FITOPATOGÊNICOS

[001] Trata-se a presente patente de invenção, de uma composição para controle biológico de fungos fitopatogênicos, pertencente ao setor técnico de biotecnologia agrícola, mais particularmente trata-se de uma composição de bactérias e fungos com mecanismos de ação diferentes e complementares, na mitigação de fungos fitopatogênicos em plantas cultiváveis. Particularmente, a composição trata de uma formulação utilizando Bacillus amyloliquefaciens e Trichoderma harzianum misturados a um Aditivo e Excipientes. Opcionalmente poderá ser acrescentado também o microorganismo Clonostachys rosea.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

[002] Rhizoctonia solani Kíihn e Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, agentes causais do tombamento e mofo branco, respectivamente, são dois dos fungos fitopatogênicos mais agressivos para cultivos comerciais (Bolton et al. 2006; Faltin et al. 2004). Ambos são capazes de infectar uma gama enorme de hospedeiros em todo o mundo, levando a prejuízos consideráveis (Boland & Hall 1994; Ohkura et al. 2009).

[003] Um levantamento realizado em 2006, estimou que os prejuízos atribuídos aos danos causados pelo mofo branco (S. sclerotiorum ), apenas nos EUA, chegam a cerca de US$ 200 milhões ao ano (Bolton et al., 2006). Concomitantemente, as perdas causadas por Rhizoctonia solani em soja, nos EUA, foram estimadas em mais de 3 milhões de hectares entre os anos de 2006 a 2009 (Koenning & Wrather, 2010).

[004] O controle desses fungos tem se mostrado particularmente complicado, devido, principalmente:

a) capacidade de produção de estruturas de resistências, escleródios, que

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) permitem a sobrevivência em condições adversas do solo por muitos anos; b) suas atividades saprofíticas;

c) diversidade de hospedeiros;

d) ausência de cultivares resistentes para algumas culturas; e

e) seleção de estirpes resistentes aos defensivos químicos (Bardin & Huang 2001; Campion et al., 2003; Ogoshi, 1996; Zhang et al., 2009).

[005] Desses fatores, o uso de defensivos tem sido considerado um dos pontos chaves para controle de pragas agrícolas; entretanto, seu uso indiscriminado tem induzido a seleção de populações resistentes e, também causado sérios problemas sanitários e ambientais. Além disso, devido aos efeitos nocivos causados por alimentos contaminados com defensivos, tem havido um aumento na percepção pública contra esses produtos, culminando numa necessidade por estratégias de controle alternativas.

[006] Nesse contexto, o uso de microrganismos para mitigar os danos causados por fitopatógenos vem sendo considerado uma opção viável. Essa estratégia, conhecida como controle biológico, possui algumas vantagens frente às demais tecnologias, principalmente, por ser pouco ou nada tóxica para seres humanos e animais, e permitir explorar modos de ação diferentes dos defensivos químicos (Zucchi et al. 2008).

[007] Muitos microrganismos antagonistas ou microparasitas têm sido reportados e utilizados para o controle biológico de diversos fungos fitopatogênicos. De maneira geral, bactérias antagonistas a fungos fitopatogênicos (p. ex. Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas etc.) têm seu modo de ação associado à produção de compostos secundários e enzimas líticas (Raajimakers et al. 2002; Fernando et al., 2007; Canova et al. 2010; Zucchi et al. 2010). No caso de fungos comumente utilizados em programas de controle biológicos, somam-se, a essas características, a capacidade de

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) parasitar fitopatógenos fúngicos, p. ex. Trichoderma spp. parasitando Sclerotinia sclerotiorum (Abdullah et al. 2008) e Clonostachys rosea parasitando Botrytis cinerea (Huang et al. 2002).

[008] Essa versatilidade no modo de ação apresentado pelos organismos de controle biológico vem sendo largamente explorada. Isolados de diversas espécies são comercializados e apresentam resultados muitas vezes iguais ou superiores aos defensivos químicos. Os efeitos benéficos desses modos de ação podem ainda ser expandidos ao usar formulações com mais de um organismo. Entretanto, apesar de pesquisas relacionadas demonstrar a eficácia relativamente superior dessas misturas, seu uso comercial ainda é incipiente (Siddiqui 2005). Um dos motivos para a baixa comercialização de produtos contendo misturas de agentes de controle biológico se deve, justamente, à dificuldade de estabilização dessas formulações e, no caso do Brasil, entraves burocráticos referentes ao registro. Porém, formulações mistas vêm sendo empregadas para outros fins agrícolas, como controle de fitonematoides (US 20150050258A1; BR 1020170006735) e microrganismos promotores de crescimento de planta (US20090308121A1), sinalizando um novo campo para o controle de fitopatógenos: o uso de composições microbiológicas complexas para o controle desses microrganismos.

