CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a una composición que comprende una matriz soporte y células troncales mesenquimáticas de gelatina de Wharton (WJ-MSC) para el tratamiento de heridas. Y un método para el tratamiento de heridas que comprende aplicar la composición sobre la herida a tratar.

En una realización preferida la herida a tratar es una herida ulcerosa producto de isquemia crónica, donde la composición de la invención promueve la neo-angiogénesis y reparación tisular, de manera de acelerar o mejorar la cicatrización, sin incorporar las células de la composición en la herida a tratar.

ANTECEDENTES

Actualmente el tratamiento de las heridas crónicas es un problema que aún no ha sido resuelto de manera satisfactoria. Dentro de estas heridas crónicas se encuentran las lesiones vasculares, como las heridas ulcerosas, y aquellas asociadas a isquemias crónicas, como las que se producen en la diabetes, donde la más importante es el pie diabético. Adicionalmente, las quemaduras muchas veces requieren de elementos que permitan acelerar la cicatrización de la herida.

La enfermedad arterial periférica (EAP) afecta comúnmente a las arterias que irrigan las piernas y los pies, patología conocida como enfermedad vascular periférica en extremidades o miembros inferiores (Beard JD., 2000). En la EAP la disminución del flujo sanguíneo, producido por la oclusión arterial, puede generar un desbalance entre el aporte y los requerimientos de oxígeno y nutrientes a nivel de la extremidad afectada, fenómeno conocido como isquemia. La isquemia de los miembros inferiores puede manifestarse en forma aguda o crónica y sus consecuencias clínicas son variadas. Se conoce como isquemia aguda a la interrupción brusca del aporte sanguíneo hacia una extremidad. La forma crónica por su parte, es consecuencia de la disminución lenta y progresiva del flujo sanguíneo y se caracteriza por la aparición de dolor muscular al caminar, y en casos severos por la aparición de ulceraciones y gangrena, lo que puede derivar incluso, en la perdida de la extremidad afectada. La diabetes es uno de los factores de riesgo más importantes de isquemia crónica (Giménez y col., 2011 ). Las consecuencias de la diabetes como enfermedad, están determinadas por anomalías metabólicas, caracterizadas por la hiperglicemia dada por alteraciones en la secreción de la insulina o por defectos en su acción. En el ámbito vascular, la hiperglicemia crónica establece una secuencia de fenómenos bioquímicos que finalmente se manifiestan como enfermedades micro y macrovasculares, como son la nefropatía y la retinopatía (enfermedades microvasculares) y las enfermedades vasculares de diversos territorios como el corazón, cerebro y extremidades inferiores (Julio R. y col., 2009). La mala circulación y la menor sensibilidad en los pies de estos pacientes traen como consecuencia una mayor facilidad de ulceración crónica y de infección de las úlceras. El pie diabético es la complicación que mayor número de hospitalizaciones motiva en la población diabética, siendo reconocida además como la principal causa de hospitalización prolongada en las salas de medicina y cirugía general (Brem & Tomic-canic, 2007).

En Estados Unidos y Europa, la incidencia anual de la isquemia crónica de las extremidades está en el rango de entre 500 a 1.000 nuevos casos por millón de personas (Minar E., 2009), siendo la diabetes uno de los factores de riesgo más importantes de esta patología. Se estima que en esta población, su incidencia es 20 veces más frecuente que en la población que no posee esta enfermedad (España Caparros G., 2000). El pie diabético es la complicación que mayor número de hospitalizaciones motiva en la población diabética, se presenta con una prevalencia de entre un 5,3% a un 10,5%, y corresponde a la primera causa de amputaciones mayores de origen no traumático, presentando los diabéticos un riesgo de requerir una amputación 17 a 40 veces mayor respecto de la población general (Lipsky, 2012; Vuorisalo S. y col., 2009; Fard AS y col., 2007).

En Chile, esta patología aqueja a cerca del 7% de la población (OMS, 2009). El año 2000, el Servicio de Salud Metropolitano Central realizó un estudio para evaluar el "pie en riesgo" dentro de la población diabética, resultando que un 63% de los diabéticos estudiados tenía pie de alto riesgo (20 o más puntos de acuerdo a norma de evaluación año 1996), así como un 13,6 % de amputaciones, siendo la tasa de amputaciones dentro de la población general de 40/100.000 adultos de 20 y más años de edad. El año 2002 se estimó que alrededor de 6 millones de pacientes beneficiarios del sistema público sufrían de diabetes (MinSal, 2006). Estudios más recientes indican que en Chile la incidencia de isquemia en las ulceras del pie diabético es cercana al 57%. Actualmente, no existen opciones disponibles de reconstrucción del tejido afectado por isquemia que deriva en ulceraciones, y los tratamientos involucrados en el cuidado de dichas heridas son sumamente costosos (Hirsch y col., 2008). Esto último es particularmente relevante considerando que más de 220 millones de personas en el mundo padecen de diabetes, proyectándose más de 440 millones de casos para el año 2025.

