본 발명은 제브라피쉬(zebrafish) AKAP12(A-Kinase anchoring protein 12)를 유효성분으로 함유하는 AKAP12의 결핍에 의해 야기되는 혈관 및 심장을 포함한 순환기적 결함 예방 및 치료용 조성물, 발생학적 결함 예방 및 치료용 조성물, AKAP12를 유효성분으로 함유하는 출혈저해제, 및 순환기적 또는 발생학적 질환 치료제 효과 검증 동물 모델로서 AKAP12 결핍 돌연변이 제브라피쉬의 용도에 관한 것이다.

제브라피쉬(zebrafish)(zebra danio, Danio rerio)는 열대성 어류의 한 종류로서 과학적 연구 모델로서 널리 이용되고 있는 동물이다. 제브라피쉬는 특히 척추동물의 발생학과 유전자 기능에 대한 연구에서 쥐와 같은 동물모델을 대체할 수 있는 동물로서 다른 척추동물에 비해 발생 시간이 짧고 배아가 크고 튼튼하며 투명하여 관찰하기가 용이하다는 장점이 있다. 그리고 모르폴리노(Morpholino) 안티센스(antisense) 기술을 이용하여 특정 유전자에 대한 RNA의 유전자 접합(gene splicing) 및 유전자 넉다운(gene knockdown)을 통한 유전자 발현의 양을 줄임으로써 특정 유전자 기능 연구에 활용될 수 있다(Froese, R., et al., Danio rerio. FishBase. Retrieved on 2007-04-07). 그러나 AKAP12 돌연변이 제브라피쉬를 순환기적 결함 치료제 효과 검증 동물 모델로 사용했다는 보고는 없다.

모르폴리노(Morpholino)는 유전자 발현(gene expression)을 조절하는 분자의 일종으로서 RNA의 25개 이하의 염기쌍과 결합하여 상기 RNA의 번역(translation) 및 유전자 접합(splicing)을 차단함으로써 상기 유전자의 발현을 하향 조절(gene knockdown)하는 시약으로 널리 사용되고 있다(Nasevicius, A et al., Nature Genetics 26 (2): 216-220, 2000).

AKAP12(A-Kinase anchoring protein 12)(Gravin, SSeCKS(Src-suppressed C kinase substrate))는 세포 내에 존재하는 구조단백질(scaffolding protein)중 하나로써 src 또는 ras와 같은 종양유전자(oncogene)에 반응하여 그 기능이 감소(down-regulation)되는 단백질로서 처음 알려진 단백질이다(Frankfort BJ, et al., Biochem Biophys Res Commun, Jan 26;206(3):916-26, 1995). 특히, 베타 아들레날린 수용체(β adrenergic receptor), PKC, PKA, 포스포디에스테라제(Phosphodiesterase), 칼모듈린(Calmodulin) 및 F-액틴(F-actin)과 작용하여 세포 신호전달에 관여한다고 알려져 있으며(Wang HY, et al., Eur J Cell Biol., Jul;85(7):643-50, 2006), 세포의 이주(cell migration), 세포 분열(mitosis), 혈관장벽(boold barrier) 및 세포자살(apoptosis)에 관여한다고 보고되었다(Weiser DC, et al., GENES & DEVELOPMENT 21:1559-1571, 2007; Xia W, Experimental Cell Research, Volume 277, Issue 2, p139-151, 2002; Choi YK, et al., The Journal of Neuroscience, April 18, 27(16):4472-4481, 2007; Lee SW, et al., Nature Medicine Article , 01 Jul, 2003; Yoon DK, et al., Cancer Letters, Volume 254, Issue 1, Pages 111-118, 2007). AKAP12가 제브라피쉬 초기배아 조직의 전체적 결함양상에 관여한다는 발생에 관한 일부 보고는 있으나(Weiser DC, et al., Genes Dev., Jun 15; 21(12):1559-71, 2007) 제브라피쉬의 심장 결함, 뇌혈관의 안정성 결함, 혈관 결함으로 인한 출혈과 같은 각 세부 기관의 결함을 제브라피쉬 akap12 알파형태 및 베타형태 2개의 아형(isoform)과 관련된 보고는 전무하다.

이에, 본 발명자들은 제브라피쉬에 모르폴리노(morpholino)를 주사하여 제브라피쉬의 akap12 mRNA를 넉다운시킨 후 표현형(phenotype)을 관찰한 결과, 정상적인 제브라피쉬에 비해 다양한 순환기적, 발생학적 결함이 나타나는 것을 확인하여 AKAP12의 기능을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 AKAP12(A-Kinase anchoring protein 12)를 유효성분으로 함유하는 AKAP12의 결핍에 의해 야기되는 순환기적, 발생학적 결함 예방 및 치료용 조성물, AKAP12를 유효성분으로 함유하는 출혈 저해용 조성물, 및 순환기적, 발생학적 결함을 갖는 AKAP12 결핍 돌연변이 동물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 AKAP12(A-Kinase anchoring protein 12)를 유효성분으로 함유하는 AKAP12의 결핍에 의해 야기되는 순환기적 결함 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 AKAP12를 유효성분으로 함유하는 AKAP12의 결핍에 의해 야기되는 발생학적 결함 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 AKAP12를 유효성분으로 함유하는 출혈 저해용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 AKAP12를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 순환기적 결함 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 AKAP12를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 발생학적 결함 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 AKAP12를 순환기적 결함 예방 및 치료용 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 AKAP12를 발생학적 결함 예방 및 치료용 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 AKAP12를 출혈 저해용 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 순환기적 결함을 갖는 AKAP12 결핍 돌연변이 동물을 제공한다.

또한, 본 발명은 발생학적 결함을 갖는 AKAP12 결핍 돌연변이 동물을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) akap12 유전자를 넉아웃(knockout) 또는 넉다운(knockdown)시킨 동물에 순환기적 결함 예방 및 치료제 후보물질을 투여하는 단계;

2) 단계 1)의 순환기적 결함 예방 및 치료제 후보물질이 투여된 동물의 순환기 발달 정도를 확인하는 단계; 및

3) 상기 후보물질을 투여하지 않은 대조군 동물과 비교하여 순환기의 발달 정도를 유의하게 회복시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 순환기적 결함 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) akap12 유전자를 넉아웃(knockout) 또는 넉다운(knockdown)시킨 동물에 발생학적 결함 예방 및 치료제 후보물질을 투여하는 단계;

2) 단계 1)의 발생학적 결함 예방 및 치료제 후보물질이 투여된 동물의 발생학적 발달 정도를 확인하는 단계; 및

3) 상기 후보물질을 투여하지 않은 대조군 동물과 비교하여 발생학적 발달 정도를 유의하게 회복시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 발생학적 결함 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에서 사용되는 용어를 정의한다.

본 발명에 있어서, 용어 "넉아웃(knockout)"은 유전자의 결손이 유발된 DNA를 외부에서 도입하여 정상 유전자에 완전 불활성화를 유도하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 용어 "넉다운(knockdown)"은 RNAi 등을 이용해서 발현하는 mRNA를 퇴화(degradation)시켜서 유전자 발현량을 줄이는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 순환기적 결함 또는 발생학적 결함을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료" 및 "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 순환기적 결함 또는 발생학적 결함의 증세가 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "개체"는 본 발명의 조성물을 투여하여 순환기적 결함 또는 발생학적 결함의 증상이 호전될 수 있는 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 아토피의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 AKAP12(A-Kinase anchoring protein 12)를 유효성분으로 함유하는 AKAP12의 결핍에 의해 야기되는 순환기적 결함 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 AKAP12를 유효성분으로 함유하는 AKAP12의 결핍에 의해 야기되는 발생학적 결함 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

상기 AKAP12는 서열번호 1로 기재되는 핵산 서열을 갖는 AKAP12 알파 형태(alpha form), 또는 서열번호 2로 기재되는 핵산 서열을 갖는 AKAP12 베타 형태(beta form)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 제브라피쉬 akap12 알파 형태 및 제브라피쉬 akap12 베타 형태를 클로닝(cloning)하였고, 제브라피쉬의 akap12 알파 형태 mRNA 및 제브라피쉬 akap12 베타 형태 mRNA를 넉다운(knockdown)시키기 위해 모르폴리노(morpholino)를 제작하였다. 상기 제작한 모르폴리노는 알파 형태 및 베타 형태 각각이 특이적으로 가지고 있는 변형 부위(variant region)가 스플라이싱(splicing)되는 위치에 결합하여 스플라이싱이 되는 것을 차단함으로써 성숙한 mRNA가 되는 것을 막게 제작되었다.

