La présente invention concerne des compositions multivalentes hyper-enrichies en au moins deux populations d'immunoglobulines, chaque population consistant en des immunoglobulines capables de reconnaître, et avantageusement neutraliser, un virus distinct.

Arrière-plan technologique

De nombreuses infections virales restent non traitées, ou mal traitées. Des stratégies d'immunisation passive ont été développées, qui impliquent l'administration d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre les virus. Les anticorps administrés peuvent lier les antigènes viraux, résultant en une neutralisation du virus et/ou en faisant du virus une cible pour la phagocytose et la présentation de l'antigène aux lymphocytes T CD4+. Dans le cas des anticorps monoclonaux, leur activité est réduite à une cible et un épitope sur cette cible. Cette approche ne permet donc pas de cibler plusieurs agents pathogènes communs à une même problématique (tels que les infections respiratoires saisonnières, les familles de virus émergents, le rejet infectieux de greffe). L'activité limitée à un épitope au sein d'une protéine du pathogène rend également le mécanisme d'action immédiatement sensible à une mutation ponctuelle. Les taux de mutations étant très élevés chez les virus, en particulier les virus à ARN, l'approche par anticorps monoclonal est de fait limitée par ce risque. La possibilité de combiner deux ou trois anticorps monoclonaux afin d'en augmenter l'activité ou d'élargir le tropisme de la préparation a été explorée mais génère à ce jour des défis technologiques et réglementaires pour un effet limité. Par exemple, le médicament expérimental ZMapp, comprenant trois anticorps monoclonaux, a été évalué dans le traitement de la maladie à virus Ebola, et les résultats restent partiels. Par ailleurs, les immunoglobulines polyclonales hyper-immunes obtenues à partir de plasmas humains hyper-immuns ou de plasmas animaux suite à l'immunisation des animaux avec un antigène viral sont avantageuses du point de vue des risques de mutation mais leur action reste limitée à un seul pathogène. Par ailleurs, les titres en anticorps réellement neutralisants restent modérés et requièrent des volumes d'administration importants. Cette administration de larges quantités d'anticorps étrangers n'est pas exempte d'effets secondaires pour le patient, en particulier lorsqu'une multi-thérapie est désirée.

Résumé de l'invention L'invention fournit une multi-thérapie qui permet le traitement ou la prévention d'une infection par plus d'un virus (que ce soit plus d'une souche virale ou plus d'une espèce virale), par administration d'une composition d'anticorps qui se lient à chaque souche ou espèce. L'invention fournit plus particulièrement une composition d'immunoglobulines hyper-enrichie en au moins deux populations d'immunoglobulines, chaque population consistant en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre un virus distinct.

Une telle composition est utile à titre de composition pharmaceutique, pour une utilisation dans le traitement d'une infection virale, plus précisément une infection par les virus contre lesquels les immunoglobulines sont dirigées.

Les immunoglobulines utilisées sont dirigées préférentiellement contre une protéine de surface du virus visé, qui joue un rôle dans les mécanismes d'infection, notamment au cours de la reconnaissance, de la liaison de la particule virale à sa cellule hôte, de la fusion de la particule virale à sa cellule hôte ou de la propagation du virus de cellule hôte à cellule hôte.

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention fournit une composition dans laquelle une desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre un virus choisi parmi les virus influenzas, les metapneumovirus (MPV), le virus respiratoire syncitial (RSV), les virus parainfluenzas, le virus Zika, le virus de la dengue, le virus de la fièvre jaune, le virus BK (BKV), le virus B19, PEpstein-Barr virus (EBV) ou le cytomégalo virus (CMV).

Avantageusement, la composition d'immunoglobulines ne comprend pas plus de 10, pas plus de 7, pas plus de 5, pas plus de 3 spécificités infectieuses différentes.

Préférentiellement, la composition d'immunoglobulines selon l'invention comprend trois ou quatre populations d'immunoglobulines, chaque population consistant en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre un virus distinct. Dans un premier mode de réalisation particulier, une première desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus RSV humain, une deuxième desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus MPV humain, et une troisième desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus parainfluenza de type 3 humain. Une telle composition est particulièrement utile pour le traitement de troubles respiratoires causés par une infection par au moins l'un de ces trois virus.

Dans un deuxième mode de réalisation particulier, une première desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus Zika, une deuxième desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus de la dengue, et une troisième desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus de la fièvre jaune.

Une telle composition est particulièrement utile pour le traitement d'au moins un symptôme, comme la fièvre ou les douleurs musculaires ou articulaires, causé par une infection par au moins un de ces trois virus. En particulier une telle composition est utile pour le traitement prophylactique, en particulier chez des sujets à risque et/ou dans les territoires à risque.

Dans un troisième mode de réalisation particulier, une première desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus RSV humain, une deuxième desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus BKV humain, et une troisième desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus CMV.

Une telle composition est particulièrement utile pour le traitement d'une infection par au moins un de ces trois virus, en particulier pour le traitement, notamment par prophylaxie, des causes infectieuses majeures de rejet de greffe.

Description détaillée de l'invention

Composition d' immunoglobulines hyper-enrichies

La composition d'immunoglobulines selon l'invention comprend différentes populations d'immunoglobulines. Par «population d'immunoglobulines », on entend un groupe d'anticorps qui se lient à un même immunogène viral (on parle alors de population monovalente d'anticorps), ou à plusieurs immunogènes différents d'un même virus (on pourra alors parler de population polyvalente d'anticorps). Essentiellement, il s'agit d'anticorps polyclonaux. Dans l'ensemble de la description, les termes « immunoglobulines » et « anticorps » peuvent être interchangeables.

La composition d'immunoglobulines selon l'invention contient essentiellement des immunoglobulines humaines polyvalentes qui peuvent être des immunoglobulines A (IgA), des immunoglobulines E (IgE), des immunoglobulines M (IgM) ou des immunoglobulines G (IgG). Avantageusement, la composition d'immunoglobulmes contient essentiellement des IgG et/ou des IgM et/ou des IgA.

Dans un mode de réalisation particulier, la composition d'immunoglobulmes selon l'invention comprend essentiellement des IgG, quelle que soit leur sous-classe (IgGl, IgG2, IgG3 et IgG4). La composition peut être adaptée par l'homme du métier selon la voie d'administration retenue et/ou le mécanisme d'action recherché. Pour une administration par voie intraveineuse par exemple, la composition contient préférentiellement essentiellement des IgG et/ou des IgM, et est avantageusement déplétée en IgA. En revanche, dans d'autres voies d'administration telle que la voie locale, la composition contient préférentiellement essentiellement des IgG et/ou des IgA, les IgA permettant le recrutement de cellules telles que des cellules mucosales présentant des alfa récepteurs.

Par « composition hyper-enrichie en au moins deux populations d'immunoglobulmes », on entend avantageusement une composition d'immunoglobulmes, comprenant au moins 10%, de préférence au moins 20%, au moins 30%>, au moins 40%>, en poids de chacune desdites populations. De préférence, la composition comprend une proportion égale de chaque population d'immunoglobulmes. Typiquement, les compositions d'immunoglobulmes hyper- enrichies sont un sous ensemble de compositions d'immunoglobulmes hyper-immunes. Dans certains modes de réalisation de l'invention, les compositions d'immunoglobulmes hyper- enrichies sont obtenues à partir de compositions d'immunoglobulmes hyper-immunes. Les compositions d'immunoglobulmes hyper-immunes sont similaires aux immunoglobulines intraveineuses (IVIG) excepté qu'elles sont issues de plasma de donneurs présentant des titres élevés d'immunoglobulmes dirigées contre un antigène spécifique. Ces compositions d'immunoglobulmes hyper-immunes contiennent un titre en immunoglobulines liant le pathogène au moins quatre fois supérieur au titre moyen observé dans une immunoglobuline polyvalente normale issue d'une même espèce (notamment humain, lapin, caprin, bovin ou équin). Néanmoins, elles comprennent moins de 10%> en poids de populations d'immunoglobulmes spécifiques du même antigène. Virus et immunogènes viraux

Chaque population consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre un virus distinct. Les populations d'immunoglobulines se lient à différents immunogènes viraux. Dans certains modes de réalisation, les immunogènes viraux proviennent de souches virales différentes (au sein d'une même espèce), ou proviennent d'espèces virales différentes. Le terme « spécifique » signifie que les immunoglobulines reconnaissent et se lient à un immunogène dudit virus, substantiellement sans réaction croisée avec un autre virus (ou le cas échéant une autre souche).

