【발명의 설명】

【발명의 명칭】

짧은사슬 지방산 생성 장내 세균 군집의 변화를 이용한 알코올성 간 질환의 진단 및 치료용조성물

【기술분야】

본 발명은 알코올성 지방간증상을 개선하는 효능을 가진 로제부리아 속 균주， 상기 균주를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 알코올성 지방간 질환의 진단용 조성물， 및 상기 균주를 포함하는 장 내 미생물을 이용한 알코을성 지방간 질환의 위험도 예측 또는 진단용 키트에 관한 것이다.

【발명의 배경이 되는 기술】

알코올성 간질환 (ALD; Alcohol ic l iver disease)의 원인은 알코올로서， 알코올은 위장관내에서 쉽게 흡수되며 그중 2~1OT는 신장과 폐로 제거되고 나머지는 주로 간에서 산화된다. 만성적인 음주는 다양한 경로를 통해 간세포의 지방대사 블균형을 초래하여 알코을성 지방간을 유도함이 알려져 있다.

종래에는 알코올성 간 손상 발생 기전은 섭취된 알코올의 약 70%가 알코올 탈수소 효소 (ADH, alcohol dehydrogenases)에 의해, 나머지 30%가 시토크롬 (cytochrome) P450 2E1에 의해 아세트알데하이드 (acet aldehyde)로 변환되는 것으로 알려졌으나， 최근 연구들은 알코을성 간염환자에서 현저하게 증가된 장내 세균과 내독소 (endotoxin)중 하나인 리포다당류 (LPS, l ipopolysacchar ide)가 알코올성 간 손상의 중요한 원인임을 제시하고 있다.

장내 꾀생물총의 구성비율은 인체의 면역 상태와 밀접한 연관성이 있는데， 만성 음주로 인하여 장 상피세포간의 .결합 (t ight junct ion)이 저해되고 장 누수 ( leaky gut ) 현상이 발생하면， 장내 그람음성균들의 LPS가 문맥을 통해 많이 이동하게 되고 간 내 쿠퍼 세포 (kupf fer cel l )의 활성 유도 및 염증성 사이토카인 (cytokine) 생성으로 인해 심한 간 손상이 유도된다.

차세대 염기서열 분석방법을 이용하는 세균 군집 분석을 통해 비배양성을 포함한 미생물총의 분석이 가능해졌으며， 미생물 유전체의 다양성과 질환과의 연관성을규명하는 연구가시행되고 있다. 장내 미생물총이 장관계 면역 외에도 간， 뇌， 신장과 같은 2차 장기의 질환 증상에 관여될 수 있으며， 장내 미생물총의 구성 비율뿐만 아니라 특정 균주의 획득이 면역 체계에 있어 매우 중요함이 밝혀지고 있다. 따라서， 알코올성 지방간 증상을 개선하는 효능이 있는 장내 미생물을 확인하여， 이를 이용한 알코올성 지방간 질환을 진단하는 기술의 개발이 필요한실정이다.

[발명의 내용】

【해결하고자하는과제】

본 발명은 알코을성 지방간 개선 활성을 가진 로제부리아 속 균주를 제공하는것을목적으로 한다.

본 발명은 장 내 로제부리아 (Roseburia) 속 균주를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 알코올성 지방간 질환의 진단용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 대상 (subject )의 장내에 존재하는 제 1항에 따른 알코을성 지방간 증상 완화 활성을 가지는 로제부리아 속 균주의 양을 측정하는 거 U단계;

알코올을 섭취시킨 대조군의 장내에 존재하는 제 1항에 따른 알코올성 지방간 증상 완화 활성을 가지는 로제부리아 속 균주의 양을 측정하는 게 2단계; 및

상기 제 1단계 및 제 2단계에서 측정한 로제부리아 속 균주의 양을 비교하는 게 3단계를 포함하는 알코올성 지방간 진단에 관한 정보를 제공하는 방법를 제공하는 것을목적으로 한다. 【과제의 해결 수단】

본 발명은 차세대 염기서열 분석방법을 이용한 장내 세균 군집 분석과 이를 이용한 알코올 섭취량에 변화하는 마이크로비음 바이오 마커 발굴에 관한 것으로서， 구체적으로 알코을 섭취량에 변화하는 마이크로비음 바이오 마커에 해당하는 로제부리아 인테스티날리스 균주를 분리하고 마우스 실험을 통해 알코올성 지방간 질환 증상 개선 효능을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 구체적으로， 본 발명자들은 건강한 한국인에서 분리된 로제부리아 인테스티날리스 SNUG30017 균주를 발굴하고 이를 대상으로 알코을성 지방간증상 개선 효능을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 하나의 양태로서， 본 발명은 알코올성 지방간 예방 또는 개선 활성을 가지는로제부리아 (Rosebur i a) 속 균주에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 일예는， 본 발명에 따른로제부리아속 균주， 상기 균주의 편모 추출물， 상기 균주의 배양물， 상기 배양물의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는, 알코을성 지방간 예방또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 일예는， 본 발명에 따른로제부리아속 균주， 상기 균주의 편모 추출물， 상기 균주의 배양물， 상기 배양물의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는， 알코올성 지방간 예방또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 일예는， 본 발명에 따른로제부리아 속 균주， 상기 균주의 편모 추출물， 상기 균주의 배양물， 상기 배양물의 농축액 및 건조물로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는， 알코올성 지방간 예방또는 개선용프로바이오틱스 제제에 관한 것이다.

상기 로제부리아 속 균주는， 장내 미생물 균총의 다양성 증가， 또는 대사와관련된 장내 미생물 균총 기능성 증가를유발하는 것일 수 있다. 본 발명의 또다른 일예는， 대상 (subject )의 장 내에 존재하는， 본 발명에 따른 로제부리아 속 균주를 정량하는 제제를 포함하는 알코올성 지방간 진단용조성물에 관한 것이다.

상기 조성물은， 지방산 대사체인 부티르산 및 프로피오닉산의 농도를 정량하는 제제를 포함하는 것일수 있다.

본 발명의 또다른 일예는， 대상 (subject )의 장내에 존재하는 알코올성 지방간 증상 완화 활성을 가지는 로제부리아 속 균주의 양을 측정하는 제 1단계; 알코올을 섭취시킨 대조군의 장내에 존재하는 제 1항에 따른 알코올성 지방간 증상 완화 활성을 가지는 로제부리아 속 균주의 양을 측정하는 제 2단계 ; 및 상기 제 1단계 및 제 2단계에서 측정한 로제부리아 속 균주의 양을 비교하는 제 3단계를 포함하는， 알코올성 지방간 진단에 관한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

이하， 본 발명을 더욱자세히 설명한다.

본 발명에 따른 알코올성 지방간 개선 활성을 가지는 로제부리아 속 균주는， 예를 들면 알코올 섭취량에 따른 장 내 균총 분석 결과 알코올 섭취량이 적은 정상 그룹에서 로제부리아 속 균주가 연관성을 나타내었으며， 상기 연관성을 보인 로제부리아 속 균주를 선택하여 본 발명에 따른 알코을성 지방간 개선 활성을 가지는 로제부리아 속 균주로 채택하였다. 본 발명에 따른로제부리아속 균주는 장내균총에서 유래된 것일 수 있다.

상기 로제부리아속 균주는， 장상피세포간 밀착연접 (tight junction) 강화를 통해 알코올성 지방간 개선 활성을 나타낼 수 있다. 구체적으로， 로제부리아 속 균주가 첨가될 경우， 상피세포막의 상피 저항이 증가되어 장의 상피세포 간결합이 강화되는 것을 확인하였다 (실시예 7).

상기 로제부리아 속 균주는， 로제부리아 인테스티날리스 (Roseburia intestinal is), 및 로제부리아 호미니스 (Roseburia hominis)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.

상기 로제부리아 속 균주는, 로제부리아 인테스티날리스 (Roseburia intestinalis)일 수 있다.

상기 로제부리아 속 균주는， 로제부리아 인테스티날리스 (Roseburia intestinalis) SNUG30017일 수 있다.

상기 로제부리아 속 균주는, 로제부리아 호미니스 (Roseburia hominis) DSM 16839일 수 있다.

본 발명에 따른 로제부리아 속 균주는 하기와 같은 특성을 1종 이상 가진 균주일 수 있다.

(1) 상피세포간 밀착연접 (tight junction)올 강화， 상피세포 막의 상피 전기저항을 증가， Zo-1 및 Occludin 유전자의 발현량 증가， 또는 MUC2 유전자의 발현량증가,

(2) 알코올성 지방간의 발생 원인 물질， 예를 들면 혈중 리포다당류 (LPS)의 농도 감소，

(3) 간손상의 개선， 혈중 ALT농도 감소， 혈중 AST농도 감소， 간의 중성지방 감소, 생체 내 장벽 투과도 실험으로 FITC 투여 시 혈중 FITC 형광 발현 감소， 또는 Oil Red 0 염색 결과 간의 지방량 감소，

(4) 지방간유발유전자의 발현 감소， 또는 PPAR-r 및 CD36 유전자의 발현량 감소，

(5) 간 손상 증상의 개선 또는 치료， CXCL2 및 CXCL5 유전자의 발현량 감소，

(6) 간에서의 염증 반웅 감소， 또는 TNF-α 및 IL-Ιβ 유전자의 발현량 감소. (7) 장내 미생물 균총 회복 및 다양성 증가，

(8) DNA회복 및 대사와관련된 장내 미생물 균총 기능성 증가.

본 발명의 일예에 따른 로제부리아 속 균주의 상피세포간 밀착연접 강화 특성은， 세포간 밀착연접 ( t ight j unct i on)의 기능 유지 또는 증가를 의미하며， 구체적으로 밀착 연접 활성 증가， 밀착 연접 단백질， 예를 들면 막단백질인 occ l udi n의 mRNA 발현 증가일 수 있다. 본 발명의 일예에 따른 로제부리아 속 균주는 인간유래 대장세포주인 Caco-2 세포주에서 밀착연접 단백질 발현을증가시켜 장세포간밀착연접 특성을 향상시킨다.

예를 들어 , Caco-2 세포에 상기 균주를 투여 후 24시간 후 상피세포 막의 상피 전기저항 (TEER , TransEpi the l i al El ectr i cal Res i stance)의 증가율 (%)이 대조구 대비 1배 이상， 1.2배 이상, 1 .4배 이상, 1.6배 이상， 1.8배 이상， 또는 2배 이상으로 나타나 (도 8a)， 상피세포간 결합을 강화시키는 효과가 있으며， 알코을성 지방간증상을 완화할수 있다.

