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Patent Searching and Data


Title:
COMPOSITION AND FORMULATION BASED ON COFFEE OIL, AND USES THEREOF
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2014/075157
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention describes a composition and formulation thereof based on coffee oil, for topical use, with high skin wound healing capacity. The composition can keep ideal moisture conditions in the wound area and keep the peripheral zones dry and protected, besides exhibiting systemic action, which are all factors the accelerate the skin wound healing process.

Inventors:
LINAX COMÉRCIO DE ÓLEOS ESSENCIAIS LTDA. (Estrada VTG 342, S/N, Sexto Distrito Industrial, CEP: -027 . Votuporanga SP, 15503, BR)
NEVES FERREIRA VELHO, Paulo Eduardo (Rua Frei Manoel da Ressureição, 1144, CEP: -221 - Campinas - SP, 13073, BR)
NILSON BORLINA, Maia (Rua Alano Raizer, 823 JD. Botânico,,Distrito de Sousas, CEP:-210 - Campinas - SP, 13106, BR)
BRUNO GROSSELLI, Lania (Rua Luzitana, 977 Apto. 42,,Centro, CEP: -121 Campinas - SP, 13015, BR)
Application Number:
BR2013/000459
Publication Date:
May 22, 2014
Filing Date:
November 01, 2013
Export Citation:
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Assignee:
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS - UNICAMP (Rua Roxo Moreira 1831, Cidade Universitária "Zeferino Vaz" - Distrito de Barão GeraldoCaixa Postal 6.131, CEP: -970- Campinas -SP, 13083, BR)
INSTITUTO AGRONÔMICO (Av. Barão de Itapura, 1481, -970 Campinas - SP, 13012, BR)
LINAX COMÉRCIO DE ÓLEOS ESSENCIAIS LTDA. (Estrada VTG 342, S/N, Sexto Distrito Industrial, CEP: -027 . Votuporanga SP, 15503, BR)
NEVES FERREIRA VELHO, Paulo Eduardo (Rua Frei Manoel da Ressureição, 1144, CEP: -221 - Campinas - SP, 13073, BR)
NILSON BORLINA, Maia (Rua Alano Raizer, 823 JD. Botânico,,Distrito de Sousas, CEP:-210 - Campinas - SP, 13106, BR)
BRUNO GROSSELLI, Lania (Rua Luzitana, 977 Apto. 42,,Centro, CEP: -121 Campinas - SP, 13015, BR)
International Classes:
A61K36/74; A23F5/00; A61P17/00
Domestic Patent References:
WO2012013764A22012-02-02
WO1999063963A11999-12-16
Foreign References:
US4793990A1988-12-27
BRPI0602842A2008-03-04
US6716437B12004-04-06
MX2013001076A2013-03-12
Other References:
WAGEMAKER T: "Variabilidade do teor de óleo, de seu fator de proteção solar e de outros componentes da fraçâo lipidica do gênero Coffea visando usos alternativos aos grãos.", DISSERTAÇÃO DE MESTRADO. INSTITUTO AGRONÔMICO DE CAMPINAS, 2009, Campinas, SP., pages 15 - 17
REUTER J ET AL.: "Botanicals in dermatology: an evidence- based review.", AM J CLINICAL DERMATOL, vol. 11, no. 4, 2010, pages 247 - 267, XP009156810, DOI: doi:10.2165/11533220-000000000-00000
Attorney, Agent or Firm:
FERNANDA LAVRAS COSTALLAT, Silvado (Rua Roxo Moreira 1831, Cidade Universitária "Zeferino Vaz" - Distrito de Barão GeraldoCaixa Postal 6.131, CEP: -970- Campinas -SP, 13083, BR)
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Claims:
REIVINDICAÇÕES

1. Composição caracterizada por compreender os seguintes componentes:

- Óleo obtido a partir de grãos torrados de café;

- Veículo farmaceuticamente aceitável.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada por compreender óleo de café com concentração variando entre 0,001% e 99,999%, preferencialmente 70%.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada por o óleo de café ser extraído, preferencialmente, do café da espécie Coffea arábica.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada por o óleo de café compreender qualquer café classificado para bebida.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada por o óleo de café compreender qualquer tipo de granulometria ou peneira utilizada para a separação por tamanho de grãos.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada por o óleo obtido a partir de grãos torrados de café compreender um processo de torra capaz de gerar as substâncias que promovem os aromas e o sabor característico da bebida de café realizada por infusão com água quente.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o processo de torra compreender o mesmo utilizado para a produção de grãos destinados ao consumo de bebida.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada por o óleo de café compreender o óleo em sua forma bruta; filtrada, clarificada, semi-refinada; refinada; fracionada; hidrogenada; interesterificado puro; e misturado com outros óleos e/ou ingredientes.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por o óleo de café compreender, preferencialmente, o óleo em sua forma filtrada ou semi-refinada. 10. Composição, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada pelo veículo farmaceuticamente aceitável ser selecionado dentre triglicérides de cadeia média (TCM), solução salina ou tampões, preferencialmente triglicérides de cadeia média (TCM) em um percentual adequado (q.s.p.) para atingir 100% da fórmula com base no peso total da composição.

1 1. Uso da composição, de acordo com as reivindicações de 1 a 10, caracterizada pelo fato de ter aplicação na cicatrização cutânea.

12. Uso do óleo de café caracterizado por ser aplicado na produção de formulações para cicatrização cutânea.

13. Formulação caracterizada pelo fato de compreender a composição de acordo com as reivindicações de 1 a 10 em um veículo farmacologicamente aceitável e componentes opcionais selecionados dentre agentes quelantes, agentes ajustadores de pH, agentes conservantes, emolientes, umectantes, agentes bacteriostático, ingredientes ativos, corantes e aromatizantes.

14. Uso da formulação, de acordo com a reivindicação de 13, caracterizada pelo fato de ter aplicação cicatrização cutânea.

15. Uso da composição descrita nas reivindicações de 1 a 10 caracterizado por ser na preparação de um medicamento para cicatrização cutânea.

Description:
COMPOSIÇÃO E FORMULAÇÃO A BASE DE ÓLEO DE CAFÉ E USOS

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a uma composição a base de óleo de café. Mais especificamente, o presente invento trata de uma composição de uso tópico a base de óleo de café torrado com capacidade de cicatrização cutânea. Além disso, são objetos adicionais seu uso e uma formulação compreendendo a referida composição.

Fundamentos da Invenção

As tentativas humanas de intervir no processo da cicatrização de feridas, sejam elas acidentais ou intencionalmente promovidas durante procedimentos cirúrgicos, remontam à Antiguidade. A incidência e a prevalência de úlceras crónicas é extremamente alta repercutindo em elevados custos financeiros. Embora no Brasil não se encontre dados precisos, alguns trabalhos demonstram que há grande impacto psíquicossocial e económico da cronificação de feridas. Elas são a segunda causa de afastamento do trabalho no Brasil (Ereno, 2003).

Muitas variáveis tanto de ordem geral como de ordem local influenciam esse longo e complexo processo. Dos fatores gerais, interferem a idade, o estado nutricional do paciente, a existência de doenças de base, como diabetes, alterações cardiocirculatórias e de coagulação, aterosclerose, disfunção renal, quadros infecciosos sistémicos e uso de drogas sistémicas.

Além deles, interferem também a localização anatómica da lesão, ráça, técnica cirúrgica utilizada, etc (Mandelbaum, 2003).

Para que uma úlcera cutânea apresente cicatrização, ocorre, a nível celular e molecular, uma cascata de eventos que trabalham em conjunto para a repavimentação e reconstituição do tecido lesado (Ortonne, 1994).

O processo de cicatrização pode ser dividido de forma mais simples em três fases: inflamatória, proliferativa e de remodelação (Pittman, 2007). Na fase inflamatória, depois de iniciada a coagulação hemostática, inúmeros mediadores químicos são liberados por células inflamatórias. Nos três primeiros dias, predomina a ação dos polimortonucleares, responsáveis pela fagocitose de bactérias. O macrófago é a célula mais importante desta fase e permanecerá do terceiro ao décimo dia. Os linfócitos aparecem na lesão aproximadamente com uma semana. As linfocinas por eles liberadas têm influência na ação dos macrófagos (Mandelbaum, 2003). Além destas, esta fase conta com a fibronectina. Sintetizada por fibroblastos, queratinócitos e células endoteliais, ela adere simultaneamente à fibrina, ao colágeno e a outros tipos de células, funcionando assim como cola para consolidar o coágulo de fibrina, as células e os componentes de matriz (Mosher, 1981).

A fase de proliferação é responsável pelo fechamento propriamente dito da lesão. Nela acontece a reepitelização pela migração dos queratinócitos a partir das bordas da ferida e dos anexos, se estes foram preservados (Dielgmann et al., 1981 ; Clark, 1985; Gentilhomme et al, 1999). As citocinas modulam o processo inflamatório que é necessário no processo cicatricial, mas que pode ser prejudicial se excessivo. Elas também são responsáveis por uma cicatrização mais rápida e eficaz (Gentilhomme et al, 1999). A formação da matriz depende, além das células inflamatórias e endoteliais, do fibroblasto responsável pela produção de substâncias importantes tanto para o desbridamento como para a remodelação fisiológica (Van Winkle, 1967). A proliferação de vasos que ocorre nesta fase é essencial para o suprimento de oxigénio e nutrientes para a cicatrização. Desta forma, pode-se dizer que a fase de proliferação é dividida em reepitelização, fibroplasia e angiogênese (Mandelbaum, 2003).

