ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к области разработки терапевтических композиций и их применению для заживления ран, которые расположены на коже или на влажных эпителиальных тканях, слизистых оболочках млекопитающих. Кроме лечения механического повреждения участка кожи, мышц и мягких тканей млекопитающего, данную композицию можно применять для лечения термических и химических ожогов, некротических и экссудативных ран и язв.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Плохое заживление ран является причиной многочисленных научных исследований для разработки новых композиций и препаратов для лечения. Сложность лечения состоит в том, что в ходе лечения процесс заживления раны проходит через этапы снятия воспаления, этап восстановления активности клеток, этап пролиферации, этап восстановления кожного покрова, при этом каждый этап содержит свои требования к препарату и способу его применения. Кроме этого необходимо, чтобы свойства препарата обеспечивали воздухопроницаемость и защиту раны от внешних вирусов и бактерий.

При экспериментальном исследовании различных средств для лечения ран и дефектов кожи было установлено, что можно значительно повысить эффективность лечения за счет применения эффективных антиоксидантов. Полезные свойства применения антиоксидантов при лечении ран изучаются длительное время. Эффективный пример применения антиоксидантов для лечения ран млекопитающих описан в патенте RU 2280448 [1]. В патенте описано средство на основе рекомбинантного белка пероксиредоксина 6 (Ргх VI), который обеспечивает эффективную защиту органов от воспалительных процессов, вызванных механическими повреждениями кожи и ткани в результате травм, инъекций лекарственных препаратов или хирургических операций. При лечении поражений кожи раствор композиции наносят тонким слоем и/или делают аппликацию на место поражения. Получение рекомбинантного белка является достаточно дорогостоящей процедурой, что ограничивает его применение.

К другому типу антиоксиданта, используемого для лечения ран, можно отнести наночастицы на основе оксида церия. Известен ряд публикаций, в которых обсуждаются возможности применения наночастиц оксида церия для заживления ран. В статье Revathy Davan (Revathy Davan et al. Cerium Oxide Nanoparticles Promotes Wound Healing Activity in In-Vivo Animal Model. https://www.researchgate.net/publication/273621984 (December 2012)) [2] использованы наночастицы оксида церия размером 160 нм, изготовленные с использованием простого и эффективного золь-гель процесса. Отмечается, что применение 2%-ного наноцерия увеличило ранозаживляющую активность в значительной степени.

В работе Chigurupati S. et al. (Chigurupati S. et al. Effects of cerium oxide nanoparticles on the growth of keratinocytes, fibroblasts and vascular endothelial cells in cutaneous wound healing. Biomaterials 34, 2194-2201 (2013)) [3] приведены данные о том, что местное применение водорастворимых наночастиц оксида церия (Nanoceria) ускоряет заживление полнослойной кожной раны у мышей за счет усиления пролиферации и миграции фибробластов, кератиноцитов и эндотелиальных клеток сосудов. В статье Legon'kova О.А. et al. (Legon'kova О. A. et al. Experimental Study of the Effects of Nanodispersed Ceria on Wound Repair. Bull Exp Biol Med. 2017 Jan;162(3):395-399) [4] приведены данные о том, что диоксид церия стимулировал заживление ран, что проявлялось в усадке области ожоговой раны (в 1,5 раза) и интенсификации (в 2,4 раза) краевой эпителизации.

Известна заявка на изобретение US 2013195927 [5] в которой описана местная композиция, способствующая заживлению раны, содержащая эффективное количество наночастиц церия для обработки раны, а также фармацевтически приемлемый носитель в форме, предназначенной для местного введения субъекту. Композиция для заживления ран может быть использована в форме, выбранной из группы, состоящей из раствора, суспензии, спрея, крема, геля, пены, мази, лосьона и порошка. Кроме этого наночастицы оксида церия могут быть нанесены на повязку, выбранную из группы, состоящей из трансдермального пластыря, подушечки, порошка, матрицы и повязки. Раствор с наночастицами нанесен внутри и/или нанесен на поверхность повязки с использованием любого подходящего метода, известного в данной области, например, путем покрытия, распыления или погружения.

В работе Naseri-Nosar М. et al. (Naseri-Nosar М. 1 et al. Cerium oxide nanoparticle-containing poly ( -caprolactone)/gelatin electrospun film as a potential wound dressing material: In vitro and in vivo evaluation, Materials Science and Engineering C, 81 : 366-372, Dec 2017) [6] проведено исследование по включению наночастиц оксида церия (СеОг) в поли(в- капролактон)/желатиновую пленку для разработки потенциального раневого перевязочного материала. Пленки с содержанием 1.5% наночастиц СеОг были выбраны в качестве оптимальных для прижизненного исследования раны у крыс. К недостатку применения желатиновых пленок можно отнести невысокую паропроницаемость и отсутствие в их составе биологически активных компонентов, способствующих заживлению раны.

Основная проблема, которую необходимо решить при использовании наночастиц оксида церия для лечения повреждений кожи, заключается в необходимости обеспечить длительность нахождения препарата на поверхности повреждения. Это может быть достигнуто путем включения частиц диоксида церия в гелевую или мазевую основу, которая бы обеспечивала постепенное высвобождение наночастиц в рану, при этом не уменьшая их антиоксидантных свойств.

