Titre : Composition pour la captation de plomb et/ou de cadmium dans un fluide de dialyse

Domaine technique [0001] La présente divulgation relève du domaine des techniques de dialyse. Elle porte plus précisément sur des méthodes de traitement des eaux et liquides de dialyse, en particulier pour capter certains métaux toxiques tels que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, diminuer ainsi la concentration en cations métalliques susceptibles de diffuser au travers d’une membrane, et prévenir leur passage dans le sang lors d’une dialyse d’un patient, par exemple une hémodialyse, une hémofiltration ou une hémodiafiltration.

Technique antérieure

[0002] Le maintien de l’homéostasie du milieu intérieur de l’organisme, c’est-à-dire de l’ensemble des liquides ou fluides biologiques de l’organisme, est nécessaire au bon fonctionnement de ce dernier. Dans de nombreuses pathologies, des dérégulations systémiques ou locales de l’homéostasie des métaux ont été mises en évidence.

[0003] Dans l’organisme, les métaux sont soumis à de nombreux équilibres et sont associés à des fonctions complexes. Certains métaux comme le cuivre ou le fer sont indispensables pour le fonctionnement du corps humain tandis que d’autres n’ont aucune fonction reconnue et sont associés à de fortes toxicités. C’est notamment le cas des métaux lourds comme par exemple le plomb, le mercure ou le cadmium. Ces métaux peuvent notamment induire un stress oxydant ou interagir et modifier les fonctions de biomolécules essentielles.

[0004] Le cadmium et le plomb sont ainsi cités par la « World Health Organization » (WHO) comme deux des dix polluants d’importance majeure pour la santé humaine (S. Satarug et al., Toxics, 2020). Ils se concentrent majoritairement dans les os et les reins, mais leur effet toxique ne se limite pas à ces organes, notamment en induisant un stress oxydant, des lésions de l’ADN, en prenant la place d’autres métaux ou en détournant de leur usage certaines protéines, notamment celles contenant des composés soufrés. Les agences de sûreté ont ainsi baissé fortement les taux acceptables de ces composés, bien qu’il ait été montré que même un taux faible en dessous de ces valeurs est reconnu comme toxique et que toute diminution plus forte de ce taux serait bénéfique. Pour le plomb, le WHO recommande ainsi un taux dans le sang inférieur à 100 pg.L ¹ pour les adultes et l’agence américaine préconise un taux à 50 pg.L ¹ pour les enfants (L. A. Alli, Interdiscip. Toxicol., 2015). Pour le cadmium, le taux est beaucoup plus bas et compris entre 0,3 et 1,2 pg.L ¹ pour la WHO. L’augmentation du taux de cadmium ou de plomb dans le sang est ainsi notamment liée à une augmentation du risque de maladie des reins, de maladies cardiovasculaires ou de cancers.

[0005] L’hémodialyse et l’hémodiafiltration sont actuellement les traitements les plus classiquement utilisés pour les patients souffrant d’une maladie rénale en phase terminale et sont malheureusement associés à une surmortalité par infection ou maladie cardiovasculaire (M. Tonelli et al., BMC Medicine, 2009). Ces techniques consistent à permettre, à travers une membrane perméable aux molécules de poids moléculaires petits et moyens, des échanges libres d’ions et de toxines entre un fluide appelé dialysat et le sang du patient. Cette technique permet d’extraire du sang des molécules ou atomes toxiques tels que les métaux lourds. Un fluide de dialyse est essentiellement constitué d’eau. L’objectif de la dialyse étant de purifier le sang, il va de soi que l’eau utilisée pour la préparation d’un fluide de dialyse doit être stérile et la plus pure possible. Il a été montré dans de nombreuses études que les patients traités à long terme par dialyse peuvent présenter une déficience en éléments essentiels comme le zinc et le sélénium mais également une surconcentration en métaux lourds tels que le plomb ou le cadmium (A. Almeida et al., J. Trace Elem. Med. Biol., 2020). Les patients subissant une hémodialyse sont en effet soumis à une grande quantité de dialysat (> 300 L/semaine), ainsi même une pollution à l’état de trace dans le dialysat peut conduire à une surconcentration métallique en métaux lourds et à une toxicité clinique avérée (G. Filler étal., Pediatr. Nephrol., 2014) le cadmium est par exemple associé à une dysfonction rénale (C. G. Sotomayor Kidney int, 2020), à l’ostéoporose (K. A. James, Int. J. of Public Health 2013) et à l’artériosclérose (B. Messner, Arteriosclerosis, thrombosis ans Vascular Bio 2009) avec une augmentation de la mortalité cardiovasculaire chez les patients exposés à des concentrations élevées (S. Larsson, Int. J. of Epdemiology 2016). Ces risques sont d’autant plus grands pour les enfants pour lesquels la toxicité des métaux lourds est reconnue comme encore plus critique notamment pour le développement neurocognitif et la croissance. Ces risques sont également élevés chez la femme enceinte pour le développement du foetus.

[0006] La pureté recommandée des eaux de dialyse est déjà bien stricte, et est souvent de l’ordre du ppb en concentration maximale en plomb ou cadmium, c’est-à-dire souvent des concentrations beaucoup plus faibles que la concentration totale dans le sang. Néanmoins, ces concentrations ne semblent pas encore assez faibles, pour éviter des problèmes de santés liés aux surcharges en métaux lourds. En effet, si les concentrations en métaux lourds dans le sang sont très souvent supérieures aux fluides de dialyses utilisés, il est à noter que dans le sang, la grande majorité de ces métaux est associée à des cellules (en particulier érythrocytes) et seuls quelques pourcents se retrouvent dans le plasma. La concentration plasmatique en plomb et cadmium est alors assez proche des teneurs initiales en métaux lourd dans les fluides de dialyses. Plus précisément encore, sur la teneur plasmatique en métaux, une grande majorité est associé à des protéines de grandes tailles (comme l’albumine) et ne peuvent ainsi pas diffuser à travers les membranes conventionnelles de dialyses. La concentration plasmatique en cations de métaux lourds, Pb ²⁺ et Cd ²⁺ , libres ou associés à des petites espèces qui peuvent diffuser à travers une membrane de dialyse est donc beaucoup plus faible et apparaît souvent en dessous des teneurs du fluide de dialyse. Il existe alors un risque de contamination du patient en métaux lourds lors des dialyses, même si les teneurs du fluide de dialyse sont inférieures à 1 ppb. [0007] Un fluide de dialyse purifié en partie en métaux libre, et en particulier en métaux lourds de type plomb ou cadmium, apporte un bénéfice au traitement de dialyse et surtout en hémodiafiltration, lorsque le fluide est réinjecté directement dans le patient, en amont ou aval de la dialyse. Les métaux lourds sont connus pour favoriser le stress oxydant, et une diminution de leur teneur au sein des fluides de dialyse apporterait un bénéfice au niveau de la diminution des risques de maladies cardiovasculaires, d’arthérosclérose, de diminution de la fonction rénale, de problème d’articulation et osseux et également de maladies neurodégénératives. En captant les métaux lourds on préserve l’endothélium des patients.

[0008] Il est extrêmement difficile de garantir une absence d’impuretés métalliques dans des réactifs chimiques ou même une source d’eau nécessaire à la formulation d’un fluide de dialyse. Ce fait est même encore plus problématique dans les pays émergents rendant nécessaire la mise en place de solutions technologiques pour garantir une dialyse qui ne contribuera pas à une surconcentration en espèces métalliques toxiques. En particulier, la purification de l’eau utilisée pour préparer un fluide de dialyse fait appel à un processus long et coûteux nécessitant des appareils de haute technicité. Par ailleurs, les teneurs en éléments potentiellement polluants pour le patient dialysé varient d’un endroit à un autre.

[0009] Ainsi, de manière générale, dans les dispositifs d’hémodialyse, les utilisations d’eaux ultra-pures, mais aussi de fluides de dialyse ultra-purs sont largement conseillés.

[0010] En particulier de nouveaux dispositifs, comme des filtres d’ultrafiltration, permettent de diminuer le taux d’endotoxines directement sur la ligne de circulation des fluides de dialyse, avant le passage dans le dialyseur, ou même avant leur réinsertion directe dans le patient en cas d’hémodiafiltration. Plusieurs dizaines de litres de fluides de dialyse peuvent ainsi être directement injectées dans le patient au cours d’une séance, et la qualité du fluide est très importante. Si ces dispositifs, comme par exemple le filtre d’hémodialyse DIASAFE Plus, permettent une rétention efficace des contaminations microbiennes et/ou endotoxines bactériennes, ils n’ont pas d’efficacité sur la rétention de métaux libres.

[0011] Ainsi, il serait bénéfique de proposer une solution qui s’affranchisse, au moins en partie, de ces appareils et du lieu de préparation du fluide de dialyse pour prévenir la pollution du patient dialysé.

[0012] C’est dans ce cadre que se situe l’invention présentée qui concerne notamment l’utilisation d’un adjuvant polymérique chélatant, présent en très faible quantité dans le dialysat et susceptible de chélater les métaux lourds indésirables, tout en présentant une taille suffisante pour prévenir son relargage dans l’organisme lors de la dialyse.

[0013] Un objectif de l’invention est donc de proposer une méthode de préparation d’une composition pour dialyse, indépendante du lieu de mise en oeuvre de la dialyse.

[0014] Un autre objectif de l’invention est de proposer une composition de dialyse présentant des teneurs en métaux lourds diffusables (plomb et cadmium sous forme de cations libres ou associés à des petites molécules/ions complexants) extrêmement faibles, en dessous du ppb et de préférence en dessous de 0,1 ppb.

[0015] Un objectif supplémentaire est de proposer une méthode permettant de prévenir la pollution par des métaux exogènes tels que le plomb ou le cadmium du patient dialysé.

[0016] Ces objectifs et d’autres sont atteints grâce à la composition selon l’invention et ses utilisations détaillées ci-après.

Résumé

[0017] L’invention porte sur une composition pour dialyse, comprenant un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20 kDa et 1000 kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, ledit polymère étant présent dans une quantité suffisante pour être dans une concentration comprise entre 0,01 mg/L et 10mg/L dans le dialysat lors d’une dialyse d’un patient.

[0018] L’invention porte également sur un méthode de captation d’au moins un métal toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, présent dans un fluide de dialyse, comprenant une étape d’ajout audit fluide de dialyse d’une quantité suffisante d’un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20kDa et 1000kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, permettant ainsi la captation dudit métal toxique par chélation avec l’agent chélatant dudit polymère. [0019] L’invention porte également sur l’utilisation d’un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20kDa et 1000kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium pour préparer une composition pour dialyse, par exemple pour hémodialyse, hémodiafiltration ou hémofiltration, en particulier une composition selon l’invention.

[0020] Les caractéristiques exposées dans les paragraphes suivants peuvent, optionnellement, être mises en oeuvre, indépendamment les unes des autres ou en combinaison les unes avec les autres.

Brève description des dessins

[0021] D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, et à l’analyse des dessins annexés, sur lesquels :

Fig. 1

[0022] [Fig. 1] La figure 1 est un schéma décrivant le principe d’une ultrafiltration Vivaspin.

Fig. 2

[0023] [Fig. 2] La figure 2 est un graphique représentant l’efficacité de la captation du Pb ²⁺ et du Cd ²⁺ selon l’exemple 1.

Fig.2a

[0024] [Fig. 2a] La figure 2a est un chromatogramme HPLC-MS de la détection du Pb ²⁺ en interaction avec le polymère Mex-CD1 selon l’exemple 1.

Fig.2b

[0025] [Fig. 2b] La figure 2b est un chromatogramme HPLC-MS de la détection du Cd ²⁺ en interaction avec le polymère Mex-CD1 selon l’exemple 1.