A remodelação é a última fase, dura meses e é responsável pelo aumento da força de tensão e diminuição do tamanho da cicatriz. Reformulações dos colágenos, melhoria nos componentes das fibras colágenas, reabsorção de água são eventos que permitem uma conexão que aumenta a força da cicatriz e diminui sua espessura (Doillon et al., 1985). A neovasculatura local diminui, e a área cicatricial normal tem cerca de 80% da força de tensão da pele normal, não é volumosa e é plana (Mandelbaum, 2003). Dentre as substâncias relacionadas com a inflamação que acredita-se interferirem no processo cicatricial, destacam-se as seguintes: adiponectina, leptina, interleucina (IL) 2, IL-4, IL-6, IL-12, fator de necrose tumoral (TNF)-a, fator de crescimento relacionado à insulina (IGF)-1 , interferon (IFN)-a e IFN-γ.

A adiponectina uma proteína que atua na homeostase de glicose e lipídeos. Os níveis de adiponectina circulante são altos, chegando a aproximadamente 0,01% das proteínas plasmáticas (Basu, 2009). É induzida durante a diferenciação do adipócito e sua secreção é estimulada por insulina. A adiponectina é uma adipocina que influência o metabolismo sistémico. Atua no metabolismo de glicose e ácidos graxos, sendo em algumas situações antagonista ao TNF-α (Yano, 2008). Induz uma diminuição nos níveis séricos de glicose e triglicérides, aumenta o nível de glucagon. No fígado promove a inibição insulina-dependente da gliconeogenese e tem ação antifibrosante; no músculo esquelético promove o uso e oxidação de ácidos graxos, uso de glicose e produção de lactato. Age como anti-inflamatório e tem ação protetora contra a aterosclerose (Berg, 2001 ). Na pele de pacientes diabéticos, a adiponectina atua diretamente nos queratinócitos, regulando a expressão de substâncias imunomoduladoras produzidas por estas células; isso indica que a adiponectina atua indiretamente sobre outras células, através dos produtos dos queratinócitos. Outra ação seria a supressão da proliferação e diferenciação dos queratinócitos, o que seria benéfico em casos de hiperqueratinização (Kaway, 2008). Estudo realizado no Brasil aponta que o sobrepeso tem a capacidade de aumentar o tempo de cicatrização (Nascimento, 2006).

A falta de leptina nos animais, assim como nos humanos, pode levar a um aumento de peso e também ao aumento no tempo necessário para cicatrização. A administração direta de leptina leva a diminuição do tempo de cicatrização, com maior reepitelização, mas sem interferir na angiogênese. Outro fato observado em animais é do aumento da expressão de genes de receptores para leptina localmente, o que indica a importância da leptina para o processo cicatricial. A leptina leva a um aumento dos queratinocitos no local de aplicação, no início da cicatrização (Nascimento, 2006).

A IL-2 é uma citocina pleiotrópica (assim como a maioria das citocinas), isto é, têm múltiplos efeitos: uma única citocina pode interagir com mais de um tipo de célula, ter múltiplas atividades biológicas, interagir com outras citocinas, com as quais pode ter sobreposição de atividades (Arai, 1990). Produzida primariamente por linfócitos T ativados mitogênica ou antigenicamente. Possui papel chave na promoção da expansão clonal de células T antígeno-específicas. Além disso, a IL-2 é capaz de mediar múltiplas respostas imunes numa variedade de tipos celulares. A IL-2 estimula a proliferação dos timócitos, a proliferação e diferenciação de células B ativadas; promove o crescimento e diferenciação e a atividade citocida dos monócitos; induz o crescimento das células natural killer e a produção nelas de citocinas e da ativida citolítica; aumenta a produção de células LAK (células killer ativadas por linfócito) e induz a proliferação e diferenciação de oligodendrócitos (Goldsmith, 1994). Em situações de cicatriz hipertrófica e quelóides o IL-2 é encontrado em linfócitos locais, sugerindo ação pró-cicatricial (Armour, 2007).

A IL-4 também é uma citocina pleiotrópica que possui múltiplas atividades de modulação de resposta imune numa variedade de tipos celulares. É um fator de ativação/diferenciação das células B, que regula a troca de isótopo do Ig, particularmente lgG1 e IgE. Ela suprime o desenvolvimento de células T CD4+ produtoras de IFN-γ e regula a diferenciação de células T helper naive no subconjunto Th2 que media a resposta alérgica e humoral imune. Junto com o TNF-α induz sinergicamente a expressão de VCAM-1 (molécula de adesão à célula vascular 1) em células endoteliais e musculares lisas, resultando no recrutamento seletivo de eosinófilos e linfócitos no sítio de inflamação. A IL-4 regula negativamente a produção de mediadores inflamatórios como a IL- , TNF-α, e prostaglandina 2 (PGE 2 ) em monócitos. Foi demonstrado atividade anti-tumoral tanto in vivo quanto in vitro. As células que secretam IL-4 são os basófilos, T CD8+, CD4+ de memória e Th2 naive, mastócitos, eosinófilos e células dendríticas ativadas por vírus. A IL-4 é a -

principal responsável por estimular a produção de tenascina (uma glicoproteína da matriz extracelular, presente como uma fina camada na derme papilar adulta, mas que é reexpressa no processo cicatricial) por fibroblastos, nas fases anteriores da deposição de colágeno e migração celular (Makhluf, 1996).

A IL-6 é uma cítocína que desempenha papéis importantes na defesa do hospedeiro, em reações de fase aguda, inflamação, hematopoiese, metabolismo ósseo, e progressão do câncer. A IL-6 é essencial para a transição de inflamação aguda. Ela é secretada por vários tipos de células e a produção é regulada por numerosos sinais como estímulos mitogênicos ou antigênicos, lipopolisacarídeos, cálcio, outras citocinas e vírus. As citocinas IL- 4, IL-10 e IL-13 inibem a expressão de IL-6 nos monócitos (Hirano, 1996). Níveis sorológicos elevados de IL-6 foram observados em situações patológicas como infecções virais e bacterianas, trauma, doenças autoimunes e inflamação. A IL-6 aumenta no início do processo cicatricial e é importante, pois possui propriedade mitogênicas nos queratinóctios, assim como quimiotático para neutrófilos e a infiltração destes até a área afetada, tem capacidade de aumentar a angiogênese local e aumenta a deposição de colágeno no local da ferida (Lin, 2003).

A IL-12 é uma glicoproteína heterodimérica, que aumenta a atividade citotóxica e induz a produção de IFN-γ nas células natural killer, T e T dendríticas da epiderme. Também induz a produção de IFN-γ nos macrófagos. Esta citocina, em conjunto com outras da mesma família (IL-23 e IL-27), é capaz de promover o desenvolvimento de resposta imune através de células T CD4+ Th1 ; em resposta a infecções, a IL-12 promove a produção de células Th1 , após a IL-27 ter transformado o ThO em Th0/1 ; junto com a IL-18, a IL-12 cria células Th1 de memória a partir de células efetoras (Hamza, 2010). Em processos cicatríciais, a IL-12 tem sua expressão genética aumentada, fazendo com que os macrófagos produzam e secretem mais IFN-y (lshida, 2004).

O TNF-α desempenha papéis críticos na resistência normal do hospedeiro à infecção e ao crescimento de tumores malignos, servindo como imunoestimulantes e como mediadores da resposta inflamatória. Excesso de produção de TNF, no entanto, tem sido implicada como desempenhando um papel numa série de condições patológicas, incluindo caquexia, choque séptico, e doenças auto-imunes. O TNF-α é produzido por ativação dos macrófagos e outros tipos de células, incluindo células T e B, células NK, células endoteliaís, células musculares lisas e algumas células tumorais. Na cicatrização a ausência de receptores para esta citocina acelera o processo (Ware, 1996). Em feridas, o TNF- α é um dos responsáveis por iniciar a cascata pró-inflamatória, sendo responsável pela força e tensão cicatricial (Mast, 1996).

O !GF-I, também conhecido como somatomedína C, é um membro da superfamília insulina. Foi descoberto como um mediador de ações do hormônio no crescimento de células somáticas, mas também tem sido demonstrado ser um importante regulador do metabolismo celular, diferenciação e sobrevivência. IGF-I é sintetizado como uma pré-proteína que é proteoliticamente clivada para gerar a proteína madura (Humbel, 1990). O IGF- 1 , juntamente com o fator de crescimento derivado de plaquetas 2 (PDGF-2) , pode aumentar a espessura da pele na cicatrização de feridas (Lynch, 1989), e esta substância está diretamente envolvida na regeneração de vários tipos de tecidos, não apenas o epitelial (Chen, 2010).

O IFN-cf é uma glicoproteína pertencente à família das citocinas que participa no controle e na replicação celular, na defesa do hospedeiro contra organismos estranhos, como vírus ou bactérias e é um dos principais interferons de tipo I. É produzido por fagócitos mononucleares em resposta à infecção virai. Tem papel na inibição da replicação virai e aumenta a expressão de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade do tipo I (MHC tipo I), seja por atuação autócrina ou parácrina (Krause, 2005). Outra forma de ação do IFN-α é proteger algumas células contra a entrada de vírus. Numerosas investigações mostraram que o IFN está envolvido na regulação do crescimento celular e no efeito imunomodulatório (Ferrantini, 2007).