OBJETIVO DA INVENÇÃO

[009] Assim, o objetivo da presente invenção é desenvolver composições efetivas contra fungos fitopatogênicos em plantas cultiváveis, que apresente mecanismos de ação diferentes e complementares. Essas composições envolvem o uso de bactérias e fungos com adição de aditivos e excipientes.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) [010] A presente invenção refere-se ao uso efetivo de quantidades de Bacillus amyloliquef aciens, Clonostachys rosea e Trichoderma harzianum, concomitantemente com aditivos e excipientes, em composições biológicas na mitigação de fungos fitopatogênicos em plantas cultiváveis.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[011] A composição para controle biológico de fungos fitopatogênicos compreende microrganismos, mas não se limita a, uma concentração final de (em unidades formadoras de colónia, u.f.c.), conforme segue:

• Bacillus amyloliquefaciens 1,0 x 10 u.f.c./g

• Clonostachys rosea 1,0 x 10 ⁶ u.f.c./g

• Trichoderma harzianum 1,0 x 10 u.f.c./g

[012] Os isolados foram identificados e classificados pela Coleção Brasileira de Microrganismos de Ambiente e Indústria (CBMAI/UNICAMP) e Instituto Biológico de Campinas, onde encontram-se depositados.

[013] A composição apresenta as seguintes concentrações:

Bacillus amyloliquefaciens : 1,0 a 20,0%

Trichoderma harzianum : 1,0 a 45,0%

Aditivos: 1,0 a 10,0%

Excipientes: 10,0 a 96,0%

[014] Opcionalmente na composição poderá ser acrescentado o microorganismo Clonostachys rosea com na concentração de 1,0 a 15,0%.

[015] Os aditivos podem ser, mas não se limitam a, dispersantes selecionados do grupo consistindo de polímeros iônicos solúveis em água, polímeros aniônicos solúveis em água; surfactantes selecionados do grupo consistindo de surfactantes aniônicos e surfactantes não iônicos; e combinações entre eles.

[016] Os excipientes podem ser, não se limitando a, do grupo que

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) consiste em sílicas, talco, bentonita, carboidratos e combinações entre eles.

[017] A composição deve ser empregada como formulação em pó molhável. Entretanto, outras formulações contendo esses microrganismos, tais como, emulsões, suspensões concentradas, grânulos, etc. também podem ser utilizadas.

EXEMPLOS DE OBTENÇÃO

[018] Uma composição contendo 8,0% de Bacillus amyloliquefaciens, 8,0% de Clonostachys rosea, 4,8% de Trichoderma harzianum, 3,0 % de polímero de estireno acrílico, 1,0% surfactante aniônico e 75,2% de inerte foi formulada para avaliar sua eficiência no controle de fitopatógenos. Os exemplos abaixo ilustram, mas não limita, o uso dessa composição:

[019] EXEMPLO 1: Controle de Rhizoctonia solani em feijão.

OBJETIVO

[020] Avaliar o efeito, em condições de campo, da formulação biológica contendo agentes bacterianos e fúngicos antagónicos no controle de Rhizoctonia solani, aplicado via tratamento de sementes.

MATERIAL E MÉTODOS

[021] Delineamento experimental: blocos casualizados com sete tratamentos e quatro repetições. As parcelas constituíram-se de seis linhas com cinco metros de comprimento cada, totalizando uma área de 15 m ² . Entretanto, para as avaliações desconsiderou-se 1 m em cada uma das extremidades das linhas, totalizando uma parcela útil de 9 m ² .

[022] Tratamentos e forma de aplicação: Avaliou-se o efeito de cinco doses da formulação (30, 70, 100, 150 e 200 g.100 kg de sementes ¹ ), utilizando-se um controle negativo (sem tratamento) e um controle positivo (300 g de fludioxonil + metalaxyl - 7,5 e 3,0% ingrediente ativo, respectivamente). O tratamento das sementes foi feito adicionando-se água à

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) dose do produto indicado até completar o volume de 5 mL. Em seguida, 500 g de sementes de feijão, variedade Pérola, foram adicionadas em um saco plástico juntamente com os 5 mL da mistura (produto + água). Esse saco foi fechado e agitado até a completa homogeneização dos produtos e, posteriormente, as sementes foram semeadas em área com espaçamento de 0,5 m entre linhas densidade populacional de 15 sementes por metro. A emergência das plântulas ocorreu 5 dias após a semeadura.

[023] Amostragem e avaliação da eficácia da formulação: O efeito dos tratamentos em estudo foi avaliado pelo número de plantas por metro linear (stand) e o número de planta sintomáticas em uma amostra de 100 plantas em cada parcela útil. As avaliações foram realizadas aos 7, 14, 21 e 28 dias após a emergência das plântulas (DAE). A produtividade média da cultura foi estimada em toneladas por hectare, pesando-se os grãos colhidos em 6 m ² de cada parcela útil.