Dans un mode de réalisation particulier, la composition peut en outre comprendre, et de préférence être enrichie, d'au moins une autre population consistant en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre un antigène différent d'un même virus.

Tous les virus susceptibles d'infecter un sujet, humain ou non-humain, de préférence un mammifère, sont compris.

Avantageusement, on cherche à traiter les infections les plus fréquentes, ou les infections qui touchent les sujets les plus sensibles (femmes enceintes, nouveaux-nés, sujets immunodéprimés), et/ou encore les infections pour lesquelles aucun traitement n'est disponible. Parmi les virus, on peut citer les virus de la famille des Flaviviridiae, dont par exemple le virus de l'encéphalite japonaise, le virus West Nile, le virus de la dengue, le virus de la fièvre jaune, le virus Zika, le virus de l'hépatite. On peut aussi citer les virus qui provoquent un trouble respiratoire, notamment une bronchiolite ou une pneumonie, notamment le virus parainfluenza, le virus syncitial (RSV), adenovirus, rhinovirus, metapneumovirus, enterovirus, et coronavirus.

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention fournit une composition dans laquelle une desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre un virus choisi parmi le virus parainfluenza, notamment le virus parainfluenza de type 3, le metapneumovirus (MPV), le virus Zika, le virus de la dengue, le virus de la fièvre jaune, ou le cytomégalovirus (CMV). Dans un mode de réalisation, la composition selon l'invention est enrichie en une population d'immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus RSV. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention fournit une composition dans laquelle une desdites populations consiste en des immunoglobulines dirigées spécifiquement contre un virus choisi parmi le virus parainfluenza, notamment le virus parainfluenza de type 3, le metapneumovirus (MPV), le virus Zika, le virus de la dengue, le virus de la fièvre jaune, ou le cytomégalovirus (CMV), ladite composition étant en outre enrichie en une population d'immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus RSV. Dans un autre mode de réalisation, la composition d'immunoglobulines au contraire n'est pas enrichie en une population d'immunoglobulines dirigées spécifiquement contre le virus RSV. En d'autres termes, la composition ne comprend substantiellement pas, ou comprend moins de 5%, d'immunoglobulines reconnaissant le virus RSV. Les immunoglobulines dirigées spécifiquement contre les virus ciblés peuvent se lier à l'une quelconque des protéines du virus, de préférence une protéine de surface, jouant un rôle dans les mécanismes d'infection, notamment au cours de la reconnaissance, de la liaison de la particule virale à sa cellule-hôte, de la fusion de la particule virale à sa cellule-hôte et de la propagation du virus de cellules hôte à cellule hôte.

Dans le cas du RSV et du métapneumovirus appartenant à la famille des paramyxoviridae, on peut citer notamment la protéine SH, la protéine M, la protéine G ou la protéine F.

Dans le cas du virus parainfluenza de type 3 humain, également de la famille des paramyxoviridae, on peut citer en plus la protéine hemagglutinine-neuraminidase (HN) qui remplace la protéine G.

Dans le cas du virus CMV, on peut citer les antigènes B, gH,gL,gO, gM, gN UL128, UL130 et UL131.

Dans le cas de virus influenza de la famille des orthomyxoviridae, on peut citer les protéines hémagglutinines (HA) et neuraminidase (NA).

Dans le cas du virus BK de la famille des polyomaviridae, on peut citer les protéines VPl, 2 et 3.

Dans le cas des flavivirus (comme le virus Zika, le virus de la dengue, et le virus de la fièvre jaune), on peut citer la protéine E, et les protéines prM/M. Méthodes de préparation des compositions d'immunoglobulines

Plusieurs méthodes de préparation des compositions de l'invention sont possibles. Les principales méthodes sont décrites ci-après.

Lorsque le virus d'intérêt est un virus humain contre lequel un humain adulte est généralement immunisé (par contact antérieur avec le virus, de manière souvent asymptomatique) et que cette immunité est réputée protectrice, on privilégiera une méthode de préparation d'immunoglobulines à partir de pools de plasma, avantageusement de plasma humain. C'est par exemple le cas du RSV ou du CMV. Une telle méthode implique des étapes de concentration des préparations plasmatiques, typiquement d'un facteur 100 à 1000.

Dans le cas où l'être humain n'est généralement pas immunisé (comme par exemple lorsque le virus visé est un flavivirus), on pourra par exemple produire les anticorps dans un animal (non- humain) transgénique.

Selon une première méthode, des préparations d'immunoglobulines issues de plasma humain ou de fractions de plasma sanguin sont soumises à une chromatographie d'affinité utilisant une protéine virale comme ligand d'affinité, pour obtenir une préparation d'immunoglobulines hyper-enrichies en immunoglobulines capables de reconnaître, et avantageusement de neutraliser, ledit virus. Les préparations d'immunoglobulines hyper-enrichies en immunoglobulines d'intérêt sont ensuite combinées pour former la composition selon l'invention.

Alternativement, des préparations d'immunoglobulines issues de plasma humain ou de fractions de plasma sanguin sont soumises à une ou plusieurs chromatographie(s) d'affinité, en séquentiel ou en une étape sur lit mélangé, utilisant plusieurs protéines virales distinctes comme ligands d'affinité, pour obtenir une préparation d'immunoglobulines hyper-enrichies en immunoglobulines capables de reconnaître, et avantageusement de neutraliser, lesdits virus.

Ces méthodes mettent en œuvre des supports de chromatographie d'affinité sur lesquels sont greffés une ou plusieurs protéines virales, ou des fragments antigéniques de celles-ci. Parmi les protéines virales utiles comme ligands, on peut citer par exemple les protéines décrites plus haut, ou préférentiellement les protéines de surface, jouant un rôle dans les mécanismes d'infection, notamment au cours de la reconnaissance, de la liaison de la particule virale à sa cellule-hôte, de la fusion de la particule virale à sa cellule-hôte et de la propagation du virus de cellules hôte à cellule hôte. La chromatographie utilise une matrice comprenant un support à base de particules de polymère, et est de préférence sous forme d'un gel ou d'une résine. Ces particules de polymère sont de préférence de forme sphérique ou oblongue, il peut s'agir notamment de billes. Le polymère peut être naturel ou non-naturel, organique ou inorganique, réticulé ou non réticulé. Le polymère est de préférence un polymère organique, de préférence réticulé. Dans un mode de réalisation préféré, le polymère est de la cellulose, et les particules sont de préférence des billes de cellulose poreuses. D'autres types de polymères possibles incluent l'agarose, le dextran, les polyacrylates, le polystyrène, le polyacrylamide, le polyméthacrylamide, des copolymères de styrène et divinylbenzène, ou des mélanges de ces polymères.

Les particules peuvent fournir un milieu de chromatographie que l'on peut utiliser pour remplir une colonne par exemple.

Sur le support est greffée une protéine virale, ou un fragment antigénique de celle-ci, soit directement, soit via un espaceur, qui lie de manière covalente le ligand aux particules du support chromatographique.

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le support greffé présente plusieurs ligands différents. Le support peut alors être greffé avec plusieurs protéines différentes et/ou plusieurs fragments antigéniques différents appartenant à différents virus ou souches virales, afin d'obtenir un concentré d'immunoglobulines présentant différentes cibles antigéniques. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les ligands spécifiques de chaque virus ou souche virale peuvent être sous la forme d'un mélange de cibles antigéniques, constitué de plusieurs protéines différentes et/ou plusieurs fragments antigéniques différents appartenant au même virus ou souche virale.