O IFN-γ, também conhecido como interferon do tipo II, foi inicialmente identificado como produto com atividade anti-viral de linfócitos T ativados mitogenicamente. Possui papel chave na defesa do hospedeiro exercendo atividades imunoregulatórias, anti-proliferativas e pró-inflamatórias (Boehm, 1997). Algumas das funções mais importantes são a estimulação de funções efetoras dos macrófagos, aumento da diferenciação de Th1 induzido por IL-12, modulação da expressão das classes I e II de moléculas do MHC, regulação da troca de classe de imunoglobulinas (Ig) e regulação das interações entre leucócitos e endotélio. O IFN-γ também foi envolvido em papéis fisiológicos em neurónios sensores e na espermatogênese (Neumann, 1997; Kanzaki, 1998).

Ambos os interferons possuem ação anticicatricial, atuando na inibição da síntese de colágeno e proliferação celular e podem aumentar a produção de metaloproteinases. O IFN-α pode aumentar a produção da enzima colagenase, o que aumenta sua ação anticicatricial. Deste modo, ambas devem ter seus valores aumentados na fase final da cicatrização, impedindo que a mesma evolua para lesão hipertrófica (Tredget, 2000)

Estudos têm sido realizados avaliando o potencial do uso de produtos naturais como princípio ativos de recursos para cicatrização. Entre estes, foram realizados estudos com dendezeiro (Sasidharan, 2012), água termal (Faga, 2011 ), babosa (Duansak, 2003), Jatyadi Taila (Shailajan, 2011 ), hortelã (Takayama, 2011 ) e alguns tipos de óleo, tais como óleo de pinha (Tumen, 2011 ), óleo de arroz (BR 10 2012 028235 6). Especificamente no que se refere ao uso de óleos, já é conhecido do Estado da Arte, por exemplo, que àqueles ricos em ácidos graxos essenciais tem ações antissépticas e cicatrizantes.

A cicatrização é um processo dinâmico e, portanto nenhum efeito antisséptico ou cicatrizante observado in vitro garante um resultado favorável in vivo. Por exemplo o álcool, sabidamente antisséptico, não é usado para cicatrização. A composição dos ácidos graxos não é alterada substancialmente pelo processo de aquecimento da torra dos grãos de café, por exemplo, contudo são gerados nesse processo compostos responsáveis pelo aroma e sabor característicos da bebida. Da mesma forma que estas substâncias novas podem mudar o aroma e sabor da infusão do pó de café em água quente, elas podem potencialmente estar envolvidas em uma resposta diferente do óleo de café no processo cicatricial.

Segundo recente artigo de revisão de Ferreira et al, publicado em 2012 na Revista da Escola de Enfermagem da USP, diante da escassez de estudos clínicos randomízados controlados em humanos não se pôde generalizar, na prática clínica, que os ácidos graxos essenciais influenciam positivamente no processo de cicatrização ou que possuem ação antimicrobiana. Assim, há necessidade de realização de pesquisas com maior rigor metodológico comparando as diferentes fórmulas disponíveis contendo ácidos graxo.

O documento BRPI0602842-A de 20/07/2006, por exemplo, descreve o uso de óleo de café verde (Coffea arábica) em formulações cosméticas e farmacêuticas para a manutenção das propriedades da pele, onde o referido óleo atua como agente propiciador de atividades de regeneração; firmeza e hidratação da pele; antioxidante; anti-radicais livres; anti-envelhecimento; redutor das rugosidades da pele; agente auxiliar na redução e prevenção de estrias; agente lipolítico; e agente anti-inflamatório, sendo que essas ações benéficas são obtidas com o óleo de café em sua forma bruta; semi-refinado, refinado, fracionado, hidrogenado ou interesterificado puro ou ainda em misturas com outros óleos e/ou ingredientes em preparações de produtos cosméticos e farmacêuticos, cujo resultado prático confere à pele características saudáveis.

Contudo, embora a formulação reivindicada tenha ação antiinflamatória não se pode afirmar que a mesma poderia ser aplicada, com eficiência, no tratamento de úlceras cutâneas. Isso porque o processo cicatricial exige um equilíbrio entre a produção de substâncias inflamatórias e antiinflamatórias e, neste caso, embora estudos in vitro possam indicar alguma possibilidade de aplicação do produto em uma situação anti-inflamatória, por exemplo, o resultado final in vivo pode ser completamente diferente, podendo inviabilizar, inclusive, o seu uso para a referida aplicação vislumbrada anteriormente. No processo cicatricial, uma mesma substância pode ser „

necessária em concentrações mais altas no início do processo e em doses mais baixas no final do dito processo para evitar, por exemplo, uma cicatriz hipertrófica.

Como ficará evidente nos resultados dos estudos realizados para a concretização da presente invenção, o óleo de café verde ou produzido a partir de grãos crus não promove uma ação cicatrizante in vivo, mas apenas o óleo obtido de grãos torrados de café tiveram ação comparável ao AGE®, a base de ácidos graxos essenciais de cadeias médias e óleo de girassol, e que foi utilizado como um dos controles do estudo. Isso mostra que não é qualquer ácido graxo essencial, nem qualquer óleo de café que tem a ação cicatrizante.

Assim, um mesma substância pode ser anti-inflamatória e não ter ação pró-cicatricial e é necessária a comparação e trabalho inventivo para obter-se um produto cuja ação in vivo se mostre benéfica no processo cicatricial como um todo.

Diferente do óleo extraído do café verde ou cru {Coffea arábica), em que a maioria das pesquisas está relacionada com o setor farmacêutico e cosmético, o óleo extraído do café torrado, obtido diretamente pela prensagem dos grãos, é mais conhecido por sua utilização no setor alimentício, principalmente como recheios de balas, bombons e trufas, formulação de licores, realçador do sabor em café solúvel, ice coffee, cappuccinos, sobremesas diversas, sorvetes, pudins, doces e preparados à base de leite. Não existem estudos prévios que avaliem a ação do óleo de café verde ou do óleo de café torrado sobre a cicatrização e a ação anti-inflamatória do óleo de café cru foi avaliada, sobretudo, em estudos in vitro.

Estudo de Wagemaler, T.AL; Carvalho, C.R.L; Maia, N.B; Baggio,

S; Guerreiro Filho, O., intitulado "Sun protection factor and composition of lipid fraction of gree coffee beans" e publicado na revista Industrial Crops and Products, 33(2011 )469-473, mostrou que o principal agente envolvido na fotoproteção é o caveol, conforme descreve o Depósito de Pedido de Patente 221105532784 de 13/06/2011 do inventor Maia, N.B. Os autores da presente solicitação tentam encontrar novas aplicações ao óleo de café e a ação pró- cicatricial só pode ser observada quando utilizado o óleo obtido de grãos torrados de Coffea arábica.

Como foi mencionado, não foi encontrado na literatura nenhum estudo in vivo sobre a ação do óleo de café, seja este verde (cru) ou torrado, relacionado com processos de cicatrização.

Diante das informações disponíveis e, de certa forma, contrariando o estado da técnica, a presente invenção refere-se a uma composição a base de óleo de café, incluindo grãos de café torrado, para o tratamento de úlceras cutâneas. O uso tópico da referida composição influencia a produção sistémica - e não apenas no local de aplicação - de substâncias relacionadas à cicatrização, sugerindo que o uso da mesma apresenta uma ação cicatricial sistémica benéfica. Adicionalmente, a composição proposta apresenta vantagens sob vários aspectos. Primeiro, sobre as características de um produto eficaz para o tratamento de feridas devem incluir a facilidade de remoção do produto e o conforto do mesmo para o paciente, boa relação custo/benefício, manter a área cicatricial com umidade ideal e as áreas periféricas secas e protegidas, facilidade de aplicação e adaptabilidade (conformação às diversas partes do corpo). Outro diferencial do processo aqui descrito está relacionado com ação sistémica que a tecnologia possui, onde os níveis séricos de algumas substâncias foram alterados, assim como é capaz de acelerar o processo cicatricial em relação ao tipo de colágeno depositado no local, sendo mais eficaz que outros produtos comumente utilizados para este fim.

Breve Descrição da Invenção

A presente invenção trata-se de uma composição a base de óleo de café de uso tópico com alta capacidade de cicatrização cutânea. Além disso, a presente invenção refere-se também ao uso e a formulação da referida composição.

Breve descrição das figuras A estrutura e operação da presente invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma podem ser mais bem entendidas mediante referência às figuras em anexo e à seguinte descrição:

A Figura 1 mostra a área não cicatrizada dos ferimentos (%) ao longo de 10 dias de tratamento dos animais do Grupo 1 (Testemunha).

A Figura 2 mostra a área não cicatrizada dos ferimentos (%) ao longo de 10 dias de tratamento dos animais do Grupo 2 (AGE).

A Figura 3 mostra a área não cicatrizada dos ferimentos (%) ao longo de 10 dias de tratamento dos animais do Grupo 3 (Óleo de Café Cru),

A Figura 4 mostra a área não cicatrizada dos ferimentos (%) ao longo de 10 dias de tratamento dos animais do Grupo 3 (Óleo de Café Torrado).

A Figura 5 apresenta um gráfico referente à celularidade no lado controle dos 4 grupos.

A Figura 6 apresenta um gráfico referente à celularidade no lado tratado nos 4 grupos.