TEER는 내피 및 상피 단일 층의 세포 배양 모델에서 단단 접합 역학의 완전성을 측정하기 위해 널리 받아들여지는 정량적 기술이다. TEER 값은 약물이나 화학 물질의 운반을 평가하기 전에 세포 장벽의 완전성을 나타내는 강력한 지표아다. TEER측정은 세포 손상 없이 실시간으로 수행할 수 있으며 일반적으로 광범위한 주파수 스펙트럼에서 오믹 저항 측정 또는 임피던스 측정올 기반으로 한다. TEER를 활용하여 널리 특성화된 장벽 모델에는 위장관 (GI ) 관 모델이 있으며， 위장관 세포층이 가지는 전기적 저항치 /장상피세포 간극의 건전성 지표로 활용될 수 있다.

예를 들어， 로제부리아속 균주를 투여할 경우 Zo-1 발현량이 대조군 대비 10OT 이상， 105% 이상， 110% 이상, 또는 12OT 이상일 수 있다 (도 15a) . 예를 들어， 본 발명의 일예에 따른 로제부리아 속 균주를 투여할 경우， Occ ludi n 발현량이 대조군 대비 100% 이상, 105% 이상, 11 이상， 115% 이상， 120% 이상, 125% 이상， 130% 이상， 135% 이상, 또는 140% 이상일 수 있다 (도 15a) .

예를 들어, 본 발명의 일예에 따른 로제부리아 속 균주를 투여할 경우， MUC2 발현량이 대조군 대비 100% 이상， 105% 이상， 110% 이상, 115% 이상， 120% 이상， 125% 이상， 130% 이상, 135% 이상， 또는 140% 이상일 수 있다 (도 15a) .

본 발명의 일예에 따른 로제부리아 속 균주의 알코을성 지방간의 발생 원인 물질 감소 효과는， 알코올성 지방간 또는 알코올성 간염의 원인 물질인 리포다당류 (LPS, l ipopolysacchar ide)의 혈중 농도를 감소시켜, 알코올성 지방간을 개선할 수 있다. 예를 들어， C57BL/6J 마우스에 알코올과 함께 상기 로제부리아 속 균주를 투여할 경우， 에탄올만을 투여한 대조군 대비 혈중 LPS 농도가 90% 이하， 이하， 80% 이하， 75% 이하， 70% 이하, 65% 이하， 또는 62% 이하일 수 있다 (도 11) .

본 발명의 일예에 따른 로제부리아 속 균주의 간 손상의 개선 또는 치료 효과는， 알코올성 지방간을 개선하여, 알코올성 지방간 유도 동물 모델에서， 상기 로제부리아 속 균주를 무처리한 대조구 대비， 상기 로제부리아 속.균주 처리 군에서， 간 손상의 정도를 나타내는 지표인 혈중 ALT 농도， 혈중 AST 농도, 간의 증성지방, 생체 내 장벽 투과도 실험으로

FITC 투여 시 혈중 FITC 형광 발현, 및 /또는 Oi l Red 0 염색 결과 간의 지방량이 감소될 수 있다.

예를 들어， 본 발명의 일예에 따른 로제부리아 속 균주를 투여할 경우， 혈중 ALT 농도가 대조군 대비 100% 이하， 95% 이하， 90% 이하， 85¾> 이하, 80% 이하， 75% 이하, 7(» 이하， 65% 이하， 60% 이하， 또는 5OT 이하일 수 있다.

예를 들어， 본 발명의 일예에 따른 로제부리아 속 균주를 투여할 경우， 혈중 AST 농도가 대조군 대비 100% 이하, 95% 이하， 90% 이하， 85% 이하， 80% 이하， 75¾> 이하， . 70% 이하, 65% 이하， 60% 이하， 또는 50% 이하일 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 일예에 따른 로제부리아 속 균주를 투여할 경우, 간의중성지방 농도 (Liver TG)가 대조군 대비 10(» 이하, 95¾> 이하， 90% 이하， 85% 이하， 80% 이하, 75% 이하， 70% 이하， 65% 이하, 60% 이하， 또는 50% 이하일 수 있다.

예를 들어， 본 발명의 일예에 따른 로제부리아 속 균주를 투여할 경우， 혈중 FITC 형광 발현이 대조군 대비 10 이하， 95% 이하， 90% 이하， 85% 이하, 80% 이하， 75% 이하， 74% 이하， 또는 73% 이하일 수 있다.

예를 들어， 본 발명의 일예에 따른 로제부리아 속 균주를 투여할 경우， Oi l Red 0 염색 결과 지방량이 대조군 대비 100% 이하， % 이하， 90% 이하， 85% 이하， 80% 이하， 75% 이하, 70% 이하， 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하， 또는 50% 이하일 수 있다.

본 발명의 일예에 따른 로제부리아 속 균주는 알코올성 지방간을 개선할 수 있으며， 상기 로제부리아 속 균주를 알코올과 함께 투여시 지방간 유발 유전자의 발현량이， 상기 로제부리아 속 균주를 무처리한 대조구 대비， 상기 로제부리아 속 균주 처리 군에서 감소하여， 알코을에 의해 발생한지방간의 개선 효과를 확인하였다.

예를 들어， 본 발명의 일예에 따른 로제부리아 속 균주를 투여할 경우, 간에서의 중성지방 합성 및 지방산 수송과 같은 지방 대사와 관련된 유전자인 PPAR-r의 발현량이 대조군 대비 90% 이하， 85% 이하， 80% 이하, 또는 75% 이하일 수 있다 (도 14) .

예를 들어， 본 발명의 일예에 따른 로제부리아 속 균주를 투여할 경우， 간에서의 중성지방 합성 및 지방산 수송과 같은 지방 대사와 관련된 유전자인 CD36의 발현량이 대조군 대비 90% 이하， 85% 이하， 80% 이하, 75% 이하， 70% 이하, 65% 이하， 60% 이하， 50% 이하， 45% 이하, 40% 이하， 35% 이하， 30% 이하， 또는 25% 이하일 수 있다.

본 발명의 일예에 따른 로제부리아 속 균주는 알코올에 의해 발생하는 간에서의 염증 반응의 증가를 개선할 수 있으며， 상기 로제부리아 속 균주를 알코올과 함께 투여시 염증성 사이토카인 또는 케모카인 유전자의 발현량이， 상기 로제부리아 속 균주를 무처리한 대조구 대비， 상기 로제부리아 속 균주 처리 군에서 감소하여， 알코올에 의해 발생한 지방간의 개선 효과를 확인하였다.

예를 들어， 본 발명의 일예에 따른 로제부리아 속 균주를 투여할 경우， 염증성 사이토카인 중 하나로서 호중구 모집 (neutrophi l recrui tment )을 활성화 시키는 케모카인 (chemokine.s)인 CXCL2 및 /또는 CXCL5 유전자 발현량이， 대조군 대비 90% 이하， 85% 이하， 80% 이하， 75% 이하， 70¾> 이하， 65¾) 이하, 60% 이하， 50% 이하， 45% 이하， 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하， 또는 25% 이하일 수 있다.

예를 들어， 본 발명의 일예에 따른 로제부리아 속 균주를 투여할 경우， 염증성 사이토카인으로 알려진 TNF- a 및 /또는 IL— 1 β 유전자의 발현량이 , 대조군 대비 90% 이하, 85% .이하, 80% 이하， 75% 이하， 70% 이하 65% 이하， 60% 이하， 50% 이하， 45% 이하, 40% 이하， 35% 이하， 30% 이하， 또는 25% 이하일 수 있다.

본 발명의 일예에 따른 로제부리아 속 균주의 상피세포간 밀착연접 강화 특성은， 로제부리아 속 균주의 편모에 의한 것일 수 있다. 구체적으로 _: 실시예 8에서 로제부리아 속 균주, 로제부리아 속 균주의 배양액， 및 로제부리아 속 균주의 편모를 각각 처리 후， 장 상피세포 막의 상피 전기저항 (TEER) 및 FITC 투과도를 측정해 본 결과， 로제부리아 속 균주의 편모가 첨가된 경우 상피세포막의 상피 전기 저항이 유의하게 증가하여， 로제부리아 속 균주 유래 편모에 장 상피세포간 결합을 강화시키는 효과가 있으며， 알코올성 지방간을 개선할수 있음을 확인하였다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제， 과립제， 정제, 캡슐제， 연고제, 현탁액， 에멀젼， 시럽， 에어로졸 등의 경구형 제형， 또는 경피제， 좌제 및 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 둥으로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물을 비경구용으로 제공하는 경우， 일 예로 액제， 겔 (gel )제 세정 조성물， 정제, 좌제 형태， 크림， 연고， 드레싱 용액， 분무제， 기타 도포제 등의 국소 투여제， 용액형， 현탁형， 유제형 등의 액상 제형일 수 있으며， 멸균된 수용액， 비수성용제， 현탁제， 유제， 동결건조제제， 좌제， 크림， 연고， 젤리， 거품， 또는 세척제， 바람직하게는 액제， 겔 (gel )제， 세정 조성물 등의 피부 외용제가 포함될 수 있다. 상기 제형은 일 예로 멸균수에 용해보조제， 유화제， pH조절을 위한 완충제 등을 첨가하여 제조할수 있다. _.

상기 비수성용제 또는 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol ) , 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol ) , 올리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체， 부형제 및 희석제 등의 보조제를 추가로 함유하는 것일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈， 덱스트로즈， 수크로스 솔비를， 만니를， 자일리를， 에리스리를， 말티를， 전분, 아카시아 고무， 알지네이트， 젤라틴， 칼슴 포스페이트， 칼슘 실리케이트， 셀를로즈, 메틸 셀를로즈， 미정질 샐를로스， 폴리비닐 피를리돈， 물， 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트， 탈크， 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 층진제， 증량제, 결합제, 습윤제， 붕해제， 계면활성제 등의 회석제 또는부형제를사용할수 있다

본 발명에 따른 약학적 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며， 예컨대， 경구, 피부， 정맥, 근육, 피하 등의 경로로 투여될 수 있으며， 바람직하게는 경구로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물을 인간에게 적용하는 구체예에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 투여될 수 있으나， 일반적으로 투여방식과 표준 약제학적 관행 (standard pharmaceut i cal pract i ce)을 고려하여 선택된 약제학적 담체와흔합되어 투여될 수 있다.

예를 들면， 본 발명의 로제부리아 속 균주 함유 조성물은 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 단독 또는 부형제를 함유하는 캡슐 형태로， 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구， 구강내 또는 혀 밑 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 투여 용량은 환자의 나이， 몸무게， 성별， 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며， 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대， 유효성분 함량을 기준으로 1일 투여량이 0. 1 내지 500 mg/kg, 바람직하게는 0.5 내지 300 mg/kg일 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나낮을수 있다.

또한， 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량이 상기 투여 용량 미만이면 유의성 있는 효과를 얻을 수 없으며， 그 이상을 초과하는 경우 비경제적일 뿐만 아니라 상용량의 범위를 벗어나므로 바람직하지 않은 부작용이 나타날우려가발생할수 있으므로， 상기 범위로 하는 것이 좋다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따른 알코올성 지방간의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 있어서, 식품이란 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며， 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며， 통상적인 의미로서의 식품， 식품 첨가제， 건강 기능성 식품， 음료 및 음료 첨가제 둥올 모두 포함하는 의도이다. 본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함하는 의도이다.

