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Title:
COMPOSITION FOR INACTIVATING SPORES BY MEANS OF ANTIMICROBIAL PEPTIDES
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2018/082860
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to the use of a composition, which comprises at least one natural, recombinant or synthetic human antimicrobial peptide, which is selected from a human defensin or cathelicidin or functional fragments or combinations thereof, for inactivating bacterial spores.

Inventors:
NUDING SABINE (DE)
STANGE EDUARD (DE)
Application Number:
PCT/EP2017/075432
Publication Date:
May 11, 2018
Filing Date:
October 06, 2017
Export Citation:
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Assignee:
ROBERT BOSCH GES FUER MEDIZINISCHE FORSCHUNG MBH (DE)
International Classes:
A61K38/17; A61P31/04
Foreign References:
DE102005014687A12006-10-12
US20100034824A12010-02-11
DE102014213654A12016-03-24
Other References:
MARK W LISANBY ET AL: "Cathelicidin Administration Protects Mice from Bacillus anthracis Spore Challenge", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, 1 October 2008 (2008-10-01), United States, pages 4989, XP055437481, Retrieved from the Internet
SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
KENT: "Chemical Synthesis of Proteins and Peptides", ANN. REV. BIOCHEM., vol. 57, 1988, pages 957 - 989, XP002623175, DOI: doi:10.1146/annurev.bi.57.070188.004521
ALBERICIO; MARTIN: "Solid supports for the Synthesis of Peptides", ERGÄNZUNG ZU CHIMICA OGGI/CHEMISTRY TODAY, vol. 26, 2008, pages 29 - 34
KIBBE A.: "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 2000, AMERICAN PHARMACEUTICAL ASSOCIATION AND PHARMACEUTICAL PRESS
Attorney, Agent or Firm:
BEE, Joachim (DE)
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Claims:
Ansprüche

1 . Verwendung einer Zusammensetzung, die mindestens ein natürliches, rekombinantes oder synthetisches menschliches antimikrobielles Peptid umfasst, das ausgewählt ist aus einem menschlichen Defensin oder Cathelicidin, oder funktionellen Fragmenten oder Kombinationen davon, zur Inaktivierung von bakteriellen Sporen.

2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Sporen von aeroben oder anaeroben Bakterien sind.

3. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sporen von Bakterien abgeleitet sind, die ausgewählt sind aus zumindest einem der folgenden: Clostridium sporogenes, Clostridium difficile, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium novyi, Clostridium histolyticum,

Clostridium sordellii, Clostridium ramosum, Clostridium innocuum, Clostridium septicum oder Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans. 4. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung zur Hemmung der Auskeimung von bakteriellen Sporen zu vegetativen Zellen eingesetzt wird.

5. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das menschliche Defensin oder Cathelicidin ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend menschliches beta-Defensin-3, Cathelicidin LL-37, oder Fragmenten oder Kombinationen von einem oder mehreren davon.

6. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung als Desinfektionsmittel eingesetzt wird.

7. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung als Desinfektionsmittel von Material-Oberflächenflächen eingesetzt wird.

8. Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung zur Desinfektion bei Säugetieren, insbesondere dem

Menschen, eingesetzt wird. 9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung auf der menschlichen Haut, vorzugsweise auf Händen, Schleimhaut oder einer Wunde eingesetzt wird.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung als Arzneimittel zur Verhinderung eines Rezidivs bei Infektionen, die durch bakterielle Sporen ausgelöst werden, eingesetzt wird.

1 1. Zusammensetzung, die mindestens ein natürliches, rekombinantes oder

synthetisches menschliches antimikrobielles Peptid umfasst, das ausgewählt ist aus einem menschlichen Defensin oder Cathelicidin, oder funktionellen Fragmenten oder Kombinationen davon, zur Verwendung in der Inaktivierung von bakteriellen Sporen.

12. Zusammensetzung zur Verwendung nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass sie als Desinfektionsmittel oder Arzneimittel eingesetzt wird.

13. Zusammensetzung zur Verwendung nach Anspruch 1 1 oder 12, zum Einsatz in der Therapie oder Prophylaxe einer Infektion, insbesondere eines Rezidivs, die durch bakterielle Sporen ausgelöst wird.

Description:
Zusammensetzung zur Inaktivierung von Sporen

durch antimikrobielle Peptide

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung von antimikrobiellen Peptiden zur Inaktivierung von bakteriellen Sporen, insbesondere ihre Verwendung als Desinfektionsmittel und ihre Verwendung als Arzneimittel zur

Verhinderung eines Rezidivs bei Infektionen.