Fig. 3

[0026] [Fig. 3] La figure 3 est un chromatogramme HPLC-MS de la détection du Pb ²⁺ dans l’acide acétique selon l’exemple 2.

Fig. 4

[0027] [Fig. 4] La figure 4 est un chromatogramme HPLC-MS de la détection du Pb ²⁺ dans l’acide citrique selon l’exemple 2.

Fig. 5

[0028] [Fig. 5] La figure 5 est un chromatogramme HPLC-MS de la détection du Pb ²⁺ dans l’acide acétique selon l’exemple 3. Fig. 6

[0029] [Fig. 6] La figure 6 est un chromatogramme HPLC-MS de la détection du Pb ²⁺ dans l’acide citrique selon l’exemple 3

Fig. 7 [0030] [Fig. 7] La figure 7 est un graphique représentant l’efficacité de la captation du Pb ²⁺ selon l’exemple 4.

Fig. 8

[0031] [Fig. 8] La figure 8 représente 2 graphiques représentant l’efficacité de la captation du Pb ²⁺ et du Cd ²⁺ , à haute et basse concentration, selon l’exemple 5. Fig. 9

[0032] [Fig. 9] La figure 9 est un graphique représentant l’efficacité de la captation du Cu ²⁺ et du Mn ²⁺ , selon l’exemple 5.

Fig. 10

[0033] [Fig. 10] La figure 10 est un graphique représentant l’efficacité de la captation du Pb ²⁺ , selon l’exemple 6.

Fig. 11

[0034] [Fig. 11] La figure 11 est un graphique représentant l’efficacité de la captation du Cd ²⁺ , Cu ²⁺ et du Pb ²⁺ , selon l’exemple 7.

Fig. 12 [0035] [Fig. 12] La figure 12 est un graphique représentant l’efficacité de la captation du

Cd ²⁺ , Cu ²⁺ et du Pb ²⁺ , selon l’exemple 8.

Fig. 13

[0036] [Fig. 13] La figure 13 est un graphique représentant l’efficacité de la captation du Cd ²⁺ , Cu ²⁺ et du Pb ²⁺ , selon l’exemple 9. Fig. 14

[0037] [Fig. 14] La figure 14 est un graphique représentant l’efficacité de la captation du Cd ²⁺ , Cu ²⁺ et du Pb ²⁺ , selon l’exemple 10.

Fig. 15

[0038] [Fig. 15] La figure 15 représente un chromatogramme représentant la stabilité du MEX-CD1 dans de l’acide citrique selon l’exemple 11. Fig. 16

[0039] [Fig. 16] La figure 16 représente un chromatogramme représentant la stabilité du PEG@DOTAGA dans de l’acide citrique selon l’exemple 11.

Fig. 17 [0040] [Fig. 17] La figure 17 un chromatogramme représentant la chélation du Pb ²⁺ et du

Cd ²⁺ selon l’exemple 12.

Fig. 18

[0041] [Fig. 18] La figure 18 est un chromatogramme représentant la chélation du Pb ²⁺ et du Cd ²⁺ en milieu acide selon l’exemple 12. Fig. 19

[0042] [Fig. 19] La figure 19 est un chromatogramme représentant la chélation de l’aluminium selon l’exemple 13.

Fig. 20

[0043] [Fig. 20] La figure 20 est un chromatogramme représentant la chélation de l’aluminium en présence de citrate selon l’exemple 13.

Fig. 21

[0044] [Fig. 21] La figure 21 est un graphique représentant la concentration en aluminium mesurée par ICP-MS selon I’exemple14.

Fig. 22 [0045] [Fig. 22] La figure 22 est un graphique représentant le pourcentage d’aluminium extrait selon l’exemple 14.

Description détaillée

[0046] L’invention concerne une composition pour dialyse, ladite composition comprenant un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20 kDa et 1000 kDa et portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, ledit polymère étant dans une quantité suffisante pour être dans une concentration comprise entre 0,01 mg/L et 10 mg/L dans le dialysat (ou fluide de dialyse) lors d’une dialyse d’un patient.

[0047] Au sens de l’invention, le terme « dialyse » englobe les procédés d’épuration du sang chez des patients qui en ont besoin, par exemple des patients souffrant d’insuffisance rénale, aiguë ou chronique, notamment d’insuffisance rénale chronique terminale, et comprenant l’utilisation d’un dialyseur. Le dialyseur comprend une membrane poreuse ou semi-perméable, permettant le passage par diffusion ou convection des petites molécules, tout en bloquant le passage des molécules de taille plus importante, par exemple des protéines. La membrane présente ainsi un seuil de coupure ou « cut-off », c’est-à-dire la masse moléculaire au-delà de laquelle la membrane est considérée comme strictement imperméable, c’est-à-dire comme susceptible de bloquer 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, voire jusqu’à au moins 99,9% des molécules de masse moléculaire supérieure au seuil de coupure.

[0048] Le terme « dialyse » ou « épuration extra rénale » englobe en particulier l’hémodialyse, l’hémofiltration et l’hémodiafiltration. La dialyse désigne l’ensemble des méthodes d’épuration extrarénale permettant d’épurer les toxines urémiques et de corriger les troubles hydroélectrolytiques résultant de la dysfonction rénale (potassium, calcium, phosphore, acide, base). En pratique, le seuil de coupure d’une membrane semi-perméable pour une hémodialyse est de moins de 20 à 50 kDa pour les membranes à haute perméabilité. Dans le cadre de l’hémodialyse, les échanges à travers la membrane poreuse ou semi-perméable se font principalement par gradient de concentrations de part et d’autre de la membrane, mécanisme appelé diffusion. Dans le cadre d’hémofiltration, les échanges se font par gradient de pressions, du dialysat vers le sang, appelé convection. L’hémodiafiltration est la technique la plus communément prescrite, elle combine diffusion et convection (B. Canaud, Principes et modalités d’application de l’hémodialyse au traitement de l’insuffisance rénale chronique. Néphrologie et thérapeutique 2009).

[0049] Les dispositifs d’épuration extra rénale utilisés avec la présente invention, permettent donc des échanges entre dialysat et sang à travers une membrane semi perméable, ils comprennent (1 ) un réservoir contenant de l’eau ultra pure, (2) un générateur qui assure la circulation sanguine extra corporelle, la circulation du dialysat et qui génère le dialysat (ou fluide de dialyse), (3) une membrane semi perméable, aussi appelée dialyseur, (4) un dispositif de circulation sanguine extracorporelle et (5) un accès vasculaire.

[0050] Typiquement, on entend par « dispositif de circulation sanguine extracorporel », un dispositif permettant de réaliser une diversion du flux sanguin veineux dans un circuit situé hors du corps avec un débit de circulation de 300 à 400 ml/min chez l’adulte (variable chez l’enfant, en néonatologie >10 ml/min).

[0051] Le terme « dialysat » ou « fluide de dialyse » (utilisé de manière interchangeable) correspond au fluide préparé par le générateur, et utilisé lors de la séance de dialyse pour correction des troubles hydroélectrolytiques. Le dialysat résulte d’un mélange à partir du bain d’acide (acide acétique, acide citrique ou acide chlorhydrique), d’ions (potassium, sodium, chlore, calcium, magnésium), de glucose, d’eau ultrapure stérile et d’un tampon bicarbonate. En cas d’utilisation d’un dispositif de purification par ultrafiltration (par exemple DIASAFE ^(R) plus ou DIACLEAR ^(R) Ultrafiltrate), la composition du dialysat peut être mesurée en amont ou en sortie d’un filtre d’ultrapurification. Elle s’entend préférentiellement en amont de ces filtres, au niveau de la connexion d’entrée. Le débit du dialysat étant généralement de 500 à 700ml/min, et les séances de dialyse de 4 heures, un générateur de dialysat produit de façon continue et extemporanée 120 à 170 litres de dialysat par séance. Certains protocoles d’hémodialyse courts (2 heures par séance, et 6 séances par semaine), appelés hémodialyse quotidienne, utilisent des générateurs (NxStage, Physidia S3) qui nécessitent du dialysat en poches stériles de 5 litres, de même composition que décrit précédemment.

[0052] Par « composition pour dialyse », on entend ainsi toute composition adaptée pour son utilisation dans la préparation d’un dialysat ou fluide de dialyse. Ainsi, au sens de l’invention, le terme « composition pour dialyse » englobe le dialysat, ou une solution concentrée (additif) permettant la préparation du fluide de dialyse après dilution dans de l’eau stérile, et, le cas échéant avec d’autres additifs. Typiquement, dans un mode de réalisation, la composition pour dialyse selon l’invention est une solution concentrée pour dialyse ou un additif pour solution concentrée. Lesdites solutions concentrées comprennent notamment des solutions concentrées acides, comprenant au moins une quantité suffisante d’acide, par exemple choisi parmi l’acide acétique, l’acide chlorhydrique ou l’acide citrique, associé à un mélange d’ions, tel que le potassium, le sodium, le chlore, le calcium ou le magnésium, avec du glucose, à cette solution s’ajoute le tampon bicarbonate et l’eau ultrapure stérile.

[0053] Dans un autre mode de réalisation, la composition pour dialyse selon l’invention est une solution concentrée comprenant en outre un ou plusieurs électrolytes, en particulier choisi parmi le sodium, le potassium, le chlore, le magnésium ou le calcium, et des bicarbonates.

[0054] Dans un mode de réalisation particulier, la composition pour dialyse est une solution concentrée comprenant en plus dudit polymère, un acide et plusieurs électrolytes, en particulier choisi parmi le sodium, le potassium, le chlore, le magnésium et le calcium, et des bicarbonates.

[0055] Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition pour dialyse selon l’invention est une solution concentrée conditionnée dans une poche adaptée pour un dispositif de dialyse, de préférence une poche contenant un volume de solution compris entre 500 et 5000 mL et une quantité dudit polymère comprise entre 5 et 5000 mg et de préférence entre 10 et 100 mg.

Le polymère

[0056] Conformément à l’invention, le polymère est de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20 kDa et 1000 kDa. Ainsi, lorsque la composition pour dialyse est mise en oeuvre dans un dispositif de dialyse, le polymère est d’une masse moléculaire moyenne supérieure au seuil de coupure de la membrane semi-perméable utilisée dans le dispositif de dialyse. De manière préférée, le polymère est de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 100 kDa et 900 kDa, de manière plus préférée entre 250 kDa et 750 kDa et de manière encore plus préférée, entre 400 kDa et 600 kDa.

[0057] Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, le polymère est un polysaccharide statistique portant au moins un agent chélatant.

[0058] La masse moléculaire moyenne du polymère peut être déterminée par chromatographie d’exclusion stérique. [0059] De manière préférée, le polymère selon l’invention, de préférence le polysaccharide de formule I ou II ci-dessous, présente une constante de complexation d’au moins 10 ¹⁵ pour un élément de transition d ou f.

[0060] En particulier, dans un mode avantageux, le polymère est un polysaccharide statistique de formule I [0061] [Chem. 1]:

Formule I dans laquelle : chaque Rc représente indépendamment un groupement comportant un agent chélatant, chaque Z représente indépendamment un liant pouvant être une simple liaison ou une chaîne hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisi parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes,. x est compris entre 0,005 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,7, préférentiellement entre 0,2 et 0,6, et plus préférentiellement entre 0,25 et 0,4, y est compris entre 0,01 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,2, le rapport y/x étant supérieur ou égal à 0,05, de préférence supérieur ou égal à 0,15, et la somme x + y étant supérieure ou égale à 0,30, de préférence supérieure ou égale à 0,35.

[0062] Il est entendu que, dans la formule I ci-dessus, plusieurs groupements Rc peuvent être présents dans le polysaccharide. Ces groupements Rc peuvent être identiques ou différents les uns des autres. Ils sont tous indépendamment choisis parmi les groupements portant un agent chélatant. Il en va de même des liants Z : plusieurs liants Z peuvent être présents, et ils peuvent être identiques ou différents les uns des autres.