Une particule peut porter plusieurs espaceurs. La liaison entre le ligand et l'espaceur peut être, par exemple, une liaison amide. L'espaceur comprend typiquement au moins un atome de C, O, N, ou S. Les ligands sont immobilisés chimiquement par des liaisons covalentes entre les particules et l'espaceur, et entre l'espaceur et le ligand. Cette immobilisation peut être réalisée de manière classique par l'homme du métier.

Dans un mode de réalisation préféré, la particule porte un bras -NH-R1-COOH. De préférence il s'agit d'acide alpha-aminocaproïque (où RI est un groupe pentyle).

De manière classique, la particule peut être activée en utilisant des réactifs bifonctionnels tels que l'épichlorhydrine, l'épibromhydrine, le dibromo-et dichloropropanol, le dibromobutane, l'éthylène glycol diglycidyléther, le butanediol diglycidylether, divinylsulfone, l'allylglycidyléther, et le bromure d'allyle. Le réactif bifonctionnel est capable de réagir à la fois avec les particules et le bras -NH-R1-COOH. Les composés hétéro fonctionnels allyle, tels que le bromure d'allyle, sont des réactifs bifonctionnels préférés et permettent d'obtenir une matrice activée. Pour certains supports solides, tels que la cellulose, les composites contenant un hydrogel ou d'autres matériaux présentant des groupes hydroxyles, il est avantageux de déprotoner les groupes hydroxyles avec une source d'hydroxyde, par exemple, avant la réaction avec un réactif bifonctionnel. La matrice sous forme de gel est préparée par addition classique d'un tampon sur les particules de polymère portant les ligands, comme cela est connu de l'homme du métier, de manière à obtenir une matrice sous forme de gel, adaptée pour une chromatographie d'affinité.

La matrice telle que définie ici est utile dans une chromatographie d'affinité liant des immunoglobulines. La matrice est particulièrement utile dans une chromatographie d'affinité à lit mélangé. Une telle matrice comprend avantageusement plusieurs antigènes différents spécifiques du même virus et est donc capable de lier des immunoglobulines dirigées contre plusieurs épitopes différents d'un même virus. Une telle matrice peut également avantageusement comprendre plusieurs antigènes différents issus de différents virus, et est donc capable de lier à la fois des immunoglobulines spécifiques d'un premier virus et des immunoglobulines dirigées contre un autre virus choisi.

Les immunoglobulines anti-virus présentes dans le plasma ou la fraction plasmatique se fixent à la matrice, et le produit adsorbé est élué et récupéré, enrichi en immunoglobulines anti-virus. De manière avantageuse, les conditions de mise en œuvre de la chromatographie d'affinité selon l'invention sont adaptées par l'homme du métier pour garantir la réutilisation de la matrice selon l'invention tout en maintenant des conditions d'élution non dégradantes pour le produit d'intérêt.

Le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement consiste en du plasma provenant de plasmas sanguins ou de pools de plasmas sanguins de sujets mammifères (humains ou non humains) ou en une fraction de ce plasma, soit toute partie ou sous-partie du plasma, ayant fait l'objet d'une ou plusieurs étapes de purification. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement de l'invention consistent avantageusement en du plasma provenant de pools de plasmas sanguins de sujets humains normaux ou en une fraction de ce plasma, soit toute partie ou sous-partie du plasma, ayant fait l'objet d'une ou plusieurs étapes de purification.

Les fractions plasmatiques utilisables incluent ainsi le surnageant de plasma cryoprécipité, le cryoprécipité de plasma (remis en suspension), les fractions I à V obtenues par fractionnement éthanolique (selon la méthode de Cohn ou de Kistler & Nitschmann), le surnageant et le précipité obtenus après précipitation à l'acide caprylique et/ou caprylate, les éluats de chromatographies et les fractions non adsorbées des colonnes de chromatographie, et les filtrats. De manière particulièrement avantageuse, le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement proviennent de pools de plasmas sanguins de sujets humains normaux, sans sélection préalable des donneurs, en particulier, sans sélection des donneurs sur la base de leur éventuel taux plasmatique en immunoglobulines anti-virus d'intérêt. Le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement comporte ainsi avantageusement un taux d'immunoglobulines anti-virus similaire ou égal au taux d'immunoglobulines anti- virus d'un plasma issu du pool d'au moins 1000 donneurs humains normaux aléatoirement choisis. Le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement de l'invention est avantageusement non enrichi en immunoglobulines anti-virus d'intérêt comparé au taux d'immunoglobulines anti-virus d'un plasma issu du pool d'au moins 1000 donneurs choisis de manière aléatoire.

Le plasma ou la fraction plasmatique de départ soumis au procédé d'enrichissement contient des immunoglobulines humaines polyvalentes qui peuvent être des immunoglobulines A (IgA), des immunoglobulines E (IgE), des immunoglobulines M (IgM) ou des immunoglobulines G (IgG). Avantageusement, le plasma ou la fraction plasmatique de départ contient essentiellement des IgG quelle que soit leur sous-classe (IgGl, IgG2, IgG3 et IgG4) et/ou des IgM.

Le procédé utilise préférentiellement comme échantillon de départ un plasma ou une fraction plasmatique provenant de pools de plasmas sanguins de sujets humains normaux, sans sélection préalable des donneurs, en particulier, sans sélection des donneurs sur la base de leur éventuel taux plasmatique en immunoglobulines anti-virus.

Le procédé peut typiquement être un procédé indépendant, dédié à la purification d'immunoglobulines anti-virus uniquement, et est alors avantageusement effectué à partir de plasma ou d'une fraction plasmatique.

Dans ce mode de réalisation, le procédé comprend avantageusement les étapes suivantes : fourniture d'un échantillon de plasma ou d'une fraction plasmatique,

- passage de l'échantillon de plasma ou d'une fraction plasmatique sur une chromatographie d'immunoaffînité sur la matrice décrite ici,

récupération de la fraction adsorbée sur la matrice correspondant à la composition d'immunoglobulines hyper-enrichie en immunoglobulines anti-virus.

De manière avantageuse, le procédé peut comprendre en outre, après l'étape de capture sur chromatographie d'affinité anti-virus, une étape dédiée de déplétion de certaines immunoglobulines, en particulier les immunoglobulines E (IgE) et/ou immunoglobulines M

(IgM), qui peuvent être impliquées dans des mécanismes d'effets secondaires délétères chez les patients. Le procédé comprend avantageusement en outre une étape ultérieure consistant à soumettre la composition d'immunoglobulines hyper-enrichie en immunoglobulines anti-virus à au moins une étape d'inactivation et/ou d'élimination virale.

Dans encore un autre mode de réalisation particulier, le procédé d'obtention des immunoglobulines anti-virus est couplé à un procédé d'obtention d'immunoglobulines G polyvalentes afin d'obtenir, à partir d'un même pool de plasma de départ, à la fois un concentré d'immunoglobulines G polyvalentes et un concentré d'immunoglobulines hyper-enrichies en anti- virus.

Le procédé de l'invention comprend alors typiquement une étape préalable d'obtention de la fraction plasmatique, par fractionnement éthanolique et/ou fractionnement caprylique et/ou séparation chromatographique.

Dans ce mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend avantageusement les étapes suivantes :

fourniture d'un échantillon d'une fraction plasmatique prépurifiée obtenue par fractionnement éthanolique et/ou fractionnement caprylique et/ou séparation chromatographique,

passage de la fraction plasmatique prépurifiée sur une chromatographie d'immunoaffînité sur la matrice décrite ici,

récupération de la fraction adsorbée sur la matrice correspondant à la composition d'immunoglobulines hyper-enrichie en immunoglobulines anti-virus.