[024] Análise estatística: Os dados das avaliações de stand, número de plantas atacadas e produtividade foram transformados utilizando-s submetidos à análise de variância. As comparações das médias foram realizadas pelo teste de Tukey (p<0,05) (1949), e as eficácias dos tratamentos foram calculadas segundo Abbott (1925).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

[025] Aos sete dias após emergência não houve diferença entre o stand em feijoeiro das áreas com sementes tratadas com a formulação biológica e os controles. Entretanto, na avaliação realizada aos 28 DAE, observou-se que o stand nas áreas semeadas com sementes tratadas com a formulação biológica (150 e 200 g p.c.100 kg sementes ¹ ) e/ou com o controle químico era substancialmente superior do que o apresentado pelo controle, mantendo o stand inicial da cultura em um intervalo de 83,33 a 90% (Tabela 1).

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) [026] TABELA 1. Efeito dos tratamentos sobre o stand em feijoeiro ( P . vulgaris) ao longo das avaliações.

Doses Dias após emergência (DAE)

Tratamentos

g.100 kg sementes ¹ _ 7^ _ 28*

30 13,50 a 11,50 c

70 13,25 a l l,75 bc

Formulação biológica 100 13,50 a 12,00 bc

150 13,50 a 12,50 ab

200 _ 13,50 a _ 13,00 ab

Controle químico** 300 _ 13,50 a _ 13,50 a Controle _ _ - _ 13,25 a _ 9,75 d

CV (%) 1 ,84_ 2,12

*médias seguidas de mesma letra não diferem entre si nas colunas pelo teste de Tukey (p<0,05);

CV (%): coeficiente de variação. **Fludioxonil+metalaxyl (7,5 e 3,0% i.e., respectivamente)

[027] O tratamento com a formulação biológica nas concentrações de 70 a 200 g.p.c.100 kg sementes ¹ e o tratamento químico apresentaram resultados satisfatórios e significativamente diferentes do controle, na mitigação da podridão radicular de R. solani aos sete DAE (Tabela 2). Vale destacar que os tratamentos com a formulação biológica nas doses de 100 a 200 g p.c.100 kg sementes ¹ e o tratamento químico, impediram a infecção das plantas pelo fungo R. solani e, consequentemente, a podridão radicular com 100% de eficácia. Aos 28 DAE, verificou-se uma relativa queda no poder residual dos tratamentos com a formulação biológica, os quais apresentaram índices de controle de até 73,97%. Essa queda foi significativamente diferente e inferior à observada no controle. Entretanto, no mesmo período de avaliação, o tratamento químico reduziu a quantidade de plantas danificadas por R. solani em 90,41%.

[028] TABELA 2. Efeitos dos tratamentos sobre a quantidade de plantas de feijão com podridão radicular de R. solani ao longo das avaliações.

N° de plantas sintomáticas em 100 plantas por parcela útil

Tratamentos Doses ¹

7 DAE 28 DAE

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) m E (%) 111 E (%)

30 1,75 c 58,82 13,00 e 28,77

70 0,75 b 82,35 9.75 d 46,58

Formulação

100 0,00 a 100,00 7,25 c 60,27 biológica

150 0,00 a 100,00 4.75 b 73,97

200 0,00 a 100,00 5,00 b 72,60

Controle

300 0,00 a 100,00 1,75 a 90,41 químico ²

Testemunha 4,25 d - 18,25 f

CV (%) 9,77 5,28

Nota: médias seguidas de mesma letra não diferem entre si nas colunas pelo teste de Tukey

(p£0,05); 'g.lOO kg sementes '; ² Fludioxoni'+mctalaxyl (7,5 e 3,0% i.e., respectivamente); m: percentual de plantas com podridão radicular de Rhizoctonia solani em 100 plantas por parcela útil

(média de quatro repetições); DAE: dias após a emergência das plântulas; E (%): eficácia dos tratamentos segundo Abbott (1925); CV (%): coeficiente de variação.

[029] Finalmente, os diferentes tratamentos em estudo foram responsáveis por acréscimos variando de 13,75 a 24,31% na produtividade da cultura. Esses resultados demonstram os efeitos nocivos da podridão radicular de R. solani no feijoeiro e os benefícios decorrentes do seu controle utilizando a formulação biológica (Tabela 3).

[030] TABELA 3. Produtividade média do feijoeiro ( P . vulgaris) em função dos tratamentos aplicados para controle da podridão radicular de R. solani. Uberlândia, MG, agosto de 2012.