[0063] Selon un autre mode de réalisation, dans la formule I, x est compris entre 0,05 et

0,6, y est compris entre 0,1 et 0,9, le rapport y/x étant supérieur à 0,16, et la somme x + y étant supérieure à 0,4.

[0064] Selon un mode de réalisation, le polysaccharide de formule I est un polysaccharide de formule II

[0065] [Chem. 2]: Formule II dans laquelle :

Rci et RC ₂ sont différents, et sont des groupements comportant un agent chélatant,

Zi et 2.2, identiques ou différents, sont des liants pouvant être une simple liaison ou une chaîne hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisis parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes, x est compris entre 0,005 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,7, préférentiellement entre 0,2 et 0,6, et plus préférentiellement entre 0,25 et 0,4, y est compris entre 0,01 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,2, le rapport y/x étant supérieur ou égal à 0,05, de préférence supérieur ou égal à 0,15, la somme x + y étant supérieure ou égale à 0,30, de préférence supérieure ou égale à 0,35, et z est compris entre 0,5 et 1.

[0066] Dans ce mode de réalisation spécifique, le polysaccharide de formule II peut comprendre : - un seul type de groupement comportant un agent chélatant, Rci, lorsque z = 1 , ou

- 2 types de groupements comportant un agent chélatant, Rci et RC2, lorsque 0,5 < z < 1.

[0067] Selon un mode de réalisation, z est compris entre 0,8 et 0,99, le groupement Rci est donc largement majoritaire.

[0068] Selon un autre mode de réalisation, dans la formule II, x est compris entre 0,05 et 0,6, y est compris entre 0,1 et 0,9, le rapport y/x étant supérieur à 0,16, et la somme x + y étant supérieure à 0,4.

[0069] On entend par groupement de type Rc, les groupements Rc dans le polysaccharide de formule I, et les groupements Rci et Rc2, lorsque le groupement Rc2 est présent, dans le polysaccharide de formule II.

[0070] Le groupement Rc est un agent chélatant. En d’autres termes le groupement Rc permet de chélater un ou plusieurs métaux en formant un complexe.

[0071] Conformément à l’invention, les groupements Rc, Rci et Rc2 sont des agents chélatants. En d’autres termes les groupements Rc, Rci et Rc2 permettent de chélater un ou plusieurs métaux en formant un complexe.

[0072] Chacun des groupements Rc, Rci et Rc2 peut contenir un ou plusieurs sites de coordination. De préférence, le site de coordination est un atome d’azote ou d’oxygène. De manière avantageuse, chacun des groupements Rc, Rci et Rc2 comporte entre 4 et 8 sites de coordination, de manière plus avantageuse entre 6 et 8 sites de coordination et de manière encore plus avantageuse chacun des groupements Rc, Rci et Rc2 comporte 8 sites de coordination.

[0073] On entend par site de coordination une unique fonction capable de chélater un métal. Par exemple, une fonction amine représente un site de coordination par la formation d’une liaison dative entre l’atome d’azote et le métal et une fonction acide hydroxamique représente également un site de coordination par la formation d’une liaison dative entre l’oxygène du motif carbonyle et par une liaison covalente avec l’oxygène du motif N-oxyde le site de coordination formant ainsi un cycle à cinq chaînons. [0074] Dans un mode de réalisation de l’invention, pour le polysaccharide de formule I, chaque groupement Rc est indépendamment choisi dans le groupe constitué du DOTA (acide 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-N,N’,N”,N”’-térac� �tique), NOTA (acide 1,4,7- triazacyclononane-1 ,4,7-triacétique), NODAGA (acide 1 ,4,7-triazacyclononane-1- glutarique-4,7-acide diacétique), DOTAGA (acide 2-(4,7,10-tris(carboxyméthyl)-1,4,7,10- tétraazacyclododécan-1-yl)pentanedioïque), DOTAM (1 , 4,7,10-tetrakis(carbamoylméthyl)- 1,4,7,10 tétraazacyclododécane), D03AM (acide 2-‘4,7,10-tris(2-amino-2oxoéthyl)- 1 ,4,7,10-tétraazacyclododécan — 1-yl) acétique), NOTAM (1 ,4,7-tetrakis(carbamoylméthyl)- 1 ,4,7-triazacyclononane), DOTP (1 ,4,7,10-tétraazacyclododécane 1,4,7,10- tétrakis(méthylène phosphonate), NOTP (1,4,7-tétrakis(méthylène phosphonate )-1 ,4,7- triazacyclononane), TETA (acide 1,4,8,11-tétraazacyclotétradécane-N,N’,N”,N’”- téraacétique), TETAM (1 ,4,8,11-tétraazacyclotétradécane-N,N’,N”,N”’-tét rakis(carbamoyl méthyl), du DTPA (acide diéthylène triaminopentaacétique) et DFO (deferoxamine), de préférence dans le groupe constitué du DOTAGA, du DFO, du DOTAM et du DTPA et de manière plus préférée le groupement Rc est le DOTAGA.

[0075] Dans un mode de réalisation de l’invention, pour le polysaccharide de formule II, Rci et RC ₂ sont indépendamment choisis dans le groupe constitué du DOTA, NOTA, NODAGA, DOTAGA, DOTAM, D03AM, NOTAM, DOTP, NOTP, TETA, TETAM, du DTPA et DFO, de préférence dans le groupe constitué du DOTAGA, DFO, DOTAM et du DTPA. [0076] Selon un mode de réalisation, pour le polysaccharide de formule II, le groupement

Rci est le DOTAGA, et de préférence, z=1.

[0077] Selon un mode de réalisation, pour le polysaccharide de formule II, le groupement Rci est le DOTAGA et le groupement Rc2est le DFO.

[0078] On entend par liant de type Z, les liants Z dans le polysaccharide de formule I, et les liants Zi et Z2, lorsque le liant Z2 est présent, dans le polysaccharide de formule II.

[0079] Le choix des liants Z, Z1 et Z2 dans les formules I et II dépend essentiellement des groupements Rc, Rci et RC2 et du métal à chélater. En effet, pour des raisons stériques notamment, les groupements Rc, Rci et RC2 peuvent être plus ou moins proches du cycle à 6 chaînons de l’azote de l’unité glucosamine. [0080] De préférence, dans la formule I, chaque Z est indépendamment une simple liaison ou une chaîne hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisis parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes. [0081] Selon un mode de réalisation, dans la formule I, chaque Z est indépendamment sélectionné dans le groupe constitué par : une liaison, une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, et une chaîne alcényle linéaire ou ramifiée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, lesdites chaînes alkyle et alcényle pouvant être interrompues par un ou plusieurs groupes aryle en C6-C10, et/ou par un ou plusieurs hétéroatomes ou groupes sélectionnés dans le groupe constitué par -O-, -S-, -C(O)-, -NR’-, -C(0)NR’-, -NR’-C(O)-, -NR’-C(0)-NR’-, -NR’- C(0)-0-, -0-C(0)NR’, -C(S)NR’-, -NR’-C(S)-, -NR’-C(S)-NR’ lesdites chaînes alkyle et alcényle pouvant être substituées par un ou plusieurs groupes sélectionnés dans le groupe constitué par les halogènes, -OR’, -COOR’, -SR’, -NR’2 _, chaque R’ est indépendamment H ou un alkyl en C1-C6.

[0082] Avantageusement, dans la formule I, chaque Z est indépendamment sélectionné dans le groupe constitué par : une liaison et une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne alkyle pouvant être interrompue par un ou plusieurs groupes aryle en C6-C10, et/ou par un ou plusieurs hétéroatomes ou groupes sélectionnés dans le groupe constitué par -O-, -S-, -C(O)-, -NR’-, -C(0)NR’-, -NR’-C(O)-, -C(S)NR’-, -NR’-C(S)-, -NR’-C(S)-NR’, chaque R’ est indépendamment H ou un alkyl en C1-C6 _.

[0083] Dans un mode de réalisation particulier chaque Z est une chaîne alkyle comportant entre 1 et 12 atomes de carbone.

[0084] Dans un autre mode de réalisation particulier, chaque Z est un polyéthylène glycol (PEG).

[0085] De préférence, dans la formule II, Z1 et Z2 sont indépendamment une simple liaison ou une chaîne hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisis parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes.

[0086] Selon un mode de réalisation, dans la formule II, Z1 et Z2 sont indépendamment sélectionné dans le groupe constitué par : une liaison, une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, et une chaîne alcényle linéaire ou ramifiée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, lesdites chaînes alkyle et alcényle pouvant être interrompues par un ou plusieurs groupes aryle en C6-C10, et/ou par un ou plusieurs hétéroatomes ou groupes sélectionnés dans le groupe constitué par -O-, -S-, -C(O)-, -NR’-, -C(0)NR’-, -NR’-C(O)-, -NR’-C(0)-NR’-, -NR’- C(0)-0-, -0-C(0)NR’, -C(S)NR’-, -NR’-C(S)-, -NR’-C(S)-NR’ lesdites chaînes alkyle et alcényle pouvant être substituées par un ou plusieurs groupes sélectionnés dans le groupe constitué par les halogènes, -OR’, -COOR’, -SR’, -NR’2 _, chaque R’ est indépendamment H ou un alkyl en C1-C6.

[0087] Avantageusement, dans la formule II, Z1 et Z2 sont indépendamment sélectionnés dans le groupe constitué par : une liaison et une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne alkyle pouvant être interrompue par un ou plusieurs groupes aryle en C6-C10, et/ou par un ou plusieurs hétéroatomes ou groupes sélectionnés dans le groupe constitué par -O-, -S-, -C(O)-, -NR’-, -C(0)NR’-, -NR’-C(O)-, -C(S)NR’-, -NR’-C(S)-, -NR’-C(S)-NR’, chaque R’ est indépendamment H ou un alkyl en C1-C6 _.

[0088] Dans un mode de réalisation particulier Z1 et/ou Z2 est une chaîne alkyle comportant entre 1 et 12 atomes de carbone.

[0089] Dans un autre mode de réalisation particulier, Z1 et/ou Z2 est un polyéthylène glycol (PEG)Le polymère de formule I est composé de 3 unités monomériques, à savoir une unité A de type N-acétylglucosamine, une unité B de type glucosamine et une unité C de type glucosamine fonctionnalisée par un agent chélatant (Rc) lié par un liant Z à l’azote de la glucosamine.

[0090] Le polysaccharide selon l’invention est composé de 3 unités monomériques, à savoir une unité A de type N-acétylglucosamine, une unité B de type glucosamine et une unité de type C de type glucosamine fonctionnalisée par un agent chélatant (de type Rc) lié par un liant (de type Z) à l’azote de la glucosamine.

[0091] Le polymère de formule I ou II est un polymère statistique. En d’autres termes, l’enchainement des différentes unités monomériques A, B et de type C est aléatoire.

[0092] Dans les formules I et II, x représente la proportion d’unités A et x est compris entre 0,05 et 0,7, de manière préférée, x est compris entre 0,2 et 0,6, de manière plus préférée x est compris entre 0,25 et 0,4.

[0093] Dans les formules I et II, y représente la proportion d’unités C et y est compris entre 0,1 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,2.

[0094] Le rapport y/x est de préférence compris entre 0,15 et 1 ,5.

[0095] La somme x + y est de préférence comprise entre 0,35 et 0,8.