본 발명자들는 제브라피쉬 AKAP12의 mRNA 발현 양상을 확인하기 위해, AKAP12 알파 및 AKAP12 베타의 두 아형(isoform)에서 공통적으로 들어있는 염기서열에 해당하는 리보프로브(riboprobe)를 제작하여, 접합보인법(in situ Hybridization, ISH)을 수행한 결과, 수정된지 24시간 전 까지는 AKAP12가 포배엽 전반적으로 발현하였으나, 수정된지 24시간 이후부터 머리 부위와 큰혈관 부위[배대동맥(dorsal aorta, DA), 후기본정맥(posterial cardinal vein, PCV), 분절사이혈관(intersegmental vessels, ISV)]를 따라 발현이 국한되는 것을 확인할 수 있었다(도 2 참조).

본 발명의 AKAP12는 뇌의 미세혈관, 심장 및 전체 혈관의 순환기적 결함을 정상적으로 발달시킬 수 있으며, 외형 및 운동 기능의 발생학적 결함을 정상적으로 발달시킬 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 AKAP12가 발생학적으로 외형의 발달에 미치는 영향을 알아보기 위해 제브라피쉬(zebrafish) 배아(embryo)에 모르폴리노(morpholino)를 주사하여 제브라피쉬 akap12 알파 형태(alpha form) 및 베타 형태(beta form)를 넉다운(knockdown)시킨 후 외형을 관찰하였다. 그 결과, 제브라피쉬의 akap12 mRNA를 넉다운시키지 않은 정상적인 제브라피쉬의 경우 꼬리 쪽 부위가 곧고 긴 일자형으로 운동시 정상적인 기능을 수행할 수 있는 반면에, 제브라피쉬의 akap12 mRNA 알파 형태 및 베타 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬의 경우 꼬리 쪽 부위가 휘거나 짧아진 형태를 나타내었으며 운동시 정상적인 기능을 수행하지 못하였다.

본 발명자들은 제브라피쉬의 AKAP12 알파 형태에 대한 모르폴리노를 제브라피쉬 배아에 주사하여 AKAP12 알파 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬 중 각 결함 정도에 따른 AKAP12 알파 형태의 mRNA 발현 양상을 RT-PCR로써 확인하였다. 그 결과 결함의 정도가 심할수록 mRNA의 발현 정도가 낮은 것을 알 수 있었다(도 3 참조).

본 발명자들은 제브라피쉬의 AKAP12 알파 형태 및 AKAP12 베타 형태에 대한 모르폴리노를 농도별로 순차적으로 주사한 결과, 베타 형태의 경우는 7.5ng 이상에서, 알파 형태의 경우 3.7ng 이상에서 상기와 같은 발생학적인 결함이 나타나는 것을 알 수 있었다(도 4 참조).

따라서, AKAP12는 발생학적으로 외형 또는 운동 기능을 발달시키는 것을 알 수 있다.

본 발명자들은 AKAP12가 미세혈관 발달에 미치는 영향을 알아보기 위해, 유전자전환 제브라피쉬에서 akap12 알파 형태를 넉다운시킨 후 뇌의 미세혈관의 순환기적 결함 양상을 관찰하였다. 그 결과, AKAP12 알파 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬는 정상적인 제브라피쉬에 비해 뇌의 미세혈관의 형태가 일정한 형태를 나타내지 않았고 형광물질이 미세혈관 내에서 벗어나 주변으로 분포하였다(도 5 참조).

본 발명자들은 AKAP12가 혈관 발달에 미치는 영향을 알아보기 위해, 상기와 같이 유전자전환 제브라피쉬를 이용하여, AKAP12 알파 형태 및 AKAP12 베타 형태를 각각 넉다운시킨 다음, 혈관의 결함 양상을 관찰하였다. 그 결과, AKAP12 알파 및 베타 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬는 정상적인 제브라피쉬에 비해 혈관의 형태가 일정한 형태를 나타내지 않았고 형광물질이 혈관 내에서 벗어나 주변으로 분포하였다(도 6 참조). 또한, AKAP12 알파 및 베타 형태가 녹다운된 제브라피쉬의 혈관 내피 세포는 세포간의 접촉이 느슨하고 그 움직임 또한 활발한 것을 관찰할 수 있었다(도 7 참조).

본 발명자들은 상기 AKAP12가 넉다운된 제브라피쉬의 혈관 내피세포의 활발한 움직임이 small GTPase 단백질 중 하나인 RhoA와 관련이 있는지 알아보기 위해, AKAP12가 넉다운된 제브라피쉬에 RhoA 신호 억제제(signal inhibitor)인 ROCKOUT을 처리한 결과, 혈관 내피 세포의 과도한 움직임이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다(도 8 참조).

본 발명자들은 상기 결과를 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells)을 이용하여 시험관내(in vitro)에서 RhoA-GTP 결합 분석(binding assay)를 통해 분석한 결과, AKAP12가 녹다운된 HUVEC에서 RhoA의 활성 형태(active form)인 Rho-GTP가 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 9 참조). 또한, 시험관내에서 HUVEC을 이용하여 투과성 분석(permeability assay)를 시행한 결과, AKAP12 siRNA를 처리한 군(AKAP12ab)에서 대조군(control siRNA, sc)에 비해 RITC의 투과성이 증가되는 것을 확인할 수 있었으며, ROCKOUT 처리시 투과성 정도가 낮아지는 것을 확인할 수 있었다(도 10 참조).

본 발명자들은 AKAP12가 녹다운된 제브라피쉬에서 혈관 내피세포 간에 접촉이 느슨해지는 것이 세포간 결합 단백질의 결함에 의한 것인지 알아보기 위해, siRNA를 이용하여 AKAP12 유전자를 녹다운시켰을 때 세포막에서 결합단백질 중 하나인 ve-카드헤린(ve-cadherin)이 세포막에서의 발현 및 막-위치(membrane-localization)에 이상이 있다는 것을 웨스턴블랏(western-blot)과 면역세포화학(immunocytochemistry)을 통하여 확인하였으며, AKAP12에 대한 siRNA와 ROCTOUT을 같이 처리했을 때 상기 이상이 회복되는 것을 확인할 수 있었다(도 11 참조).

따라서, AKAP12는 혈관 및 뇌의 미세혈관을 형성하는데 관여하는 것을 알 수 있으며, 제브라피쉬 AKAP12가 혈관 및 뇌의 미세혈관의 성숙도에 영향을 줄 수 있음을 알 수 있다.

본 발명자들은 AKAP12가 심장의 발달에 미치는 영향을 알아보기 위해, 심근의 가변사슬(light chain)에 선택적으로 형광이 발현되는 유전자전환 제브라피쉬에서 akap12 알파 형태를 넉다운시킨 후 심장의 순환기적 결함 양상을 관찰하였다. 그 결과, akap12 알파 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬는 정상적인 제브라피쉬에 비해 심방 및 심실의 형태 및 배열이 일정하게 나타내지 않았고, 심장박동이 불규칙적으로 약한 박동을 나타내었으며, 결함이 심할 경우 혈액 순환이 불가능한 것으로 관찰되었다(도 12 참조).

따라서, AKAP12는 심장이 형성되는데 있어서 크게 관여한다는 것을 알 수 있다.

또한, 본 발명은 AKAP12를 유효성분으로 함유하는 출혈 저해용 조성물을 제공한다.

