DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention concerne une nouvelle utilisation thérapeutique de composés thérapeutiques connus, seuls ou en combinaison avec d’autres agents actifs, pour traiter l’infection virale par le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère SARS-CoV-2, autrement désignée maladie à coronavirus 2019 (COVID-19).

ETAT DE LA TECHNIQUE

Les infections respiratoires aigües (IRA) humaines représentent une des causes principales de consultations, d’hospitalisations et de décès dans le monde, en étant notamment la première cause de mortalité chez les jeunes enfants avec près de 2 millions de décès par an. Parmi les agents étiologiques responsables des infections respiratoires aigües, les virus occupent une place prépondérante. Ils sont en effet retrouvés dans la majorité des cas de pneumonies infantiles et sont un facteur prédisposant des pneumonies bactériennes chez l’adulte.

Les coronavirus sont des virus enveloppés, possédant une capside présentant une symétrie hélicoïdale. Ils possèdent un génome ARN simple brin, de sens positif, et sont capables d'infecter les cellules des oiseaux et des mammifères.

Les infections par les coronavirus peuvent provoquer des pathologies respiratoires associées à des symptômes similaires au rhume (provoqué notamment par les virus hCoV et OC43), aux bronchiolites (provoquées par le virus NL63) voire à des maladies plus graves telles que le syndrome respiratoire aigu sévère provoqué par le SARS-CoV ( Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus) ayant généré une épidémie en 2003, et le syndrome respiratoire du Moyen-Orient dû au MERS-CoV, ayant généré une épidémie en 2012.

Le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2, ou SARS-CoV-2, est le coronavirus à l'origine de l’épidémie de coronavirus de 2019-2020, générant la forme de pneumonie dénommée maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). Cette épidémie a été déclarée « urgence de santé publique de portée internationale » par l'Organisation mondiale de la santé (OMS) le 30 janvier 2020. Le premier patient a été signalé pour la première fois dans la ville de Wuhan (province de Hubei, république populaire de Chine). Au 9 mars 2020, 111 321 cas avaient été confirmés dans le monde, dont 3 892 décès dans 109 pays. Apparenté au virus SARS-CoV, le virus SARS-CoV-2 appartient à l'espèce Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus, dans le genre Betacoronavirus et la famille Coronaviridae (Gorbalenya ét al., 2020). La morphologie des virions est typique de celle des coronavirus, avec notamment le halo de protubérances protéiques (" Spike ") qui leur a donné leur nom de "virus à couronne".

Son génome, constitué d'un ARN simple-brin de 29 903 nucléotides, a été séquencé pour la première fois le 5 janvier 2020 par une équipe de l'université Fudan de Shanghai (Chine). Son génome est semblable à 79,5 % avec celui de SARS-CoV et à 96 % avec celui de coronavirus de chauves-souris, ce qui laisse supposer que l'origine du virus SARS-CoV-2 est zoonotique et se trouve chez les chauves-souris (Zhou ét al., 2020).

Les symptômes de l’infection par le SARS-CoV-2 ressemblent grossièrement à ceux de la grippe saisonnière : ils incluent la fièvre, la fatigue, une toux sèche, un manque de souffle, des difficultés à respirer, la pneumonie, une insuffisance rénale, et peut aller jusqu’au décès du patient dans les cas sévères (Hui et al., 2020).

Un calcul de la létalité basé sur les chiffres fournis par les différents pays à l'OMS au sujet des infections avérées et des décès permet d’estimer le taux de mortalité à environ 2 % (données de février 2020). Néanmoins, ce taux de létalité demeure incertain, du fait de la difficulté à estimer sur le terrain le nombre de cas avérés et le nombre de décès attribuables directement à SARS-CoV-2. Il est en effet à noter que d’après l’OMS, la plupart des patients décédés avaient un système immunitaire affaibli dû à d’autres problèmes de santé tels que l'hypertension, le diabète ou une maladie cardiovasculaire.

La période d'incubation de SARS-CoV-2 est estimée entre 2 et 14 jours, mais la période d'incubation serait plus longue dans certains cas, jusqu'à 24 jours.

Aucun traitement antiviral spécifique, ni vaccin n'est actuellement disponible pour la prévention et/ou le traitement de l'infection virale à SARS-CoV-2.

La majorité des traitements reçus actuellement par les patients infectés par ce virus visent essentiellement à l'atténuation des symptômes de fièvre, toux et dyspnée, afin de favoriser leur guérison spontanée.

Des composés antiviraux, connus pour leurs activités thérapeutiques sur d’autres types de virus, sont actuellement testés en essais cliniques de phase 2 et 3. Il s’agit notamment de composés inhibiteurs de protéases cellulaires ou virales, et d’analogues de nucléosides. Ces différents composés thérapeutiques sont notamment le Remdesivir, le Galidesivir, le Lopinavir, le Camostat mésilate et la Chloroquine. Remdesivir

Le Remdesivir est un composé antiviral à large spectre, agissant en tant qu’analogue de nucléoside, plus particulièrement analogue de l’adenosine. Disponible sous forme de lyophilisât, ce composé est administré par voie intraveineuse. Il est métabolisé en sa forme active (GS-441524) d’analogue de nucléotide : sa présence induit en erreur la polymérase virale et cause une réduction de la synthèse d’ARN viral.

Le Remdesivir a été développé par la société Gilead Science pour le traitement des infections par les virus Ebola et Marburg. Il présente également une activité antivirale contre d’autres virus à ARN simple brin tels que les virus Nipah, Hendra, Lassa, le virus respiratoire syncytial (VRS) et les coronavirus SARS et MERS, en modèles précliniques (Lo et al., 2017).

En clinique, le Remdesivir a été étudié pour l’instant chez des volontaires sains et chez des patients infectés par le virus Ebola. Les traitements prescrits à quelques patients infectés par le SARS-CoV-2 n’ont pas fourni d’informations quant à l’inocuité et/ou l’efficacité dans le traitement de l'infection au SARS-CoV-2. En outre, compte tenu de l'expérience clinique limitée, le profil de toxicité et donc de sécurité de ce composé n’est pas caractérisé à ce stade. Le Remdesivir n’a pas encore reçu d’autorisation de mise sur le marché.

Dans ce contexte, Gilead a fourni le Remdesivir à la Chine pour l’évaluer dans plusieurs essais cliniques incluant des patients infectés par le SARS-CoV-2 (ayant ou non des symptômes). Gilead a annoncé le 26 février 2020 la mise en œuvre de deux essais cliniques de phase 3 pour tester ce composé.

Galidesivir

Le Galidesivir (BCX4430) est un analogue de nucléoside, en particulier de l’adénosine, développé par la société BioCryst Pharmaceuticals.

Ce composé antiviral a été initialement développé pour être utilisé contre le virus de l'hépatite C, puis par la suite contre les filovirus tels que le virus Ebola et le virus Marburg. Le Galidesivir protège contre la maladie à virus Ebola et celle à virus Marburg chez les rongeurs et les singes, lorsqu'il est administré jusqu'à 48 h après l'exposition au virus. Son développement pour une utilisation chez l'homme a été accéléré afin de combler l'absence de traitements disponibles pour lutter contre l'épidémie de maladie à virus Ebola en Afrique de l'Ouest.

Ce composé possède une activité antivirale à large spectre contre un ensemble d'autres familles de virus à ARN, comme les bunyavirus, les arénavirus, les paramyxovirus, les coronavirus et les flavivirus. Le Molnupiravir

Le Molnupiravir (également désigné par les abbréviations EIDD-2801 et MK-4482) est un composé antiviral qui présente l’avantage d’être sous une forme adaptée pour une administration par voie orale.

Ce composé est un pro-médicament qui est métabolisé après ingestion en de la N4- hydroxycytidine, dérivé nucléosidique qui inhibe les virus à ARN en introduisant des erreurs de réplication de l'ARN par l'ARN polymérase ARN-dépendante virale.

Ce composé a été testé pour son activité anti-influenza. Il présente également une certaine activité contre des coronavirus tels que les SARS-CoV, MERS-CoV et SARS-CoV-2, responsables respectivement des maladies dites SRAS, MERS et COVID-19. (Painter et al., 2021 ); (Sheahan et al., 2020).

Lopinavir

Le Lopinavir est un inhibiteur de protéase virale, utilisé comme antiviral contre le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Il est commercialisé en association avec le Ritonavir par les laboratoires Abbott, essentiellement sous la dénomination Kaletra.

Le Lopinavir agit en inhibant la production de protéines et enzymes fonctionnelles par les nouveaux virions, ce qui bloque la propagation du virus.

Chez l'Homme, le Lopinavir est rapidement dégradé dans l'organisme par le système du cytochrome P450. C'est la raison pour laquelle il n'est administré qu'en association fixe avec le Ritonavir. Ce second médicament, qui est également un inhibiteur de protéase, a pour fonction d'inhiber les monooxygénases du cytochrome P450, et donc de ralentir la dégradation du Lopinavir par ces enzymes. Ceci permet de réduire sensiblement la dose nécessaire, et donc le nombre de comprimés devant être absorbés par le patient.

Une étude publiée en 2004 a montré que l'association Lopinavir/Ritonavir représentait un "bénéfice clinique substantiel" pour des patients atteints du SARS (Chu et al., 2004).

En ce qui concerne le traitement du SARS-CoV-2, l'hôpital Jinyintan de Wuhan, où les 41 premiers patients confirmés de la maladie COVID-19 ont été traités, a débuté un essai contrôlé randomisé avec cette combinaison de médicaments anti-VIH.

Camostat mésilate Le mésilate de camostat ou Camostat mésilate (FOY-305) est un inhibiteur synthétique de protéase de faible poids moléculaire. Il est capable d'inhiber la trypsine, la prostasine, la matriptase et la kallikréine plasmatique. Ce composé est utilisé en thérapie pour traiter l’inflammation chronique du pancréas. En outre, ce composé atténue la fonction des canaux sodium épithéliaux des voies respiratoires, et améliore la clairance mucociliaire.