Известно изобретение по патенту US 9700650 [7] которое рассматривает композиции гидрогелей, которые изготовлены из полисахарида и двух или более дополнительных компонентов. Субъективные гидрогелевые композиции характеризуются тем, что они способны связывать ткань как в мокрой (например, в крови), так и в сухой среде, где адгезия композиции к ткани является физиологически приемлемой. Еще одна особенность этих композиций состоит в том, что они хорошо переносятся и не вызывают существенного воспалительного ответа. Такие композиции могут обеспечивать множество желательных качеств, таких как комбинацию любого из следующих факторов: кровоостанавливающие свойства, адгезионные свойства, повторная васкуляризация, биосовместимость, бактерицидные, бактериостатические и/или фунгицидные свойства, ремоделирование тканей и/или создание каркаса для тканевой инженерии, регенерация и/или клеточный посев, ферментативные или гидролитические пути деградации, набухание, расчетное время пребывания, спроектированные вязкости, активация температуры или энергии, включение агентов для визуализации в условиях визуализации (рентгенография, КТ, МРТ).

Известно изобретение по заявке US 2011190401 [8], в котором биоадгезивная гидрогелевая композиция для местного, системного или трансдермального применения содержит фармацевтически активный агент, выполненный на основе гидрофильного полисахарида, который получают из группы трав, кустарников и деревьев.

Известны патенты RU 2180856, RU 2454242 [9, 10], в которых описано средство в виде геля на основе водорастворимых полисахаридов растительного происхождения. Гель получают путем смешивания с водой при постоянном перемешивании водорастворимого производного целлюлозы и, по меньшей мере, одного водорастворимого полисахарида, содержащего анионные группы и образующего в растворе полианионы. В качестве полисахарида, содержащего анионные группы и образующего в растворе полианионы, берут компонент, выбранный из группы, включающей альгиновую кислоту или ее соль, каррагинан, пектин, фукоидан, зостерин, гуммиарабик, экстракт красных и/или бурых водорослей, ксантангам, трагакант или их смесь в любом сочетании и соотношении, обеспечивающем терапевтическое действие.

Авторам патентов экспериментальным путем удалось подобрать композицию веществ, образующую гель, остающийся достаточно пластичным (полужидким, но не растекающимся) при температуре от 0°С до 50°С в течение достаточно длительного времени, хорошо заполняющий рваные и глубокие раны, адгезирующий к влажной ране и образующий при взаимодействии с эксудатом раны и с воздухом эластичное, губчатое, хорошо паропроницаемое покрытие, не требующее дополнительных повязок. Тем не менее, основным применением данного типа гелевых покрытий, приведенных в патентах [9, 10] является восстановление больших поверхностей поврежденных кожных покровов после ожогов.

Интенсивность изучения биологической активности полисахаридов, выделенных из растений, в том числе морских водорослей, значительно опережает исследования их химической структуры. Поэтому имеется немного данных о связи структуры и биологической активности этих полисахаридов. До настоящего времени не удалось установить свойства выделенных полисахаридов, которые отвечают за проявление той или иной биологической активности.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей изобретения является создание композиции из наночастиц диоксида церия и гидрогеля, которая обеспечивает постепенное и длительное высвобождение из геля наночастиц в место повреждения наряду с обеспечением высокой адгезии к ране и создания эластичного, хорошо паропроницаемого покрытия, обладает высокой проницаемой способностью в глубину раны и повышает эффективность заживления за счет усиления пролиферации и миграции фибробластов, кератиноцитов и эндотелиальных клеток сосудов и обладает иммуномодулирующим, противовирусным и антибактериальным действием, для местного наружного применения при лечении ран, в том числе и гнойно-деструктивных поражений слизистой и кожи.

При использовании изобретения достигаются: расширение области применения гелевой композиции, содержащей наночастицы оксида церия в сочетании с полисахаридами, выделенными из растений бурых водорослей, повышение эффективности действия геля за счет синергетического воздействия компонентов композиции, удобство и простота применения в процессе лечения.

Для решения поставленной задачи в настоящем изобретении предлагается композиция местного (локального) и наружного применения для лечения ран, в том числе и гнойно-деструктивных поражений слизистой оболочки и кожи, содержащая наночастицы оксида церия и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что носитель представляет собой по меньшей мере одно водорастворимое производное целлюлозы, а композиция дополнительно содержит по меньшей мере один водорастворимый полисахарид бурых водорослей, выбранный из группы, включающей пектин, фукоидан и альгинат, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

оксид церия 0,00000172 - 0,000172 водорастворимое производное целлюлозы 1,0 - 15,0

пектин 0,01 - 1,5

и/или фукоидан 0,01 - 1,5

и/или альгинат 0,01 - 1,5

вода остальное

Кроме того, по меньшей мере одно водорастворимое производное целлюлозы предпочтительно выбрано из группы, включающей карбоксиметилцеллюлозу и целлосайз.

