœur du matériau par microscopie confocale ont été utilisée pour quantifier la taille des pores et la porosité en utilisant ImageJ. La taille de pore mesurée la plus faible pour les deux méthodes CryoUV et CryoUV + Lyoph est de 2,16 pm, et la taille la plus élevée est de 382,5 pm avec la méthode CryoUV, et 523,5 pm avec la méthode CryoUV = Lyoph, indiquant que cette dernière permet de produire des pores plus grands (Figure 1).

Afin de satisfaire l’angiogenèse, l’innervation et la formation osseuse, la gamme de pores doit être très variée. Les données de la littérature suggèrent que la taille optimale pour l’innervation est de 0,005 à 0,3 pm, de 5 à 15 pm pour la croissance des fibroblastes, de 50 à 400 pm pour une vascularisation rapide, et de 100 à 400 pm pour la régénération osseuse. En tenant compte de la taille des pores pour induire la formation osseuse, nous avons évalué la fréquence des pores en fonction de leur taille, les représentant en micropores (inférieurs à 100 pm) et en macropores (supérieurs à 100 pm). En général, les macropores étaient plus fréquents lorsque les échantillons avaient été lyophilisés par rapport à la méthode CryoUV (Figure 1) qui satisfait à l’angiogenèse, à l’innervation et à la régénération osseuse.

Sur la base de la partie précédante, la méthode CryoUV + Lyoph a été normalisée afin d’assurer (i) une porosité élevée en tenant compte des critères de (ii) des tailles de pores larges afin de satisfaire au prérequis de colonisation cellulaire par différentes cellules permettant l’angiogenèse, l’innervation et l’ostéogenèse; iii) des modifications de composition ont été apportées pour produire un matériau polymère entièrement naturel afin de faciliter la dégradation de la matrice, c’est-à-dire que la production d’une matrice sans PEG était possible, tout en maintenant l’équinolarité alcènelhiol; iv) ELPM40 a été remplacé par ELPM80. Les inventeurs ont implanté la composition IKVAV + YIGSR ainsi que sa version scramble par voie sous-cutanée chez la souris afin d’évaluer l’angiogenèse et le potentiel d’innervation in vivo. Après 4 semaines d’implantation, les échantillons ont été prélevés et analysés histologiquement par coloration à l’hématoxy line-éosine (HE) afin d’évaluer l’architecture tissulaire, la colonisation cellulaire et l’inflammation persistante. Pour le potentiel d’angiogenèse, une immunohistochimie (IHC) CD31 a été réalisée et pour le potentiel d’innervation, une IHC de la tubuline P3 a été utilisé. Pour les deux compositions, aucun signal persistant d’inflammation n'a été observé, et des nerfs et des vaisseaux ont été observés à l’intérieur des hydrogels. Cependant, une colonisation cellulaire hétérogène a eu lieu, indiquant la nécessité d’optimiser et de normaliser la production des matériaux. La quantification des densités des vaisseaux et des nerfs a aussi confirmé ces observations, montrant une grande variabilité dans le même groupe (figure 2).

Sur la base des données exposées ci-dessus, des modifications semblaient nécessaires pour augmenter la fonctionnalité de l ’hydrogel in vivo. Compte tenu de la reproductibilité limitée des hydrogels et de la colonisation cellulaire qui en résulte, les inventeurs ont décidé d’optimiser le protocole de production de matrices et de modifier la composition afin de combiner le potentiel ostéogénique dans une nouvelle génération de matériaux. Comme nous l'avons évoqué ci-dessus, en utilisant des hydrogels à base de peptides ELP et d’adhésion, les inventeurs ont déjà montré que les hydrogels étaient capables d’induire l’angiogenèse et l’innervation entourant le site d’implantation.

Afin d’augmenter la fonctionnalité biologique, les inventeurs ont considéré d’autres peptides biomimétiques pour augmenter le recrutement des cellules neurales et vasculaires, la dégradation de la matrice, la colonisation cellulaire et la rétention de la teneur en minéraux: (i) les peptides d’adhésion de base CpA-IKVAV-pAC et CpA-YIGSR-pAC ont été remplacés par la séquence CpA-IKVAV- GGG-PVGLIG-GGG-YIGSR-pAC, où la même stratégie de chimie de réticulation a été conservée: le groupe thiol est présent sur les cystéines flanquantes, permettant la réticulation avec les alcènes greffés sur ELPM80. Les inventeurs ont également utilisé un peptide contrôle où les versions scramble VKAIV et GYSRI ont remplacé leurs séquences originales IKVAV et YIGSR, respectivement. La séquence PVGLIG a été conservée dans ce peptide témoin. Trois glycines ont été utilisées comme espaceurs entre les motifs fonctionnels et (ii) PVGLIG, un site de dégradation cible des métalloprotéinases matricielles 2 et 9 a été inclus entre les deux séquences d’adhésion. Ainsi, une fois clivée, chaque séquence d'adhésion sera toujours attachée à la matrice et disponible pour la fixation des cellules. De plus, cette séquence déclenchera la dégradation de la matrice, et donc aidera à la colonisation cellulaire, (ii) Le peptide SNA15, CpA-DDDEEKLLRRIGRFG-pAC, un motif de nucléation du phosphate de calcium dérivé de la stathérine, a été utilisé afin de retenir et d’assurer la distribution homogène des particules d’hydroapatite. Par conséquent, (iii) 1 ’hydroxyapatite (HA), correspondant au contenu minéral osseux synthétique, est incluse dans la composition du matériau pour fournir des signaux biochimiques pour les propriétés d’ostéoconduction. Le groupe des inventeurs les a déjà synthétisés et caractérisés, ayant des cristaux HA en forme de tige de 50 à 100 nm qui forment des agrégats d’un diamètre moyen de 3,26 ± 0,62 pm. En utilisant la méthode CryoUV+Lyoph, les inventeurs ont normalisé le temps d’incubation dans le protocole de production de matrices (Figure 3).