Stand der Technik

Clostridium difficile ist der häufigste Erreger nosokomialer und Antibiotika-assoziierter Durchfallerkrankungen. Damit stellen insbesondere C. d/ ' ff/ ' c/Ve-lnfektionen (CID) ein immer wichtigeres Problem in der Gesundheitsversorgung dar; sie treten häufig während oder nach einer Antibiotikum-Therapie auf. Wird beispielsweise durch Gabe eines

Breitbandantibiotikums ein wesentlicher Teil der natürlichen Darmflora zerstört, kann sich C. difficile aufgrund seiner besonderen Resistenzeigenschaften und der fehlenden Konkurrenz stark vermehren.

Die Übertragung in der nosokomialen Umwelt wird in erster Linie durch die Aufnahme von Sporen verursacht, die von anderen Patienten direkt, über die Hände der Pflegekräfte oder indirekt von unbelebten Dingen erworben worden sein können. Nach Abklingen der ersten Infektion kommt es bei ca. 20% der Patienten zusätzlich zu einem Rezidiv.

Ursächlich auch hier sind die Sporen, die von den Antibiotika während der Therapie nicht angegriffen werden. Zudem können die C. difficile Sporen nicht durch die üblichen (auch alkoholischen) Desinfektionsmittel ausreichend inaktiviert werden. Sie können monatelang in der Umgebung auf Einrichtungsgegenständen und medizinischen Instrumenten persistieren und später wieder auskeinem. Sie sind daher Hauptursache für Rezidive bei C. d/Tf/ ' c/ ' /e-lnfektionen. Gegen das durch Sporen ausgelöste Wiederauftreten von C. d/ ' ffic/Ve-lnfektionen und die damit verbundenen auftretenden Resistenzen gegenüber Antibiotika sind derzeitig keine geeigneten Mittel im Stand der Technik verfügbar. Sporen sind Dauerformen, die für viele Jahrzehnte vermehrungsfähig bleiben können und besonders umweltresistent sind. Sie sind im Gegensatz zu ihren vegetativen Zellen gegenüber Austrocknung und Bestrahlung aber auch gegenüber einer Reihe von

Chemikalien besonders resistent. Die Bildung von Sporen wird auch Sporulation genannt. Sporen bilden sich vermehrt nach Verbrauch der Nährstoffe, wenn die Wachstumsbedingungen für die sporenbildenden Bakterien ungünstig werden. Werden die äußeren Bedingungen wieder günstig und bestimmte chemische Signale (bspw. Glucose, Adenosin, Aminosäuren) wirken auf die Sporen ein, dann können Sporen innerhalb kurzer Zeit auskeimen und die Bildung einer Bakterienpopulation in Gang setzen. Gerade die Auskeimung stellt ein großes Problem bei pathogenen Bakterien dar, da diese in ihrer Form als vegetative Zelle sich erneut vermehren und wieder Toxine produzieren können.

Es besteht somit nicht nur ein erhöhter Bedarf an neuartigen Antibiotika, insbesondere gegenüber den bisher resistenten Bakterien, sondern vielmehr ein Bedarf an neuartigen Behandlungsmethoden, die auch gezielt auf Sporen einwirken.

Offenbarung der Erfindung Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine

Zusammensetzung bereitzustellen, mit der die vorstehend genannten Nachteile aus dem Stand der Technik vermindert oder gänzlich vermieden werden.

Erfindungsgemäß werden diese und andere Ziele erreicht durch die Verwendung einer Zusammensetzung, die mindestens ein natürliches, rekombinantes oder synthetisches menschliches antimikrobielles Peptid umfasst, das ausgewählt ist aus einem

menschlichen Defensin oder Cathelicidin, oder funktionellen Fragmenten oder

Kombinationen davon, zur Inaktivierung von bakteriellen Sporen. Ferner wird das Ziel erreicht durch die Zusammensetzung, die mindestens ein natürliches, rekombinantes oder synthetisches menschliches antimikrobielles Peptid umfasst, das ausgewählt ist aus einem menschlichen Defensin oder Cathelicidin, oder funktionellen Fragmenten oder Kombinationen davon, zur Verwendung in der Inaktivierung von bakteriellen Sporen.