[0096] Le reste des unités monomériques des formules I et II sont des unités B. Ainsi, dans la formule I, la proportion d’unités B est égale à 1-x-y. [0097] Dans un autre mode de réalisation particulier de l’invention, le polymère est un polymère biocompatible, par exemple de type polyéthylèneglycol (PEG), poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA), polyacrylamides, polyamines ou polycarboxyliques. Dans ce cas, le polymère biocompatible, de préférence un PEG, comprend un agent chélatant de préférence sélectionné dans le groupe constitué par EDTA, DOTA, NOTA, NODAGA, DOTAGA, DOTAM, D03AM, NOTAM, DOTP, NOTP, TETA, TETAM, du DT PA et DFO, et plus préférentiellement dans le groupe constitué du DOTAGA, EDTA, DFO, DOTAM et du DTPA.

[0098] En particulier, le polymère est un PEG comprenant un agent chélatant qui peut être choisi parmi un PEG fonctionnalisé avec du DOTAGA, un PEG fonctionnalisé avec de l’EDTA, un PEG fonctionnalisé avec du DTPA, un PEG fonctionnalisé avec du DFO, et un PEG fonctionnalisé avec du DOTA.

[0099] Selon un mode de réalisation, le polymère est choisi parmi les polysaccharides de formule I, les polysaccharides de formule II et les PEG comprenant un agent chélatant. [0100] L’agent chélatant du polymère est capable de chélater les métaux lourds susceptibles d’être présent dans les eaux et liquides utilisés pour la préparation du dialysat. En particulier, dans un mode de réalisation préféré, la concentration du polymère dans la composition pour dialyse est suffisante pour permettre une concentration résiduelle libre en métal lourd dans le dialysat, qui soit inférieure à 0,1 ppb. Par concentration résiduelle libre, on entend la concentration de métaux lourds toxiques, typiquement le plomb et le cadmium, non complexés à l’agent chélatant du polymère dans le dialysat et donc susceptibles de traverser la membrane semi-perméable du dispositif de dialyse.

[0101] De manière générale selon l’invention, l’agent chélatant est donc présent de préférence, dans le dialysat lors de l’étape de dialyse d’un patient à une concentration comprise entre 10 ⁴ mmol.L ¹ et 10 ⁶ mmol.L ¹ .

[0102] Dans un mode de réalisation préféré, en particulier en combinaison avec le mode avantageux dans lequel le polymère est de formule I ci-dessus, la composition pour dialyse comprend une quantité suffisante de polymère pour être dans une concentration dans le dialysat comprise entre 0,1 mg/L et 10 mg/L, le cas échéant après dilution. Ainsi par exemple, s’il s’agit d’une solution concentrée à diluer 45 fois, la concentration du polymère dans la solution concentrée est de préférence comprise entre 4,5 et 450 mg/L.

[0103] De manière avantageuse, le polymère utilisé est stable dans l’acide, en particulier l’acide acétique ou l’acide citrique. [0104] Dans un mode de réalisation, la présente invention vise un additif, en particulier une solution concentrée prête à l’emploi pour une dialyse, par exemple une hémodialyse, et comprenant

(i) un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20kDa et 1000kDa, et portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal exogène toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, en particulier un polymère de formule I ou II, ou un PEG comprenant un agent chélatant, de préférence dans une concentration comprise entre 4,5 et 450 mg/L ; (ii) le cas échéant, (a) un ou plusieurs éléctrolytes tels que le potassium, le sodium, le chlore, le calcium, le magnésium, le bicarbonate, l’acétate ou le citrate, et (b) au moins un sucre, tel que le glucose ou le dextrose.

[0105] Ladite solution concentrée peut être conditionnée sous forme de poche, cartouche ou bidon, par exemple en vue d’une dilution 1/45 ou 1/35 avec un générateur de dialysat.

[0106] Dans un mode de réalisation, la présente invention vise une solution concentrée acide, en particulier une solution concentrée acide prête à l’emploi pour une dialyse, par exemple l’hémodialyse, et comprenant

(i) un acide choisi parmi l’acide citrique, l’acide acétique ou l’acide chlorhydrique

(ii) un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20kDa et 1000kDa, et portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal exogène toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, en particulier un polymère de formule I ou II, ou un PEG comprenant un agent chélatant, de préférence dans une concentration comprise entre 4,5 et 450 mg/L.

(iii) le cas échéant, (a) un ou plusieurs éléctrolytes tels que le potassium, le sodium, le chlore, le calcium, le magnésium, le bicarbonate, l’acétate ou le citrate, et (b) au moins un sucre, tel que le glucose ou le dextrose.

[0107] Ladite solution concentrée acide peut être conditionnée sous forme de poche ou bidon, par exemple en vue d’une dilution 1/45 ou 1/35 avec un générateur de dialysat.

[0108] L’invention concerne également un PEG de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20 kDa et 1000 kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, l’agent chélatant étant de préférence sélectionné dans le groupe constitué par EDTA, DOTA, NOTA, NODAGA, DOTAGA, DOTAM, D03AM, NOTAM, DOTP, NOTP, TETA, TETAM, du DT PA et DFO, et plus préférentiellement dans le groupe constitué du DOTAGA, EDTA, DFO, DOTAM et du DTPA. Avantageusement, le PEG comprend entre 1pmol et 1 mmol d’agent chélatant par gramme de polymère.

[0109] L’invention concerne également une composition pour dialyse comprenant un tel PEG, ledit PEG étant présent dans une quantité suffisante pour être dans une concentration comprise entre 0,01 mg/L et 10mg/L dans le dialysat lors d’une dialyse d’un patient.

La méthode de captation

[0110] Les compositions décrites ci-dessus sont avantageusement utilisées pour capter les métaux toxiques susceptibles d’être présents dans les eaux et liquides utilisées pour préparer le dialysat.

[0111] Par conséquent, selon un autre aspect, l’invention concerne une méthode de captation d’au moins un métal toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, susceptible d’être présent dans un fluide de dialyse comprenant une étape d’ajout audit fluide de dialyse d’une quantité suffisante d’un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20kDa et 1000kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal exogène toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, et notamment l’un des polymères décrit au paragraphe précédent, plus préférentiellement le polymère de formule (I) ou (II), ou un PEG comprenant un agent chélatant.

[0112] Dans un mode de réalisation, le polymère est présent dans une solution concentrée adaptée pour son utilisation dans un dispositif de dialyse, comme décrit plus haut, par exemple une solution concentrée acide.

[0113] Dans un mode de réalisation, le fluide de dialyse comprenant le polymère est introduit dans le réservoir du dispositif de dialyse susceptible d’être connecté à un dispositif de circulation sanguine extracorporel comprenant une membrane de dialyse poreuse, typiquement présentant un seuil de coupure inférieure à la masse moléculaire moyenne dudit polymère, par exemple inférieur à 20kDa. Le polymère capte les éventuels métaux toxiques susceptibles d’être présents dans l’eau ou les liquides ou poudres utilisés lors de la préparation du fluide de dialyse par complexation à l’agent chélatant. Le polymère ne passe pas dans le sang du fait de sa masse moléculaire supérieure au seuil de coupure de la membrane semi-poreuse du dispositif de dialyse.

[0114] Dans un autre mode de réalisation, le fluide de dialyse comprenant le polymère est introduit en amont d’un filtre d’ultrafiltration, et en particulier en amont d’un filtre qui permet d’obtenir un fluide de dialyse ultra pure, avec en particulier un taux de contamination microbienne <0.1 CFU/ml et/ou un taux d’endotoxines bactériennes <0.03 lU/ml. Ainsi, outre une captation des endotoxines classiquement, le fluide de dialyse comprenant le polymère permet de séquestrer les métaux toxiques en amont et purifier ainsi les eaux de dialyses avec moins de 1 ppb en métaux lourds et même moins de 0.1 ppb en plomb et/ou Cadmium en particulier.

[0115] Ainsi, par exemple, le fluide de dialyse comprenant le polymère peut être injecté en amont d’un filtre de type Diasafe ^(R) plus ou DIACLEAR ^(R) Ultrafiltrate ou équivalent, il peut également être injecté en aval, directement avant le dialyseur au contact du sang du patient.

[0116] Dans un mode de réalisation particulier, la méthode de captation selon la présente invention est mise en oeuvre pour capter l’aluminium, par exemple, afin d’obtenir une concentration d’aluminium non complexé inférieure à 1 ppb dans le dialysat. [0117] Dans un mode de réalisation particulier, la méthode de captation selon la présente invention est mise en oeuvre pour capter le plomb, par exemple, afin d’obtenir une concentration de plomb non complexé inférieure à 0,1 ppb dans le dialysat, de préférence dans le dialysat à l’entrée du dialyseur et/ou pour une injection directe dans le sang, c’est- à-dire en amont ou en aval du filtre. [0118] Dans un mode de réalisation particulier, la méthode de captation selon la présente invention est mise en oeuvre pour capter le cadmium, par exemple, afin d’obtenir une concentration de cadmium non complexé inférieure à 0,01 ppb dans le dialysat, de préférence dans le dialysat à l’entrée du dialyseur et/ou pour une injection directe dans le sang, c’est-à-dire en amont ou en aval du filtre. [0119] Dans un mode de réalisation, on met en oeuvre la présente méthode dans une séance de dialyse d’un patient, par exemple un patient souffrant d’insuffisance rénale aiguë ou chronique. Dans ce mode de réalisation, on peut utiliser au moins 120 L de fluide de dialyse.

[0120] L’invention concerne également une méthode de traitement des liquides utilisés dans la préparation d’un fluide de dialyse, ladite méthode comprenant une étape d’ajout audit fluide de dialyse d’une quantité suffisante d’un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20 kDa et 1000 kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal exogène toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, et notamment l’un des polymères décrit au paragraphe précédent, plus préférentiellement le polymère de formule (I).

L’utilisation du polymère

[0121] Selon un troisième aspect, l’invention concerne l’utilisation d’un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20 kDa et 1000 kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal exogène toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, en particulier un polymère tel que défini plus haut, et notamment le polymère de formule (I), pour préparer un fluide de dialyse, une solution concentrée acide, ou concentré bicarbonate en poudre ou toute autre solution contenant des électrolytes. [0122] L’invention concerne aussi le procédé de préparation d’un fluide de dialyse, ledit procédé comprenant l'utilisation d’une composition pour fluide de dialyse comme décrit plus haut, et comprenant un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20 kDa et 1000 kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, dans un générateur de dialysat afin de produire un dialysat comprenant ledit polymère dans une concentration suffisante pour complexer lesdits métaux toxiques.

[0123] L’invention vise également les concentrés liquides, par exemple conditionnés sous forme de poche, cartouche ou bidon adapté pour leur utilisation dans dispositif de dialyse, et comprenant un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20 kDa et 1000 kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal exogène toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, en particulier un polymère tel que défini plus haut, et notamment le polymère de formule (I) ; pour leur utilisation dans un procédé de dialyse chez un patient qui en a besoin, par exemple un patient souffrant d’insuffisance rénale aiguë ou chronique. De tels concentrés liquides peuvent comprendre en outre un acide, par exemple, l’acide citrique, acétique ou chlorhydrique.

[0124] Le polymère est en quantité suffisante pour permettre la captation de métaux toxiques susceptibles d’être présents dans les liquides utilisés dans la préparation du dialysat. Utilisation de la composition pour dialyse

[0125] De manière avantageuse, la composition pour dialyse selon l’invention peut être utilisée sur des patients présentant des teneurs en plomb plasmatique supérieure à 1 ppb ou en cadmium plasmatique supérieure à 0,1 ppb.

[0126] De manière avantageuse, la composition pour dialyse selon l’invention peut être utilisée sur des patients présentant en plus des maladies cardiovasculaires et/ou une maladie neurodégénérative et/ou des problèmes articulaires ou fragilité des os.

[0127] De manière avantageuse, la composition pour dialyse selon l’invention peut être utilisée sur des patients qui vont subir une greffe de reins dans l’année et de préférence dans les 3 mois. Variantes de réalisation

[0128] Selon une variante 1, l’invention porte sur une composition pour dialyse, comprenant un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20 kDa et 1000 kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, ledit polymère étant présent dans une quantité suffisante pour être dans une concentration comprise entre 0,01 mg/L et 10mg/L dans le dialysat lors d’une dialyse d’un patient.