Compte tenu de l’importance de la porosité et de la taille des pores, l’étape suivante du processus de caractérisation a consisté à optimiser les matrices en fonction de plusieurs facteurs : le temps de réticulation, la concentration massique finale et la concentration en HA. La photopolymérisation a été induite au moyen du photoinitiateur Irgacure 2959, notamment utilisé à une masse volumique de 0,5 % (p/v) dans le mélange, et activé par lumière UV-visible à 305 nm. Tout d’abord, le temps de réticulation a été évalué car il a un effet direct sur la création des matrices. Des matrices à 4 % (p/v) composées d’ELPM80, de peptide biomimétique contenant les séquences IKVAV, PVGLIG et YIGSR, SNA 15 et contenant ou non HA (Tableau 4) ont été produites, réticulées pendant 5 min, 8 min et 15 min. Grâce à la microscopie électronique à balayage, des images des matrices ont été obtenues et la taille des pores a pu être quantifiée (Figure 4).

4 % (p/v) 3 % (p/v) 2 % (p/v)

ELPM80 0,67 mM 0,51 mM 0,34 mM

Peptides 3,54 mM 2,65 mM 1,77 mM biomimétiques *

SNA15 3,54 mM 2,65 mM 1,77 mM

HA 2,5 - 10 % (p/v) 2,5 - 10 % (p/v) 2,5 - 10 % (p/v)

Tableau 4. Compositions de matrices avec la concentration de tous les composants.

*Les peptides biomimétiques sont constitués d’un seul peptide contenant les motifs IKVAV, PVGLIG et YIGSR. La version scramble se compose de VKAIV et GYSRI sans affecter la séquence PVGLIG.

Les résultats obtenus suggèrent que plus le temps de réticulation est court (5 min), plus les pores sont grands. En effet, avec 15 minutes de temps de réticulation, peu de pores ont été observés. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, les inventeurs ont émis l’hypothèse que plus le temps de réticulation est long, plus les cryomatrices sont susceptibles de commencer à décongeler. Il en résulterait des matrices plus rigides, en raison d’un taux de réticulation plus élevé, et des pores plus petits en raison de la décongélation. En effet, cela peut expliquer pourquoi avec 15 minutes de temps de réticulation, très peu de pores ont pu être observés. En général, la taille des pores est différente en fonction du temps de réticulation dans les matrices sans HA, mais il n’y a pas de différence dans la taille des pores avec des matrices HA à 5 % (p/v). Cela suggère que l’HA interfère dans la formation des pores, quel que soit le temps de réticulation. Compte tenu de la taille des pores dans les matrices avec et sans HA, et du fait que les matrices étaient déshydratées, les inventeurs ont décidé de standardiser le temps de réticulation à 8 minutes pour les expériences suivantes. Ensuite, les inventeurs ont évalué l’effet de la concentration finale de la matrice sur la taille des pores. Ils ont produit des matrices à 2 % (p/v), 3 % (p/v) et 4 % (p/v) avec différentes concentrations d’HA et analysé leur microstructure (Figure 5).

Les matrices à 3 % (p/v) ont tendance à conserver leur structure en fonction de différentes concentrations d’HA, tandis que les matrices à 2 % (p/v) et 4 % (p/v) avaient des structures ressemblant à des poudres, avec une reproductibilité potentiellement réduite. L'analyse SEM a confirmé la porosité externe des matrices déshydratées produites avec 8 min de temps de réticulation, et a démontré que la densité apparente du maillage augmentait proportionnellement à la concentration de la matrice. Les matrices à 4 % (p/v) semblent comprendre plus de pores mais avec des diamètres plus petits, tandis que les matrices à 2 % (p/v) et à 3 % (p/v) semblent comprendre moins de pores mais de plus grandes dimensions. La taille des pores des matrices déshydratées ayant la même concentration d’HA n'ont pas varié en fonction de la concentration finale. Encore une fois, la teneur en HA semble interférer avec la taille des pores dans les matrices ayant la même concentration finale, mais cette tendance ne semble pas statistiquement significative.