Кроме того, композиция может включать по меньшей мере одну целевую добавку, выбранную из ряда: иммуномодулятор, антибактериальный препарат, стимулятор репаративных процессов, анальгетик, анестетик, противовоспалительный агент, антиоксидант, витамин, полисахарид, экстракт растения. Предложенная композиция может использоваться для применения как человеку, так и для комнатного животного, или домашнего животного или птицы.

Поставленная задача также решается применением предложенной композиции для приготовления лекарственного средства для нанесения на поверхность кожи и раны при лечении и восстановлении кожного покрова и мягких тканей.

Поставленная задача также решается контейнером, содержащим предложенную композицию, при этом контейнер предпочтительно выполнен из пластика и предпочтительно имеет объем от 2 до 50 мл,

Из анализа уровня техники следует, что ни одно из известных технических решений по созданию композиций для обработки ран не воздействует на разные слои поверхностного подкожного слоя и не обладает синергетическим эффектом по одновременной длительной защите внешней поверхности кожи и глубокому проникновению высокоэффективного антиоксидантного средства в рану.

Известные составы гелей на основе полисахаридов растительного происхождения [9, 10] проявляют свою эффективность лишь на поверхности ран, формируя воздухопроницаемую структуру и выделяя биологически активные компоненты, содержащиеся в растительных полисахаридах, в верхний слой, граничащий с поверхностью раны.

Известно применение растворов, содержащих наночастицы оксида церия [5], которые обладают возможностью более глубокого проникновения в структуры подкожных слоев и раны. Однако растворы наночастиц быстро высыхают на поверхности раны, что требует увеличения количества нанесений раствора на рану. Кроме того жидкие растворы стекают по поверхности кожи при нанесении, что приводит к неэффективному расходу композиции.

Известно введение наночастиц оксида церия в структуру раневой повязки на основе желатиновой пленки [6]. Такое техническое решение приводит к тому, что частицы оксида церия с трудом переносятся из повязки в рану за счет низкой диффузии из-за высокой плотности покрытия.

Наночастицы оксида церия имеют высокую способность к антиоксидантной защите клеток млекопитающих от свободных форм кислорода и выполняют дополнительную функцию по антибактериальной защите. Кроме этого, наночастицы оксида церия позволяют без помех применять методы неинвазивного контроля внутренних слоев раны при использовании рентенографии. В процессе исследования составов гелей для лечения ран было обнаружено, что полисахариды, выделенные из растительного сырья, обеспечивают усиление антиоксидантных свойств оксида церия при совместном применении в составе геля, а их мягкая пористая структура, с одной стороны, обеспечивает проницаемость для газов и, с другой стороны, задерживает испарение раствора с наночастицами с поверхности раны. В результате формируется высокий синергетический эффект от свойств наночастиц оксида церия и от свойств структуры геля на основе полисахаридов, выделенных из морских водорослей, которые содержат в своем составе биологически активные компоненты, способствующие дополнительному заживлению раны.

Таким образом, местное применение композиции, выполненной в форме геля на основе наночастиц оксида церия, водорастворимых производных целлюлозы и полисахаридных компонентов, выделенных из бурых водорослей, входящих в группу, состоящую из фукоидана пектина и, необязательно, альгината, создает условия для постепенного выхода наночастиц оксида церия в рану, обеспечивая долговременный (до 5 суток) лечебный эффект, дополнительно создает воздухопроницаемый мягкий барьер, препятствующий репликации различных форм бактерий и вирусов и осуществляет иммуномодулирующее воздействие, что повышает эффективность заживления раны за счет усиления пролиферации и миграции фибробластов, кератиноцитов и эндотелиальных клеток сосудов.

Следует отметить, что компоненты композиции совместимы со всеми лекарственными средствами, выбранными из группы, состоящей из: антибиотиков, витаминов, иммуномодуляторов, интерферонов, антиоксидантов, экстрактов растений и гидробионтов, которые могут быть дополнительно введены в состав композиции.

ПЕРЕЧЕНЬ ИЛЛЮСТРАЦИЙ

На фиг.1 представлены данные по анализу уровня дегидрогеназной активности мезенхимальных стволовых клеток (МСК) человека после инкубации с образцами N°l, JV°3, N°5, модифицированными наночастицами Се0 ₂ в течение 24, 48 и 72 часов.

На фиг. 2 представлены данные по анализу пролиферативной активности МСК человека, из которых следует достоверное увеличение пролиферативной активности в образце N« 3.

На фиг. 3 представлены данные сравнительных гистологических характеристик нормальной кожи и травмированного участка кожи после применения гелевой композиции N°2.

На фиг.4 представлены данные сравнительных гистологических характеристик нормальной кожи и травмированного участка кожи после применения гелевой композиции N°3. ПРИМЕРЫ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Состав композиции

В качестве активного компонента в состав композиции входит эффективное количество наночастиц оксида церия выполняющих роль антиоксидантов.

Дополнительно в состав композиции входит одно или смесь водорастворимых производных целлюлозы, входящих в группу карбоксиметилцеллюлозы и целлосайза, и один или смесь водорастворимых полисахаридов, выделенных из бурых водорослей, выбранных из группы: пектин, фукоидан и альгинат.