[0129] Variante 2 : Composition pour dialyse selon la variante 1, caractérisée en ce que le métal est choisi parmi les métaux lourds tels que le plomb ou le cadmium. [0130] Variante 3 : Composition pour dialyse selon la variante 1 ou 2, caractérisé en ce que l’agent chélatant est choisi dans le groupe constitué du DOTA, NOTA, NODAGA, DOTAGA, DOTAM, D03AM, NOTAM, DOTP, NOTP, TETA, TETAM, DTPA, EDTA et DFO, de préférence dans le groupe constitué du DOTAGA, DFO, DOTAM et du DTPA et de manière plus préférée le DOTAGA. [0131] Variante 4: Composition pour dialyse selon l’une des variantes 1 à 3, caractérisé en ce que le polymère est un polysaccharide statistique portant au moins un agent chélatant.

[0132] Variante 5 : Composition pour dialyse selon l’une des variantes 1 à 4, caractérisé en ce que le polymère est un polysaccharide statistique de formule I : Formule I dans laquelle : chaque Rc représente indépendamment un groupement comportant un agent chélatant, chaque Z représente indépendamment un liant pouvant être une simple liaison ou une chaîne hydrocarbonée comportant entre 1 et 12 atomes de carbone, ladite chaîne pouvant être linéaire ou ramifiée et pouvant comporter une ou plusieurs insaturations et pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence choisi parmi l’azote, l’oxygène, le soufre et les atomes de la famille des halogènes, x est compris entre 0,005 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,7, préférentiellement entre 0,2 et 0,6, et plus préférentiellement entre 0,25 et 0,4, y est compris entre 0,01 et 0,7, de préférence entre 0,05 et 0,2, le rapport y/x étant supérieur ou égal à 0,05, de préférence supérieur ou égal à 0,15, et la somme x + y étant supérieure ou égale à 0,30, de préférence supérieure ou égale à 0,35.

[0133] Variante 6 : Composition pour dialyse selon l’une des variantes 1 à 4, caractérisée en ce que le polymère est un polymère biocompatible, par exemple de type polyéthylène glycol (PEG).

[0134] Variante 7 : Composition pour dialyse, selon l’une des variantes 1 à 6, caractérisé en ce qu’il s’agit d’une solution concentrée ou d’un additif pour solution concentrée pour dialyse, de préférence une solution concentrée acide comprenant, en plus du polymère, une quantité suffisante d’acide acétique, d’acide chlorhydrique, ou d’acide citrique.

[0135] Variante 8 : Composition pour dialyse, selon l’une des variantes 1 à 7, caractérisé en ce qu’il s’agit d’une solution concentrée comprenant un ou plusieurs électrolytes, en particulier choisi parmi le sodium, le potassium, le chlore, le magnésium ou le calcium, et des bicarbonates.

[0136] Variante 9 : Composition pour dialyse, selon l’une des variantes 1 à 7, caractérisé en qu’il s’agit d’une solution concentrée conditionnée dans une poche adaptée pour un dispositif de dialyse, de préférence une poche contenant un volume de solution compris entre 500 et 5000 ml_ et une quantité dudit polymère comprise entre 5 et 5000 mg et de préférence entre 10 et 100 mg.

[0137] Variante 10 : L’invention porte sur une méthode de captation d’au moins un métal toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, présent dans un fluide de dialyse, comprenant une étape d’ajout audit fluide de dialyse d’une quantité suffisante d’un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20kDa et 1000kDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium, permettant ainsi la captation dudit métal toxique par chélation avec l’agent chélatant dudit polymère.

[0138] Variante 11 : Méthode de captation selon la variante 10, caractérisée en ce que le métal toxique est l’aluminium.

[0139] Variante 12 : Méthode de captation selon la variante 10, caractérisée en ce que le métal toxique est le plomb et que la concentration dans le fluide de dialyse est inférieure à 0,1 ppb.

[0140] Variante 13 : Méthode de captation selon la variante 10 caractérisée en ce que le métal toxique est le cadmium et que la concentration dans le fluide de dialyse est inférieure à 0,01 ppb. [0141] Variante 14 : Méthode de captation selon la variante 10 ou 11, caractérisée en ce qu’au moins 120L de fluide de dialyse est utilisé dans une dialyse d’un patient.

[0142] Variante 15 : Méthode de captation selon l’une des variantes 10 à 12, caractérisée en ce que le fluide de dialyse est introduit dans un réservoir d’un dispositif de dialyse, susceptible d’être connecté à un dispositif de circulation sanguine extracorporel comprenant une membrane de dialyse poreuse.

[0143] Variante 16 : Méthode selon la variante 13, caractérisée en ce que le seuil de coupure de la membrane poreuse est inférieur à la taille du polymère.

[0144] Utilisation d’un polymère de masse moléculaire moyenne en poids comprise entre 20kDa et 10OOkDa portant au moins un agent chélatant d’au moins un métal toxique tel que le plomb, l’aluminium, le chrome, le nickel ou le cadmium pour préparer une composition pour dialyse, par exemple pour hémodialyse, hémodiafiltration ou hémofiltration, en particulier une composition selon l’une des variantes 1 à 9.

Exemples G0145Ί Synthèse des polymères

[0146] Préparation du MexCDI (Chitosane@DOTAGA)

[0147] Dans l’étape 1, 60 g de chitosane, 4 L d’eau ultra-pure et 45 ml_ d’acide acétique glacial sont introduits dans un réacteur de 10 L et placés sous agitation pendant une durée de 16 heures à un pH de 4,5 ± 0,5. Une solution jaune pâle est obtenue. [0148] Dans l’étape 2, 1,2 L de propane-1,2-diol sont ajoutés à la solution jaune pâle obtenue à l’étape 1 et l’agitation est maintenue pendant 1 h. Une solution composée de 14 ml_ d’anhydride acétique dissous dans 600 ml_ de propane-1,2-diol est ensuite ajoutée lentement en 10 min afin d’obtenir une acétylation homogène le long de la chaîne polymérique, le milieu réactionnel est maintenu sous agitation pendant 4 h. [0149] Le taux d’acétylation peut être déterminé par analyse élémentaire. L’unité non acétylée du polysaccharide (unité B) présente une masse molaire de 161,2 g. mol ¹ (C ₆ NO ₄ H ₁₁ ) tandis-que l’unité acétylée (unité A) présente une masse molaire de 203,2 g. mol ¹ (C ₈ NO ₅ H ₁₃ ). L’analyse élémentaire du polysaccharide obtenu à l’issue de l’étape 2 d’acétylation est la suivante : C 39,22% ; H 7,55% et N 6,77%, ce qui correspond à un taux d’unités acétylées (unités A) de 40% (x=0,4)

[0150] Dans l’étape 3, 2 L de la solution obtenue à l’étape 2 d’acétylation, sont placés dans un réacteur sous agitation. 120 g de DOTAGA anhydride sont ensuite ajoutés et l’agitation est maintenue pendant 16 h. A l’issue de cette réaction, la solution est diluée par 10 dans de l’eau ultra-pure et purifiée par filtration tangentielle en utilisant une membrane de 100 kDa. Après une première étape de re-concentration jusqu’à 16 L, la solution est filtrée par 480 L de solution à 0,1 M en acide acétique à volume constant (16 L), suivi par 320 L d’eau ultra-pure et par une autre étape de re-concentration jusqu’à 8 L. L’HPLC-UV permet de vérifier que le DOTAGA a bien été éliminé. Le pic aux alentours de 7 min correspond au polymère tandis que le pic aux alentours de 11 min correspond aux DOTAGA non greffés. La solution à une concentration de polysaccharide de 10 g/L est ensuite filtrée sur un filtre nylon (0,4 pm) avant lyophilisation.

[0151] La RMN du proton permet de déterminer le taux y de fonctionnalisation par le DOTAGA sur le polysaccharide en connaissant le taux x d’acétylation. L’unité non greffée et non acétylée (unité B) est constituée de 7 protons, liés de manière covalente à des atomes de carbone, présentant un déplacement chimique compris entre 2,9 et 4,3 ppm. L’unité acétylée (unité A) présente ces 7 mêmes protons ainsi que 3 protons, liés de manière covalente à un atome de carbone, présents sur l’acétyle caractérisés par un déplacement chimique compris entre 2 et 2,2 ppm. Enfin, l’unité greffée avec le DOTAGA (unité C) inclut 34 protons, liés de manière covalente à des atomes de carbone, dont 32 intègrent entre 2,9 et 4,3 ppm et 2 intègrent entre 2 et 2,2 ppm. Le spectre RMN permet grâce aux intégrations des différents massifs de déterminer les valeurs de y grâce à l’équation suivante :

[Math. 1]

[0152] Le taux d’unité greffée (unité C) est d’environ 0,1.

[0153] Ainsi, le polysaccharide obtenu à un taux d’unité A d’environ 0,4 (x=0,4), un taux d’unité B d’environ 0,5 (1-x-y=0,5) et un taux d’unité C d’environ 0,1 (y=0,1).

[0154] Le taux d’unités greffées (unité C) peut également être déterminé par fluorescence avec de l’europium. L’europium présente en effet une luminescence principalement centrée autour de 590 ( ⁵ Do -> ⁷ Fi) et 615 nm ( ⁵ Do -> ⁷ F2). Cette luminescence est éteinte lorsque l’ion europium est coordonné seulement avec des molécules d’eau. Le principe de la méthode de détermination du taux d’unités greffées est d’ajouter des quantités croissantes d’europium, afin que celui-ci soit chélaté, la luminescence augmente alors, lorsque tous les sites de chélation sont remplis, la luminescence atteint un plateau. En pratique, le polysaccharide obtenu à l’issue de l’étape 3 a été placé dans un tampon acétate à pH 5, un sel de chlorure d’europium dissous dans le tampon acétate a ensuite été ajouté. Une courbe de dosage est ensuite tracée en excitant à 396 nm et en relevant l’émission à 590 nm. Ce dosage permet de remonter à une quantité de chélate de 0,4 pmol par mg de polymère, soit un taux d’environ 10% (y=0,1).

[0155] Synthèse du PEG@DOTAGA

[0156] Le PEG utilisé est un 8-Arm PEG Amine d’un poids moléculaire de 40 kDa, acheté chez Creative PEGWork. Le DOTAGA-anhydride (2,2',2”-(10-(2,6-dioxotetrahydro-2H- pyran-3-yl)-1 ,4,7,10-tetraazacyclododecane-1 ,4,7-triyl)triacetic acid) a été fourni par Chematech et utilisé tel quel. La synthèse a été réalisée dans du DMSO (Fischer Chemicals). Les cassettes VIVAFLOW 30kDa pour la purification ont été achetées chez Sartorius. [0157] Une masse de 10 g de PEG a été pesée et insérée dans un ballon de 500 mL. Un volume de 250 mL de DMSO a été ajouté et la solution a été mise sous agitation et chauffée à 40°C par un bain d’eau chaude. Une fois le polymère entièrement solubilisé, une masse de 2,8 g de DOTAGA-anhydride a été pesée et insérée dans la solution de PEG. La solution a été agitée et chauffée à 40°C pendant 1h30 min. La solution a ensuite été purifiée à l’eau ultra pure à l’aide d’une cassette Vivaflow avec un seuil de coupure de 30 kDa jusqu’à un taux de purification de 1500. Le produit purifié est ensuite lyophilisé. La masse moyenne de produit récupéré est de 496 mg et 23,2 mg pour 20 mL de solution.

[0158] L’analyse HPLC-UV du Peg@DOTAGA à 295 nm permet de déterminer la pureté du produit en faisant le ratio du pic de polymère sur l’aire totale des pics. Cette méthode permet de conclure que les taux de pureté du Peg@DOTAGA est 97%.