Vorliegend und allgemein versteht man unter einem„menschlichen antimikrobiellen Peptid" ein antimikrobiell wirksames Peptid menschlichen Ursprungs, oder das sich von solchen antimikrobiell wirksamen Peptiden menschlichen Ursprungs ableitet oder anderweitig hergestellt, synthetisiert oder erzeugt wird und die Struktur und Funktion von solchen antimikrobiell wirksamen Peptiden menschlichen Ursprungs aufweist.

Unter„Defensine" sind, in der vorliegenden Erfindung und wie allgemein auf dem

Fachgebiet, eine Familie von hochwirksamen antimikrobiellen Peptiden zu verstehen. Sie stellen wichtige Schlüsselmoleküle der angeborenen Immunität dar, die Menschen gegen Mikroorganismen schützen und die weiterhin die Zusammensetzung der Mikrobioten von Schleimhäuten bilden. Es ist bekannt, dass Defensine gegen Bakterien, Pilze und Viren wirksam sind. Völlig neu ist jedoch ihre zerstörende Wirkung gegenüber bakterieller Sporen, wie sie durch die Erfinder gezeigt werden konnte.

Im Stand der Technik ist gegenwärtig bekannt ist, dass zwei Arten von Defensinen vom Menschen produziert werden, die aufgrund ihrer Sequenzhomologie und der Cysteinreste in alpha-Defensine und beta-Defensine eingeteilt werden. Derzeit sind sechs alpha- Defensine und vier beta-Defensine beim Menschen charakterisiert, sowie 31

Defensingene identifiziert worden. Während die beta-Defensine an mehreren Stellen im Magen-Darm-Trakt exprimiert werden, werden die alpha-Defensine überwiegend im Dünndarm exprimiert. Reife menschliche Defensine enthalten zwischen 30 und 40 Aminosäurereste, und jedes Defensin verfügt über drei Disulfidbrücken. Unter den sechs menschlichen alpha-Defensinen werden vier in den Neutrophilen und zwei primär in den Paneth-Zellen, die sekretorische Epithelzellen und die Hauptquelle für antimikrobielle Peptide im Dünndarm sind, exprimiert.

Defensine können chemisch oder auch in genetisch modifizierten Mikroorganismen produziert werden und können mit einer entsprechenden Galenik zur Freisetzung im terminalen lleum ins Kolon gebracht werden, ohne vorher im Dünndarm degradiert oder resorbiert zu werden. Unter„einem Cathelicidin" wird vorliegend das Peptid Cathelicidin sowie mit Cathelicidin verwandte antimikrobielle Peptide verstanden, bei denen es sich um eine Familie von Polypeptiden, die sich in Lysosomen von Macrophagen und polymorph kernigen

Leukozyten (PMNs) finden, handelt. Die Cathelicidine spielen eine kritische Rolle in der in Säugern angeborenen Immunabwehr gegen eindringende bakterielle Infektionen.

Mitglieder der Cathelicidinfamilie von antimikrobiellen Polypeptiden sind durch eine stark konservierte Region (Cathelindomäne) und eine hochvariable Cathelicidinpeptiddomäne gekennzeichnet. Die Cathelicidine wurden ursprünglich in den Neutrophilen gefunden, sind jedoch seit damals in vielen anderen Zellen gefunden worden, darunter Epithelzellen und Macrophagen nach Aktivierung durch Bakterien, Viren, Pilze oder das Hormon 1 ,25- D, das die hormonell aktive Form von Vitamin D ist. Die Cathelicidine liegen größenmäßig im Bereich von 12 bis 80 Aminosäureresten und weisen verschiedenste Strukturen auf. Die meisten Cathelicidine sind lineare Peptide mit 23 bis 37 Aminosäureresten und falten sich zu amphiphatischen alpha-Helices.

Demgemäß gilt weiterhin, dass nicht nur das vollständige menschliche antimikrobielle Peptid, ausgewählt aus menschliche Defensinen oder menschliche Cathelicidinen, sondern auch Fragmente davon, die noch die antimikrobielle Aktivität gegenüber bakterieller Sporen und Funktion des/der jeweils verwendeten menschlichen

antimikrobiellen Peptids/Peptide besitzen, geeignete antimikrobielle Peptide darstellen, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung erfindungsgemäß sein können. Dem Fachmann werden anhand der vorliegenden Erfindung Mittel und Methoden zum Auffinden von geeigneten Fragmenten von vollständigen menschlichen antimikrobiellen Peptiden, insbesondere durch C- oder N-terminales Verkürzen des vollständigen menschlichen antimikrobiellen Peptids, sowie zum Testen ihrer antimikrobiellen

Wirksamkeit gegenüber Sporen bekannt sein.