El manejo del píe diabético requiere en una primera etapa, terapia antibiótica, drenaje quirúrgico y la resección del tejido muerto, pues la primera prioridad es controlar la infección a nivel local. Una vez controlada, se realiza una evaluación del paciente para detectar la existencia de isquemia a nivel del miembro afectado. Si se demuestra que presenta isquemia, el paciente puede ser sometido a un procedimiento de revascularización percutánea o quirúrgica, sin embargo, en una proporción considerable de pacientes (15%) la revascularización no es una opción efectiva. De estos pacientes, más del 40% requerirá una amputación mayor y el 20% va a morir dentro de 6 meses. Por otra parte, en aquellos pacientes que son sometidos a la intervención quirúrgica existe una alta tasa de morbilidad y mortalidad (Lipsky, 2012; Nikol S. y col., 2008; Fard AS y col., 2007; Faries PL. y col., 2004).

El costo de tratar una ulcera simple varía entre los USD 5000 y los USD 8000. La admisión en un centro hospitalario a causa de una ulcera infectada tiene un costo aproximado de USD 15.000 y la amputación de una extremidad tiene un costo que va entre los USD 50.000 a USD 150.000 (Fard AS y col., 2007). Actualmente, no existen opciones disponibles de reconstrucción del tejido afectado por isquemia que deriva en ulceraciones o gangrena.

Como ya indicamos, aunque la composición de la invención tiene su aplicación preferida en el campo del tratamiento de heridas ulcerosas tales como el pie diabético, esta puede ser aplicada sobre cualquier herida, independientemente de su origen, para promover la cicatrización de la misma. Entre las heridas que pueden ser tratadas con la composición de la invención se encuentran todas las heridas ulcerosas, incluyendo las úlceras varicosas, las quemaduras, heridas cortopunzantes profundas, escaras, etc.

La posibilidad de utilizar células troncales (SC) en medicina con fines regenerativos ofrece posibilidades nunca imaginadas previamente en esta disciplina y es por ello que las miradas se han volcado hacia el uso de SC para el desarrollo de eventuales tratamientos ( izuno H. y col., 2010; Wu KH. Y col., 2007). En los últimos años el uso de estas células ha tomado un tremendo impulso en el área clínica, debido a los grandes avances en la comprensión de los mecanismos a través de los cuales ejercen sus efectos favorables, y al éxito alcanzado en los estudios clínicos de terapia celular en las que han sido utilizadas (Salem HK. Y col., 2009).

Las SC, son un tipo específico de células indiferenciadas, que tienen la capacidad de auto-renovarse y el potencial para diferenciarse en un amplio rango de linajes celulares (Caplan I. y col., 2006; Flores-Figueroa E. y col., 2006). En función del estado de desarrollo del individuo del cual se originan, pueden ser clasificadas como células troncales embrionarias (ESC), fetales (FSC) o adultas (ASC) (Pappa Kl. Y col., 2009; Wacharaprechanont T., 2005). Dentro de estos dos últimos grupos es posible encontrar un tipo particular de SC llamado células troncales mesenquimáticas (MSC) (Phinney & Prockop, 2007).

Las MSC han sido descritas como células que poseen una serie de características que las hacen muy atractivas para uso terapéutico:

- Las MSC son células multipotenciales, tienen la capacidad de diferenciarse y dar origen a diferentes linajes mesenquimáticos, como adipocitos, osteocitos, condrocitos, miocitos, entre otros, y de transdiferenciar hacia otros linajes (Uccelli A y col., 2008; Pountos I. y col., 2005; Minguell JJ y col., 2001).

- Poseen la capacidad de migrar hacia zonas patológicas, incluyendo heridas o áreas isquémicas (Roufosse CA. Y col., 2004).

- Producen una serie de factores bioactivos (anti-fibroticos, anti-apoptóticos, pro- angiogénicos y mitóticos) que van en post de la sobrevida del tejido dañado (Caplan Al., 2009; Shabbir A. y col., 2009; Caplan Al. Y col. 2006), relacionados con procesos de angiogénesis, migración hacia el sitio de la herida, regeneración de células dañadas, proliferación y remodelamiento de la matriz extracelular (Burlacu y col., 2013; Ribeiro y col., 2012; Hematti, 2009; Valtieri & Sorrentino, 2008)

□ Son células privilegiadas en términos inmunológicos, ya que entre otras características expresan niveles bajos del complejo de histocompatibilidad clase I (MHC-I) y no presentan niveles de expresión para el MHC-ll ni moléculas co- estimuladoras, lo que las hace hipo-inmunogénicas, siendo toleradas entonces por el sistema inmune del receptor cuando son utilizadas en trasplantes de tipo alogénico (Morandi y col., 2008; Uccelli A. y col., 2008; Ryan J. y col., 2005; Le Blanc K. y col., 2003).