Пектины представляют собой водорастворимые полисахариды растительного происхождения, которые используются для профилактики и лечения различных заболеваний. Пектины обладают антибактериальным действием в отношении многих патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, оказывают положительное влияние на основные показатели иммунного статуса больных, улучшая состояние гуморального и клеточного звеньев иммунитета, проявляют антиокислительные свойства (RU 2298170) [11]. Это позволяет использовать пектины в комплексной антибактериальной терапии гнойно-воспалительных заболеваний и осложнений. Специфической особенностью пектиновых веществ, имеющей важное практическое значение, является их комплексообразующая способность.

Фуциновая (фукоидная) кислота содержится в водорослях преимущественно в виде кальциевой соли - фукоидана. Фукоидан - гомополимер сульфатированной L-фукозы, обнаруженный в составе бурых водорослей и некоторых иглокожих. Состав фуциновой кислоты неизвестен, однако на основании некоторых работ можно предположить наличие в ее молекуле уроновых кислот (от 4 до 20 %). Очень важным свойством фукоидана является его онкопротективная способность. Кроме того, установлено, что фукоидан способен ингибировать действие некоторых вирусов (Авакова О.Г., Боголицын К.Г. Растительная клетчатка: Структура, свойства, применение. ИВУЗ. Лесной журнал. 2004, N°4) [12]. Фукоидан и другие соли фукоидной кислоты составляют группу фукоидантов. Именно этой группе веществ фукус во многом обязан своими целебными свойствами, такими, как иммуномодулирующее, антикоагулянтное, детоксикационное действие и др. (Лекарственные растения и лекарственное растительное сырье, содержащие слизи, htps://medinfo.social/farmakognoziva 873/lekarstvennyie-rasteniva- lekarstvennoe-34899.html ) [13].

Включение в состав композиции разных типов полисахаридов усиливает иммунный ответ организма за счет разных механизмов воздействия на иммунную систему.

Альгиновая кислота - полисахарид, вязкое резиноподобное вещество, извлекаемое из красных, бурых и некоторых зелёных водорослей. Содержание альгиновой кислоты в ламинарии японской (лат. Laminaria japonica) колеблется от 15 до 30 %. Соли альгиновой кислоты— альгинаты, в частности альгинат натрия - это полисахарид растительного происхождения. Альгинат обладает редкими свойствами: медленно тает в воде, адсорбируя ее в сотни раз более своего веса, образуя гель, выдерживающий изменения температуры - замораживание, оттаивание. Соли альгиновой кислоты находят применение в медицине благодаря своим целительным качествам: иммуностимулирующим - защищают от инфекций и опухолей; кровоостанавливающим - лечат геморрой, анальные трещины, кровоточащие раны; адсорбирующим - выводят радионуклиды, тяжелые металлы; регенерирующим - восстанавливают кожу при ожогах, пролежнях; антигистаминным - препятствуют аллергии.

Способ получения наночастиц оксида церия

Наночастицы оксида церия в настоящее время имеются в продаже (Nanoceria) в диапазоне размеров от примерно 7 до 20 нм. Такие частицы образуются с помощью высокотемпературного процесса, что приводит к высокой агломерации наночастиц оксида церия. Известен способ получения диоксида церия, по которому вводят раствор нитрата церия (III) в качестве католита в катодную камеру электролизера, отделенную мембраной от анодной камеры, заполненной анолитом, и пропускают электрический ток плотностью 2, 5-7, 5 А/дм через католит и анолит. Способ позволяет получить порошок диоксида церия СеОг с размером частиц 8-22 нм (RU 2341459 [14]. Эти частицы также высокоагломерированы. В заявке US 20130195927 [5] описан способ получения наночастиц оксида церия, которые синтезировали с использованием гексагидрата нитрата церия (99,999% от Sigma-Aldrich). Гексагидрат нитрата церия растворяли в воде (18,2 МВ), добавляли стехиометрическое количество перекиси водорода и перемешивали в течение 1 часа. Ионы церия (III) в растворе окисляли до оксида церия (IV) и pH раствора поддерживали ниже 3,5 для поддержания синтезированного оксида церия для предотвращения агломерации.

Более предпочтительно использовать технологии получения наночастиц в диапазоне от 1 до 10 нм в форме стабильного водного золя. Такие технические решения описаны в патенте US 9585840 [15], в котором описана технология получения наночастиц оксида церия покрытых декстраном. Таким образом, в рамках данного изобретения оксид церия может иметь форму стабильного водного золя стабилизированного стабилизатором, выбранным из группы, состоящей из лецитина, декстрана, цитрата аммония, полиакриловой кислоты, но не ограничиваясь этим. Более предпочтительно использовать оксид церия, который имеет форму стабильного водного золя стабилизированного цитратом аммония (Щербаков А.Б. и др. Наноматериалы на основе диоксида церия: свойства и перспективы использования в биологии и медицине. Биотехнология, т.4, N°l, 2011 [16]; Шекунова Т.О. и др. Синтез, биологическая и фотокаталитическая активность золей диоксида церия, стабилизированных цитрат-ионом. Наносистемы: физика, химия, математика, 2013, 4 (1), С. 83-89 [17]).