Breve descrição do anexo

O anexo 1 exemplifica o aspecto dos ferimentos no quarto dia de tratamento em uma das avaliações visuais realizadas.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção descreve uma composição tópica a base de óleo de café para cicatrização.

Os principais exemplos de produtos que podem ser preparados partindo-se da composição, objeto da presente invenção, são:

- Loção;

- Creme;

- Pomada;

- Pós;

- Sprays;

- Pastas;

- Géis; - Suspensões e

- Adesivos.

A composição da presente invenção compreende os seguintes componentes:

- Óleo de café;

- Veículo farmaceuticamente aceitável.

Além destes componentes, a composição da presente invenção ainda pode compreender componentes opcionais para proporcionar alguma característica desejável não alcançada com os componentes já citados, como emoliente, umectante, agente quelante, sistema espessante, componente antioxidante, sistema conservante, corantes e aromatizantes.

Serão descritos a seguir com maiores detalhes os componentes utilizados na composição da presente invenção, bem como outros componentes opcionalmente adicionados na formulação. Para cada produto preparado as concentrações e componentes podem variar.

Matéria-prima

O café utilizado como matéria-prima para extração do óleo pode ser de qualquer tipo de classificação de mercado para bebida: mole, duro ou riados e de qualquer tipo de granulometria ou peneira utilizada para separação por tamanho de grãos.

A torra necessária para o processo é a mesma torra industrial utilizada para a produção de grãos destinados ao consumo como bebida, capaz de gerar as substâncias que promovem os aromas e sabor característico da bebida feita por infusão com água quente.

O processo de extração do óleo pode ser tanto por compressão a frio como o utilizado no trabalho desenvolvido, como por extração com solventes simples ou em estado supercrítico. Porém, existem diferenças da quantidade de ácidos graxos essenciais encontrados em diferentes espécies de café. Isso foi observado no estudo "Sun protection factor and composition of lipid fraction of gree coffee beans", já mencionado, em que um dos autores da presente invenção (Maia, N.B.), foi um dos autores. Desta forma, os estudos realizados para a concretização da presente invenção permitem assegurar que o óleo de grãos torrados de Coffea arábica obtido por prensagem fria apresentou ação cicatrizante in vivo. Para a concretização da presente invenção, o café utilizado como matéria-príma foi adquirido diretamente do produtor e posteriormente encaminhado para torrefação e extração do óleo. Tal procedimento foi necessário pelo fato do sistema de comercialização e escala utilizada pelas torrefações serem muito maiores do que o volume de 12 sacas necessárias para obtenção dos óleos utilizados nos testes realizados.

Além do uso de misturas para a formação de "blend", o café ofertado no mercado normal não tem o controle de lotes comprados pelas torrefações, não garantem a safra do produto (tempo de pós colheita), exige uma compra de no mínimo 20 sacas e não garantem ou especificam as condições de armazenamento. Para se ter um controle desses fatores se optou pela compra no produtor e posterior industrialização.

Como o volume mínimo para extração de óleo no equipamento utilizado era de seis sacas, foram adquiridas 12 sacas já beneficiadas, sendo 6 encaminhadas para um torrefação e utilizadas para obtenção de material para os tratamentos com óleo de café torrado e borra de filtro de café torrado. As demais foram direcionadas diretamente para a extração e produziram o óleo e a borra de filtro de café cru.

A torração do café foi feita em torrador comercial (Lilla®) com resfriamento a água e ventilação forçada para seis sacas para garantir um volume de matéria prima homogéneo, sem contaminações de outros lotes processados anteriormente ou posteriormente nos silos de passagem da indústria.

O tratamento de torração utilizado foi o convencional aplicado para a produção de café para bebida interna, com um rendimento de 0,79 de café cru/torrado, que resultaram num total de 285kg de café torrado para extração de óleo de café torrado.

Extração e filtragem dos óleos O óleo de café empregado na presente invenção pode ser obtido por prensagem dos grãos.Tanto a extração por compressão a frio como o utilizado no trabalho desenvolvido, como por extração com solventes simples ou em estado supercrítico, são potencialmente capazes de produzir material adequado para o tratamento, desde que se obtenha tanto o óleo com a composição de ácidos graxos adequada, quanto as substâncias, por exemplo aquelas responsáveis pelo aroma e sabor característicos, geradas no processo de torra. O óleo adicionado a um veículo farmacologicamente aceitável em concentração variando entre 0,001% e 99,999%, preferencialmente 70% pode ser utilizado como cicatrizante

A dosagem do óleo de café a ser usada depende de muitos fatores, tais como o agente causador, a idade, peso e condições clínicas do paciente assim como a experiência e julgamento do médico ou do profissional que administra a terapia. A quantidade efetiva do óleo de café é a que fornece melhora no paciente detectável por um profissional qualificado. O intervalo de dosagem varia com o composto usado, a via de administração e a potência do composto particular.

Porém, para a concretização da presente invenção, os dois tipos de café (cru e torrado) foram encaminhados para extração em prensa industrial. O equipamento utilizado foi uma prensa (Piratininga®) do tipo "Expeller" adaptada para extração do óleo de grãos de café tanto cru como torrado. A máquina foi readaptada para receber moega, bandejas coletoras e vasos em aço inoxidável apropriados para obtenção de óleo para uso no experimento, sem contaminação de outras matérias primas ou óleos extraídos, garantindo ainda assim um produto de qualidade e possível de ser repetido em posterior industrialização.

As seis sacas de café para cada tipo de café cru e as seis de café torrado geraram respectivamente 23 e 38kg de óleo bruto. Esse volume foi compatível com o volume mínimo necessário de 20kg para operar o filtro do tipo prensa. O filtro prensa horizontal de fechamento manual foi especialmente construído para a filtragem sob alta pressão e obtenção de óleo límpido, além da separação da borra de filtro com alto teor de matéria não saponificável de interesse para ser utilizada nos tratamentos. A Tabela 1 apresenta os rendimentos do processo de extração realizados.

Tabela 1. Rendimentos do processo de extração de óleo de grãos de café (C. arábica) crú e torrado por prensa do tipo "expeller"

Esterilização dos óleos

O material processado na extração e filtragem foi acondicionado em frascos de vidro fechados, lacrados, com amostras identificadas que foram encaminhadas para teste de esterilização por raios gama para uma empresa que utiliza como emissor radioisótopo 60 Co. Os diferentes materiais (óleo e borra de café cru e torrado) devidamente identificados foram submetidos às doses 3; 5; 7; 10; 12 e 15 KGy.

Após a irradiação foi realizado um estudo de contaminação em placas de cultura de microrganismos. Alíquotas de 20μΙ_ de material (óleo ou borra) obtido na filtragem na fábrica, para contagem de unidades formadoras de colónias em meios Ágar Sangue, Ágar Chocolate, BHI (Brain Heart Infusio)

Caldo e Sabouraud, especial para fungos. Todas as amostras testadas inibiram o crescimento de microorganismos.

Por este motivo, optou-se por utilizar os óleos esterilizados com a menor dose de radiação (3KGy) para aplicação nos tratamentos dos ferimentos nos animais.

Análise dos óleos

Para caracterizar a proporção de ácidos graxos nos diferentes óleos extraídos e irradiados, uma alíquota do extrato lipídico contendo aproximadamente 400 mg de lipídios, foi seca em evaporador rotatório. A transmetilação foi realizada de acordo com o método de Hartman & Lago (1973), usando solução de cloreto de amónia e ácido sulfúrico em metanol como agente esterificante.

A cromatografia gasosa foi realizada em um cromatógrafo a gás, marca Varian, modelo 3900, equipado com amostrador automático; injetor split, razão 75:1 ; coluna capilar CP-SIL 88 (100 m x 0,25 mm i.d., 0,20 μπι de filme); detector por ionização em chama (FID) e uma workstation para aquisição dos dados.

Condições cromatográficas: temperatura da coluna programada, temperatura inicial 120°C/2min, aquecimento de 120°C a 220°C numa escala de 2,2°C/min e de 220 a 235°C numa escala de 1 ,5°C/min, permanecendo em

235°C por 15 minutos; gás de arraste, hidrogénio numa vazão de 1 mL/min; gás "make-up", nitrogénio a 30 mL/min; temperatura do injetor, 270°C; temperatura do detector, 310°C; volume de injeção 1 μL.

5 A identificação dos ácidos graxos foi realizada através da comparação do tempo de retenção dos ácidos graxos das amostras e padrões e co-cromatografia.

A quantificação foi realizada por normalização de área e os resultados foram expressos em g/100g de amostra.

0 Na Tabela 2 são apresentados os dados relativos à composição dos ácidos graxos dos óleos em função da torra dos grãos e dos tratamentos com raios gama. Não foi observada nenhuma diferença significativa em função da aplicação de nenhuma das doses de raios gama aplicadas.

Tabela 2.: Composição (%) dos ácidos graxos dos óleos de café cru e torrado5 submetidos a diferentes doses de radiação gama para fins de esterilização.