Produtividade Incremento Relativo

Tratamentos Doses ¹

(ton/ha) ( %)

Testemunha 15,14 b

30 17,64 ab 16,51

70 17,22 ab 13,75

Formulação

100 17,64 ab 16,50

biológica

150 18,06 ab 19,25

200 18,82 ab 24,31

Controle químico ² 300 20,48 a 35,29

CV (%) 4,58

Médias 4,33

Nota: médias seguidas de mesma letra não diferem entre si nas colunas pelo teste de Tukey

(/ 0.05); ton/ha: toneladas por hectare; 'gramas ou mililitros de produto comercial por 100 quilogramas de sementes; ² Fludioxonil+metalaxyl (7,5 e 3,0% i.e., respectivamente); CV (%): coeficiente de variação.

[031] EXEMPLO 2: Controle de Sclerotinia sclerotiorum em feijão.

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) OBJETIVO

[032] Avaliar o efeito, em condições de campo, da formulação biológica contendo os agentes bacterianos e fúngicos antagónicos no controle de Sclerotinia sclerotiorum.

MATERIAL E MÉTODOS

[033] Delineamento experimental: blocos casualizados com sete tratamentos e quatro repetições. As parcelas constituíram-se de seis linhas com seis metros de comprimento cada, totalizando uma área de 18 m ² . Entretanto, para as avaliações desconsiderou-se 1 metro em cada extremidade das linhas, totalizando uma parcela útil de 12 m ² .

[034] Tratamento e forma de aplicação: Avaliou-se o efeito de cinco doses da formulação biológica (300, 500, 750 e 1000 g.ha ¹ ), utilizando-se um controle negativo (sem tratamento) e dois controles positivos: um químico (300 g de fludioxonil + metalaxyl - 75 e 3,0% ingrediente ativo, respectivamente) e outro biológico (350 g de Trichoderma asperellum, 1,0 x 10 ¹⁰ u.f.c/g).

[035] Os tratamentos com a formulação biológica e o controle biológico foram aplicados mediante pulverização foliar, quando as plantas se encontravam no estádio de desenvolvimento 44, segundo a escala BBCH (Weber et al., 2001). Para a aplicação foi utilizado pulverizador costal pressurizado a C0 ₂ (60 lbf/roG ² ) com pressão constante, munido de uma barra com pontas de pulverização do tipo leque 110.02 e volume de calda equivalente a 200 L.ha ¹ . O tratamento químico foi realizado antes do plantio, no estádio fenológico 0 (escala BBCH - Weber et al., 2001).

[036] Amostragem e avaliação da eficácia da formulação: Realizaram- se cinco avaliações da incidência (%) e severidade (notas de 0 a 10) da doença, contando-se a quantidade de plantas sintomáticas e o percentual da

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) planta danificada pelas lesões de mofo-branco, em uma amostra de 100 plantas por parcela útil, sendo a primeira avaliação realizada antes da aplicação dos tratamentos via pulverização, e as demais aos 10, 20, 30 e 40 dias após a aplicação dos tratamentos (DAA). A produtividade média da cultura foi estimada em sacos por hectare pesando-se os grãos colhidos em 6 m ² de cada parcela. Durante a vigência do experimento monitorou-se a cultura com a finalidade de documentar a ocorrência de qualquer sintoma de fitotoxidez causado pelos produtos às plantas de feijão.

[037] Análise estatística: Os dados das avaliações de incidência, severidade e produtividade foram transformados utilizando-se a equação A ^{+ 1} _e submetidos à análise de variância. A área abaixo da curva de progresso da severidade da doença (AACPD) foi calculada conforme Campbell e Madden (1990). As comparações das médias foram realizadas pelo teste de Tukey (p<0,05) (1949), e as eficácias dos tratamentos foram calculadas segundo Abbott (1925).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

[038] Aos 10 DAA não foi possível determinar o efeito dos tratamentos em estudo sobre a incidência de mofo-branco em feijoeiro, uma vez que a doença ainda não havia se instalado na área experimental (Tabela 4). Contudo, aos 20 DAA, com a instalação e evolução da doença, verificou-se que os tratamentos aplicados apresentaram efeitos significativos sobre a incidência da doença. Entretanto, desempenhos satisfatórios só foram observados nas plantas tratadas com a formulação biológica na concentração de 1000 g p.c.ha ¹ e no controle químico (Fludioxonil+metalaxyl; 7,5 e 3,0% i.e., respectivamente), os quais não demonstraram sintomas aparentes de mofo-branco. Aos 30 DAA, o melhor resultado foi observado nas áreas em que as sementes foram tratadas com o controle químico, onde 100% das

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) plantas permaneciam isentas da doença, seguidas pelas áreas tratadas com a formulação biológica, na dose de 1000 g p.c.ha ¹ , nas quais a incidência da doença foi controlada em 85,71%. Na última avaliação (40 DAA), os diferentes tratamentos com formulação biológica diferiram significativamente da testemunha nas doses de 500, 750 e 1000 g p.c.ha ¹ , representando um controle da incidência da doença em um intervalo de 39,34 a 62,30%. Essas doses apresentaram resultados superiores ao demonstrado pelo Controle Biológico (composto apenas por T. asperellum ), evidenciando- se a melhoria na eficiência do controle de S. sclerotiorum pelo uso da mistura de agentes de controle.