Pour confirmer ces résultats et pour évaluer la porosité interne, les inventeurs ont quantifié la taille des pores dans les matrices hydratées, en les coupant au milieu et en produisant des tranches histologiques par cryostat. La figure 6 montre que dans les matrices à 3 % (p/v), les matrices HA à 5 % ont des tailles de pores inférieures aux matrices comprenant 0 % et 2,5 % HA. En outre, lorsque l’on compare les matrices à 3 % (p/v) et à 4 % (p/v), les matrices à 3 % (p/v) avec 0 % HA, 2,5 % HA et 5 % HA ont des pores significativement plus grands que les matrices à 4 % (p/v) avec la même concentration d’HA. Il est important de noter que dans les matrices à 3 % (p/v), il n’y a pas de différence dans la taille des pores pour les matrices sans HA et 2,5 % (p/v) HA, et la taille des pores est supérieure à 100 pm, la taille minimale des pores décrite dans la littérature pour satisfaire l’ostéogenèse. A partir de là, les travaux se sont concentrés sur les matrices à 3 % (p/v) contenant un maximum de 2,5 % (p/v) HA.

Ensuite, les inventeurs ont évalué la porosité générale des matrices sans HA et 2,5 % (p/v) HA après réhydratation. Ils ont utilisé la méthodologie décrite par Ma et Zang, basée sur les densités globales de la matrice fibreuse et la densité squelettique (Ma et Zhang, J. Biomed. Mater. Res. 1999, 46, 60). La densité squelettique est considérée comme la densité des polymères et de l’HA. Les matrices sans HA et avec 2,5% p/v HA ne diffèrent en termes de porosité. Les matrices sans HA étaient de 98,9 ± 0,26 % poreuses par rapport à 98,9 ± 0,49 % pour 2,5 % p/v HA. Ces résultats suggèrent que la présence d’HA n’interfère pas sur la porosité générale des matrices hydratées. La rétention de l'HA dans la structure de la matrice a ensuite été étudiée par analyse thermogravimétrique (TGA). La teneur en HA retenue dans la structure matricielle a atteint un plateau à 2,5 % (p/v). Les inventeurs ont donc décidé d’utiliser une concentration finale maximale d'HA de 2,5 % (p/v) pour la suite des tests, sans pour autant exclure la possibilité d'utiliser des matrices contenant 1 ou 2% d'HA compte tenu des résultats obtenus à 2,5 %.

Ensuite, les inventeurs ont analysé la distribution HA par EDX à la surface et à l’intérieur des matrices. Les images de MEB ont confirmé la surface et la porosité interne des matrices avec ou sans HA. L’analyse EDX est une technique de rayons X utilisée pour identifier la composition élémentaire des matériaux, dans ce cas le contenu en calcium est visible sous forme de points blancs. Les expériences ont pu montrer que 1 ’hydroxyapatite est distribuée de manière homogène en surface et dans les matrices.

En parallèle, des évaluations biologiques ont été effectuées pour analyser la survie et la distribution des cellules dans les matrices. Les cellules endothéliales primaires (EC)-RFP de rat et des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (BMSC) ont été cocultivées avec les matrices et observées par microscopie confocale. Les acquisitions réalisées par ce dernier avaient un volume z de 130 à 190 pm et ont été analysées au moyen d'Imaris pour une représentation 3D. Après 7 jours de coculture, des EC-RFP ont été observés à la périphérie et dans les matrices, indiquant que les matrices permettent de soutenir la culture de cellules. Afin d’évaluer si les cellules colonisent le noyau de la matrice, elles ont été coupées au milieu, puis des coupes histologiques ont été préparées à l’aide d'un cryostat. Le noyau des échantillons a été contre-coloré avec du DAPI (40,60-diamidino-2- phénylindole) et des images ont été capturées pour détecter les RFP et le DAPI, pour évaluer la colonisation cellulaire dans le noyau de la matrice. Pour les matrices sans HA, aucune RFP ou coloration au DAPI n'a été observée dans le cœur des matrice, mais seulement à leur périphérie. D’autre part, les cellules RFP+ ont été réparties de manière homogène à l’intérieur des matrices contenant 2,5 % d’HA.

Après la caractérisation matricielle approfondie, les inventeurs ont implanté par voie sous-cutanée chez la souris des matrices à 3 % p/v sans HA ou contenant 1 %, 2 % et 2,5 % p/v HA. Les inventeurs ont ensuite suivi les implantations le jour de l’implantation (Jour 0), 2 (2W) et 4 semaines (4W) afin d’évaluer le potentiel de minéralisation des matrices à l’aide de microCT. MicroCT a confirmé la formation de tissu minéralisé ectopique au sein des implantations semaine 2 et semaine 4 (Figure 7). Une fois quantifié, le volume de néotissu minéralisé formé en matrices avec 1 %, 2 % et 2,5 % p/v HA a augmenté au fil du temps. Les matrices contenant 2 % et 2,5 % p/v HA ne différaient pas sur l’induction de néotissu minéralisé formé après 2 ou 4 semaines d’implantation. Les matrices contenant 2 % et 2,5 % ont produit un volume de tissu minéralisé plus élevé que les matrices contenant 1 % p/v HA après 2 semaines. Un p = 0,059 est atteint en comparant le volume de tissu minéralisé produit par des matrices contenant 1 % et 2 % p/v HA. Les matrices sans HA n’étaient pas visibles et n’ont pas produit de tissu minéralisé significatif au fil du temps. Une petite quantité de tissu minéralisé a été observée à 2 semaines chez certains animaux, mais elle n’était pas détectable en semaine 4, probablement réabsorbée. Ces données suggèrent que les matrices contenant 1-2,5 % HA ont un potentiel de minéralisation ectopique, et que 2 % et 2,5 % p/v HA ont les meilleures performances après 2 semaines.