Наночастицы оксида церия обладают бактерицидными свойствами и противовирусной резистентностью, что позволяет снизить концентрацию антибиотиков в составе композиции.

Приготовление композиции

Компоненты, входящие в состав композиции, могут использоваться в различных сочетаниях, которые в зависимости от характера раневого повреждения могут обеспечивать оптимальное сочетание защиты и восстановления раны. За счет свойств геля осуществляется физическая защита раны и осуществляется паро- и газопроницаемость покрытия внешнего слоя раны. Дополнительные свойства полисахаридов, выполненных в форме наночастиц, оказывают положительный эффект по связыванию токсинов и деструктирующих ферментов, находящихся в ране. Наночастицы оксида церия обеспечивают повышение регенерационных свойств путем создания оптимальных условий для размножения клеток в ране за счет снижения количества свободных форм кислорода. Концентрация наночастиц оксида церия может быть в пределах от 0,1 мкМ/л до 10 мкМ/л. Предпочтительно использовать концентрацию в диапазоне от 0, 1 мкМ/л до

2 мкМ/л.

Испытаны различные варианты состава геля, включая следующие биоактивные компоненты: пектин, фукоидан, альгинат, нанокристаллический диоксид церия. Изготовлены составы гелей содержащие: образец 1 - пектин, альгинат и диоксид церия; образец 2 - альгинат, фукоидан и диоксид церия; образец 3 - фукоидан, альгинат, пектин и диоксид церия; образец 4 - фукоидан и диоксид церия; образец 5 - пектин, фукоидан и диоксид церия; образец 6 - альгинат и диоксид церия.

Сочетаемость компонентов рассматривалась при максимальной используемой концентрации препаратов церия (10 мкМ/л). Компоненты тщательно перемешивались, получающиеся образцы стерилизовались и хранились в герметически закрытых флаконах.

При сравнении образцов было определено, что образцы 1, 3, 5 при изготовлении имеют прогнозируемую консистенцию. В течение недели они сохраняли свое состояние и не изменяли консистенцию. Образцы 2 и 4 после недели хранения имели заметное расслоение. Образец 6 после недельной экспозиции изменял свою консистенцию и выглядел более жидким, чем остальные препараты. Из этого следует, что добавление в гель пектина стабилизирует консистенцию геля и делает его пригодным для применения в качестве лечебного средства.

Совместное применение в одной композиции разных типов полисахаридов входящих в группу, включающую пектин, фукоидан и альгинат, позволяет синергетически воздействовать на разные системы регенерации раневого слоя, поскольку разные типы полисахаридов обладают разной биологической активностью, что повышает эффективность композиции. Смесь полисахаридов и их способ получения подобраны таким образом, что смесь образует в растворе наномицеллы величиной 10-20 нм, что резко усиливает воздействие геля на поверхность раны ввиду значительного увеличения контактной поверхности.

В композиции дополнительно использованы водорастворимые производные целлюлозы - карбоксиметилцеллюлоза и целлосайз.

В композицию могут быть включены дополнительные компоненты - целевые добавки, входящие в группу: иммуномодуляторов, антибактериальных препаратов, стимуляторов репаративных процессов, анальгетиков, анестетиков, противовоспалительных агентов, антиоксидантов, витаминов, полисахаридов, экстрактов растений.

В качестве иммуномодулятора композиция может включать следующие вещества, но не ограничиваться ими: циклоферон, криданимод, трекрезан, полиоксидоний, глутоксим, галавит, имунофан, рекомбинантные a-, b-, g-интерфероны или их природные аналоги, рекомбинантный интерлейкин- lb, рекомбинантный интерлейкин-2, миелопид, лизоцим.

В качестве вещества, обладающего антибактериальной активностью в отношении грамположительных и/или грамотрицательных бактерий и других микроорганизмов, предлагаемая композиция может включать следующие вещества , но не ограничиваться ими: антибиотики, лизоамидаза, трилон Б, линкомицин, левомицетин, гентамицин, сульфонамиды, такие как сульфаметизол, сульфизоксазол, сульфамонометоксин, сульфаметизол, хинолоны, такие как налидиксовая кислота, тригидрат пипемидиновой кислоты, эноксацин, норфлоксацин, офлоксацин, тосуфлоксацин тозилат, гидрохлорид ципрофлоксацина, гидрохлорид ломефлоксацина, спарфлоксацин, флероксацин тетрациклингидрохлорид, ампициллин, пиперациллин, дибекацин, каендомицин, ливидомицин, тобрамицин, амикацин, фрадиомицин, сисомицин, тетрациклин, окситетрациклин, ротетрациклин, доксициклин, ампициллин, пиперациллин, тикарциллин, цефалотин, цефапирин, цефаклор, цефалексин, цефадроксил, цефамандолы, цефуроксим аксетил, цефдинир, пивоксил, цефтазидит, цефпирамиды, цефсулодин, цефподоксим проксетил, цефпир, цефепит, цефсулодин, цефинетазол, цефминокс, цефокситин, цефбуперазон, латамоксиф, фломокс, цефазолин, цефотаксим, цефоперазон, цефтизоксим, моксалактам, тиенамицин, сульфазецин, азтреонам и их соли, гризеофульвин, ланкацидин, макролиды, такие как такролимус, и тому подобное.