Estas propiedades han generado una intensa investigación en el uso de estas células para la regeneración y la neovascularización de tejidos dañados, bien por su mera integración tisular o por la secreción localizada de factores de crecimiento o factores de supervivencia (Sukpat y col., 2013; Danner y col., 2012; Salem & Thiemermann 2010; Azari y col., 2011 ; Volarevic y col., 2011 ; Bartosh y col., 2010).

Considerando las anormalidades fisiopatológicas presentes en heridas crónicas, como es el caso del pie diabético, las MSC surgen como una atractiva alternativa para el tratamiento de este tipo de lesiones, puesto que podrían ayudar a la reconstitución de la dermis, la vascularización y otros componentes requeridos para una óptima cura (Volk S., 2009; Dash NR. Y col., 2009).

Según el reporte desarrollado la Industria de las SC, Select Bíosciences, en 2007- 2008, los tipos de SC usados con mayor frecuencia en actividades de investigación y comercialización son las MSC obtenidas desde individuos adultos y las ESC, ambas de origen humano (Select Bíosciences, 2008). Sin embargo, el uso de estas células presenta algunas limitaciones.

En el caso de las ESC su obtención está fuertemente limitada por temas éticos y regúlatenos, al ser obtenidas a partir de los primeros estadios del desarrollo embrionario (Insausti CL. y col., 2010; Flores-Figueroa E. y col., 2006).

Por otro lado, la obtención de una cantidad terapéutica de ASC, extraídas principalmente desde la medula ósea (BM) y el tejido adiposo, está asociada a la realización de un procedimiento quirúrgico que requiere anestesia y hospitalización (Insausti CL. y col., 2010; Wu KH. y col., 2007). Adicionalmente, en el caso de las ASC se ha demostrado que existe una disminución de su capacidad de proliferación y su potencial de diferenciación en directa relación con la edad del paciente del que son extraídas (Wagner W. y col., 2009; Fehrer C. y col., 2005). De la misma forma, las células obtenidas desde individuos que padecen alguna patología crónica no poseen las mismas potencialidades que las obtenidas desde individuos sanos. Por ejemplo, ha sido documentado que las MSC obtenidas desde la BM de pacientes con Hepatitis B crónica o cirrosis presentan una capacidad de proliferación baja (Zhong YS. y col., 2010). Por otra parte, las MSC obtenidas de pacientes diabéticos presentan baja capacidad de proliferación, disminución del potencial de diferenciación, además gran porcentaje de ellas se encuentra en un estado senescente (Stolzing A. y col., 2010; Kume S. y col., 2005). Finalmente, las MSC obtenidas desde la BM o el tejido adiposo de pacientes con diabetes, anemia o falla renal, presentan un potencial angiogénico disminuido (Li TS. Y col., 2010; El-Ftesi S. y col., 2009). La disminución de las capacidades y potencialidades de las ASC con respecto a la edad del paciente y el padecimiento de enfermedades crónicas, limita su uso en trasplantes de tipo autólogo. Frente a la existencia de estas limitaciones en el uso de las ESC y las ASC, se hace necesaria una fuente alternativa de MSC. Para esto es crucial la identificación de nuevas fuentes de MSC y la definición de su uso potencial es el centro de nuestra propuesta.

El cordón umbilical es una fuente rica de SC tejido específicas. Hace 20 años que está siendo utilizado como fuente de HSC para restablecer la hematopoyesis, tanto en trastornos malignos como no malignos (Pappa Kl. y col, 2009).

El cordón umbilical ha sido considerado una atractiva fuente de células MSC (Pappa Kl. y col., 2009; Erices A. y col., 2000). La utilización clínica de las MSC derivadas de cordón umbilical es atractiva porque son fáciles de obtener y no poseen las limitaciones presentadas por las obtenidas desde otras fuentes. Las MSC han sido aisladas desde varios compartimientos del cordón umbilical, específicamente desde la sangre, el sub-endotelio de la vena que lo recorre y recientemente desde la gelatina de Wharton (WJ) (Troyer DL. y col., 2008). Se denomina WJ al tejido conjuntivo- gelatinoso que rodea las arterias y vena en el interior del cordón umbilical. La obtención de MSC desde sangre de cordón umbilical tiene una baja eficiencia en comparación a su obtención desde la BM, ya que el número de MSC en las células mononucleadas de la sangre de cordón es muy bajo (Musina RA. Y col., 2007). Sin embargo, la obtención de MSC de la WJ es muy eficiente, pues estas células son mucho más abundantes en este tejido que en la sangre de cordón o la BM. Por otra parte, las MSC de WJ (WJ-MSC) poseen una mayor capacidad para ser expandidas in vitro (Pappa Kl. y col., 2009; Troyer DL. y col., 2008; Secco M. y col., 2008). Adicionalmente, ha sido reportado que un porcentaje cercano al 20% de las WJ-MSC al ser expandidas no expresan los genes ni del MHC-I ni del MHC-II, lo que podría hacerlas aún mejor toleradas en un trasplante alogénico que las obtenidas desde tejidos adultos (Pappa Kl., 2009; Gucciardo L. y col., 2009).