Par « séparation chromatographique », on entend toute étape de chromatographie, qu'il s'agisse de chromatographie échangeuse d'ions (échangeuse d'anions et/ou échangeuse de cations), mixed mode, ou chromatographie d'affinité (utilisant des ligands de type chimiques, anticorps, fragments d'anticorps, aptamères). Par séparation chromatographique, on entend aussi bien une seule et unique colonne de chromatographie, ou un ensemble de colonnes de chromatographie, utilisant ou non le même type de support, en série (mode multicolonnes par exemple) ou en parallèle.

Plus précisément, la fraction plasmatique peut être obtenue par un fractionnement éthanolique développé à l'origine par Cohn et al (Cohn et al, 1946. J. Am. Chem. Soc. 68, 459 ; Oncley et al, 1949, J. Am. Chem. Soc. 71, 541), ou bien par une séparation chromatographique, telle que décrite par exemple dans EP 0 703 922 et WO 99/64462, ou encore par un fractionnement caprylique tel que décrit par Steinbuch et al 1969, Arch Biochem Biophys. 134(2):279-84). On préfère tout particulièrement les procédés mis au point par la Demanderesse dans les demandes de brevet WO 94/29334 et WO 02/092632, et tout particulièrement celui décrit dans WO 02/092632. Dans ce cas, on soumet un plasma sanguin, ou une fraction de plasma sanguin enrichie en Ig, à un fractionnement caprylique (prépurification par précipitation de contaminants non immunoglobulines), et une chromatographie unique sur un support de résine échangeuse d'anions effectuée à pH alcalin. Un traitement d'inactivation virale peut être réalisé, de préférence effectué par solvant-détergent, comme décrit par Horowitz dans le brevet US 4 764 369, éventuellement complété par une étape d'élimination virale par nanofiltration sur filtre de taille de pores 75N, 35N, 20N et/ou 15N.

La fraction d'Ig ainsi récoltée est déjà concentrée, mais peut ensuite subir des étapes de concentration supplémentaire par ultrafîltration, et de fîltration stérilisante.

Ce concentré est ensuite soumis à une étape chromatographique d'immunoaffinité sur la matrice telle que décrite plus haut.

De manière avantageuse, le procédé peut comprendre en outre, de préférence après l'étape de capture sur chromatographie d'affinité anti- virus, une étape dédiée de déplétion de certaines immunoglobulines, en particulier les immunoglobulines A (IgA), et/ou immunoglobulines E (IgE) et/ou immunoglobulines M (IgM), qui peuvent être impliquées dans des mécanismes d'effets secondaires délétères chez les patients. Les immunoglobulines à dépléter sont avantageusement sélectionnées en particulier selon la voie d'administration choisie pour le concentré d'immunoglobulines hyper-enrichi en immunoglobulines anti-virus et/ou selon le contenu de l'échantillon de plasma ou de la fraction plasmatique de départ.

Le procédé peut en outre comprendre les étapes ultérieures consistant à additionner un ou plusieurs stabilisants pharmaceutiquement acceptables; et éventuellement congeler ou lyophiliser le concentré ainsi obtenu.

Selon un autre procédé de préparation, des mammifères non humains sont immunisés avec au moins deux immunogènes viraux pour produire des populations d'anticorps qui se lient aux immunogènes viraux.

Selon un autre procédé de préparation, des immunoglobulines hyper-enrichies sont obtenues à partir d'une bibliothèque d'immunoglobulines polyvalentes recombinantes générée via le séquençage du répertoire lymphocytaire d'au moins 50 donneurs. Le principe de cette technologie est décrit par exemple dans le brevet US 9, 412, 547.

Selon un autre procédé de préparation, des mammifères non humains transgéniques sont immunisés avec au moins deux immunogènes viraux pour produire des populations d'anticorps qui se lient aux immunogènes viraux. Le terme «animal transgénique» ou «mammifère transgénique» est utilisé ici de manière interchangeable pour désigner un mammifère non humain qui a été génétiquement modifié pour coder une séquence d'acide nucléique exogène dans son génome. Dans certains modes de réalisation, le mammifère transgénique a été génétiquement modifié pour produire des anticorps xénogènes en réponse à un immunogène. Dans certains modes de réalisation, le mammifère transgénique a été génétiquement modifié pour produire des anticorps humains en réponse à un immunogène. Dans certains modes de réalisation, le mammifère non humain est un ongulé. Dans certains modes de réalisation, le mammifère non humain est un bovin, une chèvre, un mouton, un bison, un chameau, un cochon, un lapin, un buffle, un cheval, un rat, une souris ou un lama.

Dans certains modes de réalisation, les mammifères non humains transgéniques ont été modifiés pour coder un chromosome artificiel humain dans son génome ; ces mammifères sont alors qualifiés de transchromosomiques. Dans certains modes de réalisation, les mammifères non humains transchromosomiques ont été modifiés pour coder un chromosome artificiel humain dans le génome d'un type de cellule particulier (par exemple, des cellules B). Voir, par exemple, Macnab et al. Gene Therapy (2009) 16: 1180-1188; Kazuki et al. Mol. Ther. (201 1) 19 (9): 1591-1601, incorporé ici à titre de référence.

Les animaux transgéniques ou transchromosomiques décrits ici peuvent être génétiquement modifiés pour contenir tout ou partie du locus du gène de l'immunoglobuline de lignée germinale exogène de telle sorte que l'immunisation des animaux transgéniques ou transchromosomiques conduit à la production d'anticorps exogènes (par exemple, humains) contre l'immunogène d'intérêt. Le gène en question comprend typiquement un ou plusieurs acides nucléiques codant pour tout ou partie d'un gène d'anticorps xénogène qui est capable de subir un réarrangement et d'exprimer un ou plusieurs anticorps xénogènes dans des cellules B. Un locus génétique capable de subir un "réarrangement" se réfère à un locus d'anticorps qui n'a pas subi de recombinaison V (D) J mais qui est capable de subir un réarrangement et d'exprimer des anticorps exogènes (par exemple humains) en réponse à une immunisation avec un immunogène.

Dans certains modes de réalisation, les animaux sont modifiés pour contenir tous les segments d'acide nucléique codant pour un segment de gène V d'une chaîne légère d'anticorps séparés de tous les segments d'acide nucléique codant pour un segment de gène J par un ou plusieurs nucléotides. Dans certains modes de réalisation, tous les segments d'acide nucléique codant pour un segment de gène V d'une chaîne lourde d'anticorps sont séparés de tous les segments d'acides nucléiques codant pour un segment de gène D par un ou plusieurs nucléotides et / ou tous les segments d'acide nucléique codant pour un segment de gène D d'une chaîne lourde d'anticorps sont séparés de tous les segments d'acide nucléique codant pour un segment de gène J par un ou plusieurs nucleotides. Dans certains modes de réalisation, le locus de gène d'immunoglobuline comprend un ou plusieurs loci de chaîne lourde d'immunoglobuline humaine. Dans certains modes de réalisation, les loci de chaîne lourde d'immunoglobuline humaine comprennent un segment V de chaîne lourde, un segment D de chaîne lourde et / ou un segment J de chaîne lourde. Dans certains modes de réalisation, les loci de chaîne lourde d'immunoglobuline humaine comprennent au moins un segment de région constante de chaîne lourde. Dans certains modes de réalisation, les loci de chaîne lourde d'immunoglobuline humaine comprennent un segment V de chaîne lourde, un segment D de chaîne lourde et / ou un segment J de chaîne lourde et au moins un segment de région constante de chaîne lourde. Dans certains modes de réalisation, le locus de gène d'immunoglobuline comprend un ou plusieurs loci de chaîne légère d'immunoglobuline humaine. Dans certains modes de réalisation, les loci de chaîne légère d'immunoglobuline humaine comprennent un segment VL de chaîne légère et / ou un segment JL de chaîne légère. Dans certains modes de réalisation, les loci de chaîne légère d'immunoglobuline humaine comprennent au moins un segment de région constante de chaîne légère. Dans certains modes de réalisation, les loci de chaîne légère d'immunoglobuline humaine comprennent un segment VL de chaîne légère, un segment JL de chaîne légère et un segment de région constante de chaîne légère.