본 발명의 일예에 따른 로제부리아 속 균주는 유제품, 요구르트, 커드 (curd) , 치즈 (예， 쿼크， 크림， 가공， 연질 및 경질)， 발효유， 분유, 우유 기재의 발효 제품， 아이스크림， 발효 곡물 제품 ( fermented cereal based product ) , 조제 분유 (mi lk based powder ) , 음료， 드레성 및 애완동물 사료와 같은 다양한 식용 제품에 함유될 수 있다. 용어 "식품 "은 본원에서 약제학적 제품 및 수의학적 제품을 제외한， 동물이 섭취할 수 있는， 모든 제공 형태의， 모든 타입의 제품을 비롯한, 가장 광의적인 의미이다ᅵ

상기 음료는 필수 성분으로서 상기 로제부리아 속 균주를 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한은 없으며， 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을추가성분으로서 함유할수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드， 예를 들어, 포도당， 과당 등의 디사카라이드， 예를 들어 말토스, 슈크로스 둥의 및 폴리사카라이드， 예를 들어 덱스트린， 시클로텍스트린 둥과 같은 통상적인 당 및 자일리를, 소르비롤， 에리트리를 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴， 스테비아 추출물 (예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) ) 및 합성 향미제 (사카린， 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품 조성물 100 당 일반적으로 약 1.내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제， 비타민， 광물 (전해질)， 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제， 착색제 및 중진제 (치즈， 초콜릿 등)， 펙트산 및 그의 염， 알긴산 및 그의 염， 유기산， 보호성 콜로이드 증점제， pH 조절제， 안정화제, 방부제， 글리세린， 알콜， 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할수 있다.

그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할수 있다.

본 발명에 따른 조성물이 식이 보조제로 사용되는 경우， 그대로 투여하거나， 물， 요구르트， 우유 또는 과일 쥬스 등의 적정 음용가능한 액체와 흔합하거나， 또는 고형 또는 액형 식품과 혼합할 수 있다. 이러한 측면에서， 식이 보조제는 정제， 환제， 캡슐제， 과립제， 산제， 현탁제， 샤셋제 (sachet ) , 패스틸 (past i l le) , 스위트 (sweet ) , 바 (bar ) , 시럽제 및 대웅되는 투여 형태들， 일반적으로 단위 투약 (uni t dose) 형태일 수 있다. 바람직하게는， 본 발명의 조성물은 약제학적 제품의 일반적인 제조 공정으로 제조된 정제, 캡슐제 또는산제 형태로 투여된다. 본 발명의 일예에 따른 식품 조성물에 함유된 유효성분으로서의 로제부리아 속 균주의 함량은 식품의 형태， 소망하는 용도 등에 따라 적절하게 특별한 제한이 없으며 , 예컨대 , 전체 식품 중량의 유효성분인 로제부리아 속 균주의 균체， 상기 균주 배양물， 상기 균주의 파쇄물 및 상기 균주의 추출물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상은 0.00001 중량 ¾> 내지 100 중량 %， 0.001 중량 %내지 99.9 중량 , 0.1 중량 ¾내지 99 중량 %, 더욱 바람직하게는 1 중량 % 내지 50 중량 %, 0.01 내지 15 중량 ¾로 가할 수 있다. 예를 들어， 식품 조성물 100 ^를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할수 있다.

본 발명의 일예에 따른 로제부리아 속 균주는， 특히 프로바이오틱으로서 이용가능하다는 이점이 있으며， 이쎄 본 발명에 따른 로제부리아 속 균주를 포함하는 프로바이오틱스 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 로제부리아 속 균주는 알코을성 지방간을 예방 또는 개선하는 특성을 가져， 유용한프로바이오틱스 제제로사용될 수 있다.

프로바이오틱 박테리아는 독성 결핍， 생존성， 부착성 및 유용 효과들과 관련된 몇가지 요건들을 층족하여야 한다. 이러한 프로바이오틱 특징들은 동일 종의 박테리아들에서도 균주-의존적이다. 따라서， 모든 프로바이오틱 요건들에 대해 우수한 성능을 나타내는 균주를 발굴하는 것이 중요하며， 상기 균주가 우수한 프로바이오틱 특징들을 가지고 있음을 입증하였다. 또한, 프로바이오틱스 조성물에 사용될 균주의 바람직한 조건은， 위장에서 활성 손실이 적고， 장내 다양한 항생제 등에 내성을 갖는 것일 수 있다.

프로바이오틱스는 "특정 개수로 섭취시， 본질적인 기본 영양을 넘어 건강상 이점을 제공하는， 살아있는 미생물들"로 정의된다 (Araya M. et al . , 2002； Guarner F. et al . , , 1998) . 수종의 유산균과 비피도박테리움 종들이 프로바이오틱스에 해당되는데， 이는 이들 균주가 특이적인 건강 효과를 촉진시키는 것으로 입증되었음을 의미한다. 프로바이오틱 박테리아는 독성 결여， 장내 생존성， 부착성 및 유익한 효과와 관련된 몇 가지 요건들을 층족시켜야 한다. 또한， 장관면역 개선 효과는 장세포간 밀착연접의 기능 유지 및 염증성 사이토카인 감소， 항염증사이토카인의 증가， 장내 균총의 균형 유지 등이 병행되어야 하는 것이 보고되었다. 따라서， 모든 프로바이오틱 요건들에 대해 우수한 성능을 가진 그러한 균주들을 발굴하는 것이 중요하다. 따라서 , 프로바이오틱스 조성물에 사용될 균주의 바람직한 조건은, 위장에서 활성 손실 적고， 장내 다양한 항생제 등에 내성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어， "진단용 마커 또는 진단 마커" 란 알코을성 지방간인 상태와 그렇지 않은 않은 상태를 구분하는 기준이 되는 물질로， 정상 시료에 비하여 알코을성 지방간을 가진 환자의 시료에서 증가 또는 감소를 보이는 각종 유기 생체 분자 둥을 포함한다. 본 발명의 목적상， 본 발명의 일예에 따른 진단용 조성물은， 알코올성 지방간 환자에서 특이적으로 높은 수준으로 발현되는 로제부리아 속 균주를 말하며， 해당 균주와 양의 상관관계를 가지는 루미노코코스 (Ruminococcus) 속 균주， 블라우티아 (Blaut i a) 속 균주， 및 /또는 클로스트리디움 (Clostr idium) 속 균주 미생물 또는 군집을 말한다. ^.

바람직하게는， 상기 검출할 수 있는 제제는 시료 내에서 알코올성 지방간의 진단 마커인 로제부리아 속 균주， 루미노코코스 속 균주, 블라우티아 속 균주, 및 /또는 클로스트리디움 속 균주의 존재를 검출하기 위하여 사용될 수 있는 물질을 의미한다. 예를 들어， 로제부리아 속 균주， 루미노코코스 속 균주， 블라우티아 속 균주， 및 /또는 클로스트리디움 속 균주에 특이적으로 존재하는 단백질, 핵산, 지질， 당지질, 당단백질 또는 당 (단당류, 이당류， 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있다.

본 발명에서 미생물 검출 제제는， 항체일 수 있으며， 항원 -항체 반웅올 기반으로 한 면역학적 방법을 사용하여 해당 미생물을 검출할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏， ELISMenzyme l inked immunosorbent asay) , 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay) , 방사면역확산법 (radioimmunodi f fusion) , 오우크 테로니 (Ouchter lony) 면역 확산법， 로케이트 (rocket ) 면역전기영동， 조직면역 염색， 면역침전 분석법 ( Imraunopreci i tat ion assay) , 보체고정분석법 (Com lement Fixat ion Assay) , FACS(Fluorescence act ivated cel l sorter ) , 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어， "위험도 예측" 이란 피시험자가 알코올성 지방간의 발생 또는 관련 질환의 발병 가능성이 있는지를 판별하는 것을 말하고， 알코올성 지방간의 발생 또는 관련 질환의 발병 위험성이 높은 피시험자를 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하거나， 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 또한， "진단" 이란， 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며， 본 발명의 목적상， 진단은 알코올성 지방간의 발생 또는 관련 질환의 발병 여부를 확인하는 것을 의미할수 있다.

본 발명의 일 예에 따르면， 로제부리아 속 균주를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 조성물로서， 상기 검출 특이도가 ½인 균주를 모두 포함하여 알코올성 지방간 또는 알코올성 지방간 관련 질환을 현저한 민감도로 검출할수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예로서, 본 발명의 상기 미생물 검출 제제를 포함하는 조성물은， 알코올성 지방간 또는 알코올성 지방간 관련 질환의 위험도 예측 또는 진단용 키트 형태로 구현되어 제공될 수 있다. 본 발명의 키트는 해당 미생물들을 검출하기 위한 프라이머， 프로브, 안티센스 을리고뉴클레오티드, 압타머 및 /또는 항체의 검출 제제를 포함할 뿐만 아니라， 분석 방법에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물， 용액， 또는 장치가포함될 수 있다.

구체적인 일례로， 본 발명에서 해당 미생물에 특이적인 프라이머를 포함하는 키트는, PCR 및 등의 증폭 반응을 수행하기 위한 필수 요소들을 포함하는 키트 일 수 있다. 예를 들어， 상기 PCR 용 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너， 반응 완층액, 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs)ᅳ Taq-폴리머라아제 역전사효소와 같은 효소， DNase , RNAse 억제제， DEPC- 수 (DEPC-water ) , 멸균수등을포함할수 있다.

상기 키트는 시료의 채취를 위한 혈액 또는 장액 시료 채취용 포집 기구를 포함하며， 상기 포집 기구는 브러쉬， 흡수성 패드， 면봉， 스포이드， 스왑， 주사기 및 양수 포집기로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 시료 채취용 포집 기구를 추가로 포함할 수 있으나， 상기 생물학적 시료를 포집할수 있는 것이라면 이에 한정되지 않는다.

또한 상기 키트는 알코올성 지방간 또는 알코올성 지방간 관련 질환의 위험도 예측 또는 진단을 위하여 피시험자의 시료를 채취할 것을 요구하는 설명서를 추가로 포함할수 있다. 본 발명의 또 다른 예로서， 본 발명은 로제부리아 속 균주를 이용하여 알코올성 지방간 또는 알코올성 지방간 관련 질환의 위험도 예측 또는 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 로제부리아 속 균주， 루미노코코스 속 균주， 블라우티아 속 균주， 및 클로스트리디움 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 미생물을 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 알코올성 지방간 또는 알코올성 지방간 관련 질환의 위험도 예측 또는 진단용 조성물에 관한 사항은 상기 미생물을 검출하는 방법에도 동일하게 적용될 수 있다.