상기 AKAP12는 서열번호 1로 기재되는 핵산 서열을 갖는 AKAP12 알파 형태(alpha form), 또는 서열번호 2로 기재되는 핵산 서열을 갖는 AKAP12 베타 형태(beta form)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 AKAP12가 출혈에 미치는 영향을 알아보기 위해, AKAP12 알파 형태 및 베타 형태가 넉다운시킨 제브라피쉬의 배아를 관찰하였다. 그 결과, 2일 ~ 3일된 제브라피쉬에서 출혈이 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. 상기 출혈은 제브라피쉬의 뇌실, 망막, 심장 및 몸통에서 전반적으로 관찰되었으며 통계적으로 제브라피쉬의 akap12 알파 형태 및 베타 형태에 대한 모르폴리노의 양이 늘어날수록 전체 중 출혈이 일어난 제브라피쉬의 비율이 늘어나는 것을 관찰할 수 있었다(도 13, 도 14 및 도 15 참조).

본 발명자들은 출혈이 있는 제브라피쉬의 혈관의 변화를 알아보기 위해, 유전자 전환 제브라피쉬를 이용하여 뇌 혈관 패턴을 관찰하였다. 그 결과, 출혈이 안 일어난 군의 경우, 모르폴리노를 주사하지 않은 정상적인 제브라피쉬의 뇌혈관과 다르게 뇌혈관 패턴이 굴곡이 일어난 불규칙적인 양상을 나타내었지만 혈관의 형성자체는 이루어진 반면, 출혈이 일어난 군의 경우는 뇌혈관의 불규칙적인 패턴양상과 함께 뇌혈관 형성 자체도 가늘어 지는 것을 확인할 수 있었다(도 16 참조).

본 발명자들은 제브라피쉬의 AKAP12 알파 형태 및 베타 형태에 대한 모르폴리노의 양을 이용하여 넉다운의 정도에 따른 발생학적 결함 및 심장과 혈관을 포함한 순환기적 결함 양상을 관찰하였다. 그 결과, 제브라피쉬의 AKAP12 알파 형태에 대한 모르폴리노 처리시 1ng ~ 2ng 까지는 출혈만 일어났고, 3ng ~ 4ng까지는 출혈과 심장 및 몸통의 혈관 결함이 동시에 일어났으며, 4ng 이상은 심장 및 다른 혈관의 결함이 심해 혈액의 순환이 원할하지 못해 출혈이 일어나는 정도가 줄어드는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 제브라피쉬의 akap12 베타 형태에 대한 모르폴리노 처리시에는 7.5ng ~ 8ng 처리시에는 출혈과 심장 및 몸통의 혈관 결함이 동시에 일어났고, 9ng이상은 심장 및 몸통의 혈관 결함만 일어나는 것을 관찰할 수 있었다(도 17 참조).

따라서, AKAP12는 심장 및 혈관과 같은 순환기를 발달시켜 출혈을 저해하는 것을 알 수 있다.

본 발명자들은 상기 관찰된 발생학적 결함이 AKAP12 특이적인 넉다운에 의한 것인지 확인하기 위해, 외형 및 출혈 결함이 AKAP12 특이적인 넉다운에 의한 것인지 확인하기 위해, 제브라피쉬 AKAP12 알파 및 베타 형태의 mRNA와 모노폴리노를 이용하여 구조(rescue) 실험을 시행하였다. 그 결과, AKAP12 알파 및 베타 형태에 대한 모르폴리노만 미세주입한 대조군은 몸통이 휘고 출혈이 나는 결함 양상을 보이는 반면에, 제브라피쉬 AKAP12 알파 및 베타 형태의 mRNA와 모르폴리노를 함께 미세주입한 실험군에서는 몸통의 결함 및 출혈 양상이 회복된 제브라피쉬의 비율이 늘어나는 것을 확인할 수 있었다(도 18 참조).

본 발명자들은 상기 관찰된 외형 및 순환기 결함이 AKAP12 특이적인 넉다운에 의한 것인지 확인하기 위해, 랫트(rat) AKAP12 mRNA를 이용하여 레스큐(rescue) 실험을 수행하였다. 그 결과, AKAP12 알파 형태에 대한 모르폴리노만 주사한 대조군은 상기 관찰된 꼬리가 휘고 짧으며, 심장이 기형적으로 나타나는 결함 양상을 보이는 반면, 랫트 AKAP12 알파 형태의 mRNA를 같이 섞어 주사한 실험군에서는 상기 mRNA의 양이 늘어날수록 꼬리 및 심장의 결함 양상이 회복된 제브라피쉬의 비율이 늘어나는 것을 확인할 수 있었다(도 19 참조).

상기 결과를 종합하면, 본 발명의 AKAP12는 외형 및 운동 기능 결함 등의 발생학적 결함을 억제 또는 완화하고, 심장 및 혈관을 포함하는 순환기적 결함을 저해하며, 출혈을 저해하는 효과를 나타내는 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 AKAP12는 AKAP12의 결핍에 의해 야기되는 순환기적 결함 예방 및 치료제, 발생학적 결함 예방 및 치료제, 및 출혈 저해제의 유효성분으로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 조성물은 AKAP12에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 투여를 위해서는 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다.

상기 AKAP12를 함유한 조성물은 임상 투여 시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등을 이용하는 제형으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 동맥 주사, 정맥 주사, 경피 주사, 비강 내 투여, 경기관지 투여 또는 근육 내 투여 등의 당업자에게 잘 알려진 방법들로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 예를 들면, 일일 투여량은 0.01 ~ 5000 ㎎/㎏인 것이 바람직하고, 0.01 ~ 10 ㎎/㎏인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 하루 일 회 내지 수 회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 AKAP12를 AKAP12의 결핍에 의해 야기되는 순환기적 결함에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 발생학적 결함 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 AKAP12를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 순환기적 결함 예방방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 AKAP12를 AKAP12의 결핍에 의해 야기되는 발생학적 결함이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 발생학적 결함 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 AKAP12를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 발생학적 결함 예방방법을 제공한다.

본 발명의 AKAP12는 외형 및 운동 기능 결함 등의 발생학적 결함을 억제 또는 완화하고, 심장 및 혈관을 포함하는 순환기적 결함을 저해하며, 출혈을 저해하는 효과를 나타내는 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 AKAP12는 AKAP12의 결핍에 의해 야기되는 순환기적 결함 예방 및 치료, 발생학적 결함 예방 및 치료, 및 출혈 저해를 위해 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

상기 AKAP12는 서열번호 1로 기재되는 핵산 서열을 갖는 AKAP12 알파 형태(alpha form), 또는 서열번호 2로 기재되는 핵산 서열을 갖는 AKAP12 베타 형태(beta form)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 투여 방법은 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

상기 비경구 투여로는 동맥 주사, 정맥 주사, 경피 주사, 비강 내 투여, 경기관지 투여 또는 근육 내 투여 등의 당업자에게 잘 알려진 방법들로 투여될 수 있다.

상기 투여량은 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 예를 들면, 일일 투여량은 0.01 ~ 5000 ㎎/㎏인 것이 바람직하고, 0.01 ~ 10 ㎎/㎏인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 하루 일 회 내지 수 회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명은 AKAP12를 순환기적 결함 예방 및 치료용 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 AKAP12를 발생학적 결함 예방 및 치료용 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 AKAP12를 출혈 저해용 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.

본 발명의 AKAP12는 외형 및 운동 기능 결함 등의 발생학적 결함을 억제 또는 완화하고, 심장 및 혈관을 포함하는 순환기적 결함을 저해하며, 출혈을 저해하는 효과를 나타내는 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 AKAP12는 AKAP12의 결핍에 의해 야기되는 순환기적 결함 예방 및 치료제, 발생학적 결함 예방 및 치료제, 및 출혈 저해제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

상기 AKAP12는 서열번호 1로 기재되는 핵산 서열을 갖는 AKAP12 알파 형태(alpha form), 또는 서열번호 2로 기재되는 핵산 서열을 갖는 AKAP12 베타 형태(beta form)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 순환기적 결함을 갖는 AKAP12 결핍 돌연변이 동물을 제공한다.