Dans certains modes de réalisation, le locus du gène de l'immunoglobuline de lignée germinale est un locus de gène d'immunoglobuline humaine. Dans certains modes de réalisation, le locus du gène de l'immunoglobuline de ligne germinale est identique au moins à 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% à la région correspondante d'un acide nucléique naturel provenant d'un être humain.

Dans certains modes de réalisation, les animaux transgéniques ou de préférence transchromosomiques sont génétiquement modifiés de sorte qu'ils produisent des taux réduits d'anticorps endogènes (par exemple bovins) ou ne produisent pas d'anticorps endogènes (par exemple bovins). Dans certains modes de réalisation, les animaux transgéniques ou de préférence transchromosomiques ont une mutation qui réduit ou élimine l'expression d'anticorps endogènes ou un isotype particulier d'anticorps endogènes. Dans certains modes de réalisation, la mutation réduit ou élimine l'expression de la chaîne lourde IgM fonctionnelle. Dans certains modes de réalisation, les animaux transgéniques ou de préférence transchromosomiques ont une mutation qui réduit ou élimine l'expression de la chaîne légère d'anticorps fonctionnel. Dans certains modes de réalisation, l'animal transgénique a une mutation qui réduit ou élimine l'expression de la chaîne lourde IgM fonctionnelle et de la chaîne légère fonctionnelle d'Ig.

Les animaux transchromosomiques pouvant être utilisés dans les procédés décrits ici ainsi que les procédés pour produire de tels animaux transchromosomiques utilisant des chromosomes artificiels sont connus dans la technique. Voir, par exemple, les brevets US 7 074 983; US 7 652 192 et US 9 315 824.

Ce procédé permet de produire des populations isolées d'anticorps qui se lient à différents immunogènes viraux. Les populations d'anticorps qui se lient à l'un quelconque des immunogènes décrits ici peuvent être combinées dans une composition à condition que les populations soient différentes (non identiques). Dans certains modes de réalisation, les populations d'anticorps sont des anticorps humains, tels que des anticorps humains qui sont produits de manière transgénique chez un mammifère non humain, comme décrit ici.

Dans certains modes de réalisation, les populations isolées d'anticorps sont préparées par immunisation d'un mammifère non humain (par exemple bovin) avec au moins deux ou trois immunogènes viraux différents. Les populations peuvent ensuite être isolées à partir d'un échantillon (par exemple, un liquide corporel, tel que sang, urine, lait) collecté à partir du mammifère non humain. Dans certains modes de réalisation, plus d'un mammifère non humain transgénique est immunisé avec un immunogène viral. Dans certains modes de réalisation, au moins deux ou trois mammifères non humains transgéniques sont chacun immunisés avec un immunogène viral différent, de sorte que chaque mammifère non humain transgénique produit une population d'anticorps qui se lie à un immunogène viral. Les populations peuvent ensuite être isolées à partir d'échantillons collectés à partir de chacun des mammifères non humains et ensuite combinées pour former une composition de combinaison.

L'isolement des populations d'immunoglobulines dirigées spécifiquement contre les virus d'intérêt peut être réalisé en mettant en œuvre une chromatographie d'immunoaffinité, comme décrit plus haut. Avantageusement, et comme décrit en détails plus haut, on utilise pour cela une matrice sur laquelle au moins une protéine virale, ou un fragment antigénique de celle-ci, est fixée.

Compositions pharmaceutiques et traitements

L'invention fournit également une composition pharmaceutique comprenant une composition d'immunoglobulines telle que décrite plus haut, en association avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition pharmaceutique peut être administrée par toute voie d'administration, par exemple : oculaire, nasale, intra-auriculaire, orale, sublinguale, pulmonaire, intrapéritonéale, intraveineuse, percutanée, sous-cutanée, intramusculaire, transmuqueuse, vaginale, rectale.

La composition est généralement concentrée, en ce qu'elle comprend des immunoglobulines à des concentrations comprises entre 50 et 100 g/1. Ces concentrés sont destinés à un usage clinique et peuvent en particulier être injectés par voie intraveineuse. A cet effet, ils doivent être sécurisés et, le cas échéant, contenir des excipients, tels que des stabilisants, compatibles avec cet usage clinique.

Il est ici décrit des méthodes de traitement ou de prévention d'une infection virale chez un sujet impliquant l'administration de compositions en une quantité thérapeutiquement efficace. L'invention fournit une "multi-thérapie" en traitant ou en empêchant l'infection avec plus d'un virus en fournissant des populations d'immunoglobulines qui se lient à différents immunogènes viraux. Dans certains modes de réalisation, les méthodes de traitement impliquent l'administration au sein d'une même composition, d'au moins deux ou trois populations d'anticorps qui se lient à différents immunogènes viraux, qui peuvent être utilisés pour traiter ou prévenir une infection par au moins deux ou trois, virus ou souches virales.

Le sujet ou patient est de préférence un humain, mais il peut aussi s'agir d'un animal, de préférence un mammifère, par exemple un animal de compagnie (chien ou chat par exemple), un cheval, un bovin, un ovin, etc. Il peut encore s'agir d'un animal qui représente un hôte pour le virus, par exemple un singe.

Dans le contexte de l'invention, le terme «traitement » signifie soulager ou atténuer au moins un symptôme associé à une infection, ou ralentir ou inverser la progression de l'infection. Par exemple, en liaison avec une infection virale, le terme «traitement» peut signifier éliminer ou réduire la charge virale, ou inhiber ou réduire un ou plusieurs symptômes de l'infection. Le terme «prévention» inclut l'administration d'une composition à un sujet pour réduire ou retarder le début de la manifestation de symptômes cliniques ou subcliniques, de complications, de pathologies ou de troubles biochimiques d'une maladie ou d'une infection, ou pour réduire ou inhiber la propagation/transmission d'un virus. Une telle administration avant l'infection, l'exposition ou le risque d'exposition au virus peut être appelée administration prophylactique.

Dans certains modes de réalisation, le sujet est un humain qui a été diagnostiqué avec une infection par l'un quelconque des virus décrits ici. Dans certains modes de réalisation, le sujet présente au moins l'un des symptômes cliniques associés à l'infection avec l'un quelconque des virus décrits ici. Dans certains modes de réalisation, le sujet est un humain qui est à risque d'infection, par exemple, le sujet peut avoir été exposé à un virus ou habiter ou avoir voyagé dans une zone géographique dans laquelle le virus est endémique. Dans certains modes de réalisation, le sujet est considéré comme étant à risque d'infection ou risque d'être infecté, par exemple parce que le sujet est immunodéprimé ou immuno logiquement immature.

Les compositions de l'invention peuvent en particulier être utilisées pour l'immunoprophylaxie chez des patients non infectés mais à risque : enfants, nourrissons, personnes hospitalisées, personnes immunodéprimées, personnes âgées.

Avantageusement, les compositions selon l'invention permettent la réduction significative de la charge virale, normée par rapport à une référence connue, chez le patient traité.

Elles peuvent en outre avantageusement provoquer la destruction des cellules infectées via le recrutement de cellules effectrices grâce aux fonctions ADCC des immunoglobulines de la composition.

Dans certains modes de réalisation, les compositions de l'invention sont utiles pour traiter ou prévenir une infection par un flavivirus (par exemple le virus Zika, le virus de la fièvre jaune, le virus de la dengue). Les flavivirus peuvent causer une variété de symptômes lors de l'infection d'un sujet, dont malaise; légère fièvre; éruption cutanée (exanthème) sur le visage, le cou, les bras; mal de tête; sensibilité à la lumière; douleur articulaire non inflammatoire; conjonctivite; manque d'appétit; diarrhée; douleur abdominale; et/ou vertiges. La sévérité et la durée des symptômes associés à l'infection par flavivirus peuvent varier, par exemple, en fonction du flavivirus spécifique provoquant l'infection et de l'un quelconque d'un grand nombre de facteurs hôtes. L'infection par le virus Zika pendant la grossesse a été associée à une microcéphalie chez le foetus/nouveau-né. Le virus de la dengue, agent causal de la dengue et de la dengue hémorragique, peut entraîner une fièvre élevée, des maux de tête sévères, des douleurs articulaires et musculaires sévères, de la fatigue, des nausées, des vomissements, des éruptions cutanées, des chocs, des saignements. La fièvre jaune, transmise par le virus de la fièvre jaune, provoque également des symptômes pouvant être graves, y compris fièvre, maux de tête, douleurs musculaires, nausées, vomissements, jaunisse, diminution de la miction, délire, arythmies, saignements, convulsions et/ou un coma.