바람직하게 상기 방법은 (a) 피시험자의 시료를 채취하는 단계; (b) 상기 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 게놈 DNA에 로제부리아 속 균주에 특이적인 프라이머를 반웅시키는 단계; 및 (c) 상기 반웅물을 증폭시키는 단계를 포함하여 구현될 수 있다.

상기 단계 (a) 에서， "피시험자의 시료' '란， 알코올성 지방간 또는 알코올성지방간 질환 환자로 예상되는 사람의 몸에서 채취된 것으로， 혈액, 장액， 조직, 세포， 전혈， 혈청， 혈장 타액, 대변 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나， 예를 들어 피시험자의： 혈액， 장액， 장에서 채취된 조직， 바람직하게는 대변 시료일 수 있다.

상기 단계 (b) 에서 피시험자의 시료로부터 게놈 DNA의 추출은 당업계에 알려진 일반적인 기술을 적용하여 수행할 수 있으며, 상기 단계 (c)에서 로제부리아 속 균주에 특이적인 프라이머는 상기 설명한 바와 같다. 상기 단계 (c)에서 반응물을 증폭시키는 방법은 당업계에 알려진 일반적인 증폭 기술들， 예를 들어 중합효소 연쇄반웅, SYBR 실시간 PCR, 역전사-중합효소 연쇄반응， 멀티플렉스 PCR, 터치다운 PCR, 핫 스타트 PCR, 네스티드 PCR, 부스터 PCR, 실시간 PCR, 분별 디스플레이 PCR, cDNA 말단의 신속 증폭, 인버스 PCR, 백토레트 PCR, TAIL-PCR, 리가아제 연쇄 반응， 복구 연쇄 반응, 전사 -중재 증폭， 자가 유지 염기서열 복제， 타깃 염기서열의 선택적 증폭 반응을 이용할 수 있으나， 본 발명의 범위가 이에 제한되지는 않는다.

또한 상기 단계 (c) 증폭 산물의 양을 정상 대조군 시료의 증폭산물과 비교하는 단계 (d)를 추가로 수행할 수 있으며, 피시험자 시료의 증폭 산물이 정상 대조군 시료의 증폭산물과 비교하여 유의적으로 증가되거나 감소되었다고 판단될 경우， 해당 피시험자는 알코올성 지방간 또는 알코올성지방간 질환이 있는 것으로 판단할수 있다. 바람직하게는， 피시험자 시료의 로제부리아속 균주의 미생물에 대한 증폭산물이 정상 대조군 시료보다 낮은 경우 , 알코올성 지방간 또는 알코올성지방간 질환의 위험성이 있는 것으로 예측하거나， 알코올성 지방간 또는 알코올성지방간 질환 이 있는 것으로 진단할수 있다.

【발명의 효과】

본 발명은 한국인 쌍등이 코호트를 기반으로 알코올 섭취량에 변화하는 장내 균총올 상관관계 분석하여 알코올성 지방간 질환의 신규 바이오 마커로 활용할 수 있는 로제부리아 속 균주에 관한 것으로서, 본 발명의 로제부리아 속 균주를 이용하여 알코올성 지방간 질환의 진단용 키트 또는 치료용조성물 개발활용이 가능하다. 【도면의 간단한설명】

도 1은 발명의 일 실시예에 따른 코호트의 알코올 섭취량 (g/day) 및 AUDIT score의 상관 관계 결과 및 그룹에 따른 나이， 성별， C 반웅성 단백 (hsCRP) 임상지표 정보를 나타낸 것이다.

도 2는 발명의 일 실시예에. 따른 16S rRNA에 기반하여 분석된 장 내 균총을 알코을 섭취량에 따라 AUDIT stage I， I I， 111로 구분 지어 장 내 균총의 다양성 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 발명의 일 실시예에 따른 건강요인과 장내 균총의 연관성을

OTU (Operat ional Taxonomi c Uni ts , 16S 기반 생물정보학적 세균 분류 단위)로 나누어 분석한 결과이다.

도 4는 발명와 일 실시예에 따른 건강요인과 장내 균총의 연관성을 분류군 (taxon)으로 나누어 분석한 결과이다.

도 5는 발명의 일 실시예에 따른 cytoscape 소프트웨어를 이용해 네트워크 분석을수행한 결과이다.

도 6은 발명의 일 실시예에 따른 짧은 사슬 지방산 대사체를 나이， 성별， 쌍등이와 가족관계를 랜덤변수로， 알코올 섭취 그룹을 보정변수로 지정 후 연관성 분석을수행한 결과이다.

도 7은 발명의 일 실시예에 따른 짧은 사슬 지방산 대사체 정보가 확보된 307개의 시료 내에서 대사체와 장 내 균총의 상관성 분석을 실시한 결과이다. 도 8a는 발명의 일 실시예에 따른 로제부리아 인테스티날리스 SNUG30017 균주의 장 상피세포간 막 (t ight junct ion) 강화 효과를 확인한 실험결과이다.

도 8b는 로제부리아 인테스티날리스 및 로제부리아 호미니스 균주로부터 유래한 단백질 추출물을 SDS-PAGE gel에 로딩한 결과이다.

도 8c는 로제부리아 인테스티날리스 및 로제부리아 호미니스 균주로부터 유래한단백질 추출물을 LTQ— Orbi trap 질량분석한 결과이다. 도 8d는 로제부리아 인테스티날리스 및 로제부리아 호미니스 균주를 투과전자현미경으로 관찰한 결과이다.

도 8e는 로제부리아 속 균주， 로제부리아 속 균주의 배양액， 및 로제부리아 속 균주의 편모를 Caco-2 세포주에 첨가한 뒤 24시간 후 막의 상피 전기저항을 측정한 결과이다.

도 8f는 로제부리아 속 균주， 로제부리아 속 균주의 배양액, 및 로제부리아 속 균주의 편모가 처리된 Caco-2 세포에, 에탄올을 500mM/wel l로 처리 후 3시간 배양 한 뒤의 막의 상피 전기저항올 측정한 결과이다.

도 8g는 FITC-dextran (Fluorescein— dextran)을 lg/1로 처리하고 1시간 배양 후 FITC permeabi l i ty를 형광을 통해 투과도를 측정한 결과이다. 도 9a는 본 발명에 따른 균주의 알코올성 지방간 개선 효과를 확인하기 위한동물실험 과정을 나타낸 모식도이다.

도 9b는 발명의 일 실시예에 따른 로제부리아 균주 SNUG30017 균주의 알코을성 지방간 개선 효과를 확인한결과이다.

도 10은 발명의 일 실시예에 따른 간과 맹장을 적출 후 무게를 측정한 결과이다.

도 11은 발명의 일 실시예에 따른 혈중 알라닌아미노전달효소 (ALT) 및 박테리아의 그람 음성균의 세포벽을 구성하는 리포다당류 (LPS ,

1 ipopolysacchar ide)를즉정한 결과이다.

도 12는 발명의 일 실시예에 따른 헤마특시린&에오신 (H&E,

Heraatoxyl in&Eosin) 염색을 통한조직병리학적 관찰 결과이다.

도 13a은 발명의 일 실시예에 따른 간조직의 손상 척도인 Oi l Red 0 염색을수행한 결과이다. 도 13b는 무작위적으로 선택된 부위의 Oil Red 0 염색 결과 사진 6장을 토대로, ImageJ 프로그램을 사용하여 지방을 나타내는 붉은 색을 정량한 결과이다.

도 14는 발명의 일 실시예에 따른 간 조직의 유전자 발현량 변화를 확인한 결과로， 각 그래프의 막대는 좌측부터 음성 대조군 (Pair), 양성 대조군 (EtOH), 로제부리아 인테스티날리스 투여군 (EtOH+Ri), 로제부리아 호미니스 투여군 (EtOH+Rh), 아커만시아 뮤시니필라 투여군 (EtOH+Akk) 락토바실러스 람노서스 GG투여군 (EtOH+LGG) 이다.

도 15a는 장 조직의 유전자 발현량 변화를 확인한 결과로, 각 그래프의 막대는 좌측부터 음성 대조군 (Pair), 양성 대조군 (EtOH), 로제부리아 인테스티날리스 투여군 (EtOH+Ri), 로제부리아 호미니스 투여군 (EtOH+Rh), 아커만시아 뮤시니필라 투여군 (EtOH+Akk), 락토바실러스 람노서스 GG투여군 (EtOH+LGG) 이다.

도 15b는 장 조직의 Occludin 및 b-actin 단백질 발현량 변화를 확인한 웨스턴 블랏 (western blot) 사진이다.

도 15c는 장 조직에서 웨스턴 블럿 (western blot)으로 확인한 단백질 발현량을 정량하여， Occludin 발현량을 b-actin 으로 보정한 값으로， 각 그래프의 막대는 좌측부터 음성 대조군 (Pair), 양성 대조군 (EtOH), 로제부리아 인테스티날리스 투여군 (EtOH+Ri), 로제부리아 호미니스 투여군 (EtOH+Rh), 아커만시아 뮤시니필라 투여군 (EtOH+Akk), 락토바실러스 람노서스 GG투여군 (EtOH+LGG) 이다.

도 16a는 16S rRNA에 기반하여 분석된 장 내 균총을 그룹에 따라 장 내 균총의 다양성 변화를 Faith' s Phylogenetic diversity 지표로 확인한 결과이다ᅳ

도 16b는 16S rRNA에 기반하여 분석된 장 내 균총을 그룹에 따라 장 내 균총의 다양성 변화를 Chaol지표로 확인한 결과이다.

도 16c는 16S rRNA에 기반하여 분석된 장 내 균총의 주성분 분석올 실시한결과이다ᅵ

도 16d는 장 내 균총의 변화를 분석하기 위해 단변량 분석 (LefSE)을 실시한 결과이다.

도 17은 PICRUSt를 통한 장 내 균총 KEGG pathways 기능 추정 분석을 실시한 결과이다. 【발명올 실시하기 위한구체적인 내용】

이하， 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명올 예시하기 위한 것일 뿐이며， 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 실시예 1. 연구대상및 시료수집

한국인 쌍등이 코호트에서 410명의 일란성, 이란성 쌍등이와 그의 가족들을 대상으로 대변 시료를 채취하여 -80 ^o C에 넁동보관하였다. 냉동보관된 시료를 실험실로 옮겨 QIAamp FAST DNA stool mini ki t (Qiagen)를 이용하여 박테리아 genomic DNA를 추출하였다. 본 코호트에서는 알코올 섭취량 (g/day) 및 알코을 섭취 습관 설문 조사 결과인 AUDIT score 임상 지표를 활용하여， AUDIT score에 따른 Zone I (0-7점， 정상 그룹)， Zone I I (8-15점)， Zone I I I ( 16-40점， 알코올 섭취량이 많은 그룹)로 나누어 분석하였다. 본 코호트의 알코올 섭취량 (g/day) 및 AUDIT score의 상관 관계 분석 결과 및 그룹에 따른 나이， 성별， C 반응성 단백 (hsCRP) 임상지표 정보를 도 1에 나타냈다. 실시예 2· 16S rRNA를 이용한장내 균총분석

실시예 1에서 추출된 DNA를, 박테리아의 16S rRNA 유전자의 V4 영역을 타겟으로 하는 아래 표 1의 515F/806R 프라이머 (서열번호 1 및 2)를 이용하여 증폭하고， I l lumina사의 MiSeq 기기를 이용하여 염기서열 데이터를 생성하였다. 생성된 대용량 염기서열^ QI IME pipel ine을 사용하여 분석하였고， 장 내 세균의 전체 유전정보를 확인하여 장 내 균총의 구조를 파악후， 알코올섭취량지표와의 연관성을 관찰하였다.