또한, 본 발명은 발생학적 결함을 갖는 AKAP12 결핍 돌연변이 동물을 제공한다.

상기 AKAP12는 서열번호 1로 기재되는 핵산 서열을 갖는 AKAP12 알파 형태(alpha form), 또는 서열번호 2로 기재되는 핵산 서열을 갖는 AKAP12 베타 형태(beta form)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 AKAP12 결핍 돌연변이는 akap12 유전자가 넉아웃(knockout) 또는 넉다운(knockdown)된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 동물은 제브라피쉬, 마우스, 랫트, 돼지 및 원숭이로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 제브라피쉬인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은

1) akap12 유전자를 넉아웃(knockout) 또는 넉다운(knockdown)시킨 동물에 순환기적 결함 예방 및 치료제 후보물질을 투여하는 단계;

2) 단계 1)의 순환기 질환 예방 및 치료제 후보물질이 투여된 동물의 순환기발달 정도를 확인하는 단계; 및

3) 상기 후보물질을 투여하지 않은 대조군 동물과 비교하여 순환기의 발달 정도를 유의하게 회복시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 순환기적 결함 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) akap12 유전자를 넉아웃 또는 넉다운시킨 동물에 발생학적 결함 예방 및 치료제 후보물질을 투여하는 단계;

2) 단계 1)의 발생학적 결함 예방 및 치료제 후보물질이 투여된 동물의 발생학적 발달 정도를 확인하는 단계; 및

3) 상기 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 발생학적 발달 정도를 유의하게 회복시킨 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 발생학적 결함 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 방법들에 있어서, 단계 1)의 동물은 제브라피쉬, 마우스, 랫트, 돼지 또는 원숭이가 바람직하고, 제브라피쉬인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방법들에 있어서, 단계 1)의 후보 물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 및 혈장으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 화합물들은 신규 화합물이거나 널리 알려진 화합물일 수 있다.

이러한 후보 물질은 염을 형성하고 있어도 된다. 후보 물질의 염으로는 생리학적으로 허용되는 산(예, 무기산 등)이나 염기(예, 유기산 등) 등의 염이 있고 이 중에서 생리학적으로 허용되는 산첨가염이 바람직하다. 이와 같은 염으로는 예를 들면, 무기산(예를 들면, 염산, 인산, 취화수소산 또는 황산 등)의 염 또는 유기산(예를 들면, 초산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 안식향산, 메탄술폰산 또는 벤젠술폰산 등)의 염 등이 이용된다.

상기와 같은 후보 물질을 투여하는 방법으로는 예를 들면, 정맥주사, 피하투여, 피내투여 또는 복강투여 등 비경구 투여 중에서 대상 동물의 증상 및 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택할 수 있다. 또한 후보 물질의 투여량은 투여 방법 및 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택할 수 있다.

본 발명의 AKAP12(A-Kinase anchoring protein 12)는 외형, 운동 기능, 뇌의 미세혈관, 심장 등의 AKAP12의 결핍에 의해 야기되는 순환기적 또는 발생학적 결함을 정상적으로 회복시키고, 출혈을 저해하는 기능을 함으로써, AKAP12를 함유하는 조성물은 순환기적 결함 예방 및 치료제, 발생학적 결함 예방 및 치료제, 및 출혈 저해제로 사용될 수 있다. 또한, AKAP12 결핍 돌연변이 제브라피쉬는 상기와 같은 순환기적 결함 또는 발생학적 결함을 나타냄으로써 순환기적 결함 또는 발생학적 결함 예방 및 치료제를 스크리닝하기 위한 효과적인 동물 모델로서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 제브라피쉬 AKAP12 알파 형태(alpha form) mRNA 및 제브라피쉬 AKAP12 베타 형태(beta form) mRNA에 모르폴리노(morpholino)가 결합된 서열을 나타내는 그림이다( ↔ : 모르폴리노의 결합 부위).

도 2는 제브라피쉬 AKAP12 알파 형태 및 베타 형태에 공통적으로 포함된 염기서열인 리보프로브(riboprobe)를 제조한 후, 접합보인법(in situ Hybridization)을 수행하여 제브라피쉬 AKAP12의 발현 패턴을 나타내는 그림이다(hpf: hour post-fertilization, 수정 후 시간).

도 3은 제브라피쉬 AKAP12 알파 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬 중 각 결함 정도(N, D1, D2 및 D3)에 따른 AKAP12 알파 형태의 mRNA 발현 양상을 RT-PCR로써 확인한 결과를 나타내는 그림이다.

도 4는 제브라피쉬의 AKAP12 알파 형태 및 베타 형태에 대한 모르폴리노의 양을 순차적으로 주사하여 발생학적인 결함이 나타나는 최소의 양을 확인한 결과를 나타내는 그림이다.

도 5는 제브라피쉬 AKAP12 알파 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬의 총기본정맥(common cardinal vein)을 통하여 붉은색 형광을 나타내는 라이신-고정 테트라메틸로다민-덱스트란(lysine-fixable tetramethylrhodamine-dextran)을 주사한 후 공초점현미경(confocal microscope)을 통해 관찰한 결과를 나타내는 그림이다:

uninj(uninjection): 제브라피쉬 AKAP12 알파 형태에 대한 모르폴리노를 미량주사하지 않은 제브라피쉬군.

도 6은 제브라피쉬의 AKAP12 알파 형태 및 베타 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬의 총기본정맥을 라이신-고정 테트라메틸로다민-덱스트란을 이용하여 공초점현미경을 통해 관찰한 결과를 나타내는 그림이다(붉은색: 라이신-고정 테트라메틸로다민-덱스트란 염료; 녹색: 혈관 내피 세포).

도 7은 제브라피쉬의 AKAP12 알파 형태 및 베타 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬의 혈관 내피 세포를 라이신-고정 테트라메틸로다민-덱스트란을 이용하여 공초점현미경을 통해 관찰한 결과를 나타내는 그림이다.

도 8은 제브라피쉬의 AKAP12 알파 형태 및 베타 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬에 RhoA 신호 억제제인 ROCKOUT을 처리한 후, 혈관 내피 세포를 라이신-고정 테트라메틸로다민-덱스트란을 이용하여 공초점현미경을 통해 관찰한 결과를 나타내는 그림이다.

도 9는 HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells)에서 AKAP12 siRNA를 처리하여 AKAP12를 넉다운시킨 후, RhoA-GTP 결합 분석을 수행한 결과인 GTP-RhoA의 수준을 나타내는 그림이다:

sc: siRNA 대조군; 및

AKAP12ab: AKAP12 siRNA군.

도 10은 HUVEC에서 AKAP12 siRNA를 처리하여 AKAP12를 넉다운시킨 후, 투과성 분석(permeability assay)을 수행한 결과인 투과성 정도를 나타내는 그림이다:

AKAP12ab: AKAP12 siRNA를 처리한 군; 및

sc: siRNA 대조군.

도 11은 HUVEC에서 AKAP12 siRNA를 처리하여 AKAP12를 넉다운시킨 후, 웨스턴블랏(western-blot)과 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석법을 이용하여 세포막 결합단백질인 ve-카드헤린(ve-cadherin)의 발현 정도를 나타내는 그림이다.

도 12는 제브라피쉬 AKAP12 알파 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬의 심장을 공초점 현미경을 통해 관찰한 결과를 나타내는 그림이다.

도 13은 제브라피쉬 AKAP12 알파 형태 및 AKAP12 베타 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬 배아의 2일 후 출혈 부위를 나타내는 그림이다:

Ventriode: 뇌실;

Retina: 망막;

Heart: 심장; 및

Trunk: 몸통.

도 14는 제브라피쉬 AKAP12 알파 형태 및 AKAP12 베타 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬 배아의 3일 후 출혈 부위를 나타내는 그림이다:

Ventriode: 뇌실;

Retina: 망막;

Heart: 심장; 및

Trunk: 몸통.

도 15는 제브라피쉬의 AKAP12 알파 형태 및 AKAP12 베타 형태에 대한 모르폴리노의 양에 따른 2일 및 3일 후 출혈이 일어난 제브라피쉬의 비율을 나타내는 그래프이다.