Le diagnostic d'une infection par flavivirus chez des sujets exposés à un flavivirus suspecté d'être infecté ou susceptible d'être exposé à un flavivirus peut impliquer la détection de la présence d'anticorps spécifiques de virus et/ou des tests moléculaires détectant le virus, tels que la PCR ou la PCR en temps réel, par exemple à partir d'échantillons de sang ou de salive d'un sujet. Dans certains modes de réalisation, les compositions décrites ici sont utilisées pour traiter ou prévenir une infection par un virus respiratoire. L'infection par un virus respiratoire peut inclure n'importe lequel d'un certain nombre de symptômes basés, par exemple, sur la partie du tractus respiratoire qui est affectée par l'infection (l'infection virale et/ou la réponse immunitaire à l'infection virale). Par exemple, l'infection par le virus respiratoire peut affecter les voies respiratoires supérieures, les voies respiratoires inférieures, ou les deux. Dans certains modes de réalisation, les compositions de l'invention comprenant des immunoglobulines dirigées contre au moins un virus respiratoire, sont utiles pour traiter ou prévenir une infection virale respiratoire telle qu'une bronchiolite, une pneumonie, une grippe, un croup (laryngo -trachéite aiguë) et/ou une bronchite. Elles peuvent être particulièrement utiles en traitement curatif par administration précoce. De manière avantageuse, elles peuvent permettre de ralentir et/ou d'empêcher la diffusion de l'infection des voies respiratoires hautes vers les voies respiratoires basses. L'infection respiratoire du virus peut inclure des symptômes tels que la congestion, le nez qui coule, la toux, les éternuements, la fièvre, le mal de gorge, la difficulté à respirer et la fatigue et le malaise général. L'infection respiratoire du virus est habituellement diagnostiquée par l'observation de la présentation des symptômes, des tests fonctionnels pulmonaires, de la détection du virus, par exemple à partir d'échantillons nasopharyngés, d'écouvillons de gorge et/ou d'expectorations.

Dans certains modes de réalisation, la composition comprend en outre un adjuvant, ou est administrée en combinaison avec un adjuvant, de manière simultanée ou séquentielle.

La posologie peut être ajustée de manière appropriée pour atteindre les niveaux souhaités de chacune des populations d'immunoglobulines, local ou systémique, selon le mode d'administration.

Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. EXEMPLE 1 : Préparation d'une composition d'Ig multivalente anti-hRSV, anti-hMPV et anti-hPIV3

1. Enrichissement en Ig anti-hRSV, Ig anti-hMPV, et Ig anti-hPIV3 à partir de fractions plasmatiques Dans cet exemple, l'échantillon utilisé est une fraction plasmatique issue du procédé de purification d'immunoglobulines tel que décrit dans la demande de brevet WO02092632. Le procédé de purification comprend les étapes suivantes :

Récupération d'une fraction Ι+Π+ΠΙ, obtenue à partir de plasma sanguin traité à l'éthanol

Précipitation à l'acide caprylique

- Traitement solvant-détergent (Triton/TnBP)

Chromatographie échangeuse d' anions (TMAE) à pH basique

L'éluat de la chromatographie échangeuse d'anions à pH basique est ensuite soumis à une chromatographie d'immunoaffinité, comme décrit ci-dessous.

1.1. Chromatographie d'affinité anti-hRSV (protéine F) On utilise comme ligand d'affinité deux versions de la protéine RSV-F ; d'une part la protéine F en conformation post-fusion 11049-V08B (Sino Biological Inc), protéine synthétique issue d'une séquence ADN du hRSV (RSS-2) de la Met 1 à la Thr 529, contenant 518 acides aminés après clivage du propeptide et dont la masse moléculaire prédite est de 58kDa et d'autre part la même protéine mais stabilisée en conformation pré-fusion décrite dans la publication McLellan et al, SCIENCE, 2013, 342(6158):592-8 et produite en cellule HEK293F dont la masse apparente en SDS PAGE-Western Blot est de 58 Kda .

2mL de gel de sépharose activée (« NHS-activated sepharose 4 Fast Flow ») sont mis en place dans une colonne de chromatographie de diamètre 1.1cm et les tampons utilisés sont ceux recommandés par le fournisseur du gel. Après lavage (ImM HCL à 4°C) et équilibrage en tampon de couplage, 1,98 mg de protéine F à greffer sont ajoutées au gel et l'ensemble est mis en agitation. Le blocage des groupements réactifs sur le gel est réalisé en ajoutant 6 mL de tampon 0.5M ethano lamine, 0.5M NaCl, pH 8.3 (6mL), et le gel est mis en agitation pendant 12h. Le gel couplé est lavé avec une alternance de 3 volumes de tampons basique puis acide : 0.1M Tris-HCl pH 8.4 et 0.1M acétate, 0.5M NaCl pH 4, ce cycle étant répété trois fois. Le gel est ensuite stocké en tampon lOmM citrate, 0.5M NaCl, 0.1 g L azide de sodium pH 6.6. Le couplage a été évalué à 98%, correspondant à une densité de ligand de 0,89mg/mL de gel greffé.

L'échantillon est équilibré dans le tampon d'injection en y ajoutant une solution concentrée de tampon de NaCl et de citrate trisodique qsp 0,05M NaCl et 0,01M Citrate trisodique. Le produit est ensuite passé sur la colonne durant 33min (temps de contact). Après lavage, Pélution est réalisée en tampon 0, 1M glycine, 30% propylène glycol à pH 2,57. L'éluat est immédiatement neutralisé par du tampon 1M Tris-HCl pH 9 pour en remonter le pH à environ 6. Le gel est alors passé en régénération afin de décrocher les Ig non éluées avec un tampon 6M guanidine pH 6. La fraction récupérée est aussi neutralisée par l'ajout de 1M Tris-HCl pH9 pour en remonter le pH à 6.

1.2. Chromatographie d'affinité anti-hRSV (protéine G)

Alternativement, ou en complément, on utilise comme ligands d'affinité la protéine RSV-G souche A (ref 11070-V08H2, SB), protéine synthétique issue d'une séquence ADN du hRSV (souche rsbl734) de la Asn 66 à l'Arg 297, contenant 242 acides aminés après clivage du propeptide et dont la masse moléculaire prédite est de 26,3kDa. En analyse SDS-PAGE et conditions réductrice, la masse moléculaire apparente est comprise du fait d'une importante glycosylation entre 60 kDa et 90 kDa.

souche B (ref 13029-VO8H, SB), protéine synthétique issue d'une séquence ADN du hRSV (souche 036633-1) de l'His 67 à l'Ala 299, contenant 244 acides aminés après clivage du propeptide et dont la masse moléculaire prédite est de 27kDa. En analyse SDS-PAGE et conditions réductrice, la masse moléculaire apparente est comprise du fait d'une importante glycosylation entre 80 kDa et 90 kDa.

Le couplage est réalisé selon le même protocole que celui utilisé à la section 1.1.

Trois colonnes sont réalisées :

gel G- A, correspondant à une densité de Protéine G souche A de 1 mg/mL de gel greffé, gel G-B, correspondant à une densité de Protéine G souche B de 1 mg/mL de gel greffé, gel G-AB, correspondant à un mélange 50%> gel G-A et 50%> gel G-B.