Les comprimés de mésilate de camostat sont approuvés au Japon et distribués sous la marque FOI PAN®. Ils sont utilisés pour le traitement de la rémission des symptômes aigus de la pancréatite chronique et de l'œsophagite par reflux postopératoire.

Le brevet EP 2 435 064 propose de cibler les sérine protéases HAT et TMPRSS2 pour le traitement des infections virales, notamment par les virus Influenza.

Récemment, il a été montré que le Camostat mésilate inhibe la serine protéase transmembranaire 2 TMPRSS2 du SARS-CoV-2, enzyme nécessaire à la multiplication du virus (Hoffmann et al., 2020).

Chloroquine

La Chloroquine, initialement connue pour son activité antipaludique, possède une action antivirale sur le SARS-CoV selon des données obtenues in vitro (Vincent ét al., 2005).

Des études publiées récemment ont décrit une apparente efficacité du phosphate de Chloroquine dans le traitement du virus SARS-CoV-2. (Wang et al., 2020 ; Gao et al., 2020)

Ainsi, un consensus d'experts chinois recommande désormais d'inclure le phosphate de Chloroquine dans le traitement des patients, à raison de 500 mg deux fois par jour pendant 10 jours pour les patients diagnostiqués comme des cas légers, modérés et sévères de maladie, et sans contre-indication à la Chloroquine.

Les données cliniques sont cependant encore limitées.

De nouveaux composés antiviraux sont recherchés activement pour le traitement et la prévention contre ce virus émergent SARS-CoV-2.

Parmi les nouveaux composés antiviraux identifiés ces dernières années, on citera notamment le Diltiazem, qui est un composé actif qui agit sur la cellule hôte du virus plutôt que directement sur le virus, permettant ainsi d’avoir un large spectre d'action et de pouvoir traiter différentes infections virales. La demande internationale WO 87/07508 décrit l’utilisation du Diltiazem pour le traitement d'infections virales liées au cytomégalovirus ou à l’herpès.

La demande internationale WO 2011/066657 décrit l'utilisation du Diltiazem pour le traitement ou la prévention d’infections virales telles que l'herpès buccal, l’herpès génital et le zona.

La demande internationale WO 2016/146836 décrit l’utilisation du Diltiazem pour traiter les infections par les virus influenza.

L'article de (Fujioka et al., 2018) enseigne que le Diltiazem, connu pour son rôle d’agent inhibiteur du transport des ions Ca2+, a également une action d’inhibiteur de l’infection cellulaire par le virus Influenza A.

La demande internationale WO 2019/224489 expose en détails certains des effets biologiques du Diltiazem, qui induit l’expression des gènes codant pour les interférons de type III dans les cellules de l’épithélium respiratoire et de l’épithélium intestinal. Le Diltiazem a ainsi été proposé pour diverses applications thérapeutiques, notamment pour le traitement des infections respiratoires virales et bactériennes dans les épithéliums respiratoires et intestinaux.

De même que le Diltiazem, la Berbérine est un composé actif connu susceptible de présenter une activité antivirale.

La Berbérine est un alcaloïde de l'isoquinoléine produit par certains végétaux, notamment par l'espèce Berberi, qui est très utilisé dans la pharmacopée asiatique.

Des études menées in vitro et en modèle murin ont montré que la Berbérine agit sur diverses voies cellulaires, et posséderait des propriétés antibactérienne, antifongique, antivirale, anti inflammatoire et métaboliques, améliorant l'hyperglycémie, le diabète de type 2, ainsi que les hyperlipidémies. (Mohan et al., 2017)

La Berbérine est notamment active pour lutter contre l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP), une maladie diffuse du remodelage microvasculaire pulmonaire accompagnée d'une prolifération maligne de cellules musculaires lisses de l'artère pulmonaire, qui provoque une élévation persistante de la pression artérielle pulmonaire conduisant à l'hypertrophie ventriculaire droite (HVD).

La Berbérine est aussi dotée d'excellentes propriétés anti-inflammatoires, en réduisant le gonflement articulaire, l'infiltration des tissus et leur destruction par des cellules inflammatoires. La Berbérine régule la polarisation des macrophages, diminue la fonction phagocytaire des macrophages, réduit les taux de cytokines M1 et augmente les niveaux de cytokines M2 (IL-10 et facteur de croissance transformant-bΐou TGF- b1). La Berbérine possède un large spectre antibactérien, notamment contre l'infection par Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (SARM). Lorsqu'elle est appliquée in vitro et en association avec la méthoxyhydnocarpine, la Berbérine inhibe la croissance de Staphylococcus aureus.

La Berbérine présente une activité antivirale sur différents virus, notamment :

- sur le virus de l’herpès HSV (Song ét al. 2014)

- sur les virus influenza (Wu et al. 2011 )

- sur le cytomégalovirus (HCMV) : de faibles concentrations (micromolaires) de Berbérine inhibent la réplication de différentes souches de HCMV, y compris des isolats cliniques et des souches résistantes aux inhibiteurs approuvés de l'ADN polymérase, en interférant avec l'activité transactivante de la protéine virale Immédiate Early-2 (IE2) (Luganini et al., 2019)

- sur le virus de l’Hépatite C (VHC) : la Berbérine inhiberait l'entrée du VHC dans les cellules (Ting-Chun Hung et al., 2019)

- sur le virus Zika (ZIKV) : la Berbérine et l'émodine se sont révélées particulièrement efficaces contre l'entrée et la réplication de plusieurs virus, déclenchant notamment un effet virucide puissant sur le ZIKV (Batista et al. 2019).

En ce qui concerne les coronavirus :

- la Berbérine pourrait présenter une action antivirale contre le SARS-CoV (WO 2013/185126), bien qu’aucune donnée expérimentale ne soit présentée ; et

- la Berbérine a une action antivirale contre le MERS-CoV (WO 2018/073549).

Dans le cadre de la présente invention, plusieurs composés ont été sélectionnés et évalués dans un test cellulaire d'infection virale ainsi que sur un modèle d’épithélium respiratoire humain cultivé in vitro à l’interface air/liquide. Certains de ces composés, seuls ou en combinaison, ont présenté un effet antiviral sur le coronavirus SARS-CoV-2, de manière tout à fait inattendue.

Les composés sélectionnés avaient été décrits préalablement pour d’autres applications thérapeutiques. De façon surprenante, il a maintenant été montré que ces composés, seuls ou en combinaison, ont une activité antivirale contre le SARS-CoV-2, et permettent le traitement et/ou la prévention de l’infection par ce coronavirus.

En particulier, les thérapies de combinaison basées sur l’association d’au moins deux composés antiviraux semblent particulièrement efficaces pour le traitement et/ou la prévention de l’infection par le coronavirus SARS-CoV-2. EXPOSE DE L'INVENTION

La présente invention concerne un composé choisi parmi le Diltiazem, la Berbérine et leur combinaison, pour son utilisation thérapeutique dans le traitement de l’infection virale par le virus SARS-CoV-2 (dite maladie COVID-19).

En particulier, la présente invention concerne le Diltiazem pour son utilisation thérapeutique dans la prévention et/ou le traitement de l’infection virale par le virus SARS-CoV-2, dite maladie COVID-19.

De plus, la présente invention est relative à une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule pharmaceutique adapté, au moins un composé choisi parmi le Diltiazem et la Berbérine, pour son utilisation thérapeutique dans le traitement de l’infection virale par le virus SARS-CoV-2 (dite maladie COVID-19).

La présente invention est aussi relative à une composition pharmaceutique comprenant du Diltiazem dans un véhicule pharmaceutique adapté, pour son utilisation thérapeutique dans la prévention et/ou le traitement de l’infection virale par le virus SARS-CoV-2.

La présente invention concerne également une composition pour son utilisation telle que décrite ci-dessus, comprenant au moins un autre agent actif choisi parmi :

- un analogue de nucléoside ;

- un inhibiteur de protéase(s) virale(s) ;

- un inhibiteur de sérine protéase transmembranaire ;

- de la Chloroquine, et

- tout mélange des composés précités.

Parmi les analogues de nucléoside, les composés préférés sont le Remdesivir, le Galidesivir, le Molnupiravir et leurs combinaisons.

Parmi les inhibiteurs de protéase(s) virale(s), le composé préféré est le Lopinavir, et plus préférentiellement le Lopinavir associé au Ritonavir.

Parmi les inhibiteurs de sérine protéase transmembranaire, le composé préféré est le Camostat mésilate.

La présente invention est également relative à un produit de combinaison comprenant au moins un composé choisi parmi le Diltiazem et la Berbérine, et au moins un autre agent actif choisi parmi :

- un analogue de nucléoside ;

- un inhibiteur de protéase(s) virale(s) ;

- un inhibiteur de sérine protéase transmembranaire ; - de la Chloroquine, et

- tout mélange des composés précités, pour son utilisation simultanée, séparée ou séquentielle dans la prévention et/ou le traitement d'une infection virale par le virus SARS-CoV-2.

La présente invention est également relative à un produit de combinaison comprenant du Diltiazem et au moins un autre agent actif choisi parmi :

- un analogue de nucléoside ;

- un inhibiteur de protéase(s) virale(s) ; un inhibiteur de sérine protéase transmembranaire ;

- de la Chloroquine, et

- tout mélange des composés précités, pour son utilisation simultanée, séparée ou séquentielle dans la prévention et/ou le traitement d’une infection virale par le virus SARS-CoV-2.

Enfin, l’invention concerne aussi une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule pharmaceutique adapté, une combinaison de Diltiazem avec du Remdesivir ; ou une combinaison de Diltiazem avec du Molnupiravir.

DESCRIPTION DES FIGURES

La Figure 1 représente les effets antiviraux de la Berbérine et du Remdesivir en monothérapie sur des cellules Vero E6 en culture infectées par le virus SARS-CoV-2.

Figure 1A : chronogramme de l'expérience.