【표 1】

16S rRNA에 기반하여 분석된 장 내 균총을 알코올 섭취량에 따라 AUDIT zone I， I I , 111로 구분 지어 장 내 균총의 다양성 변화를 확인한 결과를 도 2에 나타내었으며， 알코올 섭취량이 많은 그룹의 경우 장 내 균총의 다양성이 감소하였음을 확인하였다. 이는 알코올 섭취량이 증가함에 따라, 유익균의 다양성의 감소 및 잠재적인 유해균의 우점으로 인해， 장 건강에 부정적인 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 실시예 3. 장내 균총과 알코을섭취량의 상관관계 분석

나이, 성별， 가족력을 보정하여 흔란변수를 제어할 수 있는 MaAsLin (Multivariate analysis by linear models) 소프트웨어를 이용하여, 다변량 분석을 통해 알코올 섭취량에 따른 장 내 균총의 변화 및 이에 따른 장의 건강을 특정할 수 있는 장 내 박테리아를 규명하였다. MaAsLin 소프트웨어를 사용하여 나이， 성별, 쌍등이와 가족관계를 랜덤변수로， 알코올 섭취 그룹을 보정변수로 지정 후， 건강요인과 장 내 균총의 연관성을 OTU (Operational Taxonomic Units, 16S 기반 생물정보학적 세균 분류 단위) 및 분류군 (taxon)으로 나누어 분석하였고， 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타냈다.

도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이， ^' 알코올 섭취량이 많은 그룹은 프리보텔라 코프리 Prevotella copri) OTU가 가장 큰 연관성이 있었고， 알코올 섭취량이 적은 정상 그룹은 로제부리아 (Roseburia) OTU가 가장 큰 연관성이 있는 것으로 나타났다. 상기 도 3의 결과는 도 4에서 확인할 수 있는 바와같이, 분류군으로 분석을 하였을 때도 같은 경향성을 나타냈다. 실시예 4. 알코올섭취량그룹에 따른장내 균총의 네트워크분석 알코올 섭취량이 많은 그룹과 정상 그룹에서 장 내 균총의 발생패턴을 파악하기 위해 cytoscape 소프트웨어를 이용해 네트워크 분석을 실시하였다.

그 결과는 도 5에 나타내었으며， 네트워크 분석을 통해 장내 균총의 상호관계를 관찰한 결과， 알코올 섭취량에 따라 장 내 균총이 두 그룹으로 나뉘는 것으로 밝혀졌다. 같은 그룹에 속하는 분류군은 서로 강한 양의 상관관계가 있었으며， 다른 그룹과는서로 음의 상관관계가 있었다. 실시예 5. 알코을 섭취량에 따른 장 내 균총과 짧은 사슬 지방산 대사체의 상관관계 분석

한국인 쌍등이 코호트의 일부인 307개의 분변 시료에서 장 내 균총 유래 대사산물인 짧은 사슬 지방산 (short chain fatty acid) 분석올 실시하였다. 동량의 분변 시료를 멸균된 3차 증류수에 녹이고 95%(v/v) 황산을사용하여 산성화시킨 뒤 원심분리 하여 상층액을 회수하였다.

시료 상층액에 내부 표준 (internal standard)올 위하여 1% 2-메틸 펜타노산 (2-methyl pentanoic acid)를 첨가 후 에테르 (ethyl ether)를 첨가하였다. 이를 vortex 후 원심분리 하여 에테르 층을 회수하였고， Agilent사의 6890 GC-FID 기기를 이용하여 짧은 사슬 지방산 대사체를 분석하였다. 확보한 짧은 사슬 지방산 대사체 프로파일은 총 6종으로, 아세트산 (acetic acid), 프로피오닉산 (propionic acid), 부티르산 (butyric acid) , 아이소부티르산 (isobutyric acid), 발레르산 (valeric acid), 및 아이소발레르산 (isovaleric acid)였다.

이 프로파 °을 MaAsLin 소프트웨어를 이용하여 나이, 성별, 쌍둥이와 가족관계를 랜덤변수로， 알코올 섭취 그룹을 보정변수로 지정 후 연관성을 분석하였다.

상기 실험 결과는 도 6에 나타내었으며， 알코올 섭취량이 많을수록 부티르산의 상대존재비가 감소함을 확인할 수 있었다. 또한 알코올 섭취량이 많을수록 프로피오닉산 대 부티르산의 비율이 증가함을 확인할 수 있었다■

또한， 짧은 사슬 지방산 대사체 정보가 확보된 307개의 시료 내에서 대사체와 장 내 균총의 상관성 분석을 실시하였다. 그 결과， 도 7에서 확인할 수 있는 것처럼 로제부리아와 부티르산의 양의 상관관계가 있었으며， 프리보텔라 및 메가모나스 (Megamonas)는 프로피오닉산과 양의 상관관계가 있었다.

상기 결과를 통해서， 알코을 섭취에 따른 장 내 균총의 변화가 대사산물인 짧은 사슬 지방산의 변화를 유도할 수 있고， 장 내 균총과 짧은 사슬 지방산 대사체가 알코올 섭취에 따른 질환의 바이오마커로 사용할 수 있음을 확인 할수 있었다. 실시예 6. 한국인 유래 로제부리아속균주의 분리 및 동정

건강한 한국인의 장 내 균총에서 로제부리아 인테스티날리스 (Roseburia intestinal is) 균주를 분리하였다. 구체적으로, 장 내 균총 분리용 시료를 건강한 일반인 성인들로부터 제공받아， 분변 시료로부터 균주를분리， 동정하였다 (IRB승인번호: 1602/001-001). 분변 시료는 수득 직후 본 연구실에 운송되어 즉시 균주 분리에 사용하였다. 시료는 직접 도말 형식으로 1.5% 한천 (agar)이 포함된 YCFAG 배지에 스트리킹 후， 37 ⁰ C, 혐기 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 순수분리된 집락 (colony)을 무작위적으로 선발하여 YBHI 배지에서 배양하였고， 균주의 동정을 위하여 균주의 genomic DNA를 추출한 뒤 16S rRNA 유전자를 타겟으로 아래 표 2의 27F/1492R 프라이머 (서열번호 3 및 4)를 이용하여 PCR반응을수행하였다.

【표 2] 상기 PCR 반응물을 QIAquick PCR purification kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 후, ABI3711 automatic sequencer (마크로젠)를 이용해 염기서열 분석을 실시하였다. 그 결과는 아래 표 3의 서열과 같으며， 이 서열정보를 이용하여 천랩의 EzBioCloud 프로그램

(http://www.ezbiocloud.net/identify)으로 다중 비교하여 최종적으로 균주의 동정을 완료하였다.

【표 3]

상기 분리된 균주를 로제부리아 인테스티날리스 (Roseburia intestinal is) SNUG30017로 명명하였고 한국생명공학연구원 생물자원센터 (Korean Collection for Type Culture)에 기탁하여 수탁번호 KCTC13327BP (Roseburia intestinalis SNUG30017, 2017년 9월 1일 기탁)를 부여받았다.

순수 분리 및 동정된 균주의 장기 보관을 위해서, 지수기에 도달한 배양액에 글리세를 (60% v/v)을 첨가하여 스탁을 만들어 -80°C에 보관하였다. 실시예 7. 로제부리아속균주의 장상피세포간막강화특성

장 상피세포간 막 강화특성 (tight junction 강화 특성 ) 시험을 위한 동물세포로서 Caco-2 세포주를 미국 세포주은행 (ATCC)에서 분양 받아 사용하였다. Caco-2 세포주는 인간 대장 유래 결장직장암 adenocarcinoma 세포로서 , 형태는상피세포이다.

Caco-2 세포는 20%우태아혈청 (FBS), 1% non-essential amino acids solution, 1% HEPES, 1.5% 중탄산나트륨 용액， 페니실린-스트렙토마이신 (lOU/ml) 이 첨가된 MEM (Thermo Fisher Scientific, USA) 배지를 이용하여 5% C0 ₂ 존재 하에서 37 ^° C에서 배양시켰다. 장 상피세포간 벽 강화 실험을 위해 Caco-2 세포는 웰당 3xl0 ⁵ cell /ml의 수가 되도록 24 트렌스 웰- 플레이트 (pore size 0.4/m, Corning, USA)에 분주하였고, 격일로 배지를 교환하여 완전하게 단일층 (monolayer)을 형성하도록 7일간 배양하여 실험에 사용하였다.

실험군으로 로제부리아 인테스티날리스 SNUG30017 균주 (Ri)를 사용하였고, 대조군올 위하여 로제부리아 호미니스 Roseburia how in is) DSM 16839 균주 (Rh)를 독일 균주은행 (DSMZ)에서 분양 받아 사용하였다. 각 균은 YBHI 액체 배지에서 지수기에 도달하도록 37 ⁰ C, 혐기 조건에서 배양 후 원심 분리 후 상층액을 제거하고 PBS에 희석하여 준비하였다. 균주는 박테리아 카운트 키트를 사용하여 BD사의 Accuri C6 Flow cytometer 기기를 사용하여 균수를 측정하였다. 단일층을 형성한 Caco-2 세포는 균주를 처리하기 전 우태아혈청 및 항생계가 첨가되지 않은 배지를 첨가하였으며， 감염다중도 (M0I)가 100이 되도록 균주를 첨가하였다. 이 후

0시간， 12시간， 24시간이 지난 뒤의 장 상피세포 막의 상피 전기저항 (TEER,

TransEpithelial Electrical Resistance)을측정하였다.

그 결과는 도 8a에 나타내었으며， Ri 균주가 대조구에 비해 상피세포막의 상피 전기 저항을 증가시킴을 보였고 12시간 보다 24시간에 대조구에 비해 상피세포막의 상피 전기 저항을 현저히 증가시켰다. Rh는 대조구에 비해 유의한차이가 없었다.