[0159] La quantité de chélateur greffé est déterminée par dosage spectrophotométrique UV-Visible à 295 nm pour le DOTAGA. Des concentrations croissantes de cuivre (II) sont ajoutées à une solution de Peg@DOTAGA à 1,0 g/L dans un tampon acétate à pH 4.5 (0,1 M ammonium acétate et 0,1 M acide acétique). L’absorption mesurée à 295 nm est ensuite tracée en fonction de la concentration en cuivre (en mmol/g). La rupture de pente observée indique que le Peg@DOTAGA contient 0,14 mmol de DOTAGA par gramme de polymère.

[0160] Synthèse du PEG-EDTA et PEG-DTPA

[0161] Le PEG utilisé est un 8-Arm PEG Amine d’un poids moléculaire de 40 kDa, acheté chez Creative PEGWork. L’EDTA di-anhydride (4-[2-(2,6-dioxomorpholin-4- yl)ethyl]morpholine-2,6-dione) et le DTPA di-anhydride (2-[bis[2-(2,6-dioxomorpholin-4- yl)ethyl]amino]acetic acid) ont été fournis par Chematech et utilisé tels quels. La synthèse a été réalisée dans du DMSO (Fischer Chemicals). Les cassettes VIVAFLOW 30 kDa pour la purification ont été achetées chez Sartorius. [0162] Une solution d’EDTA di-anhydride à 24 g/L et une solution de DTPA di-anhydride à 35 g/L ont été préparées dans du DMSO. Pour chacune des synthèses, un volume de 10 mL de la solution de chélateur (EDTA di-anhydride à 24 g/L ou DTPA di-anhydride à 35 g/L) est inséré dans un ballon de 100 mL puis la solution a été mise sous agitation et chauffée à 40°C par un bain d’eau chaude. Un volume de 40 mL d’une solution de PEG à 6,25 g/L dans le DMSO est inséré dans une ampoule de coulé. Cette solution est ajoutée goutte à goutte. Une fois l’ajout fini, la solution a été agitée et chauffée à 40°C pendant 1 h30min. La solution a ensuite été purifiée à l’eau ultra pure à l’aide d’une cassette Vivaflow avec un seuil de coupure de 30 kDa jusqu’à un taux de purification de 20000. Le produit purifié est ensuite lyophilisé. Pour le PEG-EDTA et le PEG-DTPA, la masse moyenne de produit récupéré est respectivement de 16,2 mg et 23,2 mg pour 5 mL de solution.

[0163] L’analyse HPLC-UV du PEG-EDTA et PEG-DTPA à 295 nm permet de déterminer la pureté du produit en faisant le ratio du pic de polymère min sur l’aire totale des pics. Cette méthode permet de conclure que les taux de pureté du PEG-EDTA et du PEG-DTPA sont respectivement de 96% et 92%.

[0164] La comparaison des spectres RMN ¹ H du PEG et PEG-DTPA ou PEG-EDTA après purification et lyophilisation confirme le greffage des chélateurs.

[0165] La quantité de chélateur greffé est déterminée par dosage spectrophotométrie UV- Visible à 295 nm pour l’EDTA et 275 nm pour le DTPA. Des concentrations croissantes de cuivre (II) sont ajoutées à une solution de PEG-EDTA ou PEG-DTPA à 1,0 g/L dans un tampon acétate à pH 4,5 (0,1 M ammonium acétate et 0.1 M acide acétique). L’absorption mesurée à 295 nm (ou 275 nm) est ensuite tracée en fonction de la concentration en cuivre (en mmol/g). Les ruptures de pente observées indiquent que le PEG-EDTA et le PEG-DTPA contiennent respectivement 0,16 mmol d’EDTA et 0,12 mmol de DTPA par gramme de polymère.

[0166] Synthèse du PEG-DFO

[0167] Le PEG utilisé est un 8-Arm PEG Amine d’un poids moléculaire de 40 kDa, acheté chez Creative PEGWork. Le p-NCS-Bz-DFO (N1-hydroxy-N1-(5-(4-(hydroxy(5-(3-(4- isothiocyanatophenyl)thioureido)pentyl)amino)-4-oxobutanamid o)pentyl)-N4-(5-(N- hydroxyacetamido)pentyl)succinamide) a été fourni par Chematech et utilisé tel quel. La synthèse a été réalisée dans du DMSO (Fischer Chemicals). Les cassettes VIVAFLOW 30kDa pour la purification ont été achetées chez Sartorius.

[0168] Une masse de 1 g de PEG a été pesée et insérée dans un ballon de 250 mL. Un volume de 100 mL de DMSO a été ajouté et la solution a été mise sous agitation et chauffée à 40°C par un bain d’eau chaude. Une fois le polymère entièrement solubilisé, une masse de 69,4 mg de p-NCS-Bz-DFO a été pesée et insérée dans la solution de PEG. La solution a été agitée et chauffée à 40°C pendant 1h30min. La solution a ensuite été purifiée à l’eau ultra pure à l’aide d’une cassette Vivaflow avec un seuil de coupure de 30 kDa jusqu’à un taux de purification de 25000. Le produit purifié est ensuite lyophilisé, la masse moyenne de produit récupéré est de 25 mg pour 5 mL de solution.

[0169] L’analyse RMN 1H du PEG-DFO après purification et lyophilisation confirme la présence de p-NCS-Bz-DFO greffé. Les pics caractéristiques des protons portés par le benzène se retrouvent dans le spectre RMN de la déferoxamine mésylate.

[0170] Comme dans l’exemple 1 , la quantité de p-NCS-Bz-DFO greffé peut être déterminée par dosage spectrophotométrie UV-Visible à 430 nm. Des concentrations croissantes de fer (III) sont ajoutées à une solution de PEG-DFO à 1 ,0 g/L dans un tampon acétate à pH 4,5 (0,1 M ammonium acétate et 0,1 M acide acétique). L’absorption mesurée à 430 nm est ensuite tracée en fonction de la concentration en fer et une rupture de pente est observée pour 7.9 mM de fer. Une molécule de DFO pouvant complexer un seul atome de fer, 1 gramme de polymère contient donc 7,9 pmol de DFO.

[0171] Synthèse du PEG-DOTA

[0172] Le PEG utilisé est un 8-Arm PEG Amine d’un poids moléculaire de 40 kDa, acheté chez Creative PEGWork. Le DOTA-NHS (2-[4,10-bis(carboxymethyl)-7-[2-(2,5- dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-2-oxoethyl]-1,4,7,10-tetrazacyclodo dec-1-yl]acetic acid) a été fourni par Chematech et utilisé tel quel. La synthèse a été réalisée dans du DMSO (Fischer Chemicals). La membrane en PES de 30 kDa utilisée pour la purification a été achetée chez Sartorius et utilisée avec la machine de purification SARTOFLOW SMART.

[0173] Une solution de PEG à 16,67 g/L a été préparée dans le DMSO. Un volume de 30 mL de cette solution est inséré dans un ballon de 100 mL, la solution a été mise sous agitation et chauffée à 40°C par un bain d’eau chaude. Une solution de DOTA-NHS à 7,5 g/L a été préparée dans du DMSO. Un volume de 20 mL de la solution de DOTA-NHS est inséré dans une ampoule de coulé. Cette solution est ajoutée goutte à goutte. Une fois l’ajout fini, la solution a été agitée et chauffée à 40°C pendant 1 h30min. La solution a ensuite été purifiée dans la machine SARTOFLOW SMART avec une membrane possédant un seuil de coupure de 30 kDa, avec 8 L d’eau ultra-pure puis 3 L d’acide acétique et enfin 2 L d’eau pour revenir à pH neutre.

[0174] La quantité de chélateur greffé est déterminée par dosage spectrophotométrie UV- Visible à 275 nm. Des concentrations croissantes de cuivre (II) sont ajoutées à une solution de PEG-DOTA à 1,0 g/L dans un tampon acétate à pH 4,5 (0,1 M ammonium acétate et 0,1 M acide acétique). L’absorption mesurée à 275 nm est ensuite tracée en fonction de la concentration en cuivre (en mmol/g). La rupture de pente observée indique que le PEG- DOTA contient 0,16 mmol de DOTA par gramme de polymère.

[0175] Le PEG-DOTA après lyophilisation a aussi été caractérisé par RMN ¹ H qui confirme le greffage du DOTA. G0176Ί Préparation des solutions

[0177] Solution 1 : 10 g/L MexCDI

[0178] Le MexCDI lyophilisé a été solubilisé dans l’eau ultra-pure à une concentration de 10 g/L.

[0179] Solution 2 : 10 g/L Peg@DOTAGA [0180] Le PEG@DOTAGA lyophilisé a été solubilisé dans l’eau ultra-pure à une concentration de 10 g/L.

[0181] Solution 3 : 10 g/L Peg@EDTA

[0182] Le PEG@EDTA lyophilisé a été solubilisé dans l’eau ultra-pure à une concentration de 10 g/L. [0183] Solution 4 : 10 g/L Peg@DTPA

[0184] Le PEG@DTPA lyophilisé a été solubilisé dans l’eau ultra-pure à une concentration de 10 g/L.

[0185] Solution 5: Standard concentré d’acide acétique pour hémodialyse

[0186] La composition de la solution standard d’acide acétique concentré est la suivante : 263 g/L NaCI, 3,35 g/L KCI, 6,24 g/L CaCI ₂ , 2,14 g/L MgCI ₂ , 10,8 g/L acide acétique et

45,0 g/L Dextrose. Cette solution a un pH de 1,95.

[0187] Solution 6: Standard concentré d’acide citrique pour hémodialyse

[0188] La composition de la solution standard d’acide citrique concentré est la suivante : 263 g/L NaCI, 3,35 g/L KCI, 6,24 g/L CaCI ₂ , 2,14 g/L MgCI ₂ , 1 ,11 g/L acétate, 6,92 g/L acide citrique et 45,0 g/L Dextrose. Cette solution a un pH de 1 ,08.

[0189] Solution 7: Tampon acetate à 0.1 M, pH 4,6

[0190] La solution de tampon acétate contient 11 ,4 mL d’acide acétique (MS-grade), 15,4 g d’ammonium acétate et 2 L d’eau ultra-pure.

[0191] Solution 8: Tampon HEPES à 0.010 M, pH 7,4 [0192] La solution de tampon contient 2.383 g HEPES (Sigma Aldrich) dans 1000 mL d’eau ultra-pure, le pH a été ajusté avec de la soude. [0193] Protocoles expérimentaux:

[0194] Protocole 1: High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)

[0195] L’éluant utilisé est le tampon acétate (solution 7), 10 pl_ d’échantillon sont injectés et élués à un débit de 0,8 mL/min. La colonne utilisée est une colonne SEC Polysep GFC- P 4000 et la détection est réalisée avec un détecteur UV aux longueurs d’onde 250 nm and 295 nm.

[0196] Protocole 2: High Pressure Liquid Chromatography - Mass Spectroscopy (HPLC-MS)

[0197] L’éluant utilisé est le tampon acétate (solution 7 préparée avec des produits certifiés MS-Grade), le volume d’injection est de 10 pL et le débit est fixé à 0,4 mL/min. La colonne utilisée est une colonne SEC Polysep GFC-P 4000, l’HPLC est couplée à un spectromètre de masse (ICP-MS) pour la détection des isotopes recherchés.