En conclusion, les inventeurs ont décrit un nouveau matériau composite matriciel sans cellules et sans facteur de croissance capable d’induire la formation de tissu minéralisé ectopique chez la souris. Cette matrice est composée d’EEPM80 et fonctionnalisée avec des peptides biomimétiques chargés de recruter les cellules nerveuses et vasculaires, de stimuler la colonisation cellulaire et de retenir l’HA. Les matrices fonctionnalisées combinées à 1 - 2,5 % (p/v) d’HA ont des propriétés ostéoinductives. de l'intérêt du SNA 15 dans la rétention et la distribution des

Les inventeurs ont produit une matrice composite, selon les modalités exposées ci-dessus, composée pour sa partie organique d’ELPM80-alcène, de peptides biomimétiques contenant les séquences d'adhésion IKVAV, YIGSR, le motif de coupure protéolytique PVGLIG, ainsi que le peptide de nucléation du calcium SNA15, et pour sa phase minérale des microparticules d’ hydroxyapatite.

Le peptide de nucléation du phosphate de calcium SNA15, de séquence DDDEEKFLRRIGREG, est dérivé de la protéine salivaire statherine. Un peptide SNA 15 modifié de séquence CpA- DDDEEKPLRRIGREG-PAC a été utilisé.

Des matrices composites contenant ou non ce peptide SNA 15 ont été produits avec la même concentration en matrice ELPs et en faisant varier les concentrations en HA de 0 %, à 2,5 %. Une analyse Energy Dispersive X-Ray (EDX) a été réalisée afin de déterminer la composition élémentaire de surface des matériaux, et plus particulièrement l'élément calcium (identifiés sous forme de points blancs dans la figure 8). On peut voir que les matrices sans HA contiennent peu ou pas de calcium. Comme attendu, plus les matrices sont supplémentées en particules d’HA, plus le signal augmente. Ce phénomène est d’autant plus visible lorsque les gels contiennent le peptide SNA15.

L’analyse quantitative montre que le pourcentage atomique de calcium dans les matrices contenant du SNA 15 est plus important que dans celles qui n'en contiennent pas : par rapport aux matrice ne contenant pas le peptide SNA15, il y a 8 fois plus de calcium dans les matrices 1 % HA + SNA15, 8,9 fois plus dans les matrices 2 % HA + SNA15 et 12,6 fois plus dans les matrices 2,5 % HA + SNA15.

On peut conclure que le peptide SNA 15 permet avantageusement d'améliorer de manière substantielle la rétention des particules de phosphate de calcium puisqu’elles sont entre 8 et 12.6 plus nombreuses en sa présence.

Exemple 3 : évaluation in vivo des matrices composites à base d'ELPs en site ectopique et dans des lésions osseuses

I. Implantations en site ectopique des matrices ELPs supplémentées avec différentes concentrations d'hydroxyapatite

Des matrices d’ELPs et peptides contenant différentes concentrations en particules d’HA ont été implantées en site sous-cutané pour sélectionner celle présentant les meilleures capacités en termes de minéralisation, de vascularisation et d’innervation. Les quatre matrices différaient seulement par leur contenu en HA (0 %, 1 %, 2 % et 2,5 % de particules).

1.1. Etude du potentiel de minéralisation des matrices composites

La minéralisation des matrices implantées en site sous-cutané a été suivie par microtomographie aux rayons X (micro-CT) dès l’implantation (JO) de la matrice, puis après 15 et 30 jours (J15 et J30) (Figure 9). Au jour 0 aucune minéralisation n’est observée dans les implants 0 %, 1 % et 2 % HA alors qu’une très faible minéralisation est observée pour la matrice 2,5 % HA (Figure 8). Ces résultats indiquent que les particules d’HA aux concentrations étudiées ne sont que peu visibles par la technique de micro-CT.

Après 15 et 30 jours d’implantation, du tissu minéralisé ectopique s’est formé dans les matrices contenant les particules d’HA. Le volume de tissu minéralisé formé dans ces matrices composites augmente au cours du temps (Figure 8). Toutefois, aucune minéralisation n’a été détectée après implantation des matrices dépourvues d’HA, démontrant l’importance de ces particules dans le processus de minéralisation. Après 1 mois d’implantation (J30) les matrices contenant 1 % d’HA ont induit une augmentation du volume minéral de 21 ± 10 %, de 42 ± 7 % pour celles contenant 2 % d’HA, et de 37 ± 5 % pour les matrices contenant 2,5 % de particules. Nous n’avons pas mesuré de différence significative dans la quantité de tissu minéralisé formé entre les matrices contenant 2 % et 2,5 % d’HA après 30 jours d'implantation. Le suivi de la minéralisation de la matrice 2 % HA est présenté figure 10. 1.2. Etude des propriétés ostéoindutrices des matrices composites

Après 4 semaines d'implantation, les matrices ont été excisées, incluses dans de la paraffine et analysées histologiquement par coloration au trichrome de Masson afin d'évaluer l'architecture tissulaire, la colonisation cellulaire, l'inflammation et la formation de tissu ostéoïde.