Figure 1 B : Courbes d’effet-dose des molécules Berbérine et Remdesivir en monothérapie et détermination des IC50 associées à 48 et 72 heures post-infection (hpi). Le Remdesivir et la Berbérine présentent un effet antiviral à 48 hpi, avec une IC50 déterminée à 0,98 et 17,47 mM, respectivement. Cet effet antiviral est encore plus prononcé à 72 hpi avec des IC50 inférieures à 0,72 et 5,60 mM pour le Remdesivir et la Berbérine, respectivement.

La Figure 2 représente les effets antiviraux des combinaisons Diltiazem/Remdesivir, Berberine/Remdesivir sur des cellules Vero E6 en culture infectées par le virus SARS-CoV-2.

Figure 2A : chronogramme de l'expérience.

Figure 2B : Courbes d’effet-dose des combinaisons Diltiazem/Remdesivir et Berberine/Remdesivir, et détermination des IC50 associées à 48 et/ou 72 heures post infection (hpi). La combinaison d'un traitement par le Remdesivir en présence d'une concentration fixe de Diltiazem (11.5 pM), permet d’obtenir une efficacité antivirale avec une IC50 de 0.32 mM, à 48hpi. De manière équivalente, la combinaison d’un traitement par le Diltiazem en présence d’une concentration fixe de Remdesivir (2.5 mM), permet d'avoir une efficacité antivirale avec une IC50 de 0.55 mM, à 48hpi. Par ailleurs, la combinaison d’un traitement par le Remdesivir en présence d’une concentration fixe de Berbérine (12.5 pM), permet d’avoir une efficacité antivirale avec une IC50 de 0.65 pM, à 48 hpi. A un stade plus avancé de l’infection (72hpi), la combinaison d'un traitement par le Remdesivir en présence d'une concentration fixe de Diltiazem (11 .5 mM), permet d'obtenir une efficacité antivirale avec une IC50 de 0.35 pM.

La Figure 3 permet d’illustrer certains des résultats présentés dans les Figures 1 B et 2B de manière visuelle.

Figure 3A : chronogramme de l'expérience.

Figure 3B : Observation en microscopie photonique de l'effet antiviral du Remdesivir et du Diltiazem en monothérapie et en combinaison sur un tapis de cellules Vero E6 en culture, et infectées par le SARS-CoV-2. Dans les mêmes conditions expérimentales que précédemment (Fig. 2), la combinaison Remdesivir (0.625 pM) et Diltiazem (11.5 pM) permet de réduire de manière très visible les effets cytopathiques de l'infection (cellules arrondies et détachées du tapis) en comparaison du contrôle non traité, et des traitements en monothérapie.

Figure 4 : chronogramme des expériences de l’exemple 3.

Figure 5. Chronogramme de l’expérience de l'exemple 4. Les cellules A549-ACE2 sont ensemencées puis infectées avec une souche virale de SARS-CoV-2, avant d’être traitées 1 h post-infection avec du Diltiazem ou du Remdesivir.

Figure 6. (A) Cellules A549-ACE2 infectées à un taux de MOI de 10 ¹ ; (B) Cellules A549-ACE2 infectées à un taux de MOI de 10 ²

Les cellules ont été non traitées (courbes noires) ou traitées avec du Remdesivir 5 pM (carrés gris) ou du Diltiazem 45 pM (triangles gris). Les résultats sont exprimés en pourcentage de titre viral mesuré dans le surnageant, par rapport au titre viral mesuré dans les puits des cellules non traitées, en fonction du temps post-infection virale.

Figure 7. (A). Mesure de l’IC50 du Diltiazem sur cellules A549-ACE2 infectées par une souche virale de SARS-CoV-2. Le titre viral est exprimé en pourcentage de titre viral mesuré dans le surnageant, par rapport au titre viral mesuré dans les puits des cellules non traitées, en fonction de la concentration de Diltiazem utilisée. (B). Mesure du CC50 du Diltiazem sur cellules A549-ACE2 après 72 heures de traitement. La viabilité des cellules est exprimée en pourcentage de viabilité mesurée pour les cellules non traitées. Les résultats sont présentés en fonction de la concentration de Diltiazem utilisée. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

La présente invention concerne le Diltiazem pour son utilisation thérapeutique dans la prévention et/ou le traitement de l’infection virale par le virus SARS-CoV-2, dite maladie COVID-19.

La présente invention concerne aussi une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule pharmaceutique adapté, au moins un composé choisi parmi le Diltiazem et la Berbérine, pour son utilisation thérapeutique dans le traitement de l'infection virale par le virus SARS-CoV-2 (COVID-19).

La présente invention est aussi relative à une composition pharmaceutique comprenant du Diltiazem dans un véhicule pharmaceutique adapté, pour son utilisation thérapeutique dans la prévention et/ou le traitement de l'infection virale par le virus SARS-CoV-2.

Par « infection virale par le virus SARS-CoV-2 » on désigne le fait qu'un organisme, humain ou animal, présente des cellules ayant été infectées par le coronavirus SARS-CoV-2, également désigné par l’appellation COVID-19.

Au sens de l’invention, l'expression « virus SARS-CoV-2 » désigne d’une part le coronavirus identifié pour la première fois à Wuhan en Chine, et séquencé début 2020 par une équipe de l'université Fudan de Shanghai (Zhou et al., 2020) ; et d’autre part, inclut tous les variants apparentés à cette première souche virale identifiée, apparus ultérieurement, et notamment les souches variantes SARS-CoV-2 suivantes : i. la souche « Wuhan-like » utilisée par les inventeurs, décrite dans les exemples ; ii. la souche hCoV-19/France/ARA-104350/2020 (GISAID ID : EPIJSL_683350) du lignage B.1 (cette souche possède au moins la mutation D614G dans sa protéine spike; elle est considérée aujourd'hui comme la souche sauvage circulante en Europe, par comparaison avec les variants cités ci-dessous) ; iii. une souche virale dite « variant anglais » hCoV-19/France/ARA-SC2118/2020 (ID GISAID : EPI_ISL_900512) du lignage B.1.1.7 ; iv. une souche sud-africaine (501Y.V2.HV001 ) du lignage B.1.3.5.1 et v. une souche variante brésilienne du lignage B.1 .1 .28.

Une infection virale est généralement diagnostiquée par un professionnel de santé, sur la base de l’observation des symptômes du patient infecté. Des examens biologiques complémentaires peuvent être nécessaires pour confirmer le diagnostic : analyses de sang et/ou des expectorations et/ou du liquide bronchoalvéolaire. L'infection peut notamment être établie en effectuant une détection par biologie moléculaire et/ou une titration virale à partir de prélèvements respiratoires, ou en dosant les anticorps spécifiques du SARS-CoV-2 circulants dans le sang.

La détection chez les individus infectés de ce virus spécifique est réalisée par des méthodes de diagnostic classiques, notamment de biologie moléculaire (PCR) qui permettent d’établir qu’il s’agit bien de ce virus SARS-CoV-2, bien connues de l’Homme du métier.

Le terme « traitement » désigne le fait de combattre l'infection par le coronavirus SARS-CoV- 2 dans un organisme humain ou animal. Grâce à l’administration d'au moins une composition selon l’invention, le taux d’infection virale (titre infectieux) dans l'organisme va diminuer, et de préférence le virus va disparaître complètement de l’organisme dans un délai inférieur à celui attendu pour une guérison sans traitement.

Le terme « traitement » désigne aussi le fait d’atténuer les symptômes associés à l’infection virale (syndrome respiratoire, défaillance rénale, fièvre, etc...).

Certaines compositions selon l'invention sont également destinées à une utilisation dans la prévention d’une infection par le SARS-CoV-2.

Ainsi, la présente invention concerne : une composition pharmaceutique comprenant du Diltiazem dans un véhicule pharmaceutique adapté, pour son utilisation thérapeutique dans le traitement de l’infection virale par le virus SARS-CoV-2 ; une composition pharmaceutique comprenant de la Berbérine, dans un véhicule pharmaceutique adapté, pour son utilisation thérapeutique dans le traitement de l’infection virale par le virus SARS-CoV-2 ; et une composition pharmaceutique comprenant du Diltiazem dans un véhicule pharmaceutique adapté, pour son utilisation dans la prévention de l'infection virale par le virus SARS-CoV-2.

Au sens de l’invention, le terme « prévention » désigne le fait d’empêcher, ou du moins de diminuer la probabilité d’apparition, d’une infection dans un organisme humain ou animal par le SARS-CoV-2. Grâce à l'administration d’au moins une composition selon l’invention, les cellules humaines ou animales dudit organisme deviennent moins permissives à l’infection, et sont ainsi plus à même de ne pas être infectées par ledit coronavirus, ou de développer des symptômes moins sévères lors de l'infection par ledit coronavirus.

Les compositions selon l’invention peuvent être de type pharmaceutique, destinées à être administrées à un être humain, ou de type vétérinaire, destinées à être administrés à des animaux non humains. Concernant les animaux, il est entendu que les compositions vétérinaires pour leur utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’une infection par le coronavirus SARS-CoV-2 sont destinées à être administrées à des animaux infectés par ce coronavirus.

Selon l’invention, le terme « véhicule pharmaceutique adapté » désigne des véhicules ou des excipients pharmaceutiques, qui sont des composés ne présentant pas d’action propre sur l’infection ici considérée. Ces véhicules ou excipients sont pharmaceutiquement acceptables, ce qui signifie qu’ils peuvent être administrés à un individu ou à un animal sans génération d'effets délétères significatifs.

L'expression « au moins un composé choisi parmi le Diltiazem et la Berbérine » signifie que la composition pharmaceutique comprend soit du Diltiazem, soit de la Berbérine, soit une combinaison des deux.

Selon un premier aspect, la composition pharmaceutique pour son usage selon l’invention comprend au moins une quantité efficace de Diltiazem. Cette composition pharmaceutique est destinée à un usage thérapeutique et/ou préventif contre l’infection par le virus SARS-CoV-2.

Selon un second aspect, la composition pharmaceutique pour son usage selon l'invention comprend au moins une quantité efficace de Berbérine.

Selon un troisième aspect, la composition pharmaceutique pour son usage selon l’invention comprend au moins une quantité efficace de Diltiazem et une quantité efficace de Berbérine.