Café Torrado Café Crú

Dose Raios Gama Dose Raios Gama

(K (K

0 3 5 7 10 12 15 Mé 0 3 5 7 10 12 15 Mé

Ácido

C14 0. 0. 0, 0. 0. 0, 0, 0.1 0. 0. 0. 0. 0, 0, 0, 0.1

C16 31 31 31 31 31 31 31 31, 30 30 30 30 30 30 30 30,

C17 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,1 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0

C18 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8, 8.6 9, 9, 9, 9, 9, 9, 9, 9,3 C18:l 10 10 10 10 10 10 10 10, 9, 9, 9, 9, 9, 9, 9, 9,2

C18:2 38 38 38 38 38 37 38 38, 40 39 40 40 40 39 39 40,

C18:3 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,1

C20 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3,2 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3, 3,3

C21:l 0, 0, 0, 0, 1, 0, 0, 0,4 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,2

C20:3 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,2 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,2

C22 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,6 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,8

N.Knão 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,2 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,1

C24 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,2 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,2

Ácidos

Totaliza

Saturad 44 44 44 44 44 44 44 44. 44 44 44 44 44 44 44 44. onoin 11 11 11 11 11 10 11 11, 9, 9, 9, 9, 9, 9, 9, 9,4

Poliinsat 39 39 39 39 39 39 39 39, 41 41 41 41 41 41 41 41, ômega 6 38 38 38 38 38 38 38 38, 40 40 40 40 40 40 40 40, ômega 3 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,1 trans 0 0 0 0 0 0 0 0,0 0 0 0 0 0 0 0 0,0

N.l. (não 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 0,0 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0 0,0

Veículo farmaceuticamente aceitável:

A absorção local e a eficácia da presente invenção pode ser melhorada utilizando-se como veículo uma quantidade apropriada de ácidos 5 graxos essenciais de cadeia média ou outros compostos químicos conhecidos por facilitar a absorção e entrega dos compostos ativos da presente invenção usada como veículo para o óleo de café. Este será o veículo preferencial da composição da presente invenção em um percentual adequado (q.s.p.) para atingir 100% da fórmula com base no peso total da composição. Ainda podem0 ser utilizados outros veículos farmaceuticamente aceitáveis como solução salina e tampões.

Além destes componentes, a composição da presente invenção ainda pode compreender componentes opcionais tais como:

- Agente quelante como ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) e5 seus sais;

- Agente ajustador de pH como trietanolamina ou hidróxidos inorgânicos;

- Agente conservante como parabenos, ácidos orgânicos, imidazolidininas, diazolidinas, álcoois fenólicos; - Emoliente como álcoois e ácidos graxos, ésteres, éteres, mono-, di- ou triglicerídeos, hidrocarbonetos naturais ou sintéticos ou carbonatos orgânicos e suas combinações.

Umectante como glicóis, preferencialmente glicerina, propilenoglicol, butilenoglicol e suas combinações.

- Agente bacteriostático como hidroxibenzoato de metila, hidroxibenzoato de propilo, clorocresol, cloreto de benzalcônio e similares.

- Ingredientes ativos como antibióticos, anestésicos, analgésicos e descamativos. Exemplos de drogas representativas dentro dessas classes incluem gentamicina, peróxido de benzoíla, glicocorticoides, hidrocortisona, vitamina D3, metotrexate, ciclosporina, retinóides.

- Corantes;

- Aromatizantes.

A composição descrita no presente invento pode ser preparada empregando qualquer processo conhecido do estado da técnica. O óleo de café extraído através da prensagem dos grãos pode ser misturado sob condições estéreis com um veículo farmacologicamente aceito, e com qualquer conservante, tampão ou propelente que seja necessário. Preparados tópicos podem ser feitos combinando o óleo de café com diluentes farmacêuticos convencionais e veículos usados comumente em formulações tópicas secas, líquidas, em creme e aerossol. Pomadas e cremes podem, por exemplo, ser formulados com base aquosa ou lipídica com a adição de agentes espessantes ou geleificantes apropriados. As pomadas, cremes, pastas e géis podem conter também excipientes, tais como gorduras vegetais e animais, óleos, ceras, parafinas, amido, derivados de celulose, talco, óxido de zinco, silicones, polietilenoglicol, ácido silícico entre outros. Pós e sprays podem conter excipientes tais como lactose, talco, ácido silícico, hidróxido de alumínio, silicato de cálcio e pó de poliamida, ou uma mistura destas substâncias. Adicionalmente, os sprays podem conter propelentes, tais como clorofluorohidrocarbono, butano e propano.

Exemplo 1 : Testes in vivo Para os testes foram utilizadas fêmeas de ratos isogênicos da espécie Rattus norvegicus albinus linhagemNTacUnib:SD (SpragueDawIey), com idade média de 7 semanas e massa entre 220 a 270g. O experimento foi autorizado pela Comissão de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Estadual de Campinas, de acordo com a Lei Federal 6.638.

Após o período de adaptação nas gaiolas os animais foram preparados para a realização dos ferimentos e passaram a receber os tratamentos diários com os diferentes tipos de óleo, separados em "grupos" conforme indica a Tabela 3 abaixo. Em cada grupo de animais foram sub- divididos para serem sacrificados nos dias 2, 4 e 10 após a aplicação do primeiro tratamento.

A mudança dos períodos projetados para sacrifício de dois, sete e 14 dias, se deu porque observou-se clinicamente um processo de cicatrização mais rápido do que o previsto nos períodos menores de 4 e 10 dias as três fases da cicatrização poderiam ser avaliadas de modo mais adequado.

Respeítando-se o sentido da cabeça para a cauda, e/n todos os animais foram feitas quatro feridas do lado esquerdo, designadas como "A", "B", "C" e "D" e as do lado direito outras quatro designadas "E", "F", "G" e "H". O lado esquerdo recebeu sempre o produto de "Controle" ou "Testemunha" e o direito o "Tratamento".

A Tabela 3 mostra esquematicamente a distribuição das feridas e dos tratamentos recebidos por cada grupo de animais.

Tabela 3. Tratamentos aplicados em cada grupo de estudo.

Lado Esquerdo (Controle) Lado Direito (Tratamento)

Grupo 1 Curativo oclusivo com gaze estéril Óleo mineral (Nujol®)

Ácidos Graxos Essenciais -

Grupo 2 Óleo mineral (Nujol®) AGE®

Grupo 3 Óleo mineral (Nujol®) Óleo de café cru

Grupo 4 Óleo mineral (Nujol®) Óleo de café torrado Para receber o tratamento especificado e evitar estresse, cada animal foi conduzido para sala separada dos demais onde foi anestesiado com uma dose específica para sua classe de massa com quetamina 50mg.kg "1 , xilazina 7,0 mg. kg '1 e diazepam 2,0 mg.kg "1 . Após estar completamente anestesiado as regiões paravertebrais e escapulares foram completamete tricotomizadas e foi feita desinfecção com uma solução de 2% de digliconato de clorexidina para assepsia da área onde seriam produzidas as feridas.

Na área tricotomizada foram feitas 4 feridas do lado direiro e outras 4 do lado esquerdo, cerda de 1 cm ao longo da coluna vertebral. Para uma melhor homogeniedade dos ferimentos tanto entre os 8 ferimentos de cada animal como entre todos os animais estudados, utilizou-se um bisturi circular descartável com 6mm de diâmetro para um corte na forma de disco em toda a profundidade da pele. O fragmento cutâneo em forma de disco era levantado por pinça e excisado com tesoura.

Imediatamente após os ferimentos serem produzidos, o animal recebeu a primeira aplicação do produto específico para cada ferida como estipulado na Tabela 3, que foi coberta com uma gaze para cada lado do animal a fim de se evitar contaminação dos diferentes óleos aplicados no mesmo animal. A gaze foi presa por esparadrapo do tipo micropore e reforçada com esparadrapo externo. Diariamente os ferimentos foram limpos com soro fisiológico, os tratamentos repetidos com os respectivos óleos e os curativos substituídos até o dia determinado para o sacrifício. Para os curativos diários os animais não foram anestesiados para que não houvesse interferência no metabolismo hepático, uma vez que todos os animais aceitaram todos os procedimentos sem agressividade e foram tolerantes à manipulação. O dorso e cada ferimento de cada animal foram fotografados com câmara e lupa digital, respectivamente, para avaliação posterior.

Após sorteio para sacrifício nos dias 2, 4 ou 10 os animais em que haviam sido produzidos os ferimentos foram novamente anestesiados com tíopental (85,0 mg.kg "1 ), fotograficamente documentados e decaptados com guilhotina. Imediatamente após, o sangue foi coletado para as dosagens das substâncias relacionadas com inflamação pela técnica Elisa.

A pele das áreas tricotomizadas da região dorsal foram excisadas até a fáscia, separando-se as metades proximais, com duas feridas de cada lado para fixação em formal a 10% até o preparo das lâminas para avaliação histopatológica.

Novas biópsias com lâminas circulares de mesmo diâmetro foram feitas nos quatro pontos das biópsias anteriores na porção caudal da pele excisada. Cada um dos quatro fragmentos de derme ou pele retirados foram imediatamente identificados e colocados em recipiente contendo nitrogénio líquido sendo crioconservados a -80°C no final do período do experimento até o preparo para as dosagens teciduais (PCR real time) das substâncias associadas à apoptose.

A avaliação visual feita durante a manipulação diária de cada um dos animais, para renovação do tratamento, registro fotográfico e troca de curativos, indicou uma melhora significativa dos animais do Grupo 4 tratados com óleo de café torrado. A partir do segundo ou terceiro dia pod/a-se observar uma cicatrização mais efetiva dos ferimentos. No Anexo 1 pode-se observar um exemplo do aspecto dos ferimentos no quarto dia de tratamento.