Ebenso versteht man unter einem„funktionellen Fragment" eines menschlichen antimikrobiellen Peptids hier und allgemein ein Fragment dieser Peptide, das noch eine wesentliche antimikrobielle Aktivität gegenüber bakterieller Sporen aufweist, die ungefähr mit derjenigen des entsprechenden nichtfragmentierten Peptids vergleichbar ist.

In der vorliegenden Erfindung gilt, dass jeweils nicht nur ein menschliches antimikrobielles Peptid erfindungsgemäß verwendet werden kann, sondern auch eine Kombination von jeweils zwei oder mehr. Hier und allgemein gilt, dass der Ausdruck„natürlich" jegliches Peptid umfasst, das von einem Ausgangsmaterial, wo das Peptid natürlich vorkommt/erzeugt wird, entnommen worden ist; ein natürliches Peptid ist also im Allgemeinen aus seinem Ausgangsmaterial isoliert, wobei„isoliert"„von menschlicher Hand" aus seinem natürlichen Zustand verändert bedeutet, d. h. dass, wenn es in der Natur vorkommt, es aus seiner

ursprünglichen Umwelt entnommen oder entfernt wurde, oder beides. So zum Beispiel ist ein Polynukleotid oder ein Polypeptid, das auf natürliche Weise in einem lebendigen Organismus vorliegt, nicht„isoliert", dasselbe Polynukleotid oder Polypeptid, das aus den gleichzeitig vorkommenden Materialien seines natürlichen Zustande getrennt ist, ist jedoch im vorliegenden Sinne„isoliert". Auf ähnliche Art und Weise bedeutet im

vorliegenden Zusammenhang eine„synthetische" Sequenz jegliche Sequenz, die synthetisch erzeugt und nicht direkt aus einem natürlichen Ausgangsmaterial isoliert worden ist.„Rekombinant" bedeutet gentechnisch veränderte DNA, die durch Verpflanzen oder Spleißen von Genen von einer Art in Zellen eines Wirtsorganismus einer anderen Art präpariert wurde. Solch eine DNA wird zu einem Teil des genetischen Materials des Wirts und wird repliziert. Jegliches Protein/Peptid, das von solch einer DNA aus exprimiert wird, kann anschließend aus der Wirtszelle isoliert und erfindungsgemäß verwendet werden.

Zum Isolieren von natürlich vorkommenden menschlichen Defensinen oder Cathelicidin und für die Herstellung von rekombinant oder synthetisch hergestellten Defensinen oder Cathelicidin ist sich ein Fachmann ausreichender Möglichkeiten des Stands der Technik bewusst, die alle zu seiner Fähigkeit und seinem Wissen zählen und die übliche

Vorgehensweisen auf dem jeweiligen Gebiet darstellen. Das erfindungsgemäße menschliche antimikrobielle Peptid kann mittels DNA- Rekombinationstechnik unter Verwendung von gut fachbekannten Techniken hergestellt werden. Man kann sich dem Fachmann gut bekannter Verfahren bedienen, um

Expressionsvektoren zu konstruieren, die die Sequenzen, die für ein Peptid von Interesse und entsprechende Transkriptionstranslationskontrollsignale codieren, enthalten. Zu diesen Verfahren zählen zum Beispiel in-vitro-DNA-Rekombinationstechniken,

Synthesetechniken und die genetische Rekombination in vivo; siehe zum Beispiel die bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) beschriebenen Techniken. Es sind auch viele unterschiedliche Syntheseverfahren zum Erzeugen der menschlichen antimikrobiellen Peptide fachbekannt, zu denen zum Beispiel die Flüssigphasensynthese, die Festphasensynthese, Fmoc-, BOC-Schutz usw. zählen, und diesbezüglich ist eine Vielzahl von Literaturstellen verfügbar wie auch viele Firmen Peptide in Auftragsarbeit produzieren, wie zum Beispiel Sigma Aldrich. Beispielsweise sei auf Kent,„Chemical Synthesis of Proteins and Peptides", (1988) Ann. Rev. Biochem. 57: 957-989, und Albericio und Martin,„Solid Supports for the Synthesis of Peptides", (2008) Ergänzung zu Chimica Oggi/CHEMISTRY TODAY, 26: 29-34 verwiesen.