도 16은 유전자전환(fli:egfp) 제브라피쉬 배아에 제브라피쉬의 AKAP12 알파 형태에 대한 모르폴리노를 미량주사한 뒤 공초점 현미경을 통해 뇌 혈관을 관찰한 결과를 나타내는 그림이다:

A: 대조군;

B ~ D: akap12 모르폴리노 주입 개체(morphants)(3 ng);

B: 비-출혈 모르폴리노 주입 개체; 및

C, D: 뇌실 내 출혈 개체.

도 17은 제브라피쉬 AKAP12 알파 형태 및 AKAP12 베타 형태 mRNA를 넉다운시키는 경우, 각각의 모르폴리노의 양에 따른 결함 양상을 관찰한 결과를 나타내는 그림이다.

도 18은 제브라피쉬 AKAP12 알파 및 베타 형태에 대한 모르폴리노를 제브라피쉬 배아에 주사한 후 몸통의 결함 및 출혈양상의 회복 정도를 나타내는 그림이다.

도 19는 제브라피쉬 AKAP12 알파 형태에 대한 모르폴리노 및 상기 모르폴리노와 랫트 AKAP12 알파 형태의 mRNA를 혼합한 것을 제브라피쉬 배아에 주사한 후 결함을 관찰한 결과를 나타내는 그림이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 이에 한정하지는 않는다.

<실시예 1> 제브라피쉬(zebrafish)의 사육 및 발생배의 준비

일반형(wild type) 제브라피쉬는 국내 세진 수조관에서 구입하였고, 유전자전환 제브라피쉬는 오리건대학교(university of oregon)의 ZFIN 웹싸이트에서 구입하였다. 상기 제브라피쉬들은 조건(온도: 28℃, 명암: am 9:00 ~ pm 9:00 점등 그 외 시간 소등, 먹이: 브라인 슈림프(brine shrimp))하에서 사육되었다. 발생배는 교미를 시키기 전날 제브라피쉬 암컷과 수컷을 각각 칸막이로 나눠둔 뒤 다음날 아침에 밝게 해주면서 암컷과 수컷 사이의 칸막이를 없애 교미를 시켰다. 교미를 통해 얻은 제브라피쉬의 알을 아가 겔(agar gel)로 만든 틀에 옮겼다.

<실시예 2> 제브라피쉬(zebrafish) AKAP12(alpha 및 beta form) 유전자 복제

본 발명자들은 제브라피쉬(zebrafish)의 akap12에 대한 연구를 수행하기 위해 제브라피쉬 akap12 알파 형태(alpha form) 및 제브라피쉬 akap12 베타 형태(beta form)를 클로닝(cloning)하였다. 국립 생물정보센터(National center for biotechnology information)(www.ncbi.nlm.nih.gov) 웹 싸이트를 통해 제브라피쉬의 akap12 알파 형태(유전자 코드번호: xm_690658.2) 및 akap12 베타 형태(유전자 코드번호: ef539208)로 예상되는 유전자 서열을 찾은 후, 제브라피쉬 염색체(chromosome) 20(유전자 코드번호: cr926887)번 서열과 정렬(align)을 해본 결과 제브라피쉬 크로모좀 20에 제브라피쉬 akap12 알파 형태 및 제브라피쉬 akap12 베타 형태의 CDS가 존재한다는 것을 확인할 수 있었다. 본 발명자들은 클로닝을 하기 위해 상기 알파 형태 및 베타 형태의 CDS 중 시작 코돈과 BamHI 제한효소부위(restriction enzyme site)를 포함하는 포워드 프라이머(forward primer) 알파 형태: AAGGATCCATGGGAGCGACACCATCCGTGC(서열번호 3), 제브라피쉬의 5' UTR부위를 포함하는 포워드 프라이머 베타 형태: ACTTTCCAAAGCAGACAACCCTCGGG(서열번호 4), 종결코돈과 EcoRI 제한효소부위를 포함하는 리버스 프라이머(reverse primer) 알파 형태: AAGAATTCTCATGACACTGTGACAACCTCTGTGGAG(서열번호 5) 및 3' UTR부위를 포함하는 리버스 프라이머 베타 형태: AGACATGATTTTGTATCCATACTATTAACAGCTTG(서열번호 6)를 제작하였으며 이를 이용하여 알파 형태의 경우 pcDNA3.1 myc-his 벡터(vector)에 클로닝하였고, 베타 형태의 경우 T-easy 벡터에 클로닝하였다.

제브라피쉬에서 얻은 cDNA를 주형으로 하여 TAKARA Ex Tag polymerase(TAKARA 사)를 이용하여 PCR을 진행하였다. 상기 cDNA는 성체의 제브라피쉬에서 RNA를 추출한뒤 RT-PCR을 이용하여 획득하였다. 상기 RNA추출의 경우 트리졸(TRIZOL) 및 클로로포름(chloroform)을 이용한 RNA 추출 방법을 사용하였으며 RT-PCR의 경우는 MMLV RT enzyme(BEAMS 사)을 사용하였다. 상기 PCR은 전체 부피를 50ul로 하여 제브라피쉬의 cDNA를 2ul, 상기 포워드 및 리버스 프라이머를 각각 1ul, TAKARA Ex Tag polymerase를 0.3ul, 10X buffer 5ul, 및 2.5mM dNTP 6ul를 섞어 반응을 시켰다. 반응 조건으로는 95℃ 3분(1회), 95℃ 45초 → 55℃ 45초 → 72℃ 5분(25회), 72℃ 10분 → 4℃ 유지(1회)의 반응을 시켰다.

<실시예 3> 제브라피쉬 AKAP12(alpha 및 beta form) 넉다운(knockdown)을 위한 모르폴리노(morpholino) 제작

본 발명자들은 제브라피쉬의 akap12 알파 형태(alpha form) mRNA 및 제브라피쉬 akap12 베타 형태(beta form) mRNA를 넉다운(knockdown)시키기 위해 모르폴리노(morpholino)를 제작하였다. 상기 모르폴리노의 제작은 GENE TOOLS 사에 의뢰하였다. 모르폴리노 제작은 참고문헌(Summerton, J. et al., Antisense & Nucleic Acid Drug Development 7: 187-95, 1997)에 기재되어 있다. 상기 제작한 모르폴리노는 알파 형태 및 베타 형태 각각이 특이적으로 가지고 있는 변형 부위(variant region)가 스플라이싱(splicing)되는 위치에 결합하여 스플라이싱이 되는 것을 차단함으로써 성숙한 mRNA가 되는 것을 막게 제작되었으며 알파 형태의 모르폴리노의 경우는 서열이 TCTTACCTGTTAGAGTTATTGTCCC(서열번호 7) 25 머(mer)로 akap12 알파 형태의 339번째 염기 부근에 결합하도록 하였고, 베타 형태의 모르폴리노의 경우는 서열이 TACCTTGCCATCTGCGGTTTCTCCA(서열번호 8) 25 머(mer)로 akap12 베타 형태의 227번째 염기 부근에 결합하도록 설계되었다(도 1).

<실험예 1> 제브라피쉬 AKAP12(alpha 및 beta form)의 발현 패턴

본 발명자들는 제브라피쉬 AKAP12의 mRNA 발현 양상을 확인하기 위해, AKAP12 알파 및 AKAP12 베타의 두 아형(isoform)에서 공통적으로 들어있는 염기서열에 해당하는 리보프로브(riboprobe)를 제작하여, 접합보인법(in situ Hybridization, ISH)을 시행하였다.