[039] TABELA 4. Efeito dos tratamentos sobre a incidência de mofo- branco (S. sclerotiorum) em feijoeiro (P. vulgaris) e eficácia dos tratamentos ao longo das avaliações.

Incidência (%) de mofo-branco em 100 plantas por parcela útil

Tratamentos Doses ¹ Prévia 10 DAA 20 DAA 30 DAA 40 DAA

E (%) E (%) E (%)

300 0,00 a 0,00 a 2.25 b 43.75 8.75 d 44,44 38.75 de 15.30

Formulação 500 0,00 a 0,00 a 1,75 b 56,25 5.75 c 63,49 27.75 c 39,34 biológica 750 0,00 a 0,00 a 1.25 b 68.75 3.25 b 79,37 19.25 b 57,92

1000 0,00 a 0,00 a 0,00 a 100,00 2.25 b 85,71 17.25 b 62.30

Controle químico ² 300 0,00 a 0,00 a 0,00 a 100,00 0,00 a 100,00 3,00 a 93,44 Controle biológico ³ 350 0,00 a 0,00 a 1,75 b 56,25 8.25 d 47,62 33.75 cd 26,23 Testemunha 0,00 a 0,00 a 4,00 c 15.75 e 45.75 e

CV (%) 0,00 0,00 9,00 4,80 6, 18

Médias 1,00 0,00 1,54 2,52 5,01

Nota: médias seguidas de mesma letra não diferem entre si nas colunas pelo teste de Tukey (p 0,05); 'gramas de produto comercial por hectare ou mililitros de produto comercial por 100 quilogramas de sementes; ² Fludioxonil+metalaxyl (7,5 e 3,0% i.e., respectivamente); ³ Trichoderma asperellum (1,0 x 10 ¹⁰ ufc.g '); m: número de plantas sintomáticas em 100 plantas por parcela útil; DAA: dias após a aplicação dos tratamentos; E (%): eficácia dos tratamentos segundo Abbott (1925); CV (%): coeficiente de variação.

[040] Os resultados obtidos para a severidade da doença (Tabela 5) foram semelhantes aos observados para a incidência de mofo-branco. Aos 10 DAA não foi possível determinar o desempenho dos tratamentos sobre a

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) severidade do mofo-branco, já que a doença não estava instalada na área de estudo. Aos 20 DAA, com a instalação da doença, ficou comprovada a efetivo controle da formulação biológica na maior dosagem (1000 g p.c.ha ¹ ) e do controle químico, os quais controlaram a severidade da doença em 100%, enquanto que os demais tratamentos proporcionaram uma redução que variou de 50,34 a 79,31%. Aos 30 DAA, a severidade da doença reduziu em um intervalo de 31,73 a 100% nas plantas tratadas, sendo os melhores resultados também foram observados no tratamento com a formulação biológica (1000 g p.c.ha ¹ ) e no controle químico. Nesses tratamentos a redução foi de 88,27 e 100%, respectivamente. Na última avaliação, registrou-se uma queda no poder residual da formulação biológica (1000 g p.c.ha ¹ ) mas ainda assim, esse tratamento foi melhor que o tratamento com o controle biológico ( T . asperellum ), o qual não diferiu da testemunha.

[041] TABELA 5. Efeitos dos tratamentos sobre a severidade de mofo- branco (S. sclerotiorum) em feijoeiro (P. vulgaris) e eficácia dos tratamentos ao longo das avaliações.

CV {¾) tu» <U» 6,44 - 9,40 0 _r 46 0.00

Mídias 5,í» i,6í> i,4 ^’ .5 2,34 4 4 6,02

Nota: médias seguidas de mesma letra não diferem entre si nas colunas pelo teste de Tukey (p 0,05); DAA: dias após a aplicação dos tratamentos; 'gramas de produto comercial por hectare ou mililitros de produto comercial por 100 quilogramas de sementes; ² Fludioxonil+metalaxyl (7,5 e 3,0% i.e., respectivamente); ³ Trichoderma asperellum (1,0 x 10 ¹⁰ ufc.g '); m: percentual de área vegetal lesionada por mofo-branco por parcela útil; E (%): eficácia dos tratamentos segundo Abbott (1925); AACPD: área abaixo da curva de progresso da severidade da doença (Campbell e Madden, 1990); CV (%): coeficiente de variação.