Les coupes histologiques des matériaux associées aux tissus épidermiques, adipeux et musculaires environnants montrent qu'après un mois d’implantation il se produit très peu de fibrose autour des matrices d’ELPs, et ce quelle que soit la formulation. Cela indique que les matrices induisent peu d'inflammation et qu’elles ne sont pas rejetées. Ces résultats sont en accord avec la biocompatibilité démontrée in vitro. Nous retrouvons sur ces coupes une structure en feuillet, ainsi que la présence de pores.

La présence de noyaux cellulaires au sein des matrices implantées a également été observée, indiquant que des cellules ont été capables de pénétrer à l’intérieur de ces matrices.

Les tissus et les matrices n'ayant pas été décalcifiés, certaines zones de forte minéralisation ont été endommagées lors des coupes au microtome. Toutefois, on remarque la présence de minéralisation sous forme de cristaux de couleur violet foncé. On peut également observer la présence de tissu ostéoïde en périphérie et au sein des matrices.

La quantité de tissu ostéoïde nouvellement formé (Ligure 11) augmente de façon significative en fonction de la quantité d’HA dans la matrice de 0 à 2 %. En revanche, les valeurs mesurées dans les matrices contenant 2,5 % de fraction minérale ne sont pas significativement différentes de celles qui en contiennent 2 %. Ainsi, la matrice contenant 2 % de particules d’HA semble être une formulation avantageuse pour stimuler un processus de minéralisation et d’ostéoinduction.

1.3. Etude du potentiel angiogénique et d'innervation des matrices ELP

La formation de structures vasculaires et nerveuses a été observée par immunomarquage d’un marqueur vasculaire (Endomucine) et d’un marqueur neuronal (P III tubuline). Durant cette étude, des coupes histologiques des matrices ont été réalisées à 0, 3, 7, 15 jours et 1 mois post-implantation pour déterminer la cinétique de formation de ces structures.

En ce qui concerne la formation de structures vasculaires au jour 0, environ 3 à 4 heures après implantation, aucun vaisseau sanguin n’a été observé dans les matrices. Trois jours après l'implantation, des vaisseaux sanguins apparaissent principalement à la périphérie des matrices, puis nous observons leur infiltration au 7 ^eme jour. Après 15 jours d’implantation, les vaisseaux sont présents à la fois à la périphérie mais aussi à l'intérieur des matrices. Au 30 ^eme jour, le réseau vasculaire au sein des matrices s’est densifié.

Ces observations sont confirmées par la quantification des vaisseaux sanguins à l'intérieur des matrices étudiées (Figure léA). Après 1 mois d’implantation, les structures vasculaires augmentent d'environ 10 % dans toutes les matrices, quelle que soit la concentration en HA. Seule une différence significative est observée entre les matrices sans HA (0 %) et celles contenant 1 % d‘HA.

La capacité de la matrice à stimuler l'innervation a également été démontrée par la présence de nerfs à la périphérie du matériau, en particulier aux premiers stades après l'implantation. Lors de la régénération osseuse, les structures nerveuses sont les premières à apparaitre, et ce dès les stades précoces suivant la lésion osseuse. Ceci explique la présence de plusieurs fibres nerveuses visibles à la périphérie de la matrice composite dès le 3 ^eme jour d’implantation. Après 1 mois, les structures nerveuses sont toujours détectées en périphérie de la matrice, mais leur diamètre semble avoir augmenté.

Les résultats quantitatifs obtenus par mesure de la surface occupée par les structures nerveuses localisées à la périphérie des matrices par rapport à la surface totale des matrices ont confirmé les observations précédentes (Figure 12B). En termes de formulation, il semble que les matrices composites contenant 1 % d’HA stimulent de façon significative la formation de structures nerveuses après un mois d'implantation. C’est particulièrement visible lorsque l’on compare ces résultats avec ceux obtenus avec les matrices sans HA, ou supplémentées avec 2,5 % d’HA.

La densité de nerfs ou de vaisseaux mesurée pouvant varier en fonction de l'emplacement et/ou de l'angle des coupes des tissus, nous avons également utilisé une technique permettant de visualiser l'intégralité du tissu en 3 dimensions après marquage par immunofluorescence des réseaux neuronaux, et ce sans avoir à couper l’échantillon. Cette technique permet d'observer en 3 dimensions l’autofluorescence de la matrice et la présence de réseaux de structures nerveuses exprimant la P III tubuline. On peut en particulier voir une forte présence des structures nerveuses à proximité de la matrice. Par ailleurs, les réseaux vasculaires semblent répartis de manière homogène.

1.4. Etude de la réaction inflammatoire après implantation sous-cutanée des matrices composites. La réaction inflammatoire, lorsqu’elle est modérée, est un processus essentiel à la régénération tissulaire et à la vascularisation des tissus. En revanche, une réponse trop forte du système immunitaire peut entraîner le rejet de l’implant.

Dans le cas des matrices composites, l'analyse histologique par coloration au trichrome de Masson (TM) n’a pas mis en évidence de capsules fibrotiques inflammatoires autour des implants, quelle que soit leur composition.