Teniendo en cuenta lo anterior, los inventores han desarrollado una nueva composición para el tratamiento de heridas que comprende una matriz soporte y células troncales mesenquimáticas de gelatina de Wharton (WJ-MSC), donde la composición al ser aplicada sobre la herida promueve la neo-angiogénesis y reparación tisular, de manera de acelerar o mejorar la cicatrización, sin incorporarse las células de la composición en la circulación del paciente. Esto se logra por los factores secretados por las WJ-MSC, retenidas en el parche, los que se transfieren desde la composición de la invención al tejido dañado promoviendo su cicatrización. ARTE PREVIO

La presente invención se refiere a una estructura de soporte (matriz) que contiene células troncales mesenquimáticas obtenidas desde gelatina de Wharton. Dicha estructura es aplicada a heridas para promover la neo-angiogénesis, de manera de acelerar o mejorar la cicatrización. Una característica diferenciadora de la presente invención es que se evita o reduce al máximo la integración de las células foráneas en el paciente, de manera que el efecto técnico es ejercido a través de la difusión de factores angiogénicos producidos por las células hacia la herida, sin considerar la integración de las células mismas al paciente.

Previo al desarrollo de la presente invención se habían desarrollado parches de cicatrización utilizando células mesenquimáticas del mismo paciente a tratar, con el objeto de generar un transplante autólogo, que incorporara las células de la composición como parte del tejido reparado. Por ejemplo, el documento AU2009320446 (A1) describe una matriz donde se incorporan células mesenquimales progenitoras obtenidas demúsculo procesa del mismo paciente, para mejorar la cicatrización de las heridas. Esta aproximación tiene serias limitaciones, como se discutió previamente, ya que en los pacientes con enfermedades crónicas que requieren este tipo de tratamiento, las células mesenquimáticas de médula ósea o de tejido adiposo tienen baja capacidad de proliferación.

Los inventores han resuelto este problema técnico al no intentar la incorporación de las células mesenquimáticas como transplante, sino que utilizarlas como una fuente natural de factores que promueven la cicatrización y angiogénesis. De este modo pueden ser utilizadas células exógenas, con alta capacidad de producción de estos factores, como son las WJ-MSC.

En el estado del arte no se ha encontrado ningún documento que contenga todos y cada uno de los elementos que componen la presente invención.

En primer lugar es conocido en el estado del arte obtención de células troncales mesenquimáticas desde la gelatina de Wharton, esto se describe en la publicación WO2012131618 (A1), donde las WJ-MSC se formulan en una composición farmacéutica la que es útil para manejar desórdenes de carácter inmunológico, por las propiedades inmunomoduladoras de estas células.

Por otra parte se conocían composiciones para la cicatrización que incluyen células troncales mesenquimáticas, pero no WJ-MSC. Por ejemplo, la solicitud US2011256089 (A1) describe una composición de hidrogel para aplicar células a una zona dañada para promover su cicatrización. Se indica que se pueden usar células troncales mesenquimáticas, entre muchos otros tipos de células, y laestrategia es que las células del gel se integren al tejido a reparar. Esta misma estrategia, de integrar células en el tejido a reparar se emplea en la solicitud US2012134965, la que divulga composiciones para tratamiento de enfermedades vasculares en general, donde la composición contiene células troncales como componente activo, no se mencionan la WJ-MSC y como indicamos el objetivo es que las células se incorporen al tejido a tratar.

Otra estrategia en el estado del arte es la empleada en la solicitud AU2012205269 (A1), donde se describe la aplicación de células mesenquimales para, promover angiogénesis y mejorar cicatrización entre otras aplicaciones, a través de la administración sistémica de las mismas. En las reivindicaciones se describen dosis de células por kilogramo, y se indica además que la administración puede ser endovenosa.

Como puede apreciarse en ninguno de los documentos analizados ni por sí mismos ni por la combinación de 2 omás documentos, se anticipa la composición de la invención, ni el método para el tratamiento de heridas que comprende aplicar la composición sobre la herida a tratar sin incorporar las células de la composición en la herida a tratar.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. (A) Se muestran las tinciones de 2 matrices (IM y colágeno), posterior a la incubación del ensayo MTT en ausencia y presencia de WJ-MSC (1 x 10 ⁵ células), a distintos tiempos de incubación in vitro. (B) Cuantificación de la actividad metabólica de WJ-MSC sembradas en IM y colágeno, a distintos tiempos de incubación. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M. (n=6). *P < 0.05 IM vs. colágeno.