[042] A produtividade do feijoeiro foi afetada de forma significativa

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) pelos tratamentos utilizados, registrando-se ganhos na produtividade variando de 4,45 a 64,43% (Tabela 6). Ressalta-se que os acréscimos mais expressivos foram obtidos nos tratamento de sementes com a formulação biológica, na dose de 1000 g p.c.ha ¹ e o controle químico, nos quais os incrementos foram de 37,78 e 64,43%, respectivamente. Estes resultados comprovam os prejuízos acarretados pela incidência do mofo-branco na cultura do feijão e os benefícios que o produtor pode obter no controle dessa doença utilizando a formulação biológica.

[043] TABELA 6. Produtividade média do feijoeiro (P. vulgaris) em função dos tratamentos aplicados para controle do mofo-branco.

Produtividade Incremento Relativo

Tratamentos Doses ¹

(sc/ha) (%)

300 16,32 c 4,45

Formulação 500 17,09 c 9.34

biológica 750 18.68 bc 19,55

1000 21,53 b 37,78

Controle químico ² 300 25.69 a 64,43

Controle biológico ³ 350 16,46 c 5.34

Testemunha _ - 15,63 c

CV (%) 3,77

Médias 4,42

'médias seguidas de mesma letra não diferem entre si nas colunas pelo teste de Tukey (p 0,05);

'gramas de produto comercial por hectare ou mililitros de produto comercial por 100 quilogramas de sementes; ² Fludioxonil+metalaxyl (7,5 e 3,0% i.e., respectivamente); ³ Trichoderma asperellum

(1,0 x 10 ¹⁰ ufc.g '); CV (%): coeficiente de variação.

[044] Além disso, os tratamentos em estudo não causam nenhum sintoma de fitotoxidez à cultura.

[045] Assim, as avaliações comprovam que o uso da formulação biológica contendo B. amyloliquef aciens, C. rosea e T. harzianum controla R. solani e S. sclerotiorum na cultura do feijão, podendo ser recomendado no manejo integrado desses fitopatógenos na cultura.

[046] Em uma segunda composição contendo 8,0% de Bacillus amyloliquef aciens, 4,8% de Trichoderma harzianum, 3,0% de polímero de

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) estireno acrílico, 1,0% surfactante aniônico e 83,2% de inerte foi formulada para avaliar sua eficiência no controle de fitopatógenos. O exemplo abaixo ilustra, mas não limita, o uso dessa composição:

[047] EXEMPLO 3. Controle de Rhizoctonia solani em feijão.

OBJETIVO

[048] Avaliar o efeito, em condições de campo, da formulação biológica contendo os agentes bacteriano e fúngicos antagónicos no controle de Rhizoctonia solani, aplicado via tratamento de semente.

MATERIAL E MÉTODOS

[049] Delineamento experimental: blocos casualizados com sete tratamentos e quatro repetições. As parcelas experimentais totalizaram uma área de 24,0 m ² (8,0 x 3,0 m), sendo a parcela útil constituída por uma área de 14,0 m ² .

[050] Tratamento e forma de aplicação: a infecção das sementes por R. solani foi garantida com a inoculação prévia do fitopatógeno, exceto o controle negativo (sem tratamento). O inoculo do fungo, previamente preservado pelo método Castellani, foi colocado para crescer por sete dias a 25°C, fotoperíodo de 12h, em placas de Petri (140 x 15 mm) contendo meio BDA (batata dextrose ágar). Posteriormente, sementes de feijão desinfestadas com hipoclorito de sódio 2,0% por 30s, foram colocadas em contato com o fungo por dois dias e mantidas a 25°C e fotoperíodo de 12h. Passado este período, as sementes foram retiradas das placas e submetidas aos diferentes tratamentos em estudo. Assim, avaliou-se o efeito de cinco doses da formulação biológica (0,45, 0,90, 1,40, 2,00 e 2,50 g p.c. kg semente ¹ ), utilizando-se um controle negativo (sem tratamento) e um controle inoculado (fitopatógeno inoculado artificialmente). O tratamento de sementes foi feito realizado conforme descrito anteriormente. As plântulas emergiram sete dias

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) após a semeadura.

[051] Amostragem e avaliação da eficácia da formulação: os efeitos dos tratamentos sobre a podridão radicular foram aferidos por meio de avaliações de incidência e severidade da doença para uma amostra de cinco plantas coletadas ao acaso dentro de cada parcela útil. Para a avaliação de severidade, atribui-se notas de 1 a 9 (sendo 1 = 0), escala proposta por Schoonhoven e Pastor-Corrales (1987), onde: 1 = sem sintomas visíveis; 3 = 5 a 10% da planta está infectada; 5 = 20 a 30% da planta está infectada; 7 = 40 a 60% da planta está infectada; 9 = mais de 80% da planta está infectada. As notas foram convertidas para percentual pelo índice de infecção proposto por Mckinney (1923). Todas as avaliações foram realizadas aos 3, 7, 10, 14 e 21 dias após a emergência (DAE). A produtividade da cultura foi estimada em quilogramas por hectare, pesando em uma balança analítica os grãos colhidos em 7,0 m ² de cada parcela útil. Durante a vigência do experimento monitorou- se a cultura com a finalidade de documentar a ocorrência de qualquer sintoma de fitotoxidez causado pelos produtos às plantas de feijão.