Par « quantité efficace », on entend au sens de l’invention une quantité de composé actif suffisante pour inhiber la prolifération et/ou la réplication du coronavirus, et/ou le développement de l’infection virale au sein de l’organisme. Cette inhibition peut être quantifiée, par exemple en mesurant le titre viral, comme cela est présenté dans les exemples de la présente demande.

Ainsi, selon un aspect particulier de l’invention, la composition pharmaceutique pour son utilisation telle que décrite ci-dessus comprend une combinaison de Diltiazem et Berbérine.

Par « combinaison », on entend au sens de l’invention une composition comprenant au moins deux composés actifs distincts, les deux composés ayant une action antivirale.

Cette combinaison comprend soit la même quantité en poids de chaque composé antiviral, c’est-à-dire une combinaison de 50% de Diltiazem et 50% de Berbérine en poids, soit des doses non égales de chaque composé, telles que 90 % de Diltiazem et 10 % de Berbérine, 80 % de Diltiazem et 20 % de de Berbérine, 70 % de Diltiazem et 30 % de Berbérine, 60 % de Diltiazem et 40 % de Berbérine, 40 % de Diltiazem et 60 % de Berbérine, 30 % de Diltiazem et 70 % de Berbérine, 20 % de Diltiazem et 80 % de Berbérine, ou bien encore 10 % de Diltiazem et 90 % de Berbérine, les pourcentages étant exprimés en poids du composé par rapport au poids total de la combinaison. Diltiazem

Le Diltiazem est une molécule membre de la famille des benzothiazépines, référencée sous le numéro CAS 42399-41-7.

Au sens de la présente invention, est désignée par « Diltiazem » la molécule sous la forme de l’un de ses énantiomères L-cis ou D-cis, ou d’un mélange racémique des deux, ou encore un sel de Diltiazem comme par exemple l’hydrochloride de Diltiazem, dont la formule chimique développée est représentée ci-dessous, en formule (I) :

Formule I

Le Diltiazem est connu depuis plus de 30 ans et est approuvé, en Europe et aux Etats-Unis, par les autorités règlementaires du médicament. Il peut être administré sous forme d’hydrochloride de Diltiazem. Cardizem®, Cartia®, Taztia® et Dilacor® sont ses dénominations commerciales les plus courantes.

De nombreuses formulations sont disponibles, en particulier des formulations à libération prolongée. Le Diltiazem est disponible sous différentes formes galéniques, telles que sous forme de crème pour application topique, sous forme de comprimés ou capsules pour administration orale, sous forme de poudre pour préparation de solution injectable ou sous forme de préparations pharmaceutiques pour inhalation (WO 02/094238, US 4,605,552).

La posologie classique chez l’Homme est de 180 à 360 mg/jours, administrés en capsule ou comprimés, pour son utilisation thérapeutique en tant qu’inhibiteur des canaux calciques. La propriété physiologique identifiée en premier lieu de ce composé est l’inhibition des canaux calciques, et donc l’inhibition des flux de calcium intracellulaires. Le Diltiazem freine notamment l'entrée du calcium transmembranaire au niveau de la fibre musculaire myocardique et de la fibre musculaire lisse des vaisseaux. Ceci permet de diminuer la concentration intracellulaire calcique atteignant les protéines contractiles.

Chez l'homme, l’administration de Diltiazem est indiquée pour son action vasodilatatrice, dans le but de réduire le travail cardiaque. Il est ainsi utilisé dans la prise en charge des désordres cardiaques et circulatoires tels que les angines de poitrine, l’hypertension artérielle, les ischémies myocardiques et la tachycardie. Le Diltiazem agit également en renversant les effets de l’angiotensine II, du point de vue rénal et périphérique. En application topique, le Diltiazem peut être indiqué en cas de fissures anales chroniques.

Le brevet EP 1 117408 décrit l’utilisation de Diltiazem, en tant que composé inhibiteur des canaux calciques, pour traiter des pathologies liées à la dégénérescence des photorécepteurs de la rétine.

En ce qui concerne l’utilisation du Diltiazem pour le traitement des infections virales, comme précédemment évoqué, celle-ci a déjà été décrite dans plusieurs demandes de brevet. De plus, un essai clinique est en cours à ce jour (FLUNEXT PHRC #15-0442 ClinicalTrials.gov Identifier: NCT03212716), dans le but d’obtenir l’autorisation de mise sur le marché pour cette nouvelle indication thérapeutique antivirale.

Berbérine

La Berbérine est un alcaloïde naturel que l’on retrouve dans un grand nombre de végétaux, en particulier dans l’espèce Berbéri. Son numéro CAS est 633 66 9

Au sens de la présente invention, est désignée par « Berbérine » la molécule sous toutes ses formes. Sa structure chimique développée est schématisée ci-dessous : Cette molécule est largement utilisée dans la pharmacopée asiatique, pour ses propriétés antifongiques, antibactériennes et anti-inflammatoires.

Dans les cellules, la Berbérine se localise notamment dans les mitochondries où elle inhibe le complexe I de la chaîne respiratoire, diminuant ainsi la production d'ATP et l'activation subséquente de l'AMPK (Adenosine Monophosphate activated Protein Kinase). Cette enzyme ubiquitaire joue un rôle dans l'homéostasie énergétique cellulaire. L'activation de l'AMPK a principalement pour effet de (i) stimuler l’oxydation des acides gras hépatiques et la cétogenèse, (ii) inhiber la synthèse du cholestérol, la lipogénèse et la synthèse des triglycérides, (iii) stimuler l'oxydation des acides gras dans les muscles squelettiques et l’absorption du glucose par les muscles et (iv) moduler la sécrétion d'insuline par les cellules bêta du pancréas.

La biodisponibilité de la Berbérine est faible, mais cela ne présente pas de difficultés car l'action systémique de la Berbérine passe pour une part importante via soit la modification du microbiote intestinal et de ses métabolites, soit après métabolisation de la Berbérine par ce même microbiote.

La demi-vie de la Berbérine est également faible, de l'ordre de 4 heures. Cela implique que les doses quotidiennes doivent être idéalement réparties en 3 prises. Pour un adulte la dose quotidienne va généralement de 500 mg à 1500 mg.

Combinaison avec un autre agent actif

Il est entendu que la composition pour son utilisation selon l’invention comprend au moins un composé choisi parmi le Diltiazem et la Berbérine, et qu’elle peut donc également comprendre d'autres composés actifs, en sus du véhicule pharmaceutique adapté.

En effet, le Diltiazem et la Berbérine ou leur mélange, peuvent être employés en thérapie seuls, ou en combinaison avec au moins un autre agent actif.

Il peut s'agir de composés permettant d'améliorer l'activité antivirale du Diltiazem et/ou de la Berbérine, ou inversement le Diltiazem et la Berbérine peuvent agir en tant qu’agents potentialisateurs de ces autres composés actifs.

Ainsi, la présente invention concerne le Diltiazem ou la Berbérine ou leur combinaison, pour leur utilisation dans la potentialisation des effets antiviraux d’autres composés thérapeutiques utilisés pour traiter et/ou prévenir l’infection virale par le SARS-CoV-2, en particulier ceux cités dans la présente demande. Ces composés actifs supplémentaires pourront être choisis parmi les classes pharmaceutiques d’agents cités dans la demande WO 2015/157223, à savoir parmi les agents antibactériens, les agents antiparasitaires, les inhibiteurs de la neurotransmission, les inhibiteurs du récepteur aux œstrogènes, les inhibiteurs de synthèse et réplication de l’ADN, les inhibiteurs de la maturation des protéines, les inhibiteurs des voies kinase, les inhibiteurs du cytosquelette, les inhibiteurs du métabolisme des lipides, les agents anti-inflammatoires, les inhibiteurs des canaux ioniques, les inhibiteurs d’apoptose et les inhibiteurs de cathepsine.

Ainsi, selon une mise en œuvre particulière de l’invention, la composition pharmaceutique pour son utilisation telle que décrite ci-dessus comprend au moins un autre agent actif, notamment un agent antiviral.

Au sens de la présente invention, on entend par les termes « agent antiviral » ou « composé antiviral » des agents actifs qui agissent sur la charge virale (aussi dénommé titre infectieux), en inhibant soit de manière directe soit de manière indirecte la réplication et/ou la dissémination d’un virus et notamment, dans le cas présent, du coronavirus SARS-CoV-2, au sein d’un organisme infecté.

Selon un aspect particulier de l'invention, la composition pharmaceutique pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’une infection par le coronavirus SARS-CoV-2, comprend, outre du Diltiazem et/ou de la Berbérine, au moins un autre agent antiviral.

Il est entendu que cet autre agent antiviral sera utilisé aux doses nécessaires pour présenter une action antivirale, cette dose étant désignée comme étant « efficace », ce dosage pouvant être facilement déterminé par l’homme du métier.

Cette combinaison comprend soit la même quantité en poids de chaque composé antiviral, c’est-à-dire une combinaison de 50% de Diltiazem et/ou Berbérine et 50% d’un autre agent antiviral en poids, soit des doses non égales de chaque composé, telles que 90 % de Diltiazem et/ou Berbérine - 10 % de l’autre agent antiviral, 80 % - 20 %, 70 % - 30 %, 60 % - 40 %, 40 %

- 60 %, 30 % - 70 %, 20 % - 80 %, ou bien encore 10 % de Diltiazem et/ou Berbérine et 90 % d’un autre agent antiviral, les pourcentages étant exprimés en poids du composé par rapport au poids total de la combinaison.

Par « activité antivirale » ou « action antivirale », on entend soit :

- une action directe sur le virus, notamment l’action d’inhiber le cycle de réplication du virus ou sa capacité à infecter et à se reproduire dans des cellules hôtes,

- une action indirecte sur les cellules cibles dudit virus, par la modulation de l’expression de certains gènes des cellules cibles. On entend par 'cellules cibles’ des cellules infectées par le coronavirus et/ou susceptibles d’être infectées prochainement, de par leur proximité immédiate avec des cellules infectées.