Figura 2. Abundancia de la proteína VEGF en extractos celulares obtenidos a partir de las WJ-MSC cultivadas por 24 horas en matrices de colágeno e IM en un medio de cultivo libre de suero. Los símbolos representan (-) ausencia o (+) presencia de WJ- MSC. Los valores corresponden al promedio ± S.E.M. (n=6). *P < 0,05 IM vs. colágeno.

Figura 3. {A) Foto representativa del secretoma (medio condicionado) proveniente de WJ-MSC cultivadas en ausencia de suero (24 horas) obtenido de las células sembradas en el colágeno (izquierda) e IM (derecha). (B) El gráfico muestra los niveles de secreción relativa que fueron agrupados según su función celular. Las diferentes intensidades de pixeles fueron normalizados por el control positivo (puntos internos de ubicación conocida en cada membrana). Los valores corresponden al promedio ± S.E.M. (n=3). *P < 0.05, IM vs. colágeno.

Figura 4. (A) Foto representativa de ensayo CAM para Matriz IM+Medio de cultivo control DMEM (izquierda), Matriz IM+VEGF (centro) y la composición de la invención Matriz IM+ células WJ-MSC (derecha). (B) El gráfico muestra la cuantificación de los vasos saguíneos en las tres condiciones a 24, 48, 72 y 96 horas después de introducida la composición. La diferencia en los promedios del número de vasos sanguíneos generados por las matrices sembradas con WJ-MSC y DMEM determinó por ANOVA * P> 0,05

Figura 5. (A) Foto representativa de células humanas adheridas a CAM después de 96 horas con Matriz IM+Medio de cultivo DMEM por inmunohistoquímica, utilizando anticuerpo anti- Presinilin 1 humana (Barra de escala 1 mm en A, y 100 um A ') (β) Foto representativa de células humanas adheridas a CAM después de 96 horas con Matriz IM+ células WJ-MSC por inmunohistoquímica, utilizando anticuerpo anti- Presinilin 1 humana (Barra de escala 1 mm en B, y 100 um B ').

Figura 6. (A) Fotografías representativas de transiluminación de tejido y la segmentación digital de tejidos tratados con composiciones que comprenden Matriz IM (Control), Matriz IM+ células WJ-MSC (invención), Matriz IM+ células AD-MSC (ejemplo comparativo) (n = 12 para el control, 13 para WJ-MSC y 3 para AD-MSC Las barras de escala:. 5 mm. (B) La cuantificación de la segmentación digitales mostró significativamente mayores niveles de vascularización para las composiciones que contienen WJ-MSC respecto al control de sólo matriz IM y para las composiciones que contienen AD-MSC. Los valores se normalizaron con la piel normal y se expresaron como media ± SEM.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una composición que comprende una matriz soporte y células troncales mesenqu imáticas de gelatina de Wharton para el tratamiento de heridas. Y un método para el tratamiento de heridas que comprende aplicar la composición sobre la herida a tratar.

La herida a tratar se escoge entre heridas crónicas o agudas, tales como todas las heridas ulcerosas, incluyendo las úlceras varicosas y las úlceras asociadas a isquemia tales como el pie diabético; las quemaduras, las heridas cortopunzantes profundas, las escaras, etc. En una realización preferida la herida a tratar es una herida ulcerosa producto de isquemia crónica, donde la composición de la invención promueve la neo- angiogénesis y reparación tisular, de manera de acelerar o mejorar la cicatrización, sin incorporar las células de la composición en la herida a tratar.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una composición útil para el tratamiento de heridas crónicas o agudas, tales como todas las heridas ulcerosas, incluyendo las úlceras varicosas y las úlceras asociadas a isquemia tales como el pie diabético; las quemaduras, las heridas cortopunzantes profundas, las escaras, etc. En especial la composición de la invención es útil en el tratamiento de heridas crónicas o de difícil cicatrización, como es el caso de las heridas producidas por isquemias prolongadas, tales como el pie diabético. La composición comprende de dos elementos esenciales, una matriz soporte y células troncales mesenquimáticas de gelatina de Wharton.

La matriz soporte debe ser flexible y permitir integrar en ella las WJ-MSC vivas. La matriz puede estar compuesta por cualquier polímero biocompatible que no sea biadsorbible, ya que las WJ-MSC no deben integrarse a la herida. Ejemplos de polímeros biocompatibles apropiados para la matriz soporte de la presente invención son: colágeno sustancialmente puro o combinado con otros compuestos tales como glicosaminoglicanos y polisiloxano semi permeable (silicona), pectina, carboxicelulosa, quitosano, combinaciones de los mismos u cualquier otro polímero biocompatible que exista en el arte. En una realización se utiliza la matriz soporte comercial, IntegraTM atrix (IM).

El segundo componente de la composición de la invención son las células troncales mesenquimáticas de gelatina de Wharton o WJ-MSC, las que se aislan desde cordón el umbilical.