[052] Análise estatística: Os dados das avaliações de incidência, severidade e produtividade foram transformados utilizando-se a equação x ^{÷ 1} e submetidos à análise de variância. A área abaixo da curva de progresso da severidade da doença (AACPD) foi calculada conforme Campbell e Madden (1990). As comparações das médias foram realizadas pelo teste de Scott-Knott (p<0,05) (1974), e as eficácias dos tratamentos foram calculadas segundo Abbott (1925).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

[053] Com relação à incidência da doença, observou-se plantas sintomáticas em todos os tratamentos estudados, inclusive no controle negativo, para a qual utilizou-se sementes sem contato com o fungo. Esse fato

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) demonstra a contaminação do solo oriunda de safras anteriores, sendo o experimento instalado em área já com fonte de inoculo para R. solani. Essa situação é comum e se repete em quase todas as regiões de cultivo no Brasil, pois R. solani é um fungo cosmopolita, sobrevivendo no solo, na forma de escleródios, de uma safra para outra. Assim, fica comprovada a importância de se obter estratégias eficazes e ambientalmente seguras para o manejo deste fungo. Aos 3 e 7 DAE, a formulação biológica não diferiu estatisticamente do controle absoluto, ou seja, não diminui a incidência da doença. Como se trata de um produto biológico, é necessário um tempo para que haja o desenvolvimento dos organismos que compõem o produto e consequentemente, o estabelecimento dessas populações na comunidade rizosférica da cultura, possibilitando, assim, a ação desses organismos contra o fitopatógeno alvo. Essa ação pode ser visualizada aos 10 DAE, quando todas as doses avaliadas da formulação biológica reduziram de 40 a 90% a incidência de plantas doentes; esse efeito“protetor” persistiu até a última avaliação aos 21 DAE (Tabela 8).

[054] TABELA 8. Efeito dos tratamentos sobre a incidência de R. solani na cultura do feijoeiro (P. vulgaris ), cultivar Pérola, ao longo das avaliações. Uberlândia, MG, 2017.

m: média de quatro repetições (5 plantas/ parcela); médias seguidas de mesma letra não diferem entre si nas colunas pelo teste de Scott-Knott (p<0,05); DAE: dias após a emergência; g p.c. kg semente ¹ : gramas de produto comercial por quilograma de sementes; AACPD: área abaixo da curva do progresso da doença; CV (%): coeficiente de variação; E (%): eficiência calculada pela fórmula de Abbott.

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) [055] Resultados semelhantes aos apresentados para incidência foram observados para severidade. No início do desenvolvimento da cultura, aos 3 e 7 DAE, a formulação biológica não controlou a severidade da doença, obtendo-se médias semelhantes as médias observadas para os controles. No entanto, aos 10 DAE, a severidade nas plantas oriundas de sementes tratadas com as formulações biológicas foi estatisticamente inferior à testemunha inoculada, obtendo-se controle de 64,29 a 92,86%, para todas as doses avaliadas. Aos 14 DAE, houve um aumento na severidade da doença em todas as plantas, sendo esse avanço mais lento nas plantas tratadas com a formulação biológica, nas doses de 0,90 a 2,50 g p.c.kg sementes ¹ , com diferença de 60,66 a 85,25% em comparação com o controle inoculado. A menor dose (0,40 g p.c.kg sementes ¹ ), apesar de não diferir estatisticamente do controle inoculado, apresentou uma eficiência de controle superior a 29%. Aos 21 DAE os tratamentos utilizando as maiores doses (0,90 a 2,5 g p.c.kg sementes ¹ ) foram estatisticamente superiores à severidade observada no controle inoculado. No que diz respeito à evolução da doença, dentro da área e o avanço dela nas plantas, o tratamento de sementes com a formulação biológica, nas doses de 0,90 a 2,50 g p.c.kg sementes ¹ , retardou o avanço da colonização do fungo nos tecidos ainda sadios, reduzindo os danos na lavoura. O tratamento de sementes com a formulação biológica, nas quatro maiores doses, controlou de 47,24 a 70,66% a evolução da doença em comparação com a testemunha inoculada (Tabela 9).