No dia de sacrifício de cada animal, os ferimentos animais foram fotografados com distância focal constante, de modo a manter a mesma escala em todas as imagens. As áreas não cicatrizadas foram quantificadas em número de "pixel". As escalas das fotografias das peças excisadas foram corrigidas para determinação da área, utilizando-se o programa " ImageTool v.3 UTHSCSA - The University of Texas Health Science Center in San Antonio". Nos Anexos 2, 3, 4, e 5 estão as fotos de todas as peças. Nas Tabelas 4, 5 e 6 são apresentados as áreas obtidas e as análises parciais das regressões dos ferimentos.

Tabela 4. Áreas em pixel dos ferimentos tratados por 2 dias.

D2 02 02 D2 D2 D2 D2 D2

G1 2240 G2 2758 G3 2720 G4 1153

G1 3635 G2 4928 G3 2161 G4 957

G1 1556 G2 4044 G3 5815 G4 577

G1 2355 G2 4180 G3 6424 G4 1391

G1 4758 G2 3601 G3 0 G4 0

G1 4059 G2 7246 G3 3039 G4 269

G1 6115 G2 7893 G3 2177 G4 2058 G1 3886 G2 3996 G3 0 G4 2881

G1 3522 G2 5101 G3 4434 G4 198

G1 6922 G2 3976 G3 2536 G4 1490

G1 5448 G2 4577 G3 3692 G4 2490

G1 4907 G2 4172 G3 4676 G4 3214

G1 3251 G2 4128 G3 3343 G4 3278

G1 4152 G2 3270 G3 2774 G4 1355

G1 4236 G2 3343 G3 4665 G4 1360

G1 6495 G2 5676 G3 3355 G4 1607

G1 1713 G2 235 G3 4906 G4 313

G1 2416 G2 3573 G3 4391 G4 2311

G1 3661 G2 2953 G3 5809 G4 2060

G1 1544 G2 4127 G3 6417 G4 3609

Tabela 5. Áreas em pixel dos ferimentos tratados or 4 dias.

D4 D4 D4 D4 D4 D4 D4 D4

G1 7248 G2 12988 G3 4939 G4 791

G1 1068 G2 7809 G3 2974 G4 4381

G1 4842 G2 7099 G3 3016 G4 2307

G1 3085 G2 5894 G3 3513 G4 2419

G1 17033 G2 6980 G3 3140 G4 2076

G1 3394 G2 1578 G3 3033 G4 3512

G1 5882 G2 12355 G3 2985 G4 6348

G1 5573 G2 8151 G3 2203 G4 6460

G1 16062 G2 3060 G3 3014 G4 0

G1 3818 G2 1301 G3 2333 G4 5585

G1 4162 G2 10792 G3 3882 G4 6676

G1 5349 G2 3874 G3 3807 G4 7480

G1 4986 G2 2593 G3 2935 G4 5136

G1 3533 G2 5331 G3 2973 G4 5547

G1 4013 G2 7097 G3 3022 G4 5564

G1 4013 G2 5227 G3 3724 G4 4654

G1 G2 11235 G3 3088 G4 4756

G1 G2 6222 G3 2902 G4 2886

G1 G2 5015 G3 3578 G4 3418

G1 G2 11205 G3 3944 G4 5779

Tabela 6. Áreas em pixel dos ferimentos tratados por 10 dias.

D10 D10 D10 D10 D10 D10 D10 D10

G1 40 G2 0 G3 0 G4 55

G1 116 G2 134 G3 0 G4 0 G1 127 G2 0 G3 0 G4 0

G1 185 G2 0 G3 71 G4 0

G1 0 G2 0 G3 0 G4 0

G1 7 G2 0 G3 582 G4 0

G1 0 G2 840 G3 1688 G4 0

G1 24 G2 846 G3 5056 G4 0

G1 39 G2 0 G3 0 G4 0

G1 196 G2 0 G3 0 G4 2214

G1 211 G2 226 G3 0 G4 0

G1 418 G2 142 G3 291 G4 238

G1 0 G2 0 G3 24 G4 0

G1 85 G2 1147 G3 3295 G4 0

G1 58 G2 255 G3 4231 G4 0

G1 62 G2 361 G3 19 G4 0

G1 74 G2 198 G3 0 G4 0

G1 87 G2 0 G3 0 G4 0

G1 16 G2 120 G3 340 G4 0

G1 18 G2 154 G3 677 G4 216

Determinou-se para cada ferimento tratado, do lado direito do animal, a redução relativa ao seu oposto topográfico, do lado esquerdo, não tratado. Desse modo pode-se quantificar proporcionalmente quanto do ferimento tratado permaneceu sem cicatrização após o início do experimento, em relação aos ferimentos, do mesmo animal e no mesmo plano transversal. Considerou-se que no dia zero 100%.

Nas Figuras 1 , 2, 3 e 4, respectivamente são apresentadas as curvas da regressão Polinomial de segundo grau, da porcentagem da área ferida não cicatrizada nos animais dos Grupol (testemunha), Grupo 2 (AGE), Grupo 3 (Óleo de Café Crú) e Grupo 4 (Óleo de Café Torrado). No eixo X são indicados os números de dias de tratamento e o no eixo Y o percentual da área ferida, não cicatrizada, considerando-se que no dia Zero todos os ferimentos estavam com a mesma área (100%)

As barras verticais vermelhas representam quando a curva de cicatrização média atingiu 75% de ferimento e 25% cicatrizada e as barras negras quando 50% da área estava cicatrizada. Na Figura 1 , observa-se que os 25% e 50% de cicatrização foram atingidos aos 4,7 e 7,7dias após o início do tratamento.

Os resultados do cálculo das derivadas das equações polinomiais das regressões são apresentados na Tabela 7. O parâmetro (a) das equações de primeiro grau representa o ponto de máxima das regressões de segundo grau e indica o tempo necessário em dias para que a curva atinja o valor zero, ou seja, a cicatrização total do ferimento. Assim quanto mais distante do zero, menor é o efeito inicial de cicatrização do tratamento. Assim, observa-se que o tratamento com AGE teve um efeito inicial melhor do que todos os outros.

O parâmetro (b) indica a inclinação da reta, no caso com valores negativos, é a representação gráfica da área sem cicatrização. Quanto mais inclinada, maior a velocidade de cicatrização. A inclinação das curvas representa os efeitos acumulados ao longo do tempo, corroborando com as observações clínicas, de que os animais tratados com óleo de café torrado apresentaram uma significativa melhora após o quarto dia de tratamento.

Tabela 7. Derivadas das equações de regressão polinomial de segundo grau (y'=a+bx) dos quatro tratamentos estudados.

Na Tabela 8 são resumidos os dias necessários para se atingir 25% e 50% de cicatrização do ferimento inicial e a derivada de segundo grau das curvas. Como os números analisados correspondem ao percentual da área sem cicatrização, o valor negativo da derivada de segundo grau da função polinomial representa a aceleração da cicatrização (% de cicatrização dividido pelo quadrado do tempo) de cada tratamento. Tabela 8. Número de dias para cicatrização de 25% e 50% das áreas tratadas e valor da derivada de segundo grau.

δ ": aceleração de cicatrização

Os animais responderam aos tratamentos com diferentes acelerações de cicatrização. Em ordem crescente o tratamento Testemunha, seguido do Óleo de Café Cru, AGE e Óleo de Café Torrado.

Houve evidente diferença clínica na cicatrização do lado em que só foi realizada a limpeza com soro fisiológico e o lado tratado com óleo mineral nos animais do grupo 1. Esta observação reforça o conhecimento descrito desde 1945 de que a cicatrização é mais efetiva mantendo-se o ambiente úmido (Field & Kerstein, 1994). Os animais do grupo dois (AGE) e do grupo três (óleo de café cru) apresentaram processo cicatricial comparável clinicamente. Os ratos tratados com óleo de café torrado apresentaram a melhor recuperação ao longo do período de 10 dias tratamento, tendo sido possível observar melhora já a partir do terceiro dia.

Os resultados encontrados com a medida das áreas das úlceras mostraram maior velocidade de cicatrização de forma crescente com o AGE, óleo de café cru e óleo de café torrado. A área cicatricial, contudo, por vezes era difícil de ser medida pela presença de crostas que não se destacavam com a limpeza realizada de forma delicada. As crostas que persistiam não eram removidas porque a avaliação objetiva histológica foi o parâmetro considerado mais relevante.

Exemplo 2: Análise histológica

O preparo das lâminas para a análise histológica foi realizado da seguinte forma: os ferimentos da porção proximal foram conservados inicialmente em álcool e posteriormente em formol em frascos individuais devidamente identificados para a elaboração das lâminas para a análise histológica. Após a extração de cada ferida de uma seção longitudinal abrangendo todo o ferimento ou cicatriz remanescente, a peça foi corada pelo método de Hematoxilina e Eosina (HE) e contida em bloco de parafina para o trabalho em micrótomo e montagem da referida lâmina.

As lâminas foram analisadas subjetivamente e objetivamente para estimativa da taxa de cicatrização dos ferimentos de forma cega, isto é, sem que os avaliadores soubessem a identificação da lâmina que examinavam. 1 ) Avaliação histológica subjetiva

A avaliação histológica subjetiva foi feita de maneira cega, isto é, a médica dermatopatologista que participou do projeto, fez a avaliação sem saber a identificação das lâminas que examinava.