구체적으로, AKAP12 알파 및 AKAP12 베타의 두 아형에서 공통적으로 들어있는 염기서열(2258 bp)을 먼저 PCR을 이용하여 증폭을 시켰다. 이때 사용된 프라이머(primer)의 염기서열과 PCR 조건은 다음과 같다. PCR은 전체 부피를 50 ul로 하여 주형(template): AKAP12a/pGEM-T easy vector를 1 ul, 정방향 프라이머(forward primer): GAAGAATCTGGTGAACATGTTGTAGGGGAA(서열번호 9); 역방향 프라이머(reverse primer: GCGACAACCTCAACCTCATTCACTGC(서열번호 10)를 각각 1 ul, TAKARA Ex Tag polymerase를 0.3 ul, 10X buffer 5 ul, 및 2.5 mM dNTP 6 ul를 섞어 반응시켰다. 반응 조건으로는 94℃ 3분(1회), 94℃ 45초 → 55℃ 45초 → 72℃ 2분(25회), 72℃ 10분 → 4℃ 유지(1회)의 반응을 시켰다.

그런 다음, PCR을 통해 증폭된 염기서열을 pGEM-T easy vector(Promega)에 클로닝하였다. 상기 클로닝된 벡터를 SacII와 SalI 두 제한효소를 이용하여 정방향성, 역방향성으로 각각 일직선(linear)하게 만들었으며, 이렇게 만들어진 일직선(linear)한 벡터를 이용하여 DIG(digoxigenin)가 달린 AKAP12에 대한 센스와 안티센스 리보프로브를 시험관내 전사(in vitro transcription)를 통해 제작하였다. 이때 시행된 시험관내 전사 반응 조건은 다음과 같다. 총 20 ul 반응 시켰으며 일직선(linear)한 벡터 1 ug, RNAse-free water, 10x DIG-표지된 NTP mix 2ul, 10x RNA 폴리머라제 완충용액(polymerase buffer)(Roche) 2 ul, RNAse 억제제(inhibitor) 0.5 ul, T7 또는 SP6 프로모터에 대한 RNA 폴리머라제 2 ul를 혼합하여 37℃에서 2시간 반응시켰다.

이렇게 만들어진 AKAP12에 대한 리보프로브를 이용하여 수정된지 24시간, 48시간, 72시간째 된 제브라피쉬 배아에서 whole-mount 접합보인법을 수행하였다. 접합보인법의 수행방법은 다음과 같다. 먼저, 수정된지 24시간, 48시간, 72시간된 제브라피쉬 배아들을 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정시킨 후, 100% 메탄올을 이용하여 탈수(dehydration)시킨 다음, PBS(phosphate-buffered saline)로 재수화(rehydration)하였다. 그런 다음, 10 mg/ml 프로테이나제 케이(proteinase K)를 처리한 후, 앞서 제작하였던 AKAP12에 대한 DIG-리보프로브를 65℃에서 하룻밤 동안 처리하였다. 다음날 2x 식염 구연산나트륨(saline sodium citrate)과 0.2x 식염 구연산나트륨으로 세척하고 블라킹(blocking) 과정을 거친 후, 항-DIG-알칼라인 포스파타제(anti-DIG-alkaline phosphatase)를 처리하였다. 그런 다음, 니트로 블루 테트라졸륨(nitro blue tetrazolium)/5-브로모-4-클로로-3-인도일 포스페이트 p-톨루이딘(5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate p-toluidine)(Roche, mixed)를 이용하여 염색한 후, 75% 글리세롤(glycerol)에 저장하였다. 리보프로브 염기서열은 서열번호 11로 기재되며, 이는 리보프로브에 해당되는 AKAP12의 센스 염기서열이다. 하기 실험에 사용한 AKAP12 리보프로브는 상기 서열번호 11로 기재되는 염기서열에 대한 안티센스 RNA 서열을 사용하였다.

상기 접합보인법을 수행한 결과, 수정된지 24시간 전 까지는 AKAP12가 포배엽 전반적으로 발현하였으나, 수정 후 24시간 이후부터 머리 부위와 큰혈관 부위[배대동맥(dorsal aorta, DA), 후기본정맥(posterial cardinal vein, PCV), 분절사이혈관(intersegmental vessels, ISV)를 따라 발현이 국한되는 것을 확인할 수 있었다(도 2).

<실험예 2> 제브라피쉬 AKAP12(alpha 및 beta form)이 넉다운(knockdown)된 제브라피쉬의 발생학적 결함(developmental defect) 조사

본 발명자들은 <실시예 3>에서 제작한 모르폴리노를 제브라피쉬에 미량주사(microinjection)하여 제브라피쉬 akap12 mRNA를 넉다운시킨 후 표현형(phenotype)을 관찰하였다.

우선, 제브라피쉬 akap12 mRNA 알파 형태에 대한 모르폴리노는 7ng 및 10ng을 제브라피쉬 배아에 미량주사(microinjection)하였고 akap12 mRNA 베타 형태에 대한 모르폴리노는 7.5ng을 미량주사하였다.

그 결과, 제브라피쉬의 akap12 mRNA를 넉다운시키지 않은 정상적인 제브라피쉬의 경우 꼬리 쪽 부위가 곧고 긴 일자형으로 운동시 정상적인 기능을 수행할 수 있는 반면에, 제브라피쉬의 akap12 mRNA 알파 형태 및 베타 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬의 경우 꼬리 쪽 부위가 휘거나 짧아진 형태를 나타내었으며 운동시 정상적인 기능을 수행하지 못하였다.

또한, 본 발명자들은 제브라피쉬의 akap12 알파 형태에 대한 모르폴리노 7ng 및 10ng을 제브라피쉬 배아에 주사하여 akap12 알파 형태를 넉다운시킨 제브라피쉬 중 각 결함 정도에 따른 akap12 알파 형태의 mRNA 발현 양상을 RT-PCR로써 확인한 결과 결함의 정도가 심할수록 mRNA의 발현 정도가 낮은 것을 알 수 있었다(도 3).

또한, 본 발명자들은 제브라피쉬의 akap12 알파 형태 및 akap12 베타 형태에 대한 모르폴리노를 3.7ng, 7.5ng 및 10ng 순차적으로 주사한 결과, 베타 형태의 경우는 7.5ng 정도에서, 알파 형태의 경우 3.7ng 정도에서 도 4과 같은 발생학적인 결함이 나타나는 것을 알 수 있었다(도 4).

<실험예 3> 제브라피쉬 AKAP12(alpha form)이 넉다운된 제브라피쉬의 뇌의 미세혈관 결함 조사

본 발명자들은 혈관의 내피세포에 선택적으로 녹색형광이 발현되는 tg(fli:egfp)라는 유전자전환(transgenic) 제브라피쉬를 이용하여 제브라피쉬akap12 알파 형태를 넉다운시킨 경우, 뇌의 미세혈관의 결함 양상을 관찰하였다. 구체적으로, 유전자전환 제브라피쉬(fli:egfp) 배아에 제브라피쉬의 AKAP12 알파 형태에 대한 모르폴리노를 3ng 미세주사하여 제브라피쉬의 AKAP12 알파 형태를 넉다운시킨 후 3일 후에 제브라피쉬의 총기본정맥(common cardinal vein)을 통하여 붉은색 형광을 나타내는 라이신-고정 테트라메틸로다민-덱스트란(lysine-fixable tetramethylrhodamine-dextran)[로다민-덱스트란(rhodami ne-dextran), 10kDa, 25mg/ml, 분자 프로브(Molecular Probes)]을 미세주사하여 LSM 510 META NLO 공초점현미경(confocal microscope)(Carl Zeiss, Germany)를 통해 관찰하였다.

그 결과, 모르폴리노를 주사하지 않은 정상적인 제브라피쉬의 경우 붉은색 라이신-고정 테트라메틸로다민-덱스트란이 뇌의 미세 혈관 내에 머무르는 것이 관찰된 반면, akap12 알파 형태에 대한 모르폴리노를 주사한 제브라피쉬의 경우는 뇌의 미세혈관의 형태가 일정한 형태를 나타내지 않았을 뿐만 아니라 붉은색 라이신-고정 테트라메틸로다민-덱스트란이 녹색을 띄는 미세혈관 주변으로 분포되는 것을 관찰할 수 있었다(도 5).