В качестве стимулятора репаративных процессов предлагаемая композиция может включать следующие вещества, но не ограничиваться ими: метилурацил, ацемин, этаден, пантотенат кальция, солкосерил.

Анальгетики могут в себя включать следующие вещества, но не ограничиваться ими: анальгин, бутадион, амидопирин, фенацетин, парацетамол, пироксикам, димексид, хлотазол, мефенамовая и флуфенамовая кислоты, ибупрофен, флурбипрофен, диклофенак натрия.

В качестве анестетика композиция может включать следующие вещества, но не ограничиваться ими: хиноксикаин, тримекаин, пиромекаин, лидокаин

В качестве противовоспалительного агента композиция может включать, но не ограничиваться следующими веществами: диклофенак, индометацин, , ацетаминофен, феназетин, этхензамид, сульпирин, антипирин, ацетилсалициловую кислоту, мефенамовую кислоту, флуфенаминовую кислоту, локсопрофен натрий, фенилбутазон, ибупрофен, кетопрофен, напроксен, оксапрозин, флурбипрофен, фенбуфен, пранопрофен, флотфафенин, эпирозол, тиарамид гидрохлорид, залтопрофен, габекетат мезилат, каместат мезилат, иулинастатин, колхицин, пробенецид, сульфинпиразон, бензбромарон, аллопуринол, тиомалат натрия натрия, гиалуронат натрия, салицилат натрия, гидрохлорид морфина, салициловая кислота , атропин, скополамин, морфин, петидин, леворфанол, кетопрофен, напроксен, оксиморфон и тому подобное.

В качестве антисептика композиция может включать, но не ограничиваться следующими веществами: мирамистин, хлоргексидин, диоксидин, коллоидное серебро, соль серебра и тому подобное.

В качестве антиоксиданта композиция может включать следующие вещества, но не ограничиваться ими: a-липоевая кислота, метронидазол, элементарные антиоксиданты, b-глюкан, куркумин, эпигаллокатехин галлат, проантоцианидины, прополис, мед и тому подобное.

В качестве витаминов композиция может включать следующие вещества, но не ограничиваться ими: витамин А, витамин С, витамин D, витамин Е.

В качестве полисахаридов композиция может включать в себя следующие вещества, но не ограничиваться ими: каррагинан, зостерин, гуммиарабик, ксантангам, трагакант и тому подобное.

Предлагаемая композиция может быть изготовлена в виде мягких лекарственных форм - геля, спрея. Согласно изобретению, гелевую композицию размещают в контейнерах, предпочтительно в асептических условиях. Предпочтительно контейнеры изготавливают из стекла или полимеров, например, из полипропилена или полиэтилена. Объем контейнеров составляет от 2 до 50 мл, предпочтительно до 15 мл. Контейнеры для гелей могут быть снабжены крышкой. Согласно другому варианту контейнеров они могут быть изготовлены с возможностью распределения геля на поверхности кожи под давлением газа, размещенного внутри контейнера вместе с раствором геля. Спрей имеет преимущество при лечении больших поверхностей поврежденной кожи и ран. В этом случае в состав спрея могут быть дополнительно введены целевые добавки, содержащие обезболивание и снижающие микробные загрязнения. При применении геля в больничных условиях на внешней поверхности контейнера могут быть размещены этикетки с указанием данных о составе и объеме для того чтобы устранить риски ошибок идентификации содержания контейнеров. Для учета даты изготовления композиции могут быть использованы не только указание даты в цифровом виде. Предпочтительно указание дополнительной информации в виде штрих-кодов.

Одним из аспектов изобретения является применение композиции, состоящей из наночастиц оксида церия, водорастворимых производных целлюлозы и разных типов полисахаридов, входящих в группу, состоящую из: пектина, фукоидана, и, необязательно, альгината, или их смесей, для приготовления лекарственного средства для нанесения на поверхность кожи и раны для лечения и восстановления кожного покрова. Предлагаемую композицию можно использовать для применения человеку, комнатным животным, домашним животным и/или птицам. Применение композиции в форме геля для лечения ран имеет существенные преимущества за счет совместного воздействия наночастиц оксида церия и полисахаридов, выделенных из водорослей, в одной композиции на регенерационную систему организма.

Примеры, подтверждающие эффективность композиции при лечении ран включают, но не ограничивают других возможностей композиции.

Пример 1. Синтез коллоидного золя с наночастицами Се0 _2.

Для проведения химического синтеза использовали водную соль церия - Ce(N0 ₃ ) ₃ -6H ₂ 0 (х.ч.), лимонную кислоту (х.ч.) и водный раствор аммиака (ч.). Для получения золя Се0 ₂ в 25 мл 0.05М водного раствора нитрата церия (III) растворяли 0.24 г лимонной кислоты. Полученный раствор при перемешивании быстро приливали к 100 мл ЗМ раствора аммиака и выдерживали в течение 2 ч.