Pour confirmer ces données, nous avons effectué un immunomarquage des populations des cellules immunitaires. Nous avons utilisé comme marqueurs de l’inflammation le CD11b qui est exprimé par toute la lignée cellulaire myéloïde (monocytes, macrophages, neutrophiles) et le CD45 qui est un marqueur plus spécifique des lymphocytes. Nous avons constaté qu’il y a un recrutement de cellules immunitaires à la périphérie de la matrice quelques heures après l’implantation. Ces cellules sont détectées jusqu’au 7 ^eme jour post-implantation. Par la suite, après 3 mois et 6 mois les cellules immunitaires ne sont plus présentes qu'à l'intérieur de la matrice. Il pourrait s’agir de macrophages qui joueraient un rôle dans la dégradation de la matrice.

1.5. Etude in vivo du devenir de la matrice composite

Pour connaître la durée de vie des matrices, des implantations en site sous-cutané ont été réalisées et nous avons suivi leur devenir jusqu’à 6 mois d’implantation.

Juste après l’implantation (JO), la matrice composite contenant 2 % de particules d’HA est bien visible (couleur rougeâtre), et on y distingue des cristaux d’HA colorés en bleu. Après 1 mois d’implantation, les espaces libres laissés par les pores se comblent suite à la colonisation cellulaire. Nous pouvons identifier plusieurs noyaux à l'intérieur de la matrice. Après 3 mois d’implantation, la structure de la matrice n’est plus visible ce qui est probablement dû à sa dégradation par le système immunitaire. On peut noter la présence d’une forte composante cellulaire et d’une matrice extracellulaire qui comble les espaces précédemment occupés par le matériau composite. Des résultats similaires sont observés après 6 mois, avec toutefois une augmentation de la minéralisation de toute la zone préalablement occupée par la matrice composite.

Pour conclure sur ces études réalisées en site ectopique, les matrices développées à partir d’ELPs, de peptides IKVAV/YIGSR et SNA15 ont révélé leur capacité à promouvoir l’angiogenèse et l'innervation. La supplémentation des matrices en HA leur confère des propriétés ostéoinductices puisqu’elles sont alors capables de former du tissu minéralisé et du tissu ostéoide. En conclusion, la matrice composite contenant 2 % d’HA étant la plus performante en termes de néoformation osseuse, de néovascularisation et de génération de structures nerveuses, nous l’avons choisie pour les implantations en site osseux.

II. Implantation de la matrice composite en site osseux

La capacité de régénération de la matrice composite contenant 2 % d’HA a été évaluée chez le rat dans des modèles de défaut condylaire fémoral et de défaut mandibulaire.

II. 1. Implantation dans le condyle fémoral de rat

Des défauts circulaires de 3 mm de diamètre ont été réalisés au niveau des condyles fémoraux de rats. Trois conditions ont été testées : le défaut non comblé qui correspond au témoin négatif, le défaut comblé avec notre matrice composite, et le défaut comblé avec la matrice commerciale Collapat® qui a servi de contrôle positif.

Des analyses de micro-CT ont été effectuées à différents temps après l'implantation (7, 15, 30 et 60 jours) pour assurer le suivi de la minéralisation des défauts condylaires. Les images 2D des condyles fémoraux reconstruits par micro-CT 3D sont présentés dans la figure 13A, et la quantification du volume de tissu minéralisé par rapport au volume total (MV/TV) est présentée dans la Figure 13B.

Les images observées par micro-CT révèlent la formation d’un volume minéralisé dans les lésions comblées avec les matrices composites et le Collapat®, tandis qu'une minéralisation moins importante est détectée pour les défauts non comblés (Figure 13A).

Les résultats de l'analyse quantitative (Figure 13B) montrent qu’il y a une minéralisation partielle des défauts non comblés avec une augmentation non-significative du MV/TV en fonction du temps. A 7 jours, ce rapport est de de 8,6 % ± 4,8 % ; puis il augmente pour atteindre 10,3 % ± 5,6 % à 15 jours, 14,7 % ± 5,9 % à 30 jours et 37,5 % ± 3,0 % à 60 jours. Cependant, nous avons observé des fractures du site sur certains animaux, ce qui a compliqué la quantification du MV/TV. Nos précédents travaux avaient montré que des lésions osseuses de 2,8 mm de diamètre pouvaient se réparer naturellement (Schlaubitz et al. 2014). Dans notre cas, des lésions de 3 mm de diamètre ayant été réalisées, fragilisant probablement le site de lésion et provoquant des fractures qui ont retardé ou altéré la cinétique de réparation. Les images de micro-CT révèlent néanmoins une minéralisation en périphérie de la lésion, ce qui explique le rapport MV/TV élevé de la zone d’intérêt (ROI) (Figure 13B). Dans tous les cas ces images observées pour les lésions non comblées sont différentes de celles obtenues après implantation des matrices composites. En effet dans ce cas nous observons une minéralisation qui s’initie par les bords internes de la lésion et qui augmente en fonction du temps post-implantation. La minéralisation est dans un premier temps essentiellement périphérique, puis évolue au cours du temps vers l’intérieur de la lésion. Après 60 jours d’implantation nous observons que la partie corticale s’est reformée contrairement à ce qu’on observe avec le défaut non comblé (Figure 13A). Les analyses quantitatives montrent que des valeurs de MV/TV augmentent de façon significative au cours du temps (Figure 13B). Elles sont de de 8,0 ± 3,9 % après 7 jours d’implantation ; 15,6 ± 7,0 % après 15 jours ; 28,8 ± 14,2 % après 30 jours pour atteindre 56,0 ± 6,9 % après 60 jours.