Las WJ-MSC son las responsables del efecto terapéutico de la composición ya que secretan distintos factores que favorecen la cicatrización de heridas, tales como: factores pro-angiogénesis como angiogenina, VEGF, uPA, IGFBP-3; de factores de migración como TIMP-1 , Serpina E1 , de factores de respuesta inflamatorio como IL-8, MCP-1 , Pentraxina-3, y de factores de reparación de tejidos como HGF y Trombospondina-1.

De modo opcional la matriz puede comprender otros componentes que permitan aumentar la sobrevida de las WJ-MSC o componentes con acción farmacológica para el tratamiento de heridas. Dentro de los componentes que pueden aumentar la sobrevida de las WJ-MSC están el medio de cultivo para células humanas, tales como el medio DMEM, o una composición tampón de pH fisiológico (pH 7,2) y los nutrientes como glucosa, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. No obstante, se ha observado que las WJ-MSC pueden crecer en condiciones de hipoxia y sobreviven sin aporte de nutrientes hasta por 10 días.

Dentro de los componentes de acción farmacológica cicatrizante que opcionalmente puede comprender la composición de la invención se encuentran: sulfadiazina argéntica, poli(n-acetilgalactosamina-d-glucurónico) polisulfato sodio, cloranfenicol, retinol palmitato, benzalconio cloruro, benzoato bencilo, aminoácidos: alanina, cisteína, vitaminas C, E, F. Otros componentes cicatrizantes que pueden agregarse a la composición son componentes que también son secretados por las WJ-MSC con el objeto de aumentar la concentración del mismo, como por ejemplo: angiogenina, VEGF, uPA, IGFBP-3, TIMP-1 , Serpina E1 , IL-8, MCP-1 , Pentraxina-3, HGF y/o Trombospondina-1.

En un segundo aspecto la invención se refiere a un método para el tratamiento de heridas que comprende aplicar la composición directamente sobre la herida a tratar. La composición de la invención puede permanecer activa y estable sobre la herida por un plazo de hasta 10 días o más, después de ese tiempo la composición se comienza a degradar, y caer de la herida en forma natural, sin que exista transferencias de las WJ-MSC al tejido de la herida tratada. A los 10 días o incluso antes, dependiendo de la evolución de la herida, se puede aplicar nuevamente la composición sobre la herida, sin necesidad de eliminar los restos de la primera composición aplicada. Este tratamiento se puede repetir las veces que sea necesario hasta lograr la cicatrización de la herida, como en el caso de heridas de difícil cicatrización cómo por ejemplo el pie diabético.

En una realización preferida la herida a tratar es una herida ulcerosa producto de isquemia crónica, donde la composición de la invención promueve la neo-angiogénesis y reparación dérmica, de manera de acelerar o mejorar la cicatrización, sin incorporar las células de la composición en la herida a tratar.

El que las WJ-MSC no se incorporen al tejido a tratar es una de las grandes ventajas de la composición, ya que elimina los posibles rechazos del paciente a las células exógenas y sólo otorga al tejido que necesita cicatrizar los factores que promueven la cicatrización y angiogénesis. La matriz soporte debe comprender el polímero biocompatible en una conformación que asegure la flexibilidad de la misma.

Las WJ-MSC se incorporan en la matriz soporte en una concentración de entre 1 x 10 ² a 1 x 10 ⁸ células por cada 100pL y 1 mL de matriz. Especialmente se prefieren composiciones con una concentración de WJ-MSC de entre 1 x 10 ⁴ a 1 x 10 ⁶ células por cada 00pL y 1 mL de matriz.

Las WJ-MSC se incorporan en la matriz soporte en una concentración de entre 1 x 10 ² a 1 x 10 ⁸ células por entre 1 y 100 pL de matriz. Especialmente se prefieren composiciones con una concentración de WJ-MSC de entre 1 x 10 ⁴ a 1 x 10 ⁶ células por cada 1 y 100 pL de matriz.

Posteriormente la composición se extiende sobre una superficie antiadherente para formar láminas de la composición. La naturaleza de la matriz soporte permite que la composición se adhiera a la herida a tratar sin necesidad de agregar compuestos de adhesión a la misma. Opcionalmente se pueden agregar componentes adhesivos biocompatibles.

Como ya indicamos, la composición de la invención se presenta como láminas de la matriz soporte con las WJ-MSC insertadas en ella, y en caso dado con los componentes adicionales, de un espesor de entre 0,1 - 1 mm. la forma y medidas de las láminas es variable, y no afectan la efectividad de la invención. De modo conveniente, la composición de la invención se presenta en láminas de un área de entre 4 mm ² a 100 cm ² .

Una vez que se ha obtenido una lámina de la composición de la invención, esta se aplica sobre la herida a tratar, presionando suavemente para que quede adherida a la herida limpia, no es necesario ningún procedimiento adicional para el tratamiento de la herida.

En los ejemplos se demuestra que la composición de la invención efectivamente permite promover la angiogénesis y cicatrización, solucionando este importante problema técnico de la Industria Farmacéutica.