Les agents antiviraux sont classifiés en différentes catégories en fonction de leur mode d'action. On peut citer notamment :

- les analogues de nucléotides ou de ribonucléosides, qui interfèrent avec ou stoppent la synthèse d'ADN ou d'ARN ;

- les inhibiteurs des enzymes impliquées dans la synthèse d’ADN ou d’ARN (hélicase, réplicase) ;

- les inhibiteurs de protéase(s) virale(s) ;

- les composés qui inhibent les étapes de maturation du virus au cours de son cycle de réplication ;

- les composés qui interfèrent avec la liaison à la membrane cellulaire, ou à l’entrée des virus dans des cellules hôtes (Inhibiteurs de fusion ou d'entrée) tels que les inhibiteurs de sérine protéase transmembranaire, notamment celles de type 2 ;

- les agents qui empêchent le virus de s'exprimer au sein de la cellule hôte après son entrée, en bloquant son désassemblage au sein de la cellule ;

- les agents qui restreignent la propagation des virus vers d’autres cellules.

Parmi ces agents antiviraux bien connus de l’Homme du métier, sont en particulier utilisés pour lutter contre des virus à ARN : les analogues de nucléoside, les inhibiteurs de protéase(s) virale(s), les inhibiteurs d’hélicase, et les inhibiteurs d’entrée cellulaire du virus dans les cellules cibles tels que les inhibiteurs de sérine protéase transmembranaire.

Au sens de l’invention, un « analogue de nucléoside » désigne un composé utilisé pour prévenir la réplication virale dans les cellules infectées, comme par exemple i’aciciovir. Ces composés ont des structures suffisamment semblables aux nucléosides pour être intégrés dans les brins d’ADN viraux en cours de réplication, mais ils agissent comme agents terminaux de chaîne et arrêtent l’action de i’ADN polymérase virale.

Un tel composé sera choisi parmi un analogue nucléosidique de la guanosine (par exemple la Ribavirine), de l’adénosine (par exemple le Remdesivir ou le Galidesivir), de la cytidine (Molnupiravir) ou de la thymidine, ou encore de leurs versions desoxy-.

Au sens de l’invention, un « inhibiteur de protéase(s) virale(s) » désigne un composé antiviral agissant en inhibant l'action d'au moins une protéase virale, protéine qui permet le clivage et l'assemblage des protéines virales, processus indispensable à l'obtention de nouveaux virions infectieux. Les virions obtenus sont alors incapables d'infecter de nouvelles cellules. Cette stratégie thérapeutique est utilisée notamment pour traiter les infections virales par le VIH (Virus de l’immunodéficience humaine). Au sens de l’invention, un « inhibiteur de sérine protéase transmembranaire » désigne un composé antiviral agissant en inhibant l’entrée du virus dans la cellule, notamment par son action au niveau de la sérine protéase transmembranaire 2 désignée par l'abréviation TMPRSS2.

Selon une mise en œuvre particulière de l’invention, la composition pour son utilisation telle que décrite ci-dessus comprend au moins un autre agent actif choisi parmi :

- un analogue de nucléoside ;

- un inhibiteur de protéase(s) virale(s) ;

- un inhibiteur de sérine protéase transmembranaire ;

- de la Chloroquine, et

- tout mélange des composés précités.

Selon une première mise en œuvre de l’invention, la combinaison comprend du Diltiazem et au moins un analogue de nucléoside.

Selon une deuxième mise en œuvre de l’invention, la combinaison comprend du Diltiazem et au moins un inhibiteur de protéase(s) virale(s).

Selon une troisième mise en œuvre de l’invention, la combinaison comprend du Diltiazem et au moins un inhibiteur de sérine protéine transmembranaire, notamment celle de type 2.

Selon une quatrième mise en œuvre de l’invention, la combinaison comprend du Diltiazem et de la Chloroquine.

Selon une cinquième mise en œuvre de l’invention, la combinaison comprend du Diltiazem et un mélange d’au moins deux composés choisis parmi :

- un analogue de nucléoside ;

- un inhibiteur de protéase(s) virale(s) ;

- un inhibiteur de sérine protéine transmembranaire, et

- de la Chloroquine.

Selon une sixième mise en œuvre de l’invention, la combinaison comprend de la Berbérine et au moins un analogue de nucléoside.

Selon une septième mise en œuvre de l’invention, la combinaison comprend de la Berbérine et au moins un inhibiteur de protéase(s) virale(s).

Selon une huitième mise en œuvre de l’invention, la combinaison comprend de la Berbérine et au moins un inhibiteur de sérine protéine transmembranaire, notamment celle de type 2. Selon une neuvième mise en œuvre de l’invention, la combinaison comprend de la Berbérine et de la Chloroquine.

Selon une dixième mise en œuvre de l’invention, la combinaison comprend de la Berbérine et un mélange d’au moins deux composés choisis parmi :

- un analogue de nucléoside ;

- un inhibiteur de protéase(s) virale(s) ;

- un inhibiteur de sérine protéine transmembranaire, et

- de la Chloroquine.

Le au moins un analogue de nucléoside pourra notamment être choisi parmi le groupe constitué de : le Remdesivir, le Galidesivir, le Molnupiravir et leurs combinaisons.

Le au moins un inhibiteur de protéase(s) virale(s) pourra être en particulier le Lopinavir, et de préférence le Lopinavir associé au Rinotavir.

Le au moins un inhibiteur de sérine protéine transmembranaire, notamment celle de type 2, pourra en particulier être le Camostat mésilate.

Selon d’autres mises en œuvre, la composition pharmaceutique pour son utilisation selon l’invention comprend ou consiste en :

- du Diltiazem et du Remdesivir ;

- du Diltiazem et du Galidesvir ;

- du Diltiazem et du Molnupiravir ;

- du Diltiazem et du Lopinavir, de préférence associé au Rinotavir ;

- du Diltiazem et du Camostat mésilate ;

- du Diltiazem et de la Chloroquine, ou bien encore

- du Diltiazem et toutes les combinaisons possibles de Remdesivir, Galidesvir, Molnupiravir, Lopinavir, Camostat mésilate et Chloroquine.

Selon d’autres mises en œuvre, la composition pharmaceutique pour son utilisation selon l’invention comprend ou consiste en :

- de la Berbérine et du Remdesivir ;

- de la Berbérine et du Galidesvir ;

- de la Berbérine et du Molnupiravir ;

- de la Berbérine et du Lopinavir, de préférence associé au Rinotavir ;

- de la Berbérine et du Camostat mésilate ;

- de la Berbérine et de la Chloroquine, ou bien encore

- de la Berbérine et toutes les combinaisons possibles de Remdesivir, Galidesvir, Molnupiravir, Lopinavir, Camostat mésilate et Chloroquine. Selon d’autres mises en œuvre, la composition pharmaceutique pour son utilisation selon l’invention comprend ou consiste en :

- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Remdesivir ;

- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Galidesvir ;

- une combinaison de Diltiazem et de Molnupiravir ;

- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Lopinavir, de préférence associé au Rinotavir ;

- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Camostat mésilate ;

- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et de la Chloroquine, ou bien encore

- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et toutes les combinaisons possibles de Remdesivir, Galidesvir, Molnupiravir, Lopinavir, Camostat mésilate et Chloroquine.

Ces combinaisons présentent des effets antiviraux synergiques, comme cela est présenté dans les exemples.

Par exemple, les résultats présentés dans le tableau 2 permettent de mettre en évidence le fait que, à 48 heures post-infection, les effets du Remdesivir sont plus importants (+68 %) en présence de Diltiazem, ainsi qu’en présence de Berbérine (+33 %).

Les résultats présentés dans le tableau 3 mettent en évidence que, sur des modèles d'épithélium nasal, 48 heures post-infection, les effets du Remdesivir sont potentialisés par la présence de Diltiazem (+ 1.3 log de réduction de production virale) ou de Berbérine (+ 0.89 log de réduction de production virale).

Selon une autre mise en œuvre de l’invention, la composition pour son utilisation thérapeutique telle que décrite ci-dessus comprend de plus au moins un antibiotique.

Un tel antibiotique sera notamment utile pour prévenir la surinfection bactérienne à l’infection virale en cours.

L'antibiotique est choisi parmi les antibiotiques bien connus de l’Homme du métier, notamment ceux utilisés lors des infections virales pour éviter la surinfection bactérienne, et notamment ceux de la famille des macrolides.

Les compositions pharmaceutiques selon la présente invention sont adaptées pour une administration nasale, orale, sublinguale, par inhalation, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, oculaire ou rectale.

Selon une mise en œuvre préférée, la composition pour son utilisation telle que décrite ci- dessus est caractérisée en ce qu’elle est sous une forme galénique adaptée pour une administration nasale, notamment intranasale, en particulier par inhalation. La voie intranasale est une voie d'administration caractérisée en ce que la composition pharmaceutique est introduite directement dans la cavité nasale du patient, par différents procédés, par exemple : gouttes, spray, ou inhalateur. L’utilisation d’un dispositif spécifique, tel qu’un dispositif de pulvérisation muqueux intranasal, est recommandée.

La voie intranasale offre la possibilité d’administrer un médicament de façon rapide, indolore et non-invasive avec une efficacité souvent comparable à celle de la voie intraveineuse. Elle est particulièrement adaptée en pédiatrie ou pour les personnes âgées, ou dans les situations de médecine d’urgence.

Selon une mise en œuvre, la composition pharmaceutique pour son utilisation telle que décrite ci-dessus est administrée par voie intranasale.

Selon une autre mise en œuvre préférée, la composition pharmaceutique pour son utilisation telle que décrite ci-dessus est administrée par inhalation.

L'inhalation désigne l'absorption par les voies respiratoires. C’est en particulier une méthode d'absorption de composés à des fins thérapeutiques, de certaines substances sous forme de gaz, de micro-gouttelettes ou de poudre en suspension.

L'administration de compositions pharmaceutiques ou vétérinaires par inhalation, c’est-à-dire par les voies nasale et/ou buccale, est bien connue de l’Homme du métier.