<실험예 4> 제브라피쉬 AKAP12(alpha 및 beta form)이 넉다운된 제브라피쉬의 혈관 결함 조사

본 발명자들은 혈관의 내피세포에 선택적으로 녹색형광이 발현되는 tg(fli:egfp)라는 유전자전환 제브라피쉬를 이용하여 제브라피쉬 AKAP12 알파 및 베타 형태를 각각 넉다운시킨 경우, 혈관의 결함 양상을 관찰하였다. 구체적으로, 유전자전환 제브라피쉬(fli:egfp) 배아에 제브라피쉬의 AKAP12 알파 형태에 대한 모르폴리노 및 AKAP12 베타 형태에 대한 모르폴리노를 각각 2ng(알파) 및 7.5ng(베타) 미세주사하여 제브라피쉬의 AKAP12 알파 및 베타 형태를 넉다운시킨 후, 48 ~ 60시간 사이에 제브라피쉬의 총기본정맥(common cardinal vein)을 통하여 붉은색 형광을 나타내는 라이신-고정 테트라메틸로다민-덱스트란(lysine-fixable tetramethylrhodamine-dextran)[로다민-덱스트란(rhodami ne-dextran), 2000kDa, 25mg/ml, 분자 프로브(Molecular Probes)]을 미세주사하여 LSM 510 META NLO 공초점현미경(confocal microscope)(Carl Zeiss, Germany)를 통해 관찰하였다.

그 결과, 모르폴리노를 주사하지 않은 정상적인 제브라피쉬의 경우 붉은색 라이신-고정 테트라메틸로다민-덱스트란이 혈관 내에 머무르는 것이 관찰된 반면, akap12 알파 형태에 대한 모르폴리노를 주사한 제브라피쉬의 경우는 뇌의 미세혈관의 형태가 일정한 형태를 나타내지 않았을 뿐만 아니라 붉은색 라이신-고정 테트라메틸로다민-덱스트란이 녹색을 띄는 혈관 밖으로 새는 것을 관찰할 수 있었다(도 6).

<실험예 5> 제브라피쉬 AKAP12(alpha 및 beta form)이 넉다운된 제브라피쉬의 혈관 내피 세포의 움직임 조사

본 발명자들은, 상기 혈관 결함이 있는 부위의 혈관 내피 세포를 상기 <실험예 4>와 같은 방법으로 유전자전환 제브라피쉬(fli:egfp)를 이용하여 관찰한 결과, 정상적인 혈관과 비교해 AKAP12 알파 및 베타 형태가 녹다운된 제브라피쉬의 혈관 내피 세포는 세포간의 접촉이 느슨하고 그 움직임 또한 활발한 것을 관찰할 수 있었다(도 7).

또한, 상기 AKAP12가 넉다운된 제브라피쉬의 혈관 내피세포의 활발한 움직임이 small GTPase 단백질 중 하나인 RhoA와 관련이 있는지 알아보기 위해, AKAP12 가 녹다운된 제브라피쉬가 수정된지 44시간 후 RhoA 신호 억제제(signal inhibitor)인 ROCKOUT(CALBIOCHEM)을 200 uM 처리한 결과, 혈관 내피 세포의 과도한 움직임이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다(도 8).

또한, 상기 결과를 콜라게나제(collagenase)를 이용하여 사람 제대 정맥(human umbilical cord vein)에서 분리한(카톨릭 대학교 의과대학, 한국) HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells)을 이용하여 시험관내(in vitro)에서 확인하였다. 구체적으로, 세포주에서 AKAP12 알파 및 베타를 동시에 녹다운시킬 수 있는 siRNA를 이용하여 HUVEC에서 AKAP12를 녹다운시킨 후, RhoA-GTP 결합 분석(binding assay)를 통해 분석한 결과, AKAP12가 녹다운된 HUVEC에서 RhoA의 활성 형태(active form)인 GTP-RhoA가 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 9).

또한, 시험관내에서 HUVEC을 이용하여 투과성 분석(permeability assay)를 시행한 결과(상기 투과적 분석법은 type I collagen-coated transwell units (6.5 mm diameter, 3.0 m pore size polycarbonate filter; Costar, Cambridge, MA)을 이용하여 상부 챔버(upper chamber)에 0.1 mg/ml Rhodamine B isothiocyanate (RITC)-labeled dextran(molecular weight, 10,000)을 처리함으로서 세포 사이을 투과하는 정도를 통해 측정되었다. ROCKOUT 처리시, 약물처리 후에 15분간 인큐베이션(incubation) 과정을 거치고 50 ml PBS로 희석된 하부 구획(lower compartment)으로부터 분광광도계(spectrophotometer)(Spectra MAX Gemini XS; Molecular device, USA)를 이용하여 형광정도를 측정하였다.), AKAP12 siRNA를 처리한 군(AKAP12ab)에서 대조군(control siRNA, sc)에 비해 RITC의 투과성이 증가되는 것을 확인할 수 있었으며, ROCKOUT 처리시 투과성 정도가 낮아지는 것을 확인할 수 있었다(도 10).

또한, AKAP12가 녹다운된 제브라피쉬에서 혈관 내피세포 간에 접촉이 느슨해지는 것이 세포간 결합 단백질의 결함에 의한 것인지 알아보기 위해, siRNA를 이용하여 AKAP12 유전자를 녹다운시켰을 때 세포막에서 결합단백질 중 하나인 ve-카드헤린(ve-cadherin)의 발현이 감소되는 것을 웨스턴블랏(western-blot)과 면역세포화학(immunocytochemistry)을 통하여 확인하였다.

구체적으로, 웨스턴블랏의 경우, 먼저 10 mM HEPES (pH 7.9), 400 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 5 % 글리세롤, 1 mM DTT(DL-dithiothreitol) 및 프로테제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail)가 포함된 용해 완충용액(lysis buffer)으로 세포를 용해시킨 후, BCA를 이용하여 세포 내 단백질을 정량하였다. 이렇게 만들어진 전체 세포 용해물(Whole cell lysate)을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 세포 내의 단백질을 분자량 사이즈 별로 분리한 뒤 폴리비닐디플루오라이드 막(polyvinyldifluoride membrane)(Millipore)에 단백질을 이동시켰다. 그런 다음, 블라킹(blocking) 과정을 거치고 막에 1차 항체를 4℃에서 하룻밤(16시간)동안 처리하였다. 다음날 각 1차 항체에 대한 2차 항체를 상온에서 2시간 처리한 뒤 ECL PLUS(Amersham)를 이용하여 검출하였다. 이때 1차 항체로 VE-cadherin (Santa Cruz Biotechnology); F-actin (Sigma)이 사용되었다.

면역세포화학의 경우, 먼저 0.1% 젤라틴(gelatin)이 코팅된 슬라이드에 세포를 시딩(seeding)한 후, 차가운 PBS로 세척하고 4% 파라포름알데하이(paraformaldehyde)로 상온에서 10분간 고정시켰다. 그런 다음, 다시 PBS로 3번 세척하고 0.5% Triton X-100을 5분간 처리한 다음, PBS-T로 세척하고 0.1% 블라킹 용액(blocking solution)(Roche)으로 상온에서 30분간 블라킹하였다. 블라킹 과정 후에 1차 항체를 4℃에서 16시간 동안 처리하고, 다음날 각 1차 항체에 대한 2차 형광 항체를 상온에서 2시간 처리한 다음, 세척 후 DAPI 염색과정을 거친 다음, 마운팅(mounting)을 하여 세포를 Zeiss LSM510 meta MLO confocal 현미경(Zeiss, Oberkochen, Germany;KBSI, chuncheon center)으로 관찰하였다. 이때 1차 항체로는 VE-cadherin(Santa Cruz Biotechnology); F-actin (Sigma)이 사용되었다.

그 결과, AKAP12에 대한 siRNA와 ROCTOUT을 같이 처리했을 때 ve-카드헤린의 발현이 회복되는 것을 확인할 수 있었다(도 11).