EJEMPLOS DE APLICACIÓN

Ejemplo 1. Obtención de la composición para la cicatrización de heridas, a) Utilizando matriz soporte de colágeno. Se generó la composición de la invención utilizando matriz soporte de colágeno I, donde el colágeno I se obtuvo en el laboratorio a partir de cola de rata. La composición de la invención se generó en una proporción 7:2:1 , donde el 70% corresponde a la preparación de colágeno, el 20% a medio DMEM (4X, pH 7,2) y el 10% restante a las WJ-MSC (1 x 10 ⁴ ) resuspendidas en medio completo.

Rápidamente, se depositaron 80 μΙ de la esta composición en placas de 96 pocilios y luego se incubó a 37°C durante un período de 5-10 minutos para permitir que el colágeno polimerice.

b) Utilizando matriz soporte IntegraTM Matrix (IM).

Se generó la composición de la invención utilizando una matriz soporte comercial, matrices IntegraTM Matrix (IM) (Integra®, LifeScience Corporation). IM es un dispositivo aprovado por la FDA de cuidado de heridas avanzadas, compuesto por una matriz porosa de colágeno del tendón reticulado de la especie bovina y glicosaminoglicanos y polisiloxano semi permeable (silicona). Para esto, trozos de IM de 6 mm diámetro fueron utilizados y secadas con gasa estéril, para luego depositarlas en una placa de 24 pocilios donde se sembraron 1 x 10 ⁴ células WJ-MSC resuspendidas en medio de cultivo completo, y se incubaron por 1 hora a 37°C para permitir que las células WJ-MSC se integren a la matriz soporte IM.

Ejemplo 2. Evaluación de la viabilidad de las WJ-MSC en la composición para la cicatrización de heridas.

Se evaluó en primer lugar la actividad metabólica ¡n vitro de las WJ-MSC en las composiciones de la invención generadas en el Ejemplo 1 , como indicador de la viabilidad de las mismas. La actividad metabólica de las WJ-MSC en ambas matrices se cuantificó mediante un ensayo de MTT, basado en la reducción metabólica del reactivo bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazolio (MTT). Posterior a cada uno de los tiempos de incubación (12, 24 y 48 horas, así como 5 y 10 días) y en ausencia de suero fetal de bovino (FBS), se cuantificó por absorbencia a 550 nm (OD 500nm) la actividad metabólica. Los resultados obtenidos muestran que la actividad metabólica de las WJ-MSC se mantuvo en ambas composiciones de la invención hasta 10 días después de generadas (Figura 1). Los resultados muestran que la actividad metabólica de las WJ-MSC se mantuvo significativamente mayor en las composiciones de la invención que utilizan matriz soporte IM.

Los resultados indican que la actividad metabólica de las WJ-MSC en la condición inicial (12 horas) es similar en ambas composiciones de la invención, y que como es esperable ésta decae en el tiempo, no obstante en un plazo tan prolongado como a los diez días de generadas las composiciones, aún se observa una actividad metabólica importante en las células WJ-MSC de ambas composiciones de la invención. Donde en las composiciones de la invención que comprenden colágeno la actividad es un 25% de la actividad inicial, mientras que en las composiciones de la invención que comprenden IM la actividad es de un 70% de la actividad inicial. (Figura 1).

Ejemplo 3. Evaluación de la producción de VEGF en la composición para la cicatrización de heridas.

Las composiciones de la invención son útiles para acelerar o mejorar la cicatrización en heridas si las células WJ-MSC secretan factores angiogénicos. Por esta razón se evaluó la producción de VEGF, un factor angiogénico muy importante en ambas composiciones de la invención generadas en el Ejemplo 1, al cabo de 24 horas de cultivo.

Se determinó la expresión de VEGF en las composiciones de la invención, con colágeno e IM y los resultados se normalizaron con la expresión de β-actina, como control negativo se utilizó las matrices sin células WJ-MSC. Los resultados se muestran en la Figura 2, en ambas composiciones de la invención se observa una alta expresión de VEGF en los Usados celulares. Este resultado demuestra que las composiciones de la invención pueden promover la angiogénesis ya que suministran una gran cantidad de VEGF sobre la herida en la que se aplica la composición.

Ejemplo 4. Evaluación de la producción de otros factores tróficos en la composición para la cicatrización de heridas.