Unter„Inaktivierung von bakteriellen Sporen" werden allgemein die Hemmung sowie das Verzögern der Auskeimung von bakteriellen Sporen oder die Hemmung des Anwachsens neu entstandener vegetativer Zellen verstanden. Die Erfinder konnten eindrucksvoll nachweisen, dass es bei der Behandlung von Sporen mit menschlichen antimikrobiellen Peptiden lediglich zu einer geringen Auskeimung der Sporen zu vegetativen Zellen kommt. Dieses Ergebnis war völlig überraschend, da antimikrobielle Peptide

bekanntermaßen antimikrobiell gegenüber Bakterien wirken. Eine Eindringen

antimikrobieller Peptide in die Sporen und eine mögliche Zerstörung der Sporen war bisher nicht bekannt, zumal sich Bakterien im strukturellen Aufbau stark von ihren Sporen unterscheiden.

Gemäß einer beispielhaften Ausgestaltung handelt es sich bei den menschlichen antimikrobiellen Peptiden um solche, die in der Patentanmeldung DE 10 2014 213 654 A1 offenbart sind und erfindungsgemäß eingesetzt werden können. Der Inhalt der genannten Anmeldung ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.

Gemäß einem Aspekt der Erfindung sind die Sporen von aeroben oder anaeroben Bakterien.

Hier und allgemein bedeutet der Begriff„anaerobe" oder„anaerob" lebende„Bakterien" einen beliebigen bakteriellen Organismus, der keinen Sauerstoff für sein Wachstum benötigt. Wenn Sauerstoff vorhanden ist, kann er negativ reagieren, ja sogar absterben. Anaerobe Bakterien lassen sich daher in obligate Anaerobier, die durch das

Vorhandensein von Sauerstoff beschädigt werden, aerotolerante Organismen, die Sauerstoff nicht für das Wachstum verwenden können, jedoch sein Vorhandensein tolerieren, und fakultative Anaerobier, die ohne Sauerstoff wachsen können, jedoch Sauerstoff verwerten, wenn dieser vorhanden ist, einteilen. Der Begriff„aerobe Bakterien" dagegen bedeutet einen beliebigen bakteriellen

Organismus, der Sauerstoff für sein Wachstum benötigt; sie werden auch als Aerobier bezeichnet. Unter den Aerobiern wird unter obligate Aerobier und fakultativen Aerobier unterschieden. Obligate Aerobier benötigen für ihren Atmungsstoffwechsel

zwingenderweise Sauerstoff. Fakultative Aerobier werden auch als aerotolerant oder mikroaerotolerant bezeichnet. Sie lassen sich in Gegenwart von Sauerstoff kultivieren, ohne dass sie geschädigt werden, da sie vor der toxischen Wirkung des Sauerstoffs durch besondere Enzyme (z.B. Superoxid-Dismutase) geschützt sind. Dies hat den Vorteil, dass die Zusammensetzung gegenüber einer Vielzahl an bakterieller Sporen eingesetzt werden können, insbesondere solche die von pathogenen Bakterien stammen.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung sind die Sporen von Bakterien abgeleitet, die ausgewählt sind aus zumindest einem der folgenden: Clostridium sporogenes, Clostridium difficile, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium novyi, Clostridium histolyticum, Clostridium sordellii, Clostridium ramosum, Clostridium innocuum, Clostridium septicum oder Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans.

Clostridium ist eine grampositive Bakteriengattung, die zu den Firmicutes zählt. Es handelt sich um obligate Anaerobier, die fähig sind, Endosporen zu produzieren. Die einzelnen Zellen sind stäbchenförmig, wodurch sie ihren Namen erhalten, der vom griechischen Wort„kloster", oder„Spindel", stammt.

Bacillus ist auch eine grampositive Bakteriengattung, die zu den Firmicutes zählt. Die Gattung Bacillus zeichnet sich durch die Bildung von Endosporen und ein aerobes oder fakultativ aerobes Wachstum aus. Sie vermehren sich nur unter aeroben Bedingungen und bilden unter Umständen Lecithinase und Katalase.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Zusammensetzung zur Hemmung der Auskeimung von bakteriellen Sporen zu vegetativen Zellen oder deren Anwachsen eingesetzt.