상기 결과를 통해서 실시예 6에서 분리하여 확보한 로제부리아 인테스티날리스 (Rosebur ia intest inal i s) SNUG30017 균주가 장 상피세포간 결합을 강화시키는 효과가 있고， 이러한 효과를 통해서 알코올성 지방간증상을 완화할수 있음을 알수 있다. 실시예 8. 로제부리아속균주편모의 장상피세포간막강화특성

8-1： 로제부리아속균주의 편모추출

로제부리아 속 균주의 편모를 추출하기 위해， 다음과 같이 실시하였다.

로제부리아 인테스티날리스 ⁽ oseburia intest inal is) SNUG30017 균주 (Ri ) 및 로제부라아 호미니스 Roseburia hominis) DSM 16839 균주 (Rh)는 YBHI 액체 배지 500ml에서 37 ^° C， 혐기 조건에서 24시간 배양 후 4 ^° C 4, 000 X g, 20 분간 원심분리하여 상층액은 제거하였다. 이후 4 ^° C PBS에 균주를 현탁 후 믹서기로 30초간 3번 균질화하였다. 이를 4 ^° C , 10, 000 X g, 20 분간 원심분리하여 상층액만을 확보하였으며， 이를 4 ^° C , 100 ,000 X g , 1시간동안 초고속 원심분리를 실시하여 농축한 pel let을 500 μ 1의 3차 멸균 증류수에 현탁하였으며, 이렇게 추출된 단백질을 편모로 추정하였다.

8-2： 로제부리아속 균주의 편모 확인

실시예 8-1에서 얻어진 단백질 추출물을 PAGE gel , 및 LTQ-Orbi trap 질량분석기를 이용하여 분석하였다.

구체적으로, Ri 및 Rh균주에서 유래한 단백질 추출물은 BCA protein assay ki t (Thermo Fisher Scient i f ic)을 사용하여 정량하였다. 동량을 10% β -mercaptoethanol °1 포함된 Laemml i sample loading buffer (Bi으 Rad)를 첨가하여 10분간 85 ^° C 에서 끓인 후 10% SDS-PAGE gel에 로딩하여 편모에 해당하는 약 35kDa 사이즈의 밴드를 확인하였으며, 그 결과는 도 8b에 나타내었다.

해당하는 사이즈의 밴드를 trypsin digest ion하여 LTQ-Orbi trap 질량분석기 분석을 실시하였다. 확보된 아미노산 서열을 NCBI에서 확보한 단백질 데이터베이스와 매칭한 결과， 추출된 단백질은 로제부리아 속 균주의 편모임을 확인하였으며 그 결과는 도 8(：에 나타내었다. 또한 Ri 및 Rh 균주의 편모의 확인을 위하여 YBHI 고체 배지 37°C, 혐기 조건에서 24시간 배양 후 grid 위에 균주를 올려 PTA (phosphotungst ic acid)를 사용한 negative staining을 실시하였다. 이를 투과전자현미경 (TEM, Transmission electron microscope)을 통해 편모를 관찰하였으며 , 그 결과는도 8d에 나타내었다.

8-3： 로제부리아 속 균주 편모의 장 상피세포간 밀착연접 강화.특성 확인

로제부리아 속 균주 유래 편모에 장 상피세포간 막 밀착연접 강화 특성이 있음을 확인하기 위해， 다음과 같이 실시하였다.

구체적으로, 에탄올로 인해 파괴된 장 상피세포간 막 보호 특성 (tight junction 보호 특성) 시험을 위한 동물세포로서 Caco-2 세포를 미국 세포주은행 (ATCC)에서 분양 받아 사용하였다. Caco-2 세포는 20% 우태아혈청 (FBS), 1% non-essential amino acids solution, 1% HEPES, 1.5% 중탄산나트륨 용액， 페니실린-스트랩토마이신 (lOU/ml) 이 첨가된 MEM (Thermo Fisher Scientific, USA) 배지를 이용하여 5¾) C0 ₂ 존재 하에서 37 °C에서 배양시켰다. 장 상피세포간 벽 보호 실험을 위해 Caco-2 세포는 웰당 3xl0 ⁵ cell/ml의 수가 되도록 24트렌스 웰-풀레이트 (pore size 0.4卿， Corning, USA)에 분주하였고， 격일로 배지를 교환하여 완전하게 단일층 (monolayer)을 형성하도특 7일간 배양하여 실험에 사용하였다.

실험군으로 로제부리아 인테스티날리스 SNUG30017 균주 (Ri)를 사용하였고， 대조군올 위하여 로제부리아 호미니스 Roseburia horn in is) DSM 16839 균주 (Rh)를 독일 균주은행 (DSMZ)에서 분양 받아 사용하였다. 각 균은 YBHI 액체 배지에서 지수기에 도달하도록 배양 후 원심 분리 후 상층액을 제거하고 PBS에 회석하여 준비하였다. 균주는 박테리아 카운트 키트를 사용하여 BD사의 Accuri C6 Flow cytometer 기기를 사용하여 균수를 측정하였다. 배양액의 경우 상층액을 0.22um 필터 처리 하였다. 실시예 8- 1에서 추출된 편모의 경우 Thermo사의 BCA 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 단일층을 형성한 Caco-2 세포는 균주를 처리하기 전 우태아혈청 및 항생제가 첨가되지 않은 배지를 첨가하였다. 각 균주의 경우 1*10 ⁸ cells/well, 1*10 ⁹ cells/well이 되도록 첨가하였으며， 각 균주의 배양액의 경우 1¾， 각 균주의 편모의 경우 250 μΜ, 및 500 μΜ로 첨가하였다. 이 후 0시간， 24시간이 지난 뒤의 장 상피세포 막의 상피 전기저항 (TEER, TransEpi thel ial Electr ical Resistance)을 측정하였다. 이후 에탄을올 500mM/wel l로 처리하고 3시간 배양 후 장 상피세포 막의 상피 전기저항을 측정하며， FITOdextran (Fluorescein-dextran)을 lg/1로 처리하고 1시간 배양 후 FITC permeabi l i ty를 형광을 통해 투과도 (permeabi l i ty)를 측정하였다.

균， 배양액, 편모를 첨가 후 24시간이 지난 뒤 막의 상피 전기저항을 측정한 결과는 도 8e에 나타내었다. 균의 경우， h 균주가 대조구에 비해 상피세포막의 상피 전기 저항을 1*10 ⁹ eel ls/wel l로 처리시 유의하게 증가시킴을 보였다. 편모의 경우， Ri와 Rh 유래 편모 모두 250 μ Μ 또는500 μ Μ로 첨가시 대조구에 비해 상피세포막의 상피 전기 저항을 유의하게 증가시켰다. 배양액의 경우， Ri 유래 배양액을 1%로 처리시 대조구에 비해 상피세포막의 상피 전기 저항을 유의하게 감소시킴을 보였다. 상기 결과를 통해서 균주나 배양액에 비해 로제부리아 균 유래 편모가 장 상피세포간 결합을 강화시키는 효과가 현저하게 있음을 알 수 있다.

그 후, 에탄올을 500mM/wel l로 처리하고 3시간 배양 후 장 상피세포 막의 상피 전기저항을 측정한 결과는 도 8f에 나타내었다. 그 결과 에탄을 처리를 한 양성 대조군 (E)은 PBS를 처리한 음성 대조군에 비해 상피세포막의 상피 전기 저항이 매우 유의하게 감소시킴을 보였다. 또한 Ri 균주의 경우 1*10 ⁹ cel l s/wel l로 처리시 양성 대조군에 비해 상피세포막의 상피 전기 저항을 유의하게 증가시켰다. 배양액의 경우， Ri 유래 배양액을 로 처리시 양성 대조군에 비해 유의하게 증가시킴을 보였고, butyrate (but )를 처리한 컨트를군도 동일한 결과를 보였다. 상기 결과를 통해 에탄올로 인해 장 상피세포간 막이 파괴되었으며 , Ri 유래 균주와 배양액이 장 상피세포간 결합보호 효과가 있음을 알 수 있다. .

FITC-dextran (Fluorescein-dextran)을 lg/1로 처리하고 1시간 배양 후 FITC permeabi l i ty를 형광올 통해 투과도를 측정한 결과는 도 8g에 나타내었다. 그 결과 에탄올 처리를 한 양성 대조군은 PBS를 처리한 음성 대조군에 비해 상피세포막의 투과도가 매우 유의하게 증가시킴을 보였다. 또한 Ri 균주의 경우 1*10 ⁹ cel ls/wel l로 처리시 양성 대조군에 비해 상피세포막의 투과도를 유의하게 감소시켰다. 편모의 경우 Ri는 250 μ Μ 또는 500 μ Μ로 첨가시 양성 대조구에 비해 상피세포막의 투과도를 유의하게 감소시켰으며， Rh는 500 μ Μ로 첨가시 유의한 효과가 있었다. 배양액의 경우 모두 투과도를 감소시키는 효과가 없었다 . 상기 결과를 통해 에탄올로 인해 장상피세포간 막이 파괴되어 투과도가 높아졌으며， Ri 유래 균주와 편모의 경우 장 상피세포간 결합 보호 효과가 있어 투과도를 감소시켰음을 알수 있다. 실시예 9· 동물실험 모델의 확립

단일 균주 투여에 의한 장 내 균총의 변화와 알코올성 지방간의 인과 관계를 규명하기 위해 동물실험을 실시하였다.

수컷 8~10주령의 C57BL/6J 마우스에게 리버 디카를리 (Lieber DeCar l i ) 사료를 매일 투여하여 알코올성 지방간을 유발시켰다. 도 9a에 나타난 바와 같이, 액체 식이의 적웅을 위해 2일간 알코올이 첨가되지 않은 사료를 급여 후， 3일차부터 알코올의 농도를 2일마다 1%， 및 3% 증가시켜， 6일차에 (v/v)가 되도록 투여하였으며， 그 후 10일간 5%(ν/ν)로 급여 후 16일차 아침에 31.5%(ν/ν)의 에탄올을 경구투여하여 9시간 뒤 실험을 종료하였다. 이 때 음성 대조군의 경우 동일 열량의 45¾>(ν/ν)의 말토텍스트린을 경구투여 하였다. 실험군 식이에는 알코을 첨가와 더불어 말토덱스트린 (maltodextr in)의 양을 조절하여， 알코올이 첨가되지 않은 음성대조군 식이의 열량과 동일하게 하였다. 실험군으로 로제부리아 인테스티날리스 SNUG30017 (Ri ) , 및 로제부리아 호미니스 DSM 16839 균주 (Rh) , 대조군으로 기존 알코올성 지방간 완화 효능이 알려진 Akkermansi a muciniphi la ATCC BAA一 835， 및 Lactobaci l lus rhamnosus GG KCTC 5033 균주를사용하였다. 각 균주를 2xlO ^g CFU/0.2ml 의 양으로 매일 15일간 경구 투여하는 방식으로 장착 (coloni zat ion) 시켰고， 음성 및 양성 대조군에는 PBS를 경구 투여하였다. 마우스의 무게를 일주일 간격으로 측정하고， 사료 섭취량을 2일 간격으로 측정하였으며, 그 결과를 도 9b에 나타냈다.