On distingue deux types d’administration par inhalation :

- l'administration par insufflation lorsque les compositions sont sous la forme de poudres, et

- l'administration par nébulisation lorsque les compositions sont sous la forme d'aérosols (suspensions) ou sous la forme de solutions, par exemple de solutions aqueuses, mises sous pression. L’utilisation d’un nébuliseur ou d’un pulvérisateur sera alors recommandée pour administrer la composition pharmaceutique ou vétérinaire.

La forme galénique considérée ici est donc choisie parmi : une poudre, une suspension aqueuse de gouttelettes ou une solution sous pression.

La présente invention concerne aussi un produit de combinaison comprenant au moins un composé choisi parmi le Diltiazem et la Berbérine, et au moins un autre agent actif choisi parmi :

- un analogue de nucléoside ;

- un inhibiteur de protéase(s) virale(s) ;

- un inhibiteur de sérine protéase transmembranaire ;

- de la Chloroquine, et

- tout mélange des composés précités, pour son utilisation simultanée, séparée ou séquentielle dans la prévention et/ou le traitement d'une infection virale par le virus SARS-CoV-2 (COVID-19).

Ce produit de combinaison sera en particulier composé de :

- du Diltiazem et du Remdesivir ;

- du Diltiazem et du Galidesvir ;

- du Diltiazem et du Molnupiravir ;

- du Diltiazem et du Lopinavir ;

- du Diltiazem et du Camostat mésilate ;

- du Diltiazem et de la Chloroquine, ou bien encore

- du Diltiazem et toutes les combinaisons possibles de Remdesivir, Galidesvir, Molnupiravir, Lopinavir, Camostat mésilate et Chloroquine.

Selon d'autres mises en œuvre, ce produit de combinaison sera en particulier composé de :

- de la Berbérine et du Remdesivir ;

- de la Berbérine et du Galidesvir ;

- de la Berbérine et du Molnupiravir ;

- de la Berbérine et du Lopinavir ;

- de la Berbérine et du Camostat mésilate ;

- de la Berbérine et de la Chloroquine, ou bien encore

- de la Berbérine et toutes les combinaisons possibles de Remdesivir, Galidesvir, Monulpriravir, Lopinavir et Chloroquine.

Selon d'autres mises en œuvre, ce produit de combinaison sera en particulier composé de :

- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Remdesivir ;

- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Galidesvir ;

- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Molnupiravir ;

- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Lopinavir ;

- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Camostat mésilate ;

- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et de la Chloroquine, ou bien encore

- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et toutes les combinaisons possibles de Remdesivir, Galidesvir, Molnupiravir, Lopinavir, Camostat mésilate et Chloroquine.

Selon une mise en œuvre selon l’invention, l’un de ces produits de combinaison tels que décrits ci-dessus est utilisé de façon simultanée, séparée ou séquentielle, pour la prévention d'une infection virale par le virus SARS-CoV-2 (COVID-19).

Selon une autre mise en œuvre selon l'invention, l’un de ces produits de combinaison tels que décrits ci-dessus est utilisé de façon simultanée, séparée ou séquentielle, pour le traitement d’une infection virale par le virus SARS-CoV-2 (COVID-19). Ce produit de combinaison pourra comprendre d’autres composés actifs, et en particulier au moins un antibiotique.

La présente invention concerne également une méthode pour traiter un patient infecté par un virus SARS-CoV-2 (atteint de la maladie dite COVID-19) comprenant l’administration audit patient d’une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule pharmaceutique adapté, au moins un composé choisi parmi le Diltiazem et la Berbérine.

La présente invention concerne également une méthode pour prévenir l’apparition d’une infection virale par un virus SARS-CoV-2 (dite maladie COVID-19), chez un individu susceptible d’être infecté par ledit virus, comprenant l'administration audit individu d’une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule pharmaceutique adapté, du Diltiazem.

La présente invention concerne également une méthode pour traiter un patient infecté par un virus SARS-CoV-2 (atteint de la maladie dite COVID-19), comprenant l’administration audit patient d’une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule pharmaceutique adapté, du Diltiazem.

En particulier, cette méthode pourra comprendre également l’administration audit patient d'un autre composé actif, notamment choisi parmi les composés suivants :

- un analogue de nucléoside ;

- un inhibiteur de protéase(s) virale(s) ;

- un inhibiteur de sérine protéase transmembranaire ;

- de la Chloroquine, et

- tout mélange des composés précités.

La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule pharmaceutique adapté, une combinaison de Diltiazem et/ou de Berbérine, avec du Remdesivir.

La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule pharmaceutique adapté, une combinaison de Diltiazem avec du Remdesivir.

La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule pharmaceutique adapté, une combinaison de Diltiazem avec du Molnupiravir.

Plus précisément, ladite composition pharmaceutique comprend, dans un véhicule pharmaceutique adapté, une combinaison de Diltiazem, de Berbérine, et de Remdesivir. La présente invention concerne également les compositions pharmaceutiques comprenant, dans un véhicule pharmaceutique adapté, les combinaisons suivantes :

- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Galidesvir ;

- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Lopinavir ;

- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Molnupiravir ;

- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et du Camostat mésilate ;

- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et de la Chloroquine, ou bien encore

- une combinaison de Diltiazem et Berbérine, et toutes les combinaisons possibles de Remdesivir, Galidesvir, Molnupiravir, Lopinavir, Camostat mésilate et Chloroquine.

Ces combinaisons pourront être formulées selon tous les ratios possibles de chaque composé. En particulier, elles comprendront soit la même quantité en poids de chaque composé antiviral (33 % de chaque), soit des doses non égales de chaque composé, les pourcentages étant exprimés en poids du composé par rapport au poids total de la combinaison.

Toutes les utilisations thérapeutiques de ces combinaisons sont également objets de l’invention.

EXEMPLES

Les exemples 1 à 3 démontrent d’une part l’efficacité d’un traitement au Diltiazem ou à la Berberine en monothérapie, et d’autre part l’intérêt d'utiliser ces molécules en combinaison avec le Remdesivir pour le traitement des infections à SARS-CoV-2.

D’autres données, non présentées ici, ont été obtenues en utilisant l’apigénine, un autre composé présentant une action antivirale sur certaines souches virales, notamment contre le MERS-CoV (WO 2018/073549). Toutefois, cette molécule n’a pas présenté d’action antivirale significative contre le coronavirus SARS-CoV-2.

La charge virale a été quantifiée en RT-qPCR et/ou en TCID50/ml dans les prélèvements de surnageants d’infection de cellules Vero E6 mais aussi dans des lavages apicaux et lysats cellulaires d’épithélium humain reconstitué (HAE MucilAir, Epithelix), traitées avec du Diltiazem, de la Berberine, ou du Remdesivir en monothérapie ou en combinaisons de deux de ces molécules (Diltiazem+Remdesivir, ou Berberine+Remdesivir).

La production virale relative à chacune des concentrations de molécules a été déterminée et est représentée par rapport à la production virale issue des cellules ou HAE infecté(e)s dans les mêmes conditions mais non traité(e)s. Les concentrations médianes inhibitrices (IC50) ont été déterminées pour chaque condition de traitement.

Exemple 1. Matériels et méthodes

Virus utilisé

Le virus utilisé a été isolé à partir d'un échantillon de patient infecté par le SARS-CoV-2.

La souche du SARS-CoV-2 utilisée dans cette étude a été isolée chez une patiente de 47 ans, recrutée dans une cohorte clinique française évaluant les patients atteints de COVID-19 (NCT04262921 ). Cette étude a été menée conformément à la déclaration d'Helsinki et a reçu l'approbation de la commission d'éthique locale. La souche virale a été séquencée avec Illumina MiSeq et déposée dans la base de données GISAID EpiCoVTM sous la référence BetaCoV/France/IDF0571/2020 (numéro d'identification EPI _ISL_411218). Pour référence voir (Pizzorno et al., 2020).

L'isolement du virus a été réalisé par inoculation de cellules Vero E6 (ATCC CRL-1586) et suivi d’apparition d’effets cytopathiques. Après apparition des premiers effets induits par le virus, le surnageant d’infection a été récolté et les ARN viraux en ont été extraits à l’aide du kit QIAmp Viral RNA (QIAGEN). Les ARN extraits ont ensuite fait l'objet d’un séquençage Illumina MiSeq (Zymo-Seq RiboFree), avec une couverture de 500x, et les séquences ont été assemblées à l’aide des programmes d'alignement hisat2 et consensus.

La séquence a été ensuite déposée sur la plateforme GISAID EpiCoV (Accession ID EPI _ ISL _ 411218) sous le nom BetaCoV/France/IDF0571/2020.

Cette souche virale est phylogénétiquement très proche des souches de SARS-CoV-2 qui ont circulé au début de l’épidémie dans la région de Wuhan en Chine au mois de Janvier/Février 2020. Cette souche est donc représentative des souches de SARS-CoV-2 à l’origine des maladies infectieuses dites « COVID-19 » actuellement observées aujourd'hui dans le monde.

Protocole d’infection en cellules Vero E6

Les cellules Vero E6 (ATCC CRL-1586) ont été cultivées en milieu DMEM 4.5 g/l de Glucose, supplémenté en L-Glutamine et Pénicilline/streptomycine et 10 % de sérum de veau fœtal inactivé, à 37°C 5 % C02.

Pour réaliser les infections, les cellules ont été rincées deux fois par du milieu sans sérum et ont été recouvertes par un volume minimum contenant une dilution de virus, cette dilution étant déterminée à partir du titre infectieux (cf chapitre détermination du titre infectieux), afin d'obtenir une multiplicité d’infection (MOI) adéquate. Après une incubation d’une heure en présence d’un volume minimum, le milieu a été remplacé par du milieu DMEM 4.5 g/l de Glucose, supplémenté en L-Glutamine et Pénicilline/streptomycine et 2 % de sérum de veau fœtal inactivé, et les cellules ont été incubées à nouveau à 37°C 5 % C02.