Перед использованием наночастиц проводили процедуру отмывки от стабилизатора (лимонной кислоты). Золь титровали 30% соляной кислотой до рН~3 (до выпадения осадка), после чего центрифугировали при 10000 об /мин в течение 10 минут. Осадок ресуспендировали в деионизованной воде и центрифугировали 10 мин при 10000 об /мин. Ресуспендировали осадок в воде и доводили суспензию до рН=7 путем титрования 10% аммиаком.

Пример 2 Синтез водорастворимого геля и модификация полисахаридных гелей наночастицами Се0 ₂ .

Для изготовления образцов гелей использовали карбоксиметилцеллюлозу, целлосайз, фукоидан, альгинат, пектин (все препараты - фирмы Сигма) и наночастицы Се0 ₂ , полученные в соответствии с примером 1. Изготовление гелей производили путем смешивания сухих навесок веществ с дистиллированной водой в течение 30 - 40 минут при комнатной температуре, отстаиванием в течение 12 - 18 часов при температуре 2-4°С и повторном перемешивании в течение 30-40 минут. Гелевые композиции готовили путем внесения золя наночастиц Се0 ₂ при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 10 минут. После чего полученные гели закупоривают и стерлизуют.

Пример 3. Контроль цитотоксичности и пролиферативной активности клеток при применении композиции.

Чтобы определить относительную важность других компонентов геля, проводили опыты на культуре мезенхимальных стволовых клеток человека (МСК), выделенных из пульпы зуба по ортодонтическим показаниям. Контроль цитотоксичности лечебного препарата определяли по уровню дегидрогеназной активности клеток и по соотношению LIVE/DEAD в культуре клеток. В качестве показателя влияния геля на повышение активности клеток использовали оценку уровня дегидрогеназной активности клеток при помощи МТТ-теста. Клетки высевали в 96-луночные планшеты и культивировали в течение 24 и 72 ч в атмосфере, содержащей 5% С0 ₂ при 37°С. Через 6 ч после посева клеток в среду вносили 20 мг геля, содержащего наночастицы Се0 ₂ в концентрациях 1000 и 1 мкМ. В качестве контроля использовали клетки со средой, но без добавления Се0 ₂ . В качестве отрицательного контроля использовали лунки с клетками, в которые вносили 10% диметилсульфоксид (ДМСО) (10 мкл). Через 24 и 48 ч после внесения гелей с наночастицами Се0 ₂ среду во всех лунках заменяли на среду, содержащую 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5- дифенилтетразол (5 мкг/мл), а затем проводили МТТ-тест по стандартной методике. Оптическую плотность определяли на длине волны l=540 нм с использованием фотоколориметра «ВЮ-RAD model 680».

Для оценки соотношения живых и мертвых клеток в культуре использовали набор L-7007 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit производства компании Invitrogen, содержащий красители SYTO 9 (окрашивает все клетки, l = 485/498 нм) и пропидий йодид (окрашивает ядра мертвых клеток, l =535/617 нм). Окраску клеток осуществляли путем замены культуральной среды DMEM/F12 с 5% ЭТС, на среду, содержащую смесь красителей в концентрации 1 мкл/мл. Наблюдение за морфологией и флуоресцентной окраской проводили на инвертированном микроскопе LSM-510 (Carl Zeiss). Подсчет окрашенных клеток проводили с использованием программы Image J.

Модификация полисахаридных гелей цитрат- стабилизированными наночастицами Се(Э ₂ не вызывает цитотоксического действия в культуре МСК человека, сохраняя высокий уровень их жизнеспособности, снижая количество апоптотических клеток в культуре, поддерживая уровень митохондриального потенциала и дегидрогеназной активности клеток на уровне контрольных значений.

На фиг. 1 представлены результаты анализа уровня дегидрогеназной активности МСК человека после инкубации с гелевыми композициями, модифицированными наночастицами Се0 ₂ в течение 24, 48 и 72 часов для образцов геля 1, 3, 5 с минимальной 1 мкМ/л и максимальной 10 мкМ/л концентрацией диоксида церия.

Проведенный комплексный анализ биологической активности гелевых композиций, модифицированных наночастицами Се0 ₂ , выявил их высокую степень биосовместимости. Анализ уровня дегидрогеназной активности в течение 3 дней культивирования выявил достоверное повышение практически во всех тестируемых образцах, но при этом максимальный стимулирующий эффект наблюдался в образце 3 при концентрации наночастиц диоксида церия 1 мкМ.

На фиг. 2 приведены данные по пролиферативной активности клеток МСК человека в образце 3. Данные выявили достоверное увеличение пролиферативной активности клеток, что говорит о том, что клетки имеют оптимальное микроокружение и условия, максимально приближенные к условиям in vivo.

Пример 4. Проверка эффективности лечения ран.