Le design de l'expérience a en outre permis de constater que les IgG anti-RSV purifiés sur le variant A de la protéine G interagissaient également avec le variant B de la protéine G et inversement laissant penser qu'il existe une réactivité croisée entre les anticorps polyclonaux anti-RSV pour les deux variants de la protéine G.

Une forte proportion des immunoglobulines anti-RSV se fixe au support de chromatographie par affinité à la protéine hRSV-G, quelle que soit la souche, ce qui représente dans cet essai au moins 6^g d'irnrnunoglobulines anti-RSV par mL de gel. La fraction non adsorbée et la fraction de lavage sont appauvries en immunoglobulines anti-RSV. La fraction d'irnrnunoglobulines éluées du support à pH acide et en présence de Propylène glycol montre un enrichissement minimum de 109 fois en immunoglobulines anti-RSV.

L'essai montre que la chromatographie d'affinité utilisant un ligand protéine G de souches A ou B greffées via une chimie NHS permet la purification d'immunoglobulines anti-RSV avec un rendement d'au moins 26,2% dans les conditions testées, correspondant à un facteur d'enrichissement minimum de 109 fois. La composition obtenue après chromatographie d'affinité sur ligand protéine G en comprend donc au moins 30% en poids d'immunoglobulines dirigées spécifiquement contre au moins un épitope de la protéine G.

1.3. Chromatographie d'affinité anti-hMPV

On utilise comme ligand d'affinité soit la protéine F (numéro d'accès Genbank: Q6WB98) produite en cellule HEK293F avec les modifications post-traductionnelles requises ou alternativement un virus hMPV entier inactivé DAG201 produit sous forme de lysat cellulaire. 2mL de gel de sépharose activée (« NHS activated sepharose 4 fast flow ») sont mis en place dans une colonne de chromatographie de diamètre 1.1cm et les tampons utilisés sont ceux recommandés par le fournisseur du gel. Après lavage (ImM HCL à 4°C) et équilibrage en tampon de couplage, 1,98 mg de protéine F ou 5 mg de virus inactivé à greffer sont ajoutées au gel et l'ensemble est mis en agitation. Le blocage des groupements réactifs sur le gel est réalisé en ajoutant 6 mL de tampon 0.5M éthanolamine, 0.5M NaCl, pH 8.3 (6mL), et le gel est mis en agitation pendant 12h. Le gel couplé est lavé avec une alternance de 3 volumes de tampons basique puis acide : 0.1M Tris-HCl pH 8.4 et 0.1M acétate, 0.5M NaCl pH 4, ce cycle étant répété trois fois. Le gel est ensuite stocké en tampon lOmM citrate, 0.5M NaCl, 0.1 g/L azide de sodium pH 6.6.

L'échantillon est équilibré dans le tampon d'injection en y ajoutant une solution concentrée de tampon de NaCl et de citrate trisodique qsp 0,05M NaCl et 0,01 M Citrate trisodique. Le produit est ensuite passé sur la colonne durant 3.3min (temps de contact). Après lavage, l'élution est réalisée en tampon 0,1M glycine, 30% propylène glycol à pH 2,57. L'éluat est immédiatement neutralisé par du tampon 1M Tris-HCl pH 9 pour en remonter le pH à environ 6. Le gel est alors passé en régénération afin de décrocher les Ig non éluées avec un tampon 6M guanidine pH 6. La fraction récupérée est aussi neutralisée par l'ajout de 1M Tris-HCl pH9 pour en remonter le pH à 6. 1.4.Chromatographie d'affinité anti-hPIV3

On utilise comme ligand d'affinité soit la protéine hemagglutinine-neuraminidase (HN) (numéro d'accès Genbank : J7ENP1) produite en cellule HEK293F avec les modifications post- traductionnelles requises, soit un virus hPIV3 entier inactivé (DAG-H10373) produit sous forme de lysat cellulaire.

2mL de gel « NHS-activated sepharose 4 Fast Flow » sont mis en place dans une colonne de chromatographie de diamètre 1.1cm et les tampons utilisés sont ceux recommandés par le fournisseur du gel. Après lavage (ImM HCL à 4°C) et équilibrage en tampon de couplage, 1,98 mg de protéine FIN ou 5 mg de virus inactivé à greffer sont ajoutées au gel et l'ensemble est mis en agitation. Le blocage des groupements réactifs sur le gel est réalisé en ajoutant 6 mL de tampon 0.5M ethanolamine, 0.5M NaCl, pH 8.3 (6mL), et le gel est mis en agitation pendant 12h. Le gel couplé est lavé avec une alternance de 3 volumes de tampons basique puis acide : 0.1M Tris-HCl pH 8.4 et 0.1M acétate, 0.5M NaCl pH 4, ce cycle étant répété trois fois. Le gel est ensuite stocké en tampon lOmM citrate, 0.5M NaCl, O.lg/L azide de sodium pH 6.6.

L'échantillon est équilibré dans le tampon d'injection en y ajoutant une solution concentrée de tampon de NaCl et de citrate trisodique qsp 0,05M NaCl et 0,01 M Citrate trisodique. Le produit est ensuite passé sur la colonne durant 3.3min (temps de contact). Après lavage, l'élution est réalisée en tampon 0,1M glycine, 30% propylène glycol à pH 2,57. L'éluat est immédiatement neutralisé par du tampon 1M Tris-HCl pH 9 pour en remonter le pH à environ 6. Le gel est alors passé en régénération afin de décrocher les Ig non éluées avec un tampon 6M guanidine pH 6. La fraction récupérée est aussi neutralisée par l'ajout de 1M Tris-HCl pH9 pour en remonter le pH à 6.

2. Préparation d'anticorps anti-hRSV à partir d'animaux transchromosomiques

Dans un mode de réalisation alternatif, on produit des anticorps anti-RSV à partir d'animaux transchromosomiques. Des vaches transchromosomiques capables de produire des anticorps humains peuvent être obtenues par la technique des chromosomes artificiels humains (HAC, pour « human articifïal chromosomes ») décrite par exemple dans le brevet US9,315,824, qui fait lui-même référence aux méthodes décrites dans les articles Kuroiwa et al., Nat. Biotechnol. 18: 1086-1090, 2000, Kuroiwa et al, Nat. Biotechnol. 20: 889-894, 2002 et Kuroiwa et al, Nat. Biotechnol. 27: 173-181, 2009. Des exemples de fragments HAC comprenant des gènes des chaînes lourdes et légères d'immunoglobulines humaines sont décrits dans Tomizuka et al., Proceeding of the National Academy of Sciences, 97, 722-727, 2000, WO98/037757, Kuroiwa et al, Nature Biotechnology, 18, 1086-1090, 2000, WO00/010383, Kuroiwa et al, Nature Biotechnology, 27, 173-181, 2009, WO09/111.086.

Les vaches transchromosomiques produites sont en outre incapables de générer des chaînes lourdes d'IgM (vaches KcHAC/IGHM ^"7" IGHMLl ^"7" ).

On peut alors immuniser les vaches transchromosomiques KcHAC/IGHM ^"7" IGHMLl ^"7" avec des antigènes du virus RSV (de préférence la protéine F et/ou la protéine G). Les IgG humaines spécifiques des antigènes RSV générées sont purifiées en utilisant une chromato graphie d'immunoaffinité, selon le principe décrit à la section 1 ci-dessus, en fixant sur la matrice d'immunoaffinité les mêmes antigènes RSV que ceux utilisés pour l'immunisation.

Ces anticorps anti-RSV produits à partir d'animaux transchromosomiques peuvent être utilisés en combinaison avec des Ig anti-hMPV, et anti-hPIV3, comme décrit ci-dessous.

3. Production d'anticorps anti-hMPV, à partir d'animaux transchromosomiques

De la même manière, il est possible d'immuniser les vaches transchromosomiques KcHAC/IGHM ^"7" IGHMLl ^"7" avec des antigènes du virus hMPV, soit la protéine F soit le virus inactivé, comme décrit dans Kuroiwa et al., Nat. Biotechnol. 27: 173-181, 2009. Les IgG humaines spécifiques des antigènes hMPV générées sont purifiées à partir de prélèvements sanguins des vaches, et en utilisant une chromatographie d'immunoaffinité, selon le principe décrit à la section 1.