No dia 2 (fase inflamatória) pode-se observar que a reepitelização já havia iniciado, ou seja, a epiderme começava a proliferar para cobrir a ferida (quanto mais acelerada a cicatrização, maior a extensão da ferida que já apresentava reepitelização), porém, nesta fase do processo, não se justificava avaliar a extensão da ferida que já se encontrava reepitelizada, porque todos os animais estavam começando este processo. Os vasos estavam muito congestos; quanto maior o número de vasos dilatados, nesta fase, melhor para que a cicatrização ocorra. Foi feita uma avaliação subjetiva: 0= leve; 1 = evidente. Na fase seguinte, eles já não estavam tão dilatados, mas as suas células começaram a proliferar e foram avaliadas no item "celularidade".

O tecido colágeno dérmico bem imaturo começou a ser observado, pouco celular, com muita substância fundamental basófila. Sabe-se que para esta fase, quanto mais tecido conjuntivo jovem, mais adiantada está a cicatrização. As células deste tecido conjuntivo já podem começar a aparecer nesta fase da cicatrização e quanto mais presentes, melhor o processo cicatricial. A celularidade também foi estimada, de forma subjetiva: 0= muito baixa; 1 = baixa; 2= evidente; a porcentagem de colágeno jovem presente na cavidade operatória também foi estimada de forma subjetiva. Apesar de não haver avaliação histológica no dia 3, pode-se inferir avaliando os animais do dia 4 que nesta fase houve um significante aumento da celularidade. Estas eram células endoteliais (de vasos neoformados, que trazem nutrição para ajudar a cicatrizar) e células produtoras de colágeno (fibroblastos e miofibroblastos). O colágeno pode ser observado em maior quantidade no dia 4 naqueles com cicatrização mais adiantada.

No dia 4 a fase proliferativa, reepitelização, já estava bem avançada, com maior extensão da área de reepitelização. A cicatrização foi avaliada: (0= incipiente; 1 = avançada; 2= completa ou quase completa).

Nesta fase ainda havia um significante número de células, mas, nos animais em fase mais adiantada de cicatrização, a celularidade que se iniciou no 3 9 dia começa a diminuir já que, à medida que o colágeno vai sendo produzido, ele vai inibindo a produção de células (chamada inibição de contato) e, nos animais nestes animais com cicatrização mais adiantada já havia colágeno maduro. Naqueles com cicatrização menos efetiva havia mais células e menos colágeno maduro (observado como fibras acidófilas mais espessas) e bastante colágeno imaturo, como no 2- dia. A cavidade formada no experimento em parte já se encontrava preenchida; contudo, não a área central. Foi estimada de forma subjetiva a porcentagem de preenchimento relativa à pele normal adjacente (em 5). Quanto ao tecido que preenchia a ferida e que continha células, fibrina, colágeno jovem e colágeno maduro; a quantidade de fibras colágenas maduras foi estimada, de forma subjetiva (0= nenhuma quantidade; 1 = poucas fibras; 2= fibras mais evidente; 3= várias fibras; 4= numerosas fibras).

No dia 10 (fase de remodelação) os animais já tinham a reepitelização completa. Alguns ainda tinham resquícios do colágeno jovem (o mesmo do 2- dia) que ainda não foi substituído pelo maduro, de fibras espessas. Uma boa parte da cavidade formada no experimento já se encontra preenchida; contudo, a área central ainda estava deprimida, relativamente à pele normal adjacente. O preenchimento foi estimado em porcentagem. Com relação ao tecido que estava preenchendo a ferida operatória, nesta fase observaram-se áreas mais celulares e outras menos, em proporção inversa à do número de fibras colágenas maduras. Foi feita uma estimativa percentual da quantidade de fibras colágenas maduras que ocupavam o tecido que estava preenchendo a ferida.

A avaliação subjetiva não evidenciou diferença estatística entre os grupos, porém, no segundo dia do experimento, observou-se uma melhor cicatrização nos animais que utilizaram o óleo de café cru e o óleo de café torrado nos parâmetros observados no segundo dia. No quarto dia, os achados sugeriram menor celularidade nos três grupos: AGE, óleo de café cru e óleo de café torrado, contudo o preenchimento aparentou ser maior nos animais do grupo sem tratamento. No dia 10 do experimento o preenchimento foi melhor com o óleo de café torrado.

2) Avaliação histológica objetiva

A avaliação objetiva foi realizada em microscópio com tela de ciclóide para contagem de células. Foi avaliado o número de células nos cortes, responsáveis pela cicatrização dos ferimentos. Para tanto quantificaram-se os núcleos celulares que tocavam os semi-círculos do ciclóide.

No ciclóide há 30 semi-círculos. Cada núcleo que tocou um dos ciclóides ou semi-círculos foi contado. Este é um método comparativo, que mostra se a cicatrização está desenvolvida (adulta, composta de fibrócitos) ou se ainda é jovem (composta por fibroblastos). Na "fase adulta", o número de núcleos é pequeno; na "fase jovem", o número de núcleos é maior. Dessa forma, se uma amostra tem muitos núcleos, pode-se dizer que o tecido é jovem (ainda está no início do processo cicatricial).

A análise objetiva foi baseada na contagem da celularidade, como já descrita anteriormente e é o parâmetro mais importante na análise do efeito dos tratamentos sobre a cicatrização.

A menor celularidade foi observada nas úlceras tratadas com o

AGE e com o óleo de café torrado quando comparadas com o lado coníralateral em que as úlceras foram tratadas com óleo mineral o que documentou uma melhor cicatrização com estes óleos. As úlceras tratadas com o óleo de café cru tiveram cicatrização pior que quando foi usado apenas óleo mineral e soro fisiológico nas úlceras dos animais do grupo 1 .

Exemplo 3: PCR quantitativo (qPCR) - PCR real time (análise de citocinas inflamatórias no tecido cicatricial)

Foi feita a avaliação tecidual com Real-Time PCR para procurar entender a ação local do produto utilizado e avaliação sorológica para avaliar possível ação sistémica do produto utilizado sobre a derme.

As citocinas inflamatórias avaliadas têm diferentes ações sobre o processo cicatricial e umas têm ação mais intensa nas fases iniciais da cicatrização. Por esta razão as dosagens, além da avaliação histológica, também foram feitas nas diferentes fases da cicatrização: D2, fase inflamatória; D4, fase proliferativa e D10, início da fase de remodelação que se extende por meses.

Foi feita extração de RNA total das amostras de pele congeladas à -80 9 C, segundo método do reagente Qiazol (Qiagen, USA). Para a produção do cDNA, utilizamos o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), sendo a concentração final do cDNA de 3,0 [ lg. Este cDNA foi diluído segundo a concentração necessária para a amplificação eficiente de cada gene, sendo esta eficiência verificada segundo método descrito abaixo.

As reações de PCR em tempo real foram realizadas utilizando-se o sistema TaqMan™ (Applied Biosystems), que é constituído por um par de primers e uma sonda marcada com um fluoróforo. Para os genes adiponectina e leptina foram utilizados kits TaqMan™ assays (Applied Biosystems) Rn00595250_m1 e Rn00565158_m1 , respectivamente.

O gene GAPD Rat (TaqMan™ - Applied Biosystems), Part number 4352338E, foi escolhido como controle endógeno da reação, o qual serve para normalizar a expressão do gene de interesse nas diferentes amostras. A sonda GAPD está marcada com o fluoróforo VIC, enquanto os primers para os alvos estão marcados com o fluoróforo FAM.

Antes de se iniciarem os experimentos de quantificação relativa da expressão de qualquer gene, foi realizada a validação do sistema gene alvo, no caso, adiponectina e leptina, com o controle endógeno GAPD rat. Verificamos que as eficiências de amplificação dos genes foram próximas a 100%. Esse passo é essencial para que o controle endógeno possa ser utilizado para normalizar os valores de expressão relativa do gene de interesse.

A validação da eficiência dos genes de interesse consistiu na amplificação, tanto com os primers dos genes de interesse quanto com o do controle endógeno, dos cDNAs de triplicatas de concentrações diferentes (diluições seriadas) de uma amostra escolhida aleatoriamente. Em seguida, foi construída uma curva padrão a partir do logaritmo da concentração das amostras pelo Ct [Threshold Cycle: ciclo em que cada curva de amplificação atravessa o limiar de detecção {Threshold), o qual é definido arbitrariamente]. Nessa curva, foram obtidos os valores da inclinação (slope) da curva e da confiabilidade das réplicas (R2). Dessa forma, a eficiência do um sistema foi calculada através da fórmula: E = -| o (" s/ope) -1 . Para a placa de validação dos genes adiponectina, leptina e GAPD, foram feitas triplicatas de uma amostra de cDNA de hepatócito de rato em 7 concentrações diferentes (diluições seriadas de 5x).

Após o cálculo das eficiências de amplificação de cada gene de interesse e do controle endógeno, foi construído um gráfico de dispersão, o qual tem por finalidade definir qual é a amplitude de concentrações para as quais o sistema é eficiente. Para a construção do gráfico, foram utilizados os mesmos valores de logaritmo da concentração das amostras no eixo X e a diferença entre as médias dos Cts do controle endógeno e as médias dos Cts do gene de interesse para cada concentração no eixo Y. A seguir, obteve-se uma linha de tendência para estes valores, a qual possui uma equação de reta na qual é possível verificar o valor da inclinação desta reta. Para que um sistema seja considerado eficiente, o valor da inclinação deve ser menor que 0,1 (quanto mais próximo de zero for este valor, menor é a inclinação da curva e, portanto, mais constante é a diferença entre as médias dos Cts do gene de interesse e do controle endógeno). Os pontos no gráfico, correspondentes às concentrações, que estiverem mais próximos à linha de tendência são considerados validados (o sistema tem 100% de eficiência nestas concentrações).