En ce qui concerne le matériau contrôle Collapat®, le MV/TV est de 40,2 ± 9,4 % dès le 7 ^eme jour d’implantation ce qui est bien plus élevé que celui mesuré avec la matrice composite ELP/peptides/HA. Ce résultat était attendu dans la mesure où ce matériau commercial contient une teneur élevée en particules de phosphate de calcium, particules qui induisent un signal aux rayons X (Figure 13A). Nous n’avons pas observé d’augmentation significative de la minéralisation de J7 à J30. Le rapport de MV/TV ne variant quasiment pas ou peu, le rapport MV/TV est de 67,3 ± 6,3 % après 60 jours.

Ainsi, si l’on compare les trois conditions étudiées on observe que la quantité de tissus minéralisés mesurée entre les jours 7 et 60, est multipliée par 4,4 dans les défauts non comblés, par 7,1 avec notre matrice composite et par 1,7 dans le cas du Collapat®.

Nous avons ensuite réalisé une analyse histologique de la néoformation osseuse induite par les matrices composites.

7 jours, 15 jours, 1 mois et 2 mois après l’implantation, les fémurs ont été explantés, décalcifiés et des coupes histologiques ont été réalisées. Ces coupes ont ensuite été colorées au Trichrome de Masson (Figure 14).

Les coupes histologiques des zones de lésions ont été observées. Pour les lésions non comblées, la limite du défaut est toujours bien visible 7 jours après l’intervention. Après 15 jours, la lésion a été comblée par un tissu principalement collagénique. Au trentième jour, les limites de la lésion sont difficilement distinguables, et du tissu organisé de type osseux apparait en périphérie.

Les coupes histologiques montrent que les matrices composites ELP/peptides/HA se sont bien intégrées dans les défauts osseux. Il n'y a pas de délimitation visible entre la zone de lésion et le matériau. La présence de nombreux noyaux cellulaires à l’intérieur de la matrice confirme une colonisation cellulaire. De plus, l'absence de fibrose est un signe de la bonne biocompatibilité des matrices utilisées. La quantification du tissu ostéoïde nouvellement formé montre une augmentation à partir du 15 ^eme jour, la quantité maximale étant mesurée au 30 ^eme jour. À deux mois, la quantité de tissu ostéoïde avait cependant diminuée. L'analyse des coupes histologiques montre que la formation osseuse se produit de la périphérie vers le centre du défaut, ce qui confirme les images observées par micro-CT (figure 13A).

Concernant le matériau Collapat®, une bonne ostéointégration a également été observée ainsi qu'une formation de tissu osseux de la périphérie vers le centre du défaut. La quantification du tissu ostéoïde nouvellement formé a également montré un maximun de néoformation après 30 jours, ce qui est comparable à la cinétique observée avec nos matrices composites.

Pour observer spécifiquement la présence de cellules osseuses, nous avons réalisé des immunomarquages de l’ostéocalcine qui est un marqueur spécifique du tissu osseux. Les images montrent que les lésions non comblées présentent peu de cellules ostéoblastiques 7 et 15 jours après l’intervention. Après 30 jours, nous détectons quelques cellules ostéoblastiques en bordure de la zone délimitant la lésion osseuse.

Dans le cas des matrices composites et du Collapat®, l’ostéocalcine est détectée dès le 15 ^eme jour, et sa présence est avérée aux 30 ^eme et 60 ^eme jours, confirmant la présence de cellules ostéoblastiques dans les tissus néoformés.

Pour évaluer la vascularisation et l’innervation dans les lésions condylaires, nous avons effectué une analyse des marqueurs vasculaires (Endomucine, Podocalyxine et Meca32) et neuronaux (P III tubuline) en utilisant la technique dite de transparisation de l'os entier. Cette analyse a permis de visualiser l'organisation des réseaux vasculaires et neuronaux dans la zone initialement lésée. Nous avons utilisé un marquage multiple pour faciliter la visualisation des échantillons épais, comme c’est le cas pour les os entiers (Kirst et al. 2020,. Cell 180, 780-795. e25).

Des coupes 2D de la lésion comblée par la matrice composite contenant 2 % d’HA ont été analysées après 30 jours d’implantation. Le tissu osseux apparaît en vert grâce à son autofluorescence, les réseaux vasculaires sont en bleu cyan et les prolongements neuronaux en rouge. Des images 2D obtenues pour chaque condition, 15 et 30 jours après l’implantation ont également été analysées : lésions non comblées, lésions comblées avec les matrices composites ou avec le Collapat®.

Dans une lésion qui n’a pas été comblée, un réseau vasculaire s'est développé. Il semble provenir essentiellement des tissus périphériques musculaires. Après 30 jours, nous détectons des vaisseaux sanguins et des structures nerveuses à l’intérieur de la zone qui avait été lésée. Toutefois, l'analyse histologique par coloration au TM a montré que la partie lésée avait été comblée par un tissu mou, désorganisé, et riche en collagène.