В дальнейшем проводили опыты на лабораторных животных, используя активные вещества в различных соотношениях. Для этого на спину крыс породы Wistar в зоне между лопаток наносили скальпелем крестообразную рану. В случае нанесения круговой раны кожу выстригали хирургическими ножницами. Перед нанесением раны удаляли шерсть в области спины и обрабатывали место имплантации 0,05% раствором хлоргексидина. Рану наносили в стерильных условиях, под эфирным наркозом.

Все манипуляции с животными проводили согласно правилам, принятым Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследований и других научных целей.

Для испытаний на животных были изготовлены гели с различным соотношением активных компонентов в концентрации 1 мкМ/л. Во всех гелях количество нанокристаллического диоксида церия было одинаковым и составляло 1 мкМ/л.

В качестве контрольного образца использовалась мазь левомеколь. Левомеколь используется в медицинской практике наружно для лечения гнойных ран и язв на коже, инфицированных патогенной микрофлорой, травматических повреждений кожи, ожогов, трофических язв.

В таблице приведены соотношения различных активных компонентов в составе композиций, входящей в гель, в единицах концентрации.

Таблица

Крыс разделили на 5 групп. Первым трем группам наносили образцы лечебных гелей, содержащих композиции полисахаридов М -З. Четвертой группе не наносили на рану ничего (контрольная группа 1). Пятой группе наносили на рану левомеколь (контрольная группа 2).

Результаты опытов на разных этапах после нанесения обширной травмы показывают, что композиции ·N°2 и N°3 в составе геля оказывают лучший эффект на заживление раны, чем композиция JVTsl. При этом результаты применения композиций N°N°2-3 были также лучше, чем в обеих контрольных группах.

Гистологические исследования срезов кожи после заживления нанесенных травматических повреждений кожи выявили аналогичную картину. Наиболее эффективны были гели на основе композиции Ns2 и композиции N°3. При их использовании ускоряется заживление раны, снижается площадь рубца, восстанавливаются волосяные фолликулы и жировые железы. Анатомическое строение кожи в области заживления соответствует ее строению на нетравмированных участках.

У животных группы, которым на рану нанесен гель, содержащий композицию N°2, произошло образование рубца с полным восстановлением эпидермиса в раневой области. Дерма в области рубца представлена двумя слоями, при этом сетчатый слой состоит из тяжей коллагеновых волокон, расположенных параллельно поверхности кожи. Зона рубцевания визуально меньше по площади по сравнению с контрольными образцами.

На фиг. 3 представлены фотографии гистологического исследования среза кожи до и после заживления с использованием геля, содержащего композицию N°2. Эпидермис восстановлен, дерма представлена уплотненной соединительной тканью. Волокна параллельны поверхности кожи. Область рубцевания небольшая. В поле зрения в области рубца присутствуют фолликулы и сальные железы. Сосочковый слой дермы слабо выражен. Определяются новообразованные сосуды различного диаметра.

У группы животных, которым нанесен гель, содержащий композицию N°3, произошло образование рубца с полным восстановлением эпидермиса в раневой области. На фиг. 4 представлена фотография гистологического исследования среза кожи после заживления с использованием геля, содержащего композицию N°3. Эпидермис восстановлен, дерма представлена уплотненной соединительной тканью. Волокна параллельны поверхности кожи. В поле зрения в области рубца присутствуют единичные фолликулы и сальные железы. Сосочковый слой дермы слабо выражен. Определяются новообразованные сосуды различного диаметра. ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ Опираясь на полученные экспериментальные данные, можно сделать вывод, что все отобранные образцы, содержащие наночастицы оксида церия, не обладают цитотоксическим действием, что определяется высоким уровнем михохондриального потенциала, дегидрогеназной активности, отсутствием апоптотических клеток при инкубации с модифицированными гелевыми композициями.

У животных группы, которым был нанесен гель, содержащий наночастицы оксида церия, обладающие уникальными антиоксидантыми свойствами, и полисахариды, выделенные из бурых водорослей, произошло образование рубца с полным восстановлением эпидермиса в раневой области. Применение композиций, содержащих наночастицы оксида церия и полисахариды, обеспечивает ускорение репаративных процессов после повреждений кожных покровов.

Проведенный информационный поиск не выявил идентичных и сходных технических решений. Вышеуказанная совокупность признаков предлагаемой композиции (состав композиции и количественные соотношения компонентов) ранее не была известна, что говорит о новизне предложенного решения. Совокупность существенных признаков заявляемого композиции для наружного применения на основе комплекса полисахаридов, выделенных из бурых водорослей, и наночастиц оксида церия не следует явным образом из изученного уровня техники. До сих пор аналогичного решения не было предложено, хотя высокие антиоксидантные свойства оксида церия известны с 2008 г. (US 7347987) [18], а наночастицы оксида церия использовались с 2008 г. в качестве защиты от ультрафиолетового излучения в кремах для кожи (US 20080260664) [19]. Поэтому заявляемая композиция для местного применения на основе комплекса полисахаридов и наночастиц оксида церия имеет изобретательский уровень. Заявляемая композиция может быть рекомендована при лечении ран, ожогов, трофических язв и некроза тканей.