<실험예 6> 제브라피쉬 AKAP12(alpha 및 beta form)이 넉다운된 제브라피쉬의 심장 결함 조사

본 발명자들은 심근의 가변사슬(light chain)에 녹색 형광이 특이적으로 발현되는 tg(cmlc:egfp)라는 유전자전환 제브라피쉬를 이용하여 제브라피쉬 akap12 알파형태를 넉다운시킨 후 제브라피쉬의 심장 결함을 관찰하였다. 유전자전환 제브라피쉬(cmlc:egfp) 배아에 제브라피쉬의 akap12 알파 형태에 대한 모르폴리노를 3.7ng 미세주사하여 제브라피쉬의 akap12 알파 형태을 넉다운시킨 뒤 1.5일 후에 제브라피쉬의 심장을 LSM 510 META NLO 공초점 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 통해 관찰하였다.

그 결과, akap12 알파 형태에 대한 모르폴리노를 주사한 제브라피쉬의 경우, 심방과 심실이 정상보다 길쭉하고 심방이 왼편에 심실이 오른편에 위치한 정상적인 제브라피쉬의 심장과 다르게 심방과 심실이 일직선상에 위치한 모습을 나타내었으며 심장박동도 일정한 리듬을 띄지 않고 불규칙적인 약한 박동을 나타내었다(도 12). 그리고 결함이 심할 경우 혈액 순환의 역할도 수행하지 못하는 것으로 관찰되었다.

<실험예 7> 제브라피쉬 AKAP12(alpha 및 beta form)이 넉다운된 제브라피쉬의 출혈(hemorrhage) 조사

본 발명자들은 제브라피쉬 akap12 알파 형태 및 베타 형태가 넉다운된 성숙한 제브라피쉬의 배아를 관찰한 결과, 2일 ~ 3일된 제브라피쉬에서 출혈이 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. 상기 출혈은 제브라피쉬의 뇌실, 망막, 심장 및 몸통에서 전반적으로 관찰되었으며 통계적으로 제브라피쉬의 akap12 알파 형태에 대한 모르폴리노를 1ng, 2ng 및 3ng 순차적으로 주사할 경우 모르폴리노의 양이 늘어날수록 출혈이 일어난 제브라피쉬의 비율이 늘어나는 것을 관찰할 수 있었으며 제브라피쉬의 akap12 알파 형태 및 베타 형태에 대한 모르폴리노를 주입한 후 2일 ~ 3일 후를 관찰했을 때 3일째가 출혈이 일어난 제브라피쉬의 비율이 늘어난 것을 확인할 수 있었다. 3일 후 관찰한 것을 기준으로 보았을 때, 제브라피쉬의 akap12 알파 형태에 대한 모르폴리노 3ng 주입시 출혈이 일어난 제브라피쉬의 수는 전체의 약 50%, 제브라피쉬의 akap12 베타 형태에 대한 모르폴리노 7.5ng 주입시에는 약 27%의 제브라피쉬가 출혈이 일어난 것을 관찰할 수 있었다(도 13, 도 14 및 도 15).

본 발명자들은 상기 관찰된 출혈이 있는 제브라피쉬의 뇌 혈관 패턴을 관찰하였다. 혈관 패턴을 관찰하기 위해 tg(fli:egfp) 유전자전환 제브라피쉬 배아에 제브라피쉬의 akap12 알파 형태에 대한 모르폴리노를 미량주사한 뒤 3일 뒤 출혈이 일어난 군과 안 일어난 군으로 제브라피쉬를 나눈 뒤 LSM 510 META NLO 공초점 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 통해 뇌 혈관을 관찰하였다.

그 결과, 출혈이 안 일어난 군의 경우, 모르폴리노를 주사하지 않은 정상적인 제브라피쉬의 뇌혈관과 다르게 뇌혈관 패턴이 굴곡이 일어난 불규칙적인 양상을 나타내었지만 혈관의 형성자체는 이루어진 반면, 출혈이 일어난 군의 경우는 뇌혈관의 불규칙적인 패턴양상과 함께 뇌혈관 형성 자체도 가늘거나 퇴화(regression)되는 것을 확인할 수 있었다(도 16).

<실험예 8> 모르폴리노(morpholino) 농도에 따른 제브라피쉬의 결함 양상 조사

본 발명자들은 제브라피쉬의 akap12 알파 형태 및 베타 형태에 대한 모르폴리노를 이용하여 akap12 알파 형태 mRNA 및 베타 형태 mRNA를 넉다운시킨 경우, 각각의 모르폴리노의 양에 따른 결함 양상을 관찰하였다.

그 결과, 제브라피쉬의 akap12 알파 형태에 대한 모르폴리노 처리시 1ng 및 2ng 까지는 출혈만 일어나다가 3ng 및 4ng까지는 출혈과 심장 및 몸통의 혈관 결함이 동시에 일어나며 4ng부터는 심장과 다른 혈관의 결함이 심해 혈액의 순환이 원할하지 못해 출혈이 일어나는 정도가 줄어드는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 제브라피쉬의 akap12 베타 형태에 대한 모르폴리노 처리시에는 7.5ng 및 8ng 처리시에는 출혈과 심장 및 몸통의 혈관 결함이 동시에 일어나며 9ng이상에서는 심장 및 몸통의 혈관 결함만 일어나는 것을 관찰할 수 있었다(도 17).

<실험예 9> 제브라피쉬 AKAP12(alpha 및 beta form)이 넉다운된 제브라피쉬의 AKAP12 알파 및 베타 형태 mRNA에 의한 구조(rescue) 실험

본 발명자들은 상기 형태 및 출혈 결함이 AKAP12 특이적인 넉다운에 의한 것인지 확인하기 위해, 제브라피쉬 AKAP12 알파 및 베타 형태의 mRNA를 이용하여 구조 실험을 시행하였다. 구체적으로, 제브라피쉬의 AKAP12 알파 및 베타 형태에 대한 각각의 모르폴리노와 제브라피쉬 AKAP12 알파 및 베타 형태의 mRNA를 제브라피쉬 배아에 함께 미세주입한 후, 상기 <실험예 2> 및 <실험예 7>과 같이 발생 및 출혈 변화를 확인하였다.

그 결과, AKAP12 알파 및 베타 형태에 대한 모르폴리노만 미세주입한 대조군은 몸통이 휘고 출혈이 나는 결함 양상을 보이는 반면에, 제브라피쉬 AKAP12 알파 및 베타 형태의 mRNA와 모르폴리노를 함께 미세주입한 실험군에서는 몸통의 결함 및 출혈 양상이 회복된 제브라피쉬의 비율이 늘어나는 것을 확인할 수 있었다(도 18).

<실험예 10> 제브라피쉬 AKAP12(alpha 및 beta form)이 넉다운된 제브라피쉬의 랫트(rat) AKAP12 알파 형태 mRNA에 의한 구조 실험

본 발명자들은 상기 <실험예 1> 내지 <실험예 5>에서 관찰된 결함이 akap12 특이적인 넉다운에 의한 것인지 확인하기 위해 랫트(rat) akap12 mRNA를 이용하여 레스큐(rescue) 실험을 수행하였다. 제브라피쉬의 akap12 알파 형태에 대한 모르폴리노 4ng과 랫트 akap12 알파 형태의 mRNA 50pg 및 100pg을 각각 섞은 뒤 제브라피쉬 배아에 미량주사한 후 관찰하였다.

그 결과, akap12 알파 형태에 대한 모르폴리노 4ng만 주사한 대조군은 상기 관찰된 꼬리가 휘고 짧고 심장이 기형적으로 나타나는 결함 양상을 보이는 반면에 랫트 akap12 알파 형태의 mRNA를 같이 섞어 미량주사한 실험군에서는 mRNA의 양이 늘어날수록 꼬리와 심장의 결함 양상이 회복된 제브라피쉬의 비율이 늘어나는 것을 확인할 수 있었다(도 19).

상기에서 살펴본 바와 같이, AKAP12는 순환기적 결함 예방 및 치료용 조성물, 발생학적 결함 예방 및 치료제, 및 출혈 저해제로 유용하게 사용할 수 있으며, AKAP12 결핍 돌연변이 제브라피쉬는 순환기적 결함 또는 발생학적 결함의 예방 및 치료제를 스크리닝하기 위한 효과적인 동물 모델로서 유용하게 사용될 수 있다.