Pour les lésions comblées avec les matrices composites, dès le quinzième jour nous avons observé la formation d'un réseau de vaisseaux sanguins dans l’intégralité de la matrice.

En revanche, pour les défauts comblés avec le Collapat® la vascularisation était principalement présente à la périphérie externe du défaut. De plus, cette vascularisation n’était visible qu’à partir du 30 ^eme jour suivant l’implantation. Ces résultats qualitatifs montrent donc que la matrice Collapat® est moins efficace que notre matrice composite pour promouvoir la vascularisation de l’implant.

En ce qui concerne l'innervation, bien que la majorité des fibres soient présentes dans le périoste recouvrant la surface de l'os cortical, on peut voir quelques fibres à l'intérieur des lésions pour les défauts non comblés ou comblés avec la matrice composite. En revanche, aucune fibre nerveuse n’a été détectée quand les défauts condylaires avaient été comblés par le Collapat®.

IL Implantation de la matrice composite dans un défaut mandibulaire

Afin d'évaluer l'utilisation du matériau développé pour la reconstruction osseuse crânio-faciale, nous avons choisi de créer un modèle de défaut osseux mandibulaire. Parmi les os du crâne seuls deux os sont mobiles, l’os hyoïde et la mandibule. La mandibule présente l’avantage d’être un os plus gros et facilement accessible.

Le défaut mandibulaire offre également l'avantage, par rapport aux défauts de calvaria classiquement utilisés pour tester les matériaux de réparation osseuse, d’être soumis à des contraintes mécaniques élevées. Or, ces contraintes mécaniques sont nécessaires à une réparation osseuse efficace. Au niveau de la mandibule, les contraintes sont essentiellement liées à la mastication. Nous avons donc choisi ce modèle de lésion mandibulaire pour tester les matériaux de réparation osseuse, car il est plus adapté à la réalité physiologique que le défaut de calvaria.

Pour valider ce modèle, une expérience préliminaire a été menée. Un défaut circulaire de 3 mm de diamètre a été créé, puis sa réparation a été suivi par micro-CT. Après 3 mois, aucune réparation osseuse n'a été observée indiquant que le défaut réalisé est bien de taille critique.

Des observations préliminaires en micro-CT ont été effectuées à différents temps après l'implantation (7, 15, 30 jours) pour suivre la minéralisation des défauts mandibulaires. Les images 3D des mandibules reconstruites par micro-CT comblée avec la matrice composite sont présentées dans la figure 15.

Une reconstruction partielle en périphérie du défaut a est observée au 30 ^eme jour. La quantification du MV/TV était de 0.037 ± 0.010 au jour 7 et de 0.040 ± 0.018 au jour 15, donc comparable. Au 30 ^eme jour que nous avons mesuré un rapport MV/TV en augmentation (0.094 ± 0.049).

Des colorations au TM des coupes histologiques obtenues après 15 jours d’implantation de la matrice composite ont été analysées.

De façon très intéressante, nous avons observé à la jonction de l’os et de la matrice, une zone mettant en évidence la présence de tissu osseux néoformé avec la présence de cellules ostéoblastiques bordantes, des logettes avec des ostéocytes au sein d’une structure osseuse qui semble lamellaire. Des vaisseaux sanguins ont également été vus dans le tissu néoformé.

Par ailleurs, si l’on considère la reconstruction du tissu de la périphérie au centre de la lésion, il est important de noter l’invasion tissulaire qui s’accompagne de vascularisation mais aussi de formation de tissu osseux au contact de la matrice, confirmant leur potentiel ostéoconducteur.

Exemple 4: conclusion sur les études in vivo

En conclusion, différents matériaux composites ont été testés in vivo chez le petit animal en site ectopique et orthotopique.

Toutes les matrices testées se sont bien intégrées dans les tissus environnants, et elles n’ont pas induit de réaction inflammatoire majeure. Nous avons également montré que les matrices contenant de l’HA induisaient une minéralisation. Les structures vasculaires ont envahi les implants démontrant leur potentiel angiogénique. La capacité des matrices à stimuler l'innervation a également été démontrée par la présence de nerfs à la périphérie du matériau, en particulier aux stades précoces suivant l'implantation.

La matrice contenant 2 % d’HA a été sélectionnée pour sa capacité à promouvoir la minéralisation ainsi que pour son potentiel angiogénique. Elle a été implantée dans des défauts osseux condylaires et mandibulaires.

La reconstruction osseuse a été améliorée après implantation des matrices composites dans un défaut condylaire comparativement à ce qui s’est produit dans un défaut non comblé. Des structures osseuses organisées exprimant l’ostéocalcine ont été identifiées dans ces hydrogels. Un réseau vasculaire organisé s’est développé dans l’entièreté de la lésion osseuse, ce qui n’a pas été le cas pour le matériau contrôle Collapat®. Les résultats obtenus dans le modèle de défaut mandibulaire montrent des résultats très satisfaisants sur les propriétés ostéoconductrices et angiogène des matrices composites. Les analyses histologiques ont montré que les matériaux se sont bien intégrés. Des structures osseuses et vasculaires ont été retrouvées dès 15 jours d’implantations. Ces résultats montrent donc l'intérêt thérapeutique des matrices composites selon l'invention.