Protocole d’infection en épithélium

Pour réaliser des infections nous avons également utilisé un modèle d’épithélium humain reconstitué (HAE MucilAir, Epithelix), obtenu à partir de cellules primaires humaines obtenues par biopsies nasales, cultivées à l’interface air-liquide avec un milieu de culture spécifique dans des inserts Costar Transwell (Corning, NY, USA. Pour les expériences d'infection, les pôles apicaux ont été doucement lavés à deux reprises avec du milieu OptiMEM (Gibco, ThermoFisher Scientific), puis infectés avec 150 pl de dilution de virus en milieu OptiMEM, à une multiplicité d'infection (MOI) de 0.1. Après une heure d’incubation à 37°C 5 % C02, la suspension virale a été retirée.

Détermination du titre infectieux en cellules Vero E6

La détermination du titre infectieux a été réalisée par une technique de dilution limite, sur ces cellules Vero E6 en plaque 96 puits. Un volume de 50 mI de dilutions en série est déposé dans des puits en quadruplicats. Les cellules sont ensuite incubées à 37°C 5 % C02 et la présence d'effets cytopathiques est ensuite suivie après 3 jours d'infection. La dose infectieuse en culture de tissu 50 % (DICT50/ ml), c’est-à-dire le titre viral requis pour causer une infection chez 50 % des cellules inoculées, a été calculée en utilisant la technique de Reed et Muench.

Quantification du génome viral par PCR quantitative

Les sondes et amorces utilisées ont été décrites par la School of Public Health/University of Hong Kong (tableau 1).

Une PCR quantitative « one-step » a été réalisée à l’aide du kit StepOnePlus Real Time PCR System (Applied Biosystems), avec le réactif EXPRESS One-Step Superscript qRT-PCR (Invitrogen), dans un volume réactionnel de 20 mI contenant 10 mI de supermix Express qPCR (2x), 1 mI de chaque amorce (10 mM), 3.1 mI d’eau, 0.4 mI de Rox dye (25 mM) et 2 mI d’ARN viral.

Le programme suivant a été utilisé : 15min à 50°C, suivi de 40 cycles (15s 95°C ; 1 min 60°C).

Tableau 1

FAM et TAMRA désignent des marqueurs fluorescents.

Exemple 2. Comparaison des IC50 du Diltiazem, de la Berberine, du Remdesivir, et des combinaisons Diltiazem+Remdesivir et Berberine+Remdesivir sur le virus SARS-CoV-2 en modèle cellulaire Vero E6.

Des cellules Vero E6 infectées par le SARS-CoV-2 (MOI 0, 1 ) ont été traitées à une heure post infection par des concentrations croissantes :

- de Diltiazem (2.8 à 45 mM),

- de Berberine (1.6 à 25 pM) et - de Remdesivir (0.6 à 10 pM) seules (Fig1) et en combinaison (Fig 2).

Pour chacun des traitements combinés testés, une dose d’une des molécules a été fixée et associée avec des concentrations croissantes de l’autre molécule (mêmes gammes de concentration que celles utilisées en monothérapie, respectivement) et inversement. Les titres infectieux viraux mesurés dans les surnageants de culture des cellules infectées (prélevés à 48 et 72 heures post-infection) reflètent le niveau de réplication virale dans les différentes conditions de traitement.

Le tableau 2 ci-dessous résume les données d’IC50 pour différents traitements en monothérapie et/ou en combinaison obtenues en cellules Vero E6 à différents temps d’infection par le SARS-CoV-2.

Tableau 2

Cette table illustre bien le gain des combinaisons de traitements en termes de réduction de l’IC50 de certaines molécules en comparaison des traitements en monothérapie de ces molécules. Ainsi, le Remdesivir combiné à une concentration fixe de Diltiazem (11.5 pM) permet d’obtenir une réduction d’environ 68 % de son IC50 (0.32 versus 0.98 pM) à 48hpi, et de 52 % de son IC50 (0.35 versus 0.72 pM) à 72hpi.

En parallèle, le Diltiazem combiné à une concentration fixe de Remdésivir permet d’obtenir une IC50 de 0.55 pM, alors que son IC50 est supérieure à 45 pM à 48hpi. Par ailleurs, le Remdesivir combiné à une concentration fixe de Berbérine (12.5 pM) permet d’obtenir une réduction d’environ 33% de son IC50 (0.65 versus 0.98 pM) à 48hpi.

Exemple 3. Comparaison des activités antivirales du Diltiazem, de la Berberine, du Remdesivir, et des combinaisons Diltiazem+Remdesivir, Berberine+Remdesivir sur le virus SARS-CoV-2 en modèle d’infection d’épithélium respiratoire humain reconstitué.

Des épithéliums respiratoires humains d’origine nasale reconstitués et cultivés en interface air/liquide (MucilAir® HAE, Epithelix) ont été infectés par le SARS-CoV-2 (MOI 0.1). Le milieu basal a été traité une fois par jour par les molécules suivantes, en traitement simples ou en combinaison : - Diltiazem (45 ou 90 mM),

- Remdesivir (20 ou 40 pM) et

- Berbérine (4 pM) pour 48 ou 72 heures post-infection.

La figure 4 présente le chronogramme des expériences. A différents temps, les épithéliums ont été récoltés et lysés. L’ARN total a été extrait et les génomes viraux ont été quantifiés par RT-PCR en normalisant les données à l’aide de la quantification du produit d’un gène cellulaire (GAPDH).

Ces données permettent d’évaluer l’effet antiviral des traitements en monothérapie et en combinaison par mesure relative de la réplication virale, exprimée en pourcentage de la réplication virale dans le control (non traité) ou en -Iog10 de la production virale relative.

Tableau 3

Le Tableau 3 présente les effets des traitements au Diltiazem, à la Berberine et au Remdesivir en monothérapie et des traitements combinés Diltiazem+Remdesivir, Berberine+Remdesivir sur la réplication du virus SARS-CoV-2 en modèle d’épithélium respiratoire humain (MucilAir® HAE, Epithelix) d’origine nasal.

Le Tableau 3 récapitule les données d'activités antivirales du Diltiazem, de la Berbérine, du Remdesivir, et des combinaisons Diltiazem/Remdesivir, Berbérine/Remdesivir sur le virus SARS-CoV-2 en modèle d’infection d’épithélium respiratoire humain reconstitué d’origine nasale ou bronchiale. Le Remdesivir, en traitement simple présente une efficacité significative à 48hpi en épithélium d'origine nasal (plus de 7,75 Iog10 d’abattement de la réplication virale).

La combinaison du Remdesivir avec le Diltiazem ou avec la Berbérine (dans les mêmes conditions de concentration qu’en monothérapie) permet d’augmenter significativement l'effet antiviral (8,6 et 8,29 Iog10 d’abattements de la réplication virale pour la combinaison avec le Diltiazem et la Berbérine, respectivement).

Les traitements en monothérapie par le Diltiazem ou la Berbérine présentent aussi des efficacités antivirales significatives à 48hpi (0,35 et 0,86 Iog10 d’abattements de la réplication virale avec le Diltiazem et la Berbérine, respectivement).

L'efficacité du Remdesivir à 72hpi, dans nos conditions expérimentales, bien que restant très élevée, est comparativement moins importante qu’à 48hpi en épithélium d’origine nasale (2,42 et 2,05 Iog10 d’abattement à 20 mM et 2,30 et 2,24 log 10 d’abattement à 40 mM).

A 72hpi, les combinaisons Remdesivir/Diltiazem présentent une efficacité en épithélium d'origine nasale, mais sans différence importante avec un traitement simple par le Remdésivir. Cela pourrait s’expliquer par une efficacité antivirale du Diltiazem limité dans ces conditions expérimentales (0,16/0,15 Iog10 d’abattement en épithélium nasal.

Exemple 4. Comparaison des activités antivirales du Diltiazem et du Remdesivir, sur le virus SARS-CoV-2 en modèle cellulaire A549-ACE2

Les cellules de la lignée cellulaire A549 sont des cellules épithéliales basales alvéolaires humaines issues d’adénocarcinome. Cette lignée cellulaire est utilisée comme modèle pour l'étude du cancer du poumon, mais également comme cellules cibles des virus infectieux ciblant les voies respiratoires. Ces cellules ont été ultérieurement modifiées pour exprimer le récepteur AC E2, par lequel le virus SARS-CoV-2 pénètre dans les cellules hôtes. Cette lignée cellulaire A549-ACE2 a été obtenue auprès de Creative Biogene (USA).

Contrairement aux cellules Vero, ces cellules A549-ACE2 possèdent une voie de signalisation des interférons complète et opérationnelle. Elles sont donc plus adaptées pour étudier les effets du Diltiazem qui agit sur ces voies de signalisation.

Le protocole expérimental est le suivant :

Ensemencement des cellules A549-ACE2,

- 24 heures après, infection des cellules A549-ACE2 avec une souche Wuhan-like de

SARS-CoV-2 (MOI 10 ¹ et 10 ² ),

1 heure post infection (pi), les cellules sont traitées avec du Diltiazem à 45 uM, Les surnageants sont prélevés à 24 heures, 48 heures, 72 heures et 96 heures après l’infection pour une quantification virale par RT-PCR.

Les milieux d’incubation utilisés sont les suivants :

• Milieu d’ensemencement : DMEM 1 g/L glucose (GIc), 200mM L-Glutamine (L-Glu), 104 unités Pénicilline/Streptomycine (P/S), 10% Sérum Veau Fœtal (SVF)

• Milieu d’infection : DMEM 1 g/L GIc, 200mM L-Glu, 104 U P/S, 0% SVF

• Milieu de traitement : DMEM 1 g/L GIc, 200mM L-Glu, 104 U P/S, 2% SVF

La figure 5 présente le protocole expérimental : un seul traitement est réalisé à 1 h pi,, puis le surnageant est prélevé à 24, 48, 72 et 96 hpi.

La figure 6 présente les résultats obtenus après traitement des cellules infectées à deux taux de multiplicité d’infection différents (A : MOI = 10 ¹ ; B : MOI=10 ² ) avec du Diltiazem (45 mM) ou du Remdesivir (5 pM).