[0198] Protocole 3: Expérience d’ultrafiltration à l’aide de tubes Vivaspin

[0199] Différents tubes de centrifugation Vivaspin ont été utilisés : Vivaspin 20 mL avec une membrane de seuil de coupure de 30 kDa ou Vivaspin 6 mL avec une membrane de seuil de coupure de 30 kDa ou de 10 kDa. Tout le matériel a été préalablement nettoyé avec une solution d’EDTA à 21 mM puis deux fois à l’eau ultra-pure (18,2 MW) pour éliminer toute trace de contamination métallique. La centrifugation a été réalisée à une vitesse de 4000 rpm pendant 10 min. Après chaque cycle de centrifugation, le liquide qui avait passé à travers la membrane a été collecté pour chaque échantillon, cette partie est appelé le sous- nageant, et les tubes de centrifugation ont été à nouveau remplis avec la solution initiale. Cela a été reproduit jusqu’à l’utilisation de la totalité de la solution initiale. Idéalement, au moins 1 mL de surnageant reste au-dessus de la membrane et est analysé par ICP-MS pour déterminer le facteur de concentration exact de l’expérience. [0200] Les échantillons de la solution initiale avant centrifugation, du sous-nageant et surnageant à la fin de l’expérience ont été analysés par ICP-MS. Les échantillons ont été dilués au moins par 10 avec une solution d’acide nitrique à 1%. Un standard interne (Indium) a été ajouté à chaque échantillon pour atteindre une concentration finale en indium de 2 ppb. Les analyses ont été effectuées en mode KED (Kinetic Energy Discrimination) avec un flux d’hélium dans la chambre. Les isotopes détectés sont les suivants : ²⁰⁸ Pb, ²⁰⁶ Pb, ¹¹¹ Cd, ¹¹² Cd, ¹¹⁴ Cd, ⁶³ Cu, ⁶⁵ Cu, ²⁷ AI.

[0201] Une courbe de calibration entre 0,02 et 10 ppb de cadmium et 0,1 et 50 ppb de plomb a été réalisée. Cette calibration permet une conversion fiable du nombre de coups par secondes en concentration (ppb) pour chaque échantillon à l’aide du logiciel. [0202] Le principe d’une ultrafiltration Vivaspin est présentée en figure 1.

[0203] Exemple 1 : Chélation de Pb ²⁺ et Cd ²⁺ avec MexCDI et Peq@DOTAGA

[0204] Les échantillons ont été créés en utilisant la solution 8. A partir d’un mélange de métaux à 10 ppm de Pb ²⁺ et Cd ²⁺ dans 5% HNO3 acheté chez SCP Science ainsi que les solutions 1 et 2 de polymères, six échantillons par polymère ont été créés et analysés par HPLC-MS suivant le protocole 2. La composition des échantillons est donnée dans le tableau 1.

[0205] [Tableau 1]

[0206] La figure 2 montre que le plomb et le cadmium sont captés par e produit polymère fonctionnalisé, MEXCD1, dans le domaine de concentration du ppb.

[0207] En effet, sur la figure 2, en ordonnée se trouve l’air du pic du polymère et en abscisse la concentration originale en métaux. La régression linéaire montre que la captation du plomb et du cadmium augmente de manière linéaire avec la quantité de polymère introduite (R2 supérieurs à 0,99). [0208] Les figures 2a et 2b ci-dessous sont les chromatogrammes HPLC/SEC couplée à l’ICP-MS pour la détection du plomb ou du cadmium. Les pics correspondent aux pics du polymère qui ont un temps de rétention aux alentours de 15 minutes. L’augmentation de l’aire du pic correspondant au polymère avec l’augmentation de la concentration initiale en plomb ou en cadmium illustre la captation de plus en plus forte du plomb et du cadmium en fonction des concentrations introduites.,

[0209] Exemple 2: Chélation du plomb Pb ²⁺ par le MEX-CD1 dans les concentrés d’acide acétique et citrique

[0210] 77 ppb de Pb ²⁺ ont été ajoutés à la solution 5 et 26 ppb de Pb ²⁺ ont été ajoutés à la solution 6. Ces solutions, en plus des solutions 1 (MEX-CD1 à 10 g/L) et 7 (tampon acétate MS Grade) et d’eau ultra-pure, ont été utilisées pour créer différents environnements acides avec 0,1 g/L de MEX-CD1. La complexation a été testée dans trois conditions : dans l’acide concentrée (pH 2 pour l’acide acétique et pH 1 ,2 pour l’acide citrique), à pH 5 et à pH 7,4. Le pH a été ajusté avec de la soude et les échantillons ont été analysés par HPLC-MS suivant le protocole 2. La composition des échantillons est donnée dans les tableaux 2 et 3.

[0211] [Tableau 2]

[0212] [Tableau 3]

[0213] Les figures 3 et 4 montrent que le po ymère dispersé à 0, une solution représentative d’un concentré acide (à l’acide acétique ou à l’acide citrique) est efficace pour capter du plomb dès que le fluide de dialyse commence à se formuler. A pH

5 et 7,4, une grosse partie du plomb est ainsi déjà captée et associée au polymère comme le montre le chromatogramme d’HPLC/SEC-ICP-MS (détection Pb) avec l’augmentation du pic au temps de rétention de 15 min correspondant au polymère. G0214Ί Exemple 3: Chélation du plomb Pb ²⁺ par le Peq@DOTAGA dans les concentrés d’acide acétique et citrique

[0215] 77 ppb de Pb ²⁺ ont été ajoutés à la solution 5 et 26 ppb de Pb ²⁺ ont été ajoutés à la solution 6. Ces solutions, en plus des solutions 2 (Peg@DOTAGA à 10 g/L) et 7 (tampon acétate MS Grade) et d’eau ultra-pure, ont été utilisées pour créer différents environnements acides avec 0,1 g/L de Peg@DOTAGA. La complexation a été testée dans trois conditions : dans l’acide concentrée (pH 2 pour l’acide acétique et pH 1 ,2 pour l’acide citrique), à pH 5 et à pH 7,4. Le pH a été ajusté avec de la soude et les échantillons ont été analysés par HPLC-MS suivant le protocole 2. La composition des échantillons est donnée dans les tableaux 4 et 5.

[0216] [Tableau 4] [0217] [Tableau 5]

[0218] Les figures 5 et 6 montrent que le po ymère dispersé à 0, une solution représentative d’un concentré acide (à l’acide acétique ou à l’acide citrique) est efficace pour capter du plomb dès que le fluide de dialyse commence à se formuler. A pH

5 et 7,4, une grosse partie du plomb est ainsi déjà captée et associée au polymère comme le montre le chromatogramme d’HPLC/SEC-ICP-MS (détection Pb) avec l’augmentation du pic au temps de rétention de 17 min correspondant au polymère.

[0219] Exemple 4: Chélation du plomb Pb ²⁺ par le MEX-CD1 via Ultrafiltration

[0220] Les échantillons ont été préparés à partir d’eau ultra-pure, de la solution 1 et d’une solution mère de Pb ²⁺ à 50000 ppm dans l’acide nitrique HNO3 5% pour obtenir un échantillon d’un volume total de 100 mL. En suivant le protocole 3, 90 mL de chaque solution ont été centrifugés à travers les Vivaspin 20 mL avec un seuil de coupure de 30 kDa. Le volume du surnageant final était d’environ 10 mL d’où une concentration par un facteur 9 de l’échantillon initial. La composition des échantillons et les résultats sont donnés dans le tableau 6.

[0221] [Tableau 6]

[0222] Le chromatogramme c ’HPLC/SEC-ICP-MS (détection Pb) de la figure 7 corresponc à une concentration initiale de l’ordre de 5 ppb en plomb et à une purification par filtration tangentielle à travers une membrane de 30 kDa. Si 10 mg/L de MEX-CD1 sont mis en solution, 8 fois moins de plomb passe à travers la membrane en comparaison avec la même expérience réalisée sans MEX-CD1. Le produit montre une efficacité à des concentrations très basses (0,1 ppb). [0223] Exemple 5: Chélation de métaux à l’état de traces par le MEX-CD1 via

Ultrafiltration

[0224] Deux solutions métalliques achetées chez SCP Science, une de fer à 1000 ppm dans 5% HNChet un mélange de différentes métaux (Al ²⁺ , Mn ²⁺ , Pb ²⁺ , Cd ²⁺ , Cu ²⁺ , Zn ²⁺ ) à 10 ppm dans 5% HNO3, ont été utilisées en plus de la solution 1 et d’eau ultra-pure pour créer les échantillons ayant un volume final de 800 mL. Selon le protocole 3, environ 350 mL de chaque échantillon ont été centrifugés à travers les Vivaspin 20 mL possédant une membrane de seuil de coupure de 30 kDa. Le volume du surnageant final est d’environ 10 mL soit une reconcentration par un facteur 35 de l’échantillon initial. La composition des échantillons est donnée dans le tableau 7. [0225] [Tableau 7] [0226] Les figures 8 et 9 mettent en évidence une efficacité de captation dès 0,05 ppb (50 ppt) pour le plomb et le cadmium par mesure ICP/MS. Le manganèse et le cuivre sont également captés. Avec le plomb, même dans le domaine de 0,01 ppb, une efficacité de captation est observée. [0227] Exemple 6: Chélation du Pb ²⁺ par le Peq@DOTAGA via Ultrafiltration

[0228] Les échantillons ont été préparés à partir de la solution 2, d’eau ultra-pure et d’une solution de Pb ²⁺ à 50000 ppm dans IΉNO35% achetée chez SCP Science, le volume final de l’échantillon est de 100 mL. Selon le protocole 3, 99 mL de chaque échantillon ont été centrifugés à travers les Vivaspin 6 mL possédant une taille de pores de 10 kDa. Le surnageant final a un volume de 1 mL soit une reconcentration par un facteur 99 de l’échantillon initial. La composition des échantillons et les résultats sont donnés dans le tableau 8.

[0229] [Tableau 8] [0230] La figure 10 montre l’efficacité du produit PEG@DOTAGA pour capter du plomb dans le domaine du ppb. Pour une concentration initiale en plomb comprise entre 0,5 et 10 ppb, après les expériences d’ultrafiltration, on mesure une concentration en solution du surnageant de 10 à 20 fois supérieure en plomb par ICP/MS. On a donc surconcentré en plomb la solution et séquestré une partie du plomb pour l’empêcher de passer la membrane poreuse.

[0231] Exemple 7: Chélation de métaux à l’état de traces par le MEX-CD1 en situation de dialyse par Ultrafiltration

[0232] La solution 7 a été diluée à 10 mM et 100 mg/L de Ca ²⁺ (à partir de CaCh, Sigma Aldrich) ont été ajoutés à cette solution pour reproduire un environnement similaire à celui de la dialyse. Les échantillons ont ensuite été préparés à partir de cette solution, de la solution 1 et d’un mélange de métaux (Al ²⁺ , Mn ²⁺ , Pb ²⁺ , Cd ²⁺ , Cu ²⁺ , and Zn ²⁺ ) à 10 ppm dans 5% HNO3 acheté chez SCP Science, afin d’obtenir un échantillon de volume final de 31 mL. Selon le protocole 3, 30 mL de chaque solution ont été centrifugés à travers les membranes de seuil de coupure de 30 kDa des Vivaspin 6 mL. Le surnageant final a un volume de 1 mL soit une reconcentration de l’échantillon initial par un facteur 30.

[0233] Cette situation présente des conditions proches des conditions de dialyse en termes de concentrations ioniques, ce qui est particulièrement important car le calcium Ca ²⁺ a de fortes interactions avec le chélateur DOTAGA. Les concentrations en Ca ²⁺ dans le sang et dans le dialysat sont proches de 100 mg/L.

[0234] La composition des échantillons et les résultats sont donnés dans les tableaux 9 et 10. [0235] [Tableau 9]

[0236] [Tableau 10]

[0237] La figure 11 montre la captation plomb en fonction de la concentration originale en plomb. Lorsque le polymères MEX-CD1 est placé à une concentration de 100 mg/mL, une rétention des métaux lourds est possible même en présence de 100 ppm de calcium et lorsqu’ils sont placés à l’état de traces à une concentration inférieure au ppb.