그 결과, 도 9b에서 알 수 있듯이， 실험 기간 동안 평균 사료 섭취량 (Food intake)은 차이가 없음에도 불구하고， 음성 대조군 (Pair)에 비해 양성 대조군인 에탄올 그룹 (EtOH)의 무게 (Weight change)가 유의미하게 감소하였음을 확인하였다. 이는 동일한 열량을 섭취하여도 에탄올로 인해 무게가 감소하였음을 의미한다. 에탄올 그룹 (EtOH)과 로제부리아 균주 투여 그룹 (Et0H+Ri , Et0H+Rh)의 무게 차이에 유의성이 없었으며， 대조군인 Akkermans ia muciniphi la 그룹 (EtOH+Akk)의 경우 에탄올 그룹에 비해 유의한무게 감소가 발생하였다. 실험이 끝난 후, 쥐를 희생시켜 간 (liver), 맹장 (cecum), 및 비장 (spleen)을 적출 후 무게를 측정하였고, 그 결과를 도 10에 나타냈다. 그 결과, 도 10에서 알 수 있듯이， 간， 맹장， 및 비장의 몸무게 대비 상대 비율의 변화는 오직 음성 대조군 (Pair)과 양성 대조군인 에탄을 그룹 (EtOH) 사이에서만 유의성이 나타났고, 이는 각 균의 투여가 간， 맹장 및 비장의 무게 변화에는 영향을 주지 않음을 의미한다. 실시예 10. 로제부리아균주의 알코올성 지방간개선 효과확인

10-1: 정량 분석

실시예 9의 실험 종료 시 마우스의 혈액을 수득하여 혈중 알라닌아미노전달효소 (ALT), 박테리아의 그람 음성균의 세포벽을 구성하는 리포다당류 (LPS, lipopolysaccharide), 및 아스파르테이트아미노전달효소 (AST)를 측정하였다. 또한， 간에서의 중성 지방 (Triglycerides, TG)을 측정하였으며, 실험 종료 직전 fluorescein isothiocyanate (FITC) 형광이 달린 덱스트란 (4kDa)을 경구 투여 (60mg/100g body weight)하여 4시간 뒤 혈액을 수득하여 혈중 내 형광을 측정하는 in vivo permeability(FITC)를 실시하였다. 그 결과를 도 11에 나타냈다.

그 결과， 도 11에서 알 수 있듯이， ALT의 경우， 음성 대조군에 비해 양성 대조군인 에탄올 그룹은 혈중 ALT 농도가 유의하게 높아져 알코을성 지방간이 유도되었음을 확인하였다. 또한 실험군인 로제부리아 인테스티날리스 SNUG30017 (Ri), 로제부리아 호미니스 DSM 16839 (Rh), 그리고 대조군인 Akkermansia muciniphila (Akk)의 경우 에탄올 그룹에 비해 유의한 혈중 ALT 농도의 감소가 발생하였다. ALT는 간 손상의 지표로 사용되는 대표적인 바이오 마커로， 이러한 결과는 균주 투여로 인해 알코올성 지방간이 완화되었음을 의미한다.

AST의 경우， 음성 대조군에 비해 양성 대조군인 에탄올 그룹은 혈중 AST 농도가 유의하게 높아져 알코을성 지방간이 유도되었음을 확인하였다. 또한 실험군인 로제부리아 인테스티날리스 SNUG30017 (Ri) 의 경우 에탄올 그룹에 비해 유의한 혈중 AST 농도의 감소가 발생하였다. AST 역시 간 손상의 지표로 사용되는 대표적인 바이오 마커로， 이러한 결과는 균주 투여로 인해 알코올성 지방간이 완화되었음을 의미한다.

간 중성지방 (TG)의 경우， 음성 대조군에 비해 양성 대조군인 에탄올 그룹은 간에서의 중성지방 농도가 유의하게 높아져 알코올성 지방간이 유도되었음을 확인하였다. 또한 실험군인 로제부리아 인테스티날리스

SNUG30017 (Ri) 의 경우 에탄올 그룹에 비해 유의한 간에서의 중성지방의 감소가 발생하였으며， 이러한 결과는 균주 투여로 인해 알코을성 지방간이 완화되었음을 의미한다.

FITC의 경우， 음성 대조군에 비해 양성 대조군인 에탄을 그룹은 혈중

FITC형광 발현이 유의하게 높아져， 알코올성 지방간의 발생 원인 중 하나인 장벽 투과성이 높아졌음을 확인하였다. 또한 실험군인 로제부리아 인테스티날리스 SNUG30017 (Ri), 로제부리아 호미니스 DSM 16839 (Rh), 그리고 대조군인 Akkermansia muciniphila (Akk) 의 경우 에탄을 그룹에 비해 유의한 혈중 FITC형광 발현의 감소가 발생하였으며, 이러한 결과는 균주 투여로 인해， 장벽 투과성이 낮아졌으며， 알코올성 지방간 완화에 도움을 주었음을 의미한다.

알코올성 지방간의 발생 원인 중 하나인 LPS의 경우, 음성 대조군에 비해 양성 대조군인 에탄올 그룹은 혈중 리포다당류 (LPS)의 농도가 유의하게 높아져, 장벽 투과성이 높아진 것으로 인해 장에서 유래한 LPS도 증가하였음을 확인하였다. 또한 실험군인 로제부리아 인테스티날리스 SNUG30017 (Ri), 로제부리아 호미니스 DSM 16839 (Rh) 의 경우 에탄올 그룹에 비해 유의한 혈중 LPS 농도의 감소가 발생하였으며， 이러한 결과는 균주 투여로 인해 장벽이 강화된 것이 LPS의 유출을 감소시켜， 알코올성 지방간 완화에 도움을주었음을 의미한다.

10-2： 조직학적 분석

조직병리학적 관찰을 위하여 간 조직을 10% 포르말린으로 고정시킨 후 헤마특시린&에오신 (H&E, Hematoxylin&Eosin) 염색을 실시한 결과를 도 12에 나타내었고， 간조직의 손상 척도인 Oil Red 0 염색을 실시한 결과 및 ImageJ software를 사용하여 이를 정량한 결과를 도 13a 및 도 13b에 나타내었다.

도 12의 결과에 의하면， 음성 대조군 (L Pair)에 비해 양성 대조군인 에탄올 그룹 (II. EtOH)은 비대해진 지방 축적과 더블어 중심 정맥 (central vein, CV)를 중심으로 neutrophil과 같은 면역 세포의 침윤 (infiltration)이 발생한 것이 확인되었다. 또한， 실험군인 로제부리아 인테스티날리스 SNUG30017 (III. Et0H+Ri), 로제부리아 호미니스 DSM 16839 (IV. Et0H+Rh) 의 경우 에탄올 그룹에 비해 면역 세포의 침윤 (infiltration) 감소가 발생하였으몌 이러한 결과는 로제부리아 균주 투여로 인해 알코올성 지방간을 유발하는 염증 반응이 감소하였음을 의미한다.

도 13a, 및 도 13b의 결과에 의하면， 양성대조군인 에탄을 그룹 (II. EtOH)의 경우 간에서의 비대해진 지방 축적을 확인하였으나， Ri(III. EtOH+Ri) 및 Rh(IV. EtOH+Rh) 균주를 투여한 실험군의 경우 간에서의 지방 축적 증상이 완화되었음을 확인할 수 있었다. 특히 무작위적으로 선택한 6 부위의 붉은 색을 정량한 결과， 유의하게 감소하였음을 확인할 수 있었다 (도 13b). 도 13b는 무작위적으로 선택된 부위의 Oil Red 0 염색 결과 사진을 6장 확보하여, ImageJ 프로그램을 사용하여 지방을 나타내는 붉은 색을 정량한 결과이다.

10-3： 유전자 발현량분석

조직의 유전자 발현량 분석을 위해 간 조직의 RNA를 RNeasy Lipid tissue mini kit (Qiagen)를 사용하여 추출하였고， 장 조직의 RNA를 easy- spin total RNA extraction kit (Intron)를 사용하여 추출하였다. 이를 high capacity RNA-to-cDNA kit (Applied biosystems)를 사용하여 cDNA로 합성시킨 후 roter-gene SYBR green PCR kit (Qiagen)를 사용하여 유전자 발현량을분석한결과를 도 14(간조직)， 및 도 15a (장조직)에 나타냈다. 도 14는， 간에서의 중성지방 합성 및 지방산 수송과 같은 지방 대사와 관련된 유전자인 PPAR-r와 CD36의 발현량과 neutrophil recruitment를 활성화 시키는 chemokines인 CXCL2와 CXCL5의 유전자 발현량 염증성 사이토카인으로 알려진 TNF-α와 IL-Ιβ의 발현량을 비교 분석한 것이다.

도 15a는 장에서의 장상피세포간 막 (tight junction)과 관련된 Zo- 1， Occludin의 유전자의 발현량， 및 점액 층 (mucus layer)와 관련된 MUC2 유전자의 발현량을 비교 분석한 것이다.

이 때 아래 표 4의 프라이머 (서열번호 6 내지 27)를 이용하였으며， 간의 경우 18S, 장의 경우 HPRT 항존유전자 (house keeping gene)로 발현량을 보정하였다.

【표 4】 정방향 8 Ppar-γ ATGTCTCACAATGCCATCAGGTT

역방향 9 Ppar-γ GCTCGCAGATCAGCAGACTCT

정방향 10 CD36 TTGTACCTATACTGTGGCTAAATGAGA 역방향 11 CD36 CTTGTGrrTGAACATTTCTGCTT

정방향 12 CXCL2 AAAGITTGCCTTGACCCTGAA

역방향 13 CXCL2 CTCAGACAGCGAGGCACATC

정방향 14 CXCL5 TGATCCCTGCAGGTCCACA

역방향 15 CXCL5 CTGCGAGTGCATTCCGCTTA

정방향 16 CATCnCTCAAAATTCGAGTGACAA

역방향 17 TNF- α TGGGAGTAGAC GGTACAACCC

정방향 18 IL-Ι β GAAATGCCACCmTGACAGTG

역방향 19 IL-Ι β CTGGATGCTCTCATCAGGACA

정방향 20 Zo-1 ACCCGAAACTGATGCTGTGGATAG

역방향 21 Zo-1 AAATGGCCGGGCAGAACnGTGTA

정방향 22 Occludin GGAGGACTGGGTCAGGGAATA

역방향 23 Occludin CGTCGTCTAGTOTGCCTGT

정방향 24 MUC2 ACTGCACATTCTTCAGCTGC

역방향 25 MUC2 ATTCATGAGGACGGTCTTGG

정방향 26 HPRT TTATGGACAGGACTGAAAGAC

역방향 27 HPRT GCnTAA GTAATCCAGCAGGT 도 14의 결과에 의하면， PPAR-r와 CD36은 음성대조군 (Pai r )에 비하여 양성대조군 (EtOH)에서 유의하게 발현량이 증가하였고， 이는 에탄을로 인한 간에서의 지방 대사의 증가를 의미한다. 한편 Ri 균주를 투여한 실험군 (EtOH+Ri )에서는 양성대조군에 비교하여 두 유전자 모두 유의한 발현량 감소를 보였으며， Rh를 투여한 실험군 (EtOH+Rh)의 경우 CD36 발현량의 유의한 감소를 보였다. 이는 로제부리아 균주 투여가 지방 대사와 관련된 유전자 발현량을 감소시켜 알코올성 지방간 완화에 도움을 주었음을 의미한다 .