A concentração de amostra validada como eficiente para os genes adiponectina, leptina e GAPD foi de 40,0 ng de cDNA.

Para a quantificação relativa dos genes em estudo, as reações de PCR em tempo real foram realizadas em triplicata a partir de: 6,25μί_ de TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystmes, Foster City, CA, USA) 2x, 0,625μ1_ da solução de primers e sonda, 1 ,625pL de água e 4,0μΙ_ de cDNA (40ng de cDNA) , sendo que no controle negativo, foi adicionado 4,0 μΙ de água ao invés do cDNA. As condições de ciclagem utilizadas foram: 50°C por 2 minutos, 95°C por 10 minutos e 40 ciclos de 95°C por 15 segundos e 60°C por 1 minuto. Os valores da expressão gênica relativa foram obtidos pela análise dos resultados no programa 7500 System SDS Software (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Os resultados obtidos por dosagem com real-time PCR das citocinas inflamatórias estão descritos abaixo

Os valores obtidos foram os dados calculados de RQ, que é a Quantificação Relativa.

Os métodos para Quantificação Relativa da Expressão Gênica permitem quantificar diferenças no nível de expressão de um gene específico (alvo) entre as diferentes amostras. A produção de dados é expressa como uma alteração ou diferença no número de vezes nos níveis de expressão. Para o estudo, uma amostra foi escolhida como calibradora e também foi escolhido um gene endógeno para normatizar os resultados. Os resultados normatizados obtidos são sempre relativos ao dado do calibrador. A amostra calibradora utilizada para todos os grupos foi a que apresentou o valor mediano entre as três medições realizadas, para cada dia de tratamento (dois, quatro ou dez dias).

Os resultados obtidos mostraram que a adiponectina estava aumentada tecidualmente no D4 e D10 no grupo 3 quando comparada ao grupo controle e aumentada no grupo 4 quando comparada ao lado contralateral. O IGF-1 estava aumentado nos dias 2 e 4 no grupo 3 quando comparado ao grupo controle e tanto no grupo 3 como no grupo 2 quando comparado ao lado contralateral. A IL-6 apresentou melhores resultados teciduais no grupo 3 e no grupo 2 quando comparados ao controle e no grupo 3 e no grupo 4 no D2 quando comparados com o lado contralateral. O IFN-alpha apresentou melhores resultados nos dias iniciais (2 e 4) no grupo 2 e no grupo 4 e, no dia 10, .no grupo 3 quando comparado ao grupo controle. Na comparação com a ferida contralateral, o grupo 2 apresentou melhor resultado. O IFN-gama apresentou melhores resultados nos grupos 2 e 4 em relação ao grupo controle e no grupo 2 em relação às feridas contralaterais. A IL-12, que como os IFN tem ação anti-cicatricial, apresentou menores níveis no grupo 4 quando comparado com o grupo controle e no grupo 2 quando comparada às feridas contralaterais.

O TNF-alpha e a leptina apresentaram melhores resultados no grupo 3 quando comparado ao grupo controle. A leptina esteve aumentada no grupo 2 quando comparada à ferida contralateral.

A IL-2 apresentou-se aumentada no grupo 3 tanto quando comparado ao grupo controle como às feridas contralaterais. Esta citocina esteve aumentada também no grupo 4 quando comparada ao grupo controle. Não foram observadas variações expressivas quanto à IL-4.

Exemplo 4: Elisa (análise de citocinas inflamatórias no soro)

Este ensaio emprega a técnica de imunoensaío sanduíche quantitativo. Um anticorpo monoclonal específico para a substância alvo é pré- adicionado em uma microplaca ainda na fábrica. As amostras, controles e padrões são pipetados para os poços e se a substância em estudo estiver presente será ligada pelo anticorpo imobilizado. Depois de lavar as substâncias não ligadas, um anticorpo policlonal com enzima ligada específica para a substância é adicionado aos poços. Após uma lavagem para remover qualquer reagente anticorpo-enzima não ligado, uma solução de substrato é adicionado aos poços. A enzima de reação produz um produto azul que fica amarelo quando a Solução de Parada é adicionada. A intensidade de medição de cor está em proporção com a quantidade de substância alvo ligado na etapa inicial. Os valores da amostra são então lidos a partir da curva padrão.

Para as reações realizadas neste projeto, foram usados kits comerciais de ELISA Quantikine, da R&D Systems (Minneapolis, EUA) para as substâncias IL-6, IGF-1 e TNF-alfa; para as substâncias leptina e adiponectina foram usados kits comerciais fornecidos pela empresa Millipore (St. Charles, Missourí, EUA).

As placas dos 5 kits foram analisadas no leitor de microplaca Bio Rad 680, BioRad Laboratories (Hercules, CA, EUA), nos comprimentos de onda de 490 e 570nm, conforme recomendação dos fabricantes.

As quantificações das citocinas inflamatórias dosadas por técnica Elisa estão sumarizadas na Tabela abaixo:

Tabela 9: Resumo dos valores encontrados nas dosagens das citocinas pelo método Elisa

IGF-1 Controle AGE Café cru Torrado

Dia 2 594,56 602,21 1029,02 730,48

Dia 4 767,18 884,84 924,57 813,58

Dia 10 786,54 960,43 616,76 812,59

IL-6 Controle AGE Café cru Torrado

Dia 2 280,1067 255,5352 243,6248 270,7462

Dia 4 256,3285 259,4808 251 ,1673 273,7785

Dia 10 276,9472 222,9879 225,3636 1 269,0089

Adiponec Controle AGE Café cru Torrado

Dia 2 8,97218 11 ,11608 9,766461 7,92819

Dia 4 8,337174 8,712682 9,493863 8,137195 ) Dia 10 l 16,52638 l 13,46616 ) 8,367467 \ 11 ,89413 [

Sistemicamente, pode-se observar diferença favorável ao grupo 4 com a IL-6, o IFN-alp a (nos dias iniciais, 2 e 4), o IFN-gama, a leptina, e IL-2, IL-12 (no dia 10).

As citocinas que favoreciam a cicatrização no grupo 3 foram o

IGF-1 , INF-alpha e a IL -12 (no dia 10). A adiponectina esteve sistemicamente favorável à cicatrização que ocorreu no grupo 2. Neste grupo a IL-12 estava elevada neste grupo, agindo favoravelmente nos dias iniciais (2 e 4).

A IL-4 esteve elevada no grupo , favorecendo a cicatrização.

Exemplo 5: Intrepretação estatística das avaliações das citocinas inflamatórias no tecido cicatricial (Real-Tíme PCR) e sistémico (Elisa)

Na PCR, que avalia a quantidade de citocinas no tecido, foi possível determinar diferença estatisticamente significante favorável ao grupo 3 (do óleo de café cru) quando comparado ao grupo controle para as citocinas: IGF-1 e leptina (apenas no dia 4). Quando comparada a ferida contralateral, as citocinas encontradas em níveis favoráveis à cicatrização para no grupo 3 foram INF-alpha e gama e leptina (no dia 4).

Para o grupo 4 (óleo de café torrado) a quantidade de citocinas no tecido com diferença estatística significante foi observada quando foram dosadas apenas a adiponectina e INF-gama quando comparada com o grupo controle e IL-12 quando comparada à ferida contralateral.

O AGE interferiu favoravelmente na produção tecidual do IGF- , IFN-alpha e IL-12 quando comparados ao grupo controle e do ITN— alpha quando comparado à ferida contralateral.

Sistemicamente, pela dosagem sanguínea por Elisa, observou-se favorável e diferença estatisticamente significante da IL-2, do IFN-alpha e gama no grupo 4, da adiponectina nos grupos 2 e 4, do TNF-alpha no grupo 2 e da IL-12 nos grupos 2 e 3.

Desta forma, foi possível constatar que o óleo de café torrado foi mais eficaz que o óleo mineral e o óleo de café cru em promover cicatrização nas feridas produzidas nos ratos. Isto foi observado na clínica, na avaliação da área das úlceras e na avaliação histológica.

O óleo de café torrado produziu ação cicatricial tecidual com diferença estatística significante quando dosadas a adiponectina e INF-gama e a dosagem sistémica da adiponectina, o IFN-alpha e gama e a IL-2 sugerindo a relevância destas citocinas no processo cicatricial.

Este efeito sistémico sinaliza para um possível uso medicamentoso do óleo de café, uma vez que muitas dermatoses e outras doenças estão relacionadas à elevada produção de TNF-α, por exemplo, como psoríase e várias doenças reumatológicas. Este efeito sistémico se evidenciou particularmente no segundo dia do experimento.

Localmente estes óleos estimularam ou inibiram a produção de várias das citocinas estudadas. O aumento na produção de IGF-1 , IL-6 e TNF-a no décimo dia foi concordante com os dois óleos de café.

Frente aos resultados obtidos, fica evidenciado a presença de um agente com ação cicatrizante, não identificado, presente, ou com maior efetividade no óleo de café torrado, em comparação aos demais tratamentos. Sendo assim, o uso de composições a base de óleos de café sistemicamente no tratamento de doenças inflamatórias deverão ser foco de novos estudos, já que existe evidente potencial para a utilização destas substâncias no tratamento de outras dermatoses e outras doenças sistémicas que exigem uso oral ou parenteral das medicações.