[0238] Exemple 8: : Chélation de métaux à l’état de traces par le Peq@DOTAGA en situation de dialvse par Ultrafiltration

[0239] La solution 7 a été diluée à 10 mM et 100 mg/L de Ca ²⁺ (à partir de CaCh, Sigma Aldrich) ont été ajoutés à cette solution pour reproduire un environnement similaire à celui de dialyse. Les échantillons ont ensuite été préparés à partir de cette solution, de la solution 1 et d’un mélange de métaux (Al ²⁺ , Mn ²⁺ , Pb ²⁺ , Cd ²⁺ , Cu ²⁺ , and Zn ²⁺ ) à 10 ppm dans 5% HNO3 acheté chez SCP Science, afin d’obtenir un échantillon de volume final 31 mL. Selon le protocole 3, 30 mL de chaque solution ont été centrifugés à travers les membranes de 30 kDa des Vivaspin 6 mL. Le surnageant final a un volume de 1 mL soit une reconcentration de l’échantillon initial par un facteur 30.

[0240] Cette situation présente des conditions proches des conditions de dialyse en termes de concentrations ioniques, ce qui est particulièrement important car le calcium Ca ²⁺ a de fortes interactions avec le chélateur DOTAGA. Les concentrations en Ca ²⁺ dans le sang et dans le dialysat sont proches de 100 mg/L.

[0241] La composition des échantillons et les résultats sont donnés dans les tableaux 11 et 12. [0242] [Tableau 11]

[0243] [Tableau 12]

[0244] La figure 12 montre qu’en présence de 100 ppm de calcium, le produit Peg@DOTAGA ajouté à 100 mg/L est capable de séquestrer du plomb et du cadmium, même à des faibles teneurs initiales entre 0,1 et 1 ppb. Ainsi par rapport à la référence (sans le produit) à une concentration initiale autour de 1 ppb en plomb ou en cadmium, il est possible de faire passer à travers la membrane près de 10 fois moins de plomb (9,15 fois moins de plomb dans le sous-nageant) et près de deux fois moins de cadmium (1,69 fois moins de cadmium dans le sous-nageant). [0245] Exemple 9: Chélation de métaux à l’état de traces par le Peq@EDTA en situation de dialvse par Ultrafiltration

[0246] La solution 7 a été diluée à 10 mM et 100 mg/L de Ca ²⁺ (à partir de CaCh, Sigma Aldrich) ont été ajoutés à cette solution pour reproduire un environnement similaire à celui 5 de dialyse. Les échantillons ont ensuite été préparés à partir de cette solution, de la solution 1 et d’un mélange de métaux (Al ²⁺ , Mn ²⁺ , Pb ²⁺ , Cd ²⁺ , Cu ²⁺ , and Zn ²⁺ ) à 10 ppm dans 5% HNO ₃ acheté chez SCP Science, afin d’obtenir un échantillon de volume final 31 mL. Selon le protocole 3, 30 mL de chaque solution ont été centrifugés à travers les membranes de 30 kDa des Vivaspin 6 mL. Le surnageant final a un volume de 1 mL soit une 10 reconcentration de l’échantillon initial par un facteur 30.

[0247] La composition des échantillons et les résultats sont donnés dans les tableaux 13 et 14.

[0248] [Tableau 13]

[0249] [Tableau 14]

15 [0250] La figure 13 montre qu’en présence de calcium, le produit PEG@EDTA capte également une partie du plomb et du cadmium et l’empêche de passer la membrane de diafiltration et surconcentre la solution surnageante, entre 0,1 et 1 ppb. Ainsi à 0,1 ppb en cadmium ou 0,2 ppb en plomb et en présence de 100 ppm de calcium, après un cycle de diafiltration, le surnageant a été concentré par 4,4 en cadmium et par 9,5 en plomb.

20 G025P Exemple 10: Chélation de métaux à l’état de traces par le Peq@DTPA en situation de dialyse par Ultrafiltration [0252] La solution 7 a été diluée à 10 mM et 100 mg/L de Ca ²⁺ (à partir de CaCh, Sigma Aldrich) ont été ajoutés à cette solution pour reproduire un environnement similaire à celui de dialyse. Les échantillons ont ensuite été préparés à partir de cette solution, de la solution 1 et d’un mélange de métaux (Al ²⁺ , Mn ²⁺ , Pb ²⁺ , Cd ²⁺ , Cu ²⁺ , and Zn ²⁺ ) à 10 ppm dans 5% HNO3 acheté chez SCP Science, afin d’obtenir un échantillon de volume final 31 mL. Selon le protocole 3, 30 mL de chaque solution ont été centrifugés à travers les membranes de 30 kDa des Vivaspin 6 mL. Le surnageant final a un volume de 1 mL soit une reconcentration de l’échantillon initial par un facteur 30.

[0253] La composition des échantillons et les résultats sont donnés dans les tableaux 15 et 16

[0254] [Tableau 15]

[0255] [Tableau 16] intéressante pour séquestrer le plomb et le cadmium, même en présence de 100 ppm de calcium.

[0257] Exemple 11: Stabilité des polymères en milieu acide

[0258] Les figures 15 et 16 montrent que le produit peut être dispersé directement dans un concentré acide pour être utilisé. Ainsi 1 g/L de MEX-CD1 et 1 g/L de PEG@DOTAGA ont été mis dans une solution similaire à un concentré acide de type acide citrique et sels. Après plusieurs semaines de stockage, aucune modification du produit n’est observée, le produit ne semble pas s’être dégradé et conserve sa capacité de captation (testée ici au cuivre) après 3 semaines. [0259] Exemple 12 : Complexation du Cd ²⁺ et Pb ²⁺ par le PEG-DOTA en milieu acide

[0260] Le PEG-DOTA a été solubilisé dans l’eau ultra-pure à une concentration de 1 g/L. Les solutions standards de plomb et cadmium à 1000 ppm dans l’acide nitrique 5% (achetées chez SCP Science) ont été diluées par 2000 dans l’acide chlorhydrique 0,01 M. [0261] Le PEG-DOTA a été dilué à 10 mg/L dans le tampon acétate dilué (0,01 M acétate d’ammonium et 0,01 M d’acide acétique) et 1 ppb de chacun des métaux (Pb et Cd) a été ajouté à l’échantillon. Le pH a été ajusté avec de l’acide chlorhydrique à 0,1 M ou 1M pour atteindre pH 4, 3, 2 ou 1.

[0262] L’analyse HPLC-MS des échantillons montre que le PEG-DOTA à 10 mg/L est capable de complexer le cadmium aux 4 pH testés. En considérant que l’aire totale des pics de cadmium libre et lié au polymère correspond à la quantité totale de métal ajouté, le PEG- DOTA est capable de complexer plus de 26% du cadmium aux pH 1 et 2. Ce pourcentage atteint 50% et 100% à pH 3 et 4 respectivement (Figure 17). Concernant le plomb, aucun pic n’est visible à pH 1 (non représenté ici) alors qu’on observe un pic de plomb lié au polymère à 17 min aux pH 2, 3 et 4 ce qui confirme la captation du plomb par le PEG-DOTA (Figure 18).

[0263] Exemple 13 : Complexation de l’aluminium par le PEG-DFO en présence de citrate

[0264] Le PEG-DFO lyophilisé a été solubilisé dans l’eau ultra-pure à une concentration de 10 g/L. La solution standard d’Aluminium à 1000 ppm dans l’acide nitrique 5% (acheté chez

SCP Science) a été diluée par 200 dans l’acide chlorhydrique 0,01 M. Une solution d’acide citrique à 2.0 mM a été préparée dans l’eau ultra-pure. Les échantillons ont été préparés dans un tampon acétate (0,1 M acétate d’ammonium et 0,1 M d’acide acétique, pH 4,6).

[0265] Le PEG-DFO a été dilué à 0,1 g/L dans le tampon acétate et 100 ppb d’aluminium ont été ajoutés à l’échantillon. Lorsque les échantillons contenaient du citrate, celui-ci a été ajouté en premier puis l’aluminium et enfin le polymère afin d’étudier la capacité du PEG- DFO à extraire l’aluminium déjà complexé par le citrate. Les échantillons ont été analysés par HPLC-MS pour observer la répartition de l’aluminium sur les différentes espèces présentes (PEG-DFO, citrate ou aluminium libre). L’analyse par HPLC-MS a montré un pic d’aluminium lié au polymère à un temps de rétention de 17 min et un très faible pic d’aluminium libre à 24 min, ce qui confirme la complexation de l’aluminium par le polymère (Figure 19). En considérant que l’aire totale des pics d’aluminium libre et lié au polymère (auquel l’aire du polymère sans ajout d’aluminium a été soustraite) correspond au 100 ppb de métal ajouté, le PEG-DFO est capable de complexer plus de 85% de l’aluminium. En présence de citrate à 20 mM et de PEG-DFO 0,1 g/L, on observe un transfert de l’aluminium du citrate (pic à 22 min) vers le polymère (pic à 17 min) (Figure 20). Comme précédemment, si on considère l’aire totale réelle des pics (polymère, citrate et métal libre) comme étant 100 ppb d’aluminium, le PEG-DFO est capable de capter 45% de l’aluminium total et de capturer plus de 90% de l’aluminium complexé par le citrate. [0266] Exemple 14 : Extraction de l’Aluminium complexé par l’EDTA par le PEG-DFO

[0267] Le PEG-DFO lyophilisé a été solubilisé dans l’eau ultra-pure à une concentration de 10 g/L. La solution standard d’Aluminium à 1000 ppm dans l’acide nitrique 5% (acheté chez SCP Science) a été diluée par 200 dans l’acide chlorhydrique 0,01 M. Une solution d’EDTA à 8 mM a été préparée dans l’eau ultra-pure. Les échantillons ont été préparés dans une solution tamponnée d’Hémosol B0 dilué par 100. Des échantillons références de polymère sans aluminium et d’aluminium complexé par 1.1 équivalent molaire d’EDTA, i.e. 1.189 ppm d’EDTA, sans polymère ont été préparés. La composition des différents échantillons est détaillée en tableau 17.

[0268] [Tableau 17] [0269] Lors de l’expérience, le polymère a été ajouté dans une solution contenant déjà l’aluminium et l’EDTA. Après un temps d’incubation de 30 min, les échantillons sont centrifugés dans des tubes Vivaspin 20 (4000 rpm, cycle de 10 min). Ces tubes possèdent une membrane de 30 kDa ce qui permet de retenir le polymère au-dessus de la membrane grâce à sa taille supérieure à 30 kDa et de laisser passer les petites espèces telles que l’EDTA et l’aluminium libre. Selon le protocole 3, après chaque cycle de centrifugation, le sous-nageant est récupéré et le tube est complété à nouveau jusqu’à 20 mL avec la solution initiale, et cela jusqu’à que les 100 mL de solution initiale soient centrifugés et que 20 mL d’échantillon soit récupéré dans le surnageant. Tous les échantillons (solution initiale, surnageant et sous-nageant) ont ensuite été analysés par ICP-MS pour déterminer la concentration en aluminium dans chaque fraction (Tableau 18). Pour les deux échantillons contenant le polymère, la surconcentration de l’aluminium dans le surnageant par rapport à la solution initiale met en évidence la capture de l’aluminium par le polymère (Tableau 18 et Figure 21). De plus, la concentration en aluminium dans le sous-nageant est réduite en présence de polymère ce qui confirme la capacité du PEG-DFO à capter l’aluminium à faible concentration en présence d’EDTA (1 à 2 ppm) (Figure 21). En effet, dans une solution à pH 6 contenant 100 ppb d’aluminium et environ 1 ppm d’EDTA, 0.1 g/L de PEG- DFO peut extraire plus de 50 % de l’aluminium (Figure 22). [0270] [Tableau 18]