또한 CXCL2와 CXCL5은 음성대조군 (Pai r )에 비하여 양성대조군 (EtOH)에서 유의하게 발현량이 증가하였고, 이는 에탄올로 인한 간에서의 염증 반응의 증가 및 면역 세포 활성 증가를 의미한다. 특히

CXCL2와 CXCL5은 염증성 사이토카인의 일종인 케모카인으로서 염증을 유발한다. 한편 Ri를 투여한 실험군 (EtOH+Ri )에서는 양성대조군에 비교하여 두 유전자 모두 유의한 발현량 감소를 보였고， Rh를 투여한 실험군 (EtOH+Rh)의 경우 CXCL2 발현량의 유의한 감소를 보였다. 이는 로제부리아 균주 투여가 면역 세포 조절과 관련된 유전자 발현량을 감소시켜 알코올성 지방간완화에 도움을주었음을 의미한다.

또한 TNF- α와 IL— 1β은 음성대조군 (Pair)에 비하여 양성대조군 (EtOH)에서 유의하게 발현량이 증가하였고， 이는 에탄올로 인한 간에서의 염증 반응 증가를 의미한다. 한편， Ri 및 Rh를 투여한 실험군 (EtOH+Ri , EtOH+Rh)에서 모두 유의한 감소를 보였으며, 이는 균주 투여로 인한 간에서의 염증 반응의 감소를 의미한다.

도 15a의 결과에 의하면, Zo— 1의 경우 음성대조군 (Pair )과 양성대조군 (EtOH) 사이 유의한 차이가 없었다. 한편 Occludin의 경우， 음성대조군 (Pai r )에 비하여 양성대조군 (EtOH)에서 유의하게 발현량이 감소하였고， 이는 에탄올로 인한 장에서의 장 상피세포간 밀착연접 감소에 Occludin 발현량이 영향을 주는 것을 의미한다. 한편 Ri 및 Rh를 투여한 실험군 (EtOH+Ri , EtOH+Rh) 및 Akk를 투여한 대조군 (EtOH+Akk)에서 모두 ^■ 유의하게 Occludin 발현량의 증가를 보였다. 이는 로제부리아 균주의 투여가 Occludin 발현량을 증가시켜 장상피세포간 막을 강화하여 알코올성 지방간 완화에 도움을주었음을 의미한다.

MUC2의 경우 음성대조군 (Pai r)에 비하여 양성대조군 (EtOH)에서 유의하게 발현량이 감소하였고, 이는 에탄올로 인한 점액 층 구성이 더 투과성이 높게 변한 것을 의미한다. 한편 Ri 및 Rh를 투여한 실험군 (EtOH+Ri , EtOH+Rh)에서 모두 유의하게 MUC2 발현량의 증가를 보였다. 이는 로제부리아 균주 투여가 MUC2 발현량을 증가시켜 점액 층을 강화하여 알코올성 지방간 완화에 도움을 주었음을 의미한다. 10-4： 단백질 발현량분석

장 조직의 단백질 발현량 분석을 위해 장 조직의 단백질을 protease inhibi tor cocktai l이 첨가된 RIPA 버퍼에 균질화하여 추출 후 BCA protein assay ki t (Thermo Fisher Scient i f i c)을 사용하여 정량하였다. 10% β - mercaptoethanol °1 포함된 Laemml i sample loading buffer (Bi으 Rad)를 첨가하여 10분간 85 ^° C 에서 끓인 후 10% SDS-PAGE gel을 실시하였다. 이 후 membrane은 5¾) BSA가 첨가된 TBST에서 1시간 동안 blocking후 1차， 2차 항체를 붙여 반응을 진행하였다. 반응 세기는 GeneTools (Syngene)를 통해 정량하였다. 도 15b는 장에서의 장 상피세포간 막 (t ight junct ion)과 관련된 Occludin 및 항존유전자 (house keeping gene)인 β -act in의 단백질 발현량을 나타낸 것이며， 도 15c는 그룹 당 총 4-5개의 샘플에서 얻은 결과를 정량하여 β -act in값으로 보정하여 상대적인 단백질 발현량을 나타낸 그래프이다. 도 15b 및 15c의 결과에 의하면， Occludin의 경우 음성대조군 (Pai r)에 비하여 양성대조군 (EtOH)에서 유의하게 발현량이 감소하였고， 이는 에탄올로 인한 장에서의 Occludin 발현량의 감소로 인해 장 상피세포간 막이 약화되는 것을 의미한다. 한편 Ri 및 Rh를 투여한 실험군 (EtOH+Ri , EtOH+Rh) 및 Akk를 투여한 대조군 (EtOH+Akk)에서 모두 유의하게 Occludin 발현량의 증가를 보였고， Ri의 경우 가장 현저히 높게 발현량을 증가시켰다. 이는 특히 로제부리아 인테스티날리스 균주 투여가 Occludin 발현량을 증가시켜 장 상피세포간 막을 강화하여 알코올성 지방간 완화에 도움을주었음을 의미한다. 10-5： 16S rRNA를 이용한 장 내 균총 분석

실시예 9의 실험 종료 시 마우스의 맹장을 수득하여 -81 ^° C에 냉동보관 하였으며， 시료를 실험실로 옮겨 QIAamp FAST DNA stool mini ki t (Qiagen)를 이용하여 박테리아 genomic DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를， 박테리아의 16S rRNA 유전자의 V3-4 영역을 타켓으로 하는 아래 표 5의 프라이머 (서열번호 28 및 29)를 이용하여 증폭하고， index PCR을 수행 후 I l lumina사의 MiSeq 기기를 이용하여 염기서열 데이터를 생성하였다. 생성된 대용량 염기서열을 QI IME pipel ine을 사용하여 분석하였고， 장 내 세균의 전체 유전정보를 확인하여 장 내 균총의 구조를 파악 후， 그룹에 따른 단변량 분석 (LefSE)을 실시하였다.

【표 5】

16S rRNA에 기반하여 분석된 장 내 균총을 그룹에 따라 장내 균총의 다양성 변화를 Fai th' s Phylogenet ic diversi ty 및 Chaol 지표로 확인한 결과를 도 16a 및 도 16b에 나타내었으며, Fai th' s Phylogenet ic diversi ty 지표의 경우 양성 대조군인 에탄을 그룹의 경우 음성 대조군보다 장 내 균총의 다양성이 유의하게 감소하였음을 확인하였다. 이는 알코올 섭취량이 증가함에 따라， 유익균의 다양성의 감소 및 잠재적인 유해균의 우점으로 인해， 장 건강에 부정적인 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 한편

Ri 및 LGG를 투여한 실험군에서 두 지표 유의하게 장 내 균총의 다양성이 유의하게 증가하였음을 보였다. 이는 균주 투여가 장 내 균총의 다양성을 증가시켜 장 건강에 긍정적인 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.

16S rRNA에 기반하여 분석된 장 내 균총의 주성분 분석을 실시한 결과를 도 16c에 나타내었으며， PCA plot을 통해 양성 대조군인 에탄올 그룹이 음성 대조군과 매우 다른 장 내 균총 구조를 지닌 것을 확인하였다. 한편 Ri를 투여한 실험군에서만 양성 대조군인 에탄올 그룹과 다른 장 내 균총 구조를 지닌 것을 확인하였다. 이는 균주 투여가 장 내 균총을 구성하고 있는 종을 변화시켜 그 구조를 조절 (modulat ion)하였음을 시사한다 .

어떤 장 내 균총이 달라졌는지 분석하기 위하여 단변량 분석 (LefSE)을 실시한 결과를 도 16d에 나타내었다. 양성 대조군인 에탄올 그룹에서는 대표적인 유해균인 세포벽이 리포다당류 (LPS, Π卿이 ysacchar ide)로 구성되어 있는 Enterobacter iaceae의 우점을 확인하였다. 한편 Ri를 투여한 실험군에서는 Akkermansi a 및 Prevotel la의 증가를 확인하였다. 이는 균주 투여가 이러한 장 내 균총을 변화시켜 알코올성 지방간 완화에 도움을 주었음을 의미한다.

PICRUSt를 통한 장 내 균총 KEGG pathways 기능 추정 분석을 실시한 결과를 도 17에 나타내었다. 양성 대조군인 에탄올 그룹에서는 glycan 분해와 galactose 대사 기능의 우점을 확인하였다. 한편 Ri를 투여한 실험군에서는 DNA 수리 및 대사 기능의 증가를 확인하였다. 이는 균주 투여가 장 내 균총의 기능을 조절하여 알코올성 지방간 완화에 도움을 주었음을 의미한다. (M 역 Φ)

-허절차를위한미생물 기탁의 수탁증 서을대학교

대 ^' 한민국 서을 « 시 관악구 ¾악로

(우) 08826

1. 미생물의 명칭 ^' 기^자에 의해 주어 ¾ 명¾: 국 A)기락기관이 부여한 수탁번호: Rosebur a. Intestlaaiis SNUG30017 KCrC 13327BP

H , 과학적 성질 및 /또는분류학상 위치

^■ ： '1 I '«) ,^ . Ι' ' ' J ^'

파학쩍 성질

분 학싱' 위 ^ᅵ 치

m. 수령 및 수탁 본 국제기탁기관은 상기 J 표시 ¾ 미생發을 탁받 贿년. 9« 1 ¾ 수령하 ¾다,. π . 이송에 대한수빡증 성'기 ]: 표시된 미생 »은 본 꾹： φ사학기 ¾에 의하여 수령 A l 원기 *¾ ^' 부다폐스 조약 ^' 하의 기탁기 ¾으로. i ^' i ^ᅵ 이송요구 ¾ 받았다.

¥. 국제기탁기관

명 ¾: 생 원 ¾터 기락기관 날¾

주 소: 대한민국 ¾1라북 £ ¾읍 ^ᅵ 시 ¾신¾

181 , ¾국'¾명 "학연구원 (？ fl어 ^' ¾이서비 a) )

(우) 56212 2017년 9월 20일