Les deux composés Remdesivir et Diltiazem permettent d’obtenir, avec un seul traitement, un même niveau d’inhibition du titre viral (mesuré par RT-PCR) au cours du temps, et ce quel que soit le taux de multiplicité d'infection.

Exemple 5. Détermination de l’IC50 sur SARS-CoV-2 et du CC50 du Diltiazem, en lignée A549 ACE2

Le protocole expérimental est le suivant :

Ensemencement des cellules A549-ACE2,

- 24 heures après, infection des cellules A549-ACE2 avec une souche Wuhan-like de

SARS-CoV-2 (MOI 10 ¹ ),

1 heure post infection (pi), les cellules sont traitées avec du Diltiazem à différentes concentrations,

Les surnageants sont prélevés 72 heures après l’infection pour une quantification virale par RT-PCR.

L’IC50 est la concentration inhibitrice médiane c’est-à-dire la quantité de Diltiazem nécessaire pour obtenir 50% d’inhibition de la réplication virale de la souche SARS-CoV-2 testée.

Les résultats obtenus sont présentés en figure 7A : l’IC50 du Diltiazem est de 19.7 pM, ce qui est significatif d’une bonne efficacité inhibitrice in vitro.

En parallèle, la cytotoxicité du Diltiazem sur ces cellules A549-ACE2 a été vérifiée dans les mêmes conditions expérimentales. Pour cela, le CC50 (Cytotoxic concentration 50%), qui correspond la dose nécessaire de Diltiazem pour réduire la viabilité des cellules de moitié, a été mesuré en suivant la viabilité des cellules A549-ACE2 en présence de différentes concentrations de Diltiazem. La viabilité a été déterminée par un test MTS réalisé 72 heures après le début du traitement.

Le test MTS est une méthode colorimétrique: la méthode est basée sur la réduction du composé de tétrazolium MTS par des cellules viables pour générer un produit de formazan coloré, permettant la comptabilisation des cellules viables (colorées) et des cellules mortes.

Les résultats obtenus sont présentés en figure 7B : la viabilité des cellules est réduite de moitié avec une concentration de Diltiazem égale à 374 mM, une dose très supérieure à l’IC50 mesurée précédemment.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES dans l’ordre de citation dans la description

BREVETS

EP 2 435 064 WO 87/07508 WO 2011/066657 WO 2016/146836 WO 2019/224489 WO 2013/185126 WO 2018/073549 WO 02/094238 US 4,605,552 EP 1 117 408 WO 2015/157223

ARTICLES

Alexander E. Gorbalenya, Susan C. Baker, Ralph S. Baric, Raoul J. de Groot, Christian Drosten, Anastasia A. Gulyaeva, Bart L. Haagmans, Chris Lauber, Andrey M Leontovich, Benjamin W. Neuman, Dmitry Penzar, Stanley Perlman, Léo L.M. Poon, Dmitry Samborskiy, Igor A. Sidorov, Isabel Sola et John Ziebuhr, « Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus - The species and its viruses, a statement of the Coronavirus Study Group », bioRxiv, 2020

Zhou P, Yang XL, Wang XG, Hu B, Zhang L, Zhang W, Si HR, Zhu Y, Li B, Huang CL, Chen HD, Chen J, Luo Y, Guo H, Jiang RD, Liu MQ, Chen Y, Shen XR, Wang X, Zheng XS, Zhao K, Chen QJ, Deng F, Liu LL, Yan B, Zhan FX, Wang YY, Xiao GF, Shi ZL. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 2020 Feb 3. doi: 10.1038/S41586-020-2012-7

Hui DS, I Azhar E, Madani TA, Ntoumi F, Kock R, Dar O, Ippolito G, Mchugh TD, Memish ZA, Drosten C, Zumla A, Petersen E. The continuing 2019-nCoV épidémie threat of novel coronaviruses to global health - The latest 2019 novel coronavirus outbreak in Wuhan, China. Int J Infect Dis. 2020 Feb;91 :264-266.doi: 10.1016/j.ijid.2020.01.009. Epub 2020 Jan 14. PubMed PMID: 31953166

Lo MK, Jordan R, Arvey A, Sudhamsu J, Shrivastava-Ranjan P, Hotard AL, Flint M, McMullan LK, Siegel D, Clarke MO, Mackman RL, Hui HC, Perron M, Ray AS, Cihlar T, Nichol ST, Spiropoulou CF. GS-5734 and its parent nucleoside analog inhibit Filo-, Pneumo-, and Paramyxoviruses. Sci Rep. 2017 Mar 6;7:43395. doi:10.1038/srep43395. PubMed PMID: 28262699; PubMed Central PMCID: PMC5338263

Painter WP, Holman W, Bush JA, Almazedi F, Malik H, Eraut NCJE, Morin MJ, Szewczyk LJ, Painter GR. Human Safety, Tolerability, and Pharmacokinetics of Molnupiravir, a Novel Broad- Spectrum Oral Antiviral Agent with Activity Against SARS-CoV-2. Antimicrob Agents Chemother. 2021 Mar 1 :AAC.02428-20.

Sheahan TP, Sims AC, Zhou S, Graham RL, Pruijssers AJ, Agostini ML, Leist SR, Schafer A, Dinnon KH 3rd, Stevens LJ, Chappell JD, Lu X, Hughes TM, George AS, Hill CS, Montgomery SA, Brown AJ, Bluemling GR, Natchus MG, Saindane M, Kolykhalov AA, Painter G, Harcourt J, Tamin A, Thornburg NJ, Swanstrom R, Denison MR, Baric RS. An orally bioavailable broad- spectrum antiviral inhibits SARS-CoV-2 in human airway épithélial cell cultures and multiple coronaviruses in mice. Sci Transi Med. 2020 Apr 29;12(541):eabb5883.

Chu CM, Cheng VC, Hung IF, Wong MM, Chan KH, Chan KS, Kao RY, Poon LL, Wong CL, Guan Y, Peiris JS, Yuen KY; HKU/UCH SARS Study Group. Rôle of lopinavir/ritonavir in the treatment of SARS: initial virological and clinical findings. Thorax. 2004 Mar;59(3):252-6. PubMed PMID: 14985565; PubMed Central PMCID: PMC1746980

Hoffmann M, Kleine-Weber H, Schroeder S, Krüger N, Herrler T, Erichsen S, Schiergens TS, Herrler G, Wu NH, Nitsche A, Müller MA, Drosten C, Pohlmann S.SARS-CoV-2 Cell Entry Dépends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell. 2020 Mar 4. pii: S0092-8674(20)30229-4. doi:10.1016/j.cell.2020.02.052. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 32142651

Vincent MJ, Bergeron E, Benjannet S, Erickson BR, Rollin PE, Ksiazek TG, Seidah NG, Nichol ST. Chloroquine is a potent inhibitor of SARS coronavirus infection and spread. Virol J. 2005 Aug 22;2:69. PubMed PMID: 16115318; PubMed Central PMCID: PMC1232869

Wang, M., Cao, R., Zhang, L. et al. Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus (2019-nCoV) in vitro. Cell Res 30, 269-271 (2020)

Gao J, Tian Z, Yang X. Breakthrough: Chloroquine phosphate has shown apparent efficacy in treatment of COVID-19 associated pneumonia in clinical studies.Biosci Trends. 2020 Feb 19. doi: 10.5582/bst.2020.01047. [Epub ahead of print]PubMed PMID: 32074550

Fujioka Y, Nishide S, Ose T, Suzuki T, Kato I, Fukuhara H, Fujioka M, Horiuchi K, Satoh AO, Népal P, Kashiwagi S, Wang J, Horiguchi M, Sato Y, Paudel S, Nanbo A, Miyazaki T, Hasegawa H, Maenaka K, Ohba Y. A Sialylated Voltage-Dependent Ca2+ Channel Binds Hemagglutinin and Médiates Influenza A Virus Entry into Mammalian Cells. Cell Host Microbe. 2018 Jun 13;23(6):809-818.

Mohan MC, Abhimannue AP, B PK. Identification and Characterization of Berberine in Tinospora cordifolia by Liquid Chromatography Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry (LC MS/MS Q-tof) and Evaluation of its anti Inflammatory Potential. Pharmacognosy Journal. 2017;9(3):350-355

Song S, Qiu M, Chu Y, Chen D, Wang X, Su A, Wu Z. Berberine down-regulates cellular JNK and NF-KB activation and this may resuit in an inhibition of HSV réplication. Antimicrob Agents Chemother. 2014 Jun 9 Wu Y, Li JQ, Kim YJ, Wu J, Wang Q, Hao Y. In vivo and in vitro antiviral effects of berberine on influenza virus. Chin J Integr Med. 2011 Jun;17(6):444-52

Anna Luganini, Béatrice Mercorelli, Lorenzo Messa et Giorgio Palù, « The isoquinoline alkaloid berberine inhibits human cytomégalovirus réplication by interfering with the viral Immédiate Early-2 (IE2) protein transactivating activity. », Antiviral Research, vol. 164, avril 2019, p. 52- 60

Ting-Chun Hung, Alagie Jassey, Ching-Hsuan Liu et Chien-Ju Lin, « Berberine inhibits hepatitis C virus entry by targeting the viral E2 glycoprotein », Phytomedicine, vol. 53, février 2019, p. 62-69

Mariana Batista, Ana Braga, Guilherme Campos et Marcos Souza, « Natural Products Isolated from Oriental Médicinal Herbs Inactivate Zika Virus », Viruses, vol. 11, no 1 , 11 janvier 2019, p. 49.

Andrés Pizzorno, Blandine Padey, Thomas Julien, Sophie Trouillet-Assant, Aurélien Traversier, Elisabeth Errazuriz-Cerda, Julien Fouret, Julia Dubois, Alexandre Gaymard, François-Xavier Lescure, Victoria Dulière, Pauline Brun, Samuel Constant, Julien Poissy, Bruno Lina, Yazdan Yazdanpanah, Olivier Terrier and Manuel Rosa-Calatrava. “Characterization and treatment of SARS-CoV-2 in nasal and bronchial human airway epithelia." 2020 Cell Reports Medecine Volume 1 , Issue 4, 21 July 2020, 100059