Se analizó la producción de otros factores tróficos que promueven la angiogénesis en las 2 composiciones de la invención generadas en el Ejemplo 1. Para evaluar esto, se colectaron los medios condicionados de las composiciones de la invención a 24 horas de generadas para ensayos de Proteome Profiler Array según las indicaciones del fabricante (Human Angiogenesis Array Kit, Protome ProfilerTM Antibody Arrays, R&D Systems ARY007). Este kit permitió detectar simultáneamente, de manera rápida y sensible, los niveles de expresión de 55 proteínas relacionadas con los procesos angiogénicos. El kit provee de membranas de nitrocelulosa que contienen adosados anticuerpos específicos en distintos puntos por duplicado, por lo que para detectar la señal de dichas proteínas la muestra debe ser preparada con un cocktail de anticuerpos acoplados a biotina. Para realizar este ensayo, la membrana fue incubada con el medio condicionado durante una noche. Posteriormente, se realizaron lavados (3 x 10 minutos) y se incubó con el anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa de rábano (HRP) que reconoce a la biotina. Finalmente, mediante una reacción de quimioluminiscencia se detectó la cantidad de cada uno de los analitos presentes en el medio condicionado de las composiciones de la invención. Nuestros resultados indicaron que las composiciones de la invención secretan una amplia gama de factores tróficos, además de VEGF, que favorecen la cicatrización, ver Figura 3.

En la Figura 3 B se muestran los niveles de secreción relativa de las 55 proteínas analizadas, todas relacionadas con los procesos angiogénicos, las que fueron agrupadas según su función celular, en ambas composiciones de la invención. Las diferentes intensidades de pixeles fueron normalizados por el control positivo (puntos internos de ubicación conocida en cada membrana). Los valores corresponden al promedio ± S.E.M. (n=3). *P < 0.05, IM vs. colágeno. Si bien se observa que las composiciones de la invención que emplean matriz soporte IM muestran una mayor secreción de las proteínas analizadas, ambas composiciones de la invención secretan cantidades significativas de factores pro-angiogénesis como angiogenina, VEGF, uPA, IGFBP-3; de factores de migración como TIMP-1 , Serpina E1 , de factores de respuesta inflamatorio como IL-8, MCP-1 , Pentraxina-3, y de factores de reparación de tejidos como HGF y Trombospondina-1.

Ejemplo 5. Evaluación de la angiogénesis in vivo con la composición para la cicatrización de heridas.

Para evaluar el efecto in vivo de las composiciones de la invención se realizó un ensayo de membrana corioalantoica de embrión de pollo, conocido como ensayo CAM, por sus siglas en inglés. Este método es un modelo clásico para estudiar la neovascularización. El ensayo consistió en introducir una membrana matriz IM con diferentes composiciones a analizar, control: Matriz IM+Medio de cultivo DMEM, Matriz IM+VEGF (10 ng/μΙ) y la composición de la invención Matriz IM+ células WJ-MSC (5 x 10 ⁵ ), sobre la membrana corioalantoica de embrión de pollo a través de un agujero en la cáscara del huevo desde el día 8 al día 12 del desarrollo embrionario (E8-E12). Posteriormente se cuantificó la angiogénesis en la membrana cuantificando los vasos que cruzan en un perímetro de 4 mm alrededor de la membrana. Los resultados muestran que la composición de la invención supera la angiogénesis generada por la matriz soporte en combinación con el factor angiogénico VEGF puro, utilizado como control positivo (Figura 4).

Adicionalmente se estudió la transferencia de células desde la composición a la membrana corioalantoica de embrión de pollo, por inmunohistoquímica, utilizando el anticuerpo anti- Presinilin 1 humana. La Figura 5 muestra la distribución de las células humanas en el ensayo Matriz IM+Medio de cultivo DMEM y con la composición de la invención Matriz IM+ células WJ-MSC después de 96 h en contacto con ésta, evidenciándose que la mayoría de las células se identifican en la IM y no así en la CAM por lo que se puede afirmar que la migración de WJ-MSC, no es detectable. Ejemplo 6. Comparación de la composición de la invención con la matriz IM vacía y con I + células AD-ÍUISC.

Para comparar los efectos de la composición de la invención con los efectos regenerativos asociados a la matriz IM, y al uso de células mesenquimáticas provenientes de tejido adiposo adulto, que corresponde a la práctica habitual de los transplantes autólogos, se realizó un experimento de regeneración dérmica en modelo murino evaluando las 3 condiciones: Matriz IM (Control), Matriz IM+ células WJ-MSC (invención), Matriz IM+ células AD-MSC (ejemplo comparativo). Se cuantificó el porcentaje de vascularización a los 5 y 10 días después de la aplicación de la composición. Los resultados se muestran en la Figura 6, donde se puede apreciar que la composición de la invención muestra una angiogénesis significativamente mayor a la obtenida en las otras 2 condiciones control. En la Figura 6A se muestran fotografías de los vasos sanguíneos y en la Figura 6 B se representa la cuantificación de los mismos. APLICACIÓN INDUSTRIAL

Como se ha descrito previamente, la presente invención, referida a una composición que comprende una matriz soporte y células troncales mesenquimaíes de gelatina de Wharton, es útil en la industria farmacéutica para el tratamiento de heridas, especialmente para inducir la la neo-angiogénesis, de manera de acelerar o mejorar la cicatrización, sin incorporar las células de la composición en la herida a tratar.

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