4. Production d'anticorps anti-hPIV3, à partir d'animaux transchromosomiques

De la même manière, on immunise les vaches transchromosomiques KcHAC/IGHM ^"7" IGHMLl ^"7" avec des antigènes du virus PIV3. Les IgG humaines spécifiques des antigènes PIV3 générées sont purifiées en utilisant une chromatographie d'immunoaffinité, selon le principe décrit à la section 1, en fixant sur la matrice d'immunoaffinité les mêmes antigènes PIV3 que ceux utilisés pour l'immunisation.

5. Mélange des populations d'anticorps

Les anticorps anti-hRSV, anti-hMPV et anti-hPIV3 obtenus aux sections 1 à 4 ci-dessus sont mélangés dans une proportion égale, et formulés au sein d'une composition pharmaceutique. EXEMPLE 2: Préparation d'une composition d'Ig multivalente anti-RSV, anti-BKV, et anti-CMV

Dans cet exemple, on mélange des Ig humaines spécifiques des virus RSV telles que préparées à l'exemple 1.1.1 ou 1.1.2, avec des Ig humaines anti-CMV et anti-BKV. Ces dernières sont obtenues comme décrit à l'exemple 1, section 1, mais en remplaçant l'antigène de RSV par un antigène de CMV ou de BKV.

EXEMPLE 3: Préparation d'une composition d'Ig multivalente anti-Zika, anti-Dengue, et anti-fièyre jaune

3.1. Dans cet exemple, on prépare des anticorps polyclonaux humains anti-Zika, anti-Dengue et anti-fièvre jaune, en immunisant des vaches transchromosomiques KcHAC/IGHM ^{~ ~} IGHML1 ^{~ ~} avec des antigènes du virus de Zika, de la dengue et de la fièvre jaune, simultanément, et en récupérant les anticorps produits, par purification sur une même colonne d'immunoaffinité, sur laquelle sont fixés les trois antigènes viraux (respectivement des virus Zika, de la dengue, et de la fièvre jaune).

3.2. Dans un autre exemple, on prépare des anticorps polyclonaux humains anti-Zika, anti- Dengue et anti-fièvre jaune, en immunisant des vaches transchromosomiques KcHAC/IGHM ^{" /_} IGHML1 ^{~ ~} avec des antigènes du virus de Zika, de la dengue et de la fièvre jaune, chaque vache étant immunisée avec un seul antigène. On récupère les anticorps produits, par purification sur colonne d'immunoaffinité, sur laquelle est fixé chaque antigène (respectivement des virus Zika, de la dengue, et de la fièvre jaune). Les trois populations d'anticorps anti-Zika, anti-Dengue et anti-fièvre jaune purifiées séparément, sont ensuite mélangées dans des proportions égales.

EXEMPLE 4 : Préparation d'une composition d'Ig multivalente anti-hRSV et anti-HBV

4.1 Chromatographie d'affinité anti-hRSV (protéine F)

La méthode de préparation des anti-RSV (protéine F) décrite dans l'Exemple 1 peut également être utilisée. 4.2 Chromatographie d'affinité anti-HBV

On utilise comme ligand d'affinité un mélange d'antigènes du virus de l'hépatite B :

antigènes HBs ( S, pré-Sl, pré-S2) tel que celui fourni par SciVac 4mL de gel de sépharose activée (« NHS-activated sepharose 4 Fast Flow ») sont mis en place dans une colonne de chromatographie de diamètre 1.1cm et les tampons utilisés sont ceux recommandés par le fournisseur du gel. Après lavage aveclmM HCL à 4°C, et équilibrage en tampon de couplage (200mM Bicarbonate de sodium à pH=8), 4,8ml d'antigène HBs à greffer sont ajoutés au gel et l'ensemble est mis sous agitation pendant 16h à 4°C. Le blocage des groupements réactifs sur le gel est réalisé en ajoutant 8 mL de tampon Tris lOOmM, pH= 8,3 et le gel est mis sous agitation pendant 4h à 4°C. Le gel couplé est lavé ensuite 3 fois avec 8 ml de tampon PBS. Le gel est ensuite stocké en tampon lOmM citrate, 0.5M NaCl, O. lg/L acide de sodium pH 6.6.

Le couplage est à 75%, correspondant à une densité de ligand de 0,7mg/mL de gel greffé et une capacité estimée à 63650 mUI d'anti-HBV/ml.

L'échantillon (Immunoglbuline normale à 50g/L) est dialysé contre du tampon PBS. La capture est réalisée en système ouvert, 40ml d'échantillon est incubé avec la résine pendant 30min. La fraction de l'échantillon non retenue est séparée de la résine par une centrifugation de 2 min à 500g. Cette étape est utilisée pour chaque lavage et pour l'élution. La résine est ensuite lavée 3 fois par 5 ml de PBS. Les Immunoglobulines hyper-enrichies anti-HBV sont ensuite éluées par 5ml de tampon 4M MgC12. Un échange de tampon est ensuite réalisé sur PD10 (G25) en PBS et l'échantillon est concentré à lmg/ml sur cellule Amicon Ultra 10.

4.3 Mélange des populations d'anticorps

Les anticorps anti-hRSV et anti-HBV obtenus aux sections 4.1 et 4.2 ci-dessus sont mélangés dans une proportion égale, et formulés au sein d'une composition pharmaceutique.

4.4 Vérification de l'activité biologique

Leur capacité à neutraliser au sein d'une même composition les virus RSV et HBV peut être vérifiée avec des tests de neutralisation différents pour chacun des virus.

Pour RSV : Afin de mesurer la capacité d'inhibition de l'infection virale par les fractions obtenues, une souche virale hRSV(18)-cherry3 contenant un gène rapporteur codant pour une protéine fluorescente est utilisée sur une lignée de cellules Hep2. L'intensité de la fluorescence est directement représentative de la réplication virale. La veille du test, les cellules sont repiquées en plaque de 96 puits à 0.5xl0 ⁶ cellules/mL et incubées à 37°C sous 7% C02. Le jour du test, les anticorps monoclonaux témoins positifs (SynagisTM, solution d'anticorps monoclonaux dirigés contre le RSV) et négatifs (solution d'anticorps monoclonaux irrelevants) ainsi que les fractions à tester sont diluées en milieu MEM et ΊΟμΙ, sont déposés en puits de plaque de 96 puits. Le virus est de même dilué en milieu MEM au l/25ème et 70μΕ sont déposés dans les puits contenant les solutions d'anticorps. L'homogénéisation est faite par aspiration/refoulement. Le mélange est alors incubé pendant lh à 37°C sous 7% de C02. Pour l'infection des cellules, le surnageant cellulaire est aspiré, ΙΟΟμί du mélange Ig/virus sont rapidement déposés et l'incubation est réalisée à 37°C sous 7% C02 pendant 36 à 48 heures. La révélation se fait par mesure de la fluorescence en excitant à 580nm et en lisant à 620nm. Les valeurs sont normalisées par rapport au témoin « 100% infection » où le virus est mis seul en contact avec les cellules, et le témoin « 0% infection » correspond aux cellules mises en contact avec le milieu MEM seul. La détermination d'une IC50 est réalisée en exploitant les courbes de doses-réponses en fonction des concentrations d'anticorps. Pour HBV :

Des cellules Huh-106 sont inoculées avec le virus HBV w (MOI: 500ge) en présence d'une concentration d'anti-HBV comprise entre 0,5 / 5 / 50 /500 et 5000 ng/ml.

Le surnageant cellulaire est récupéré 9 jours après l'inoculation. L'IC90 permettant d'avoir 90 % de neutralisation est calculé à partir du taux de virus dosé par Northern Blot.