[056] TABELA 9. Efeito dos tratamentos sobre a severidade (índice de infecção) de R.solani na cultura do feijoeiro (P. vulgaris ), cultivar Pérola, ao longo das avaliações. Uberlândia, MG, 2017.

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26)

m: média de quatro repetições (5 plantas/ parcela); médias seguidas de mesma letra não diferem entre si nas colunas pelo teste de Scott-Knott (p<0,05); DAE: dias após a emergência; g p.c. kg semente ¹ : gramas de produto comercial por quilograma de sementes; AACPD: área abaixo da curva do progresso da doença; CV (%): coeficiente de variação; E (%): eficiência calculada pela fórmula de Abbott.

[057] Com relação a produtividade da cultura, não houve interação significativa entre os tratamentos. Ainda assim, nas áreas em que as sementes foram tratadas com a formulação biológica houve um incremento de 4,64 a 17,27 % na produtividade, o que pode ser financeiramente significativo ao produtor (Tabela 10).

[058] TABELA 10. Produtividade de feijoeiro ( P . vulgaris ), cultivar

Pérola, em função dos tratamentos aplicados. Uberlândia, MG, 2017.

Doses Produtividade IR

Tratamentos kg.ha- ¹

g p.c.kg semente %

m†

1. Testemunha 2541,01 a 19,79

2. Testemunha inoculada 2121,23 a

3. AGVL006 0,45 2219,62 a 4,64

4. AGVL006 0,90 2406,20 a 13,43

5. AGVL006 1,40 2487,53 a 17,27

6. AGVL006 2,00 2469,49 a 16,42

7. AGVL006 2,50 2412,44 a 13,73

CV (%) 9,63

Médias 2379,65

m: média de quatro repetições; tmédias seguidas de mesma letra não diferem entre si nas colunas pelo teste de Scott-

Knott (p 0,05); g p.c. kg semente ¹ : gramas de produto comercial por quilograma de sementes; kg.ha ¹ : quilogramas por hectare; IR: incremento na produtividade em relação à testemunha; CV (%): coeficiente de variação.

[059] Portanto, diante dos resultados apresentados, fica comprovado o efeito da formulação biológica no tratamento de sementes para o controle da

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) podridão radicular (R. solani ) na cultura do feijoeiro, podendo esse ser recomendado como uma prática fitos sanitária dentro do manejo integrado desta cultura.

CONCLUSÕES

[060] As combinações entre a bactéria Bacillus amyloliquefaciens, e os fungos Clonostachys rosea e Trichoderma harzianum ou Bacillus amyloliquefaciens e Trichoderma harzianum se mostram como alternativas viáveis ao uso de fungicidas químicos. Ademais, ao combinar os diversos mecanismos de controle desses microrganismos específicos, essas formulações biológicas ampliam os efeitos benéficos desses agentes de controle na mitigação dos danos causados por fitopatógenos.

[061] O preparo da formulação deverá seguir o seguinte fluxo de eventos:

• Matéria prima: as matérias primas que irão compor o produto deverão ser recebidas e manipuladas por pessoas treinadas;

• Mistura: as matérias primas deverão ser pesadas e misturadas seguindo o procedimento operacional padrão (POP) nas proporções indicadas;

• Amostragem: após a mistura, deverão ser retiradas amostras para verificação e certificação das garantias do produto. Deve-se analisar número de unidades formadoras de colónias u.f.c./g de produto;

• Envase: o produto formulado que se apresentar dentro das especificações de garantia deverão ser envasados em frascos plásticos de 1,0 e 10,0 kg, previamente rotulados. Os potes são selados e fechados com tampa;

• Armazenagem: os frascos são acomodados em pallets e armazenados em local seco, arejado e protegido da luz, permanecendo nessa condição até ser despachado.

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) [062] O presente invento poderá ser aplicado como tratamento de sementes, aplicação via sulco e pulverização em área total para o controle de fungos fitopatogênicos. O método de aplicação deverá ser analisado caso a caso e dependerá das condições técnicas e necessidade de cada produtor.

VANTAGENS OBTIDAS

[063] Com a composição para controle biológico de fungos fitopatogênicos, assim obtida, a mesma oferece as seguintes vantagens:

• Apresenta ser uma alternativa ao uso de fungicidas químicos, vindo ao encontro do interesse da sociedade para produtos mais ecologicamente seguros;

• Explora uma gama maior de mecanismos de ação contra fungos fitopatogênicos, garantindo, assim, uma maior eficiência;

• Diminui a seleção de fitopatógenos resistentes a produtos químicos; e

• Possui uma versatilidade na aplicação (via sulco de plantio, tratamento de sementes e pulverização foliar), facilitando sua utilização em diversos sistemas de plantio.

[064] A abrangência da presente patente de invenção, não deve ser limitada aos exemplos de aplicação, mas sim, aos termos definidos nas reivindicações e seus equivalentes.

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