Unter„Hemmung der Auskeimung" wird in der vorliegenden Erfindung verstanden, dass ein Großteil der Sporen in ihren Dauerformen verbleibt und nicht zu vegetativen Zellen auskeimt. Die Dauerform entspricht der nicht wachstumsfähigen und nicht pathogenen Sporen-Form. Wie groß der Anteil ist, der in der Sporenform verbleibt, richtet sich u. a. nach der Art der Zusammensetzung, der Konzentration der Zusammensetzung sowie der Art der bakteriellen Sporen. Ferner kann die Spore durch eine Behandlung mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung selbst zerstört werden; also vollständig inaktiviert werden.

Hier und allgemein versteht man unter einer„Auskeimung" einen dreiphasigen

Mechanismus einer bakteriellen Spore hin zu einer vegetativen Zelle. In einem ersten Schritt wird die Spore aktiviert. Die Aktivierung besteht im Wesentlichen in einer Erhöhung der Permeabilität der Sporenhülle, so dass stoffliche Induktoren der Sporenkeimung von außen eindringen können. Dies kann durch Alterung geschehen oder durch mechanische Schädigung. Wenn nach dieser Phase der Aktivierung bestimmte, artspezifische

Induktoren im Außenmilieu vorhanden sind, wird die Keimung im engeren eingeleitet. Als Keimungsinduktoren wirken solche Stoffe, die in natürlicher Umgebung in der Regel bei Bedingungen vorhanden sind, die für das Wachstum des Bakteriums günstig sind.

Beispiele dafür sind durch das Bakterium nutzbare Energiequellen (beispielsweise

Glucose) und Nährstoffe (beispielsweise Adenosin und L-Alanin). Bei der Keimung wird die Sporenhülle durch teilweisen Abbau geschwächt. Beim Auswachsen nimmt die Zelle durch Wasseraufnahme und Wachstum (Bildung von neuen Zellbestandteilen) an

Volumen zu, sprengt die Sporenhülle und bildet eine neue Zellwand. Im Sinne dieser Erfindung kann die Zusammensetzung in jeder Phase der Auskeimung wirkungsvoll eingreifen und die bakterielle Spore inaktivieren bzw. an der Auskeimung hindern.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das menschliche Defensin oder Cathelicidin ausgewählt aus der Gruppe umfassend menschliches beta- Defensin-3 (hBD-3), Cathelicidin LL-37, oder Fragmenten oder Kombinationen von einem oder mehreren davon.

Menschliches beta-Defensin 3 (hBD3) ist ein Protein aus 45 Aminosäuren, welches mit einer Netto Ladung von +1 1 das am stärksten kationische Defensin darstellt. hBD3 liegt in Lösung als Dimer vor und zeigt bei physiologischen Salzbedingungen im mikromolaren Konzentrationsbereich eine gute antimikrobielle Aktivität gegen gramnegative und im Gegensatz zu den alpha Defensinen und hBD1 und 2 gegen grampositive Bakterien, darunter auch Methicillin-resistente Staphylococcus aureus- (MRSA) und Vancomycin- resistente Enterococcus faecium Stämme. Über die molekullaren Mechanismen der Wirkungsweise von hBD3 ist bisher kaum etwas bekannt. Es konnte jedoch beobachtet werden, dass bei einer Behandlung von Spaphylococcus aureus-ZeWen mit hBD3 Zeichen einer Perforierung der Zellwand, Ausstülpungen der Plasmamembran und nachfolgende Zelllyse, ähnlich wie es bei Penicillin behandelten Zellen beobachtet wurde, auftraten.

LL-37 ist ein menschliches antimikrobielles Peptid aus der Gruppe der Cathelicidine. Es wird hauptsächlich in Immunzellen produziert und ist Teil der angeborenen Immunantwort sowie der Apoptose körpereigener Zellen. Es handelt sich um ein Transportprotein, dessen Einbau einerseits in die Zellwand grampositiver Bakterien sowie andererseits in die Zellmembran zu einem Verlust von Ionen und kleinen Molekülen führt. Es wird durch das CAMP-Gen codiert. Die Produktion von LL-37 wird insbesondere durch Stimulation des TLR-9, aber auch TLR-2 und TLR-4 und indirekt durch Vitamin D angeregt.

Da sich die Wirkung von hBD3 und LL37 nicht lediglich auf Bakterien erstreckt, sonder vielmehr auf bakterielle Sporen abzielt, wird eine völig neue Therapieform bereitgestellt, die es ermöglicht im Vorfeld prophylaktisch, während einer bakteriellen Erkrankung und nach einer bakteriellen Erkrankung ein Rezidiv zu verhindern.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zusammensetzung als

Desinfektionsmittel eingesetzt, insbesondere bevorzugt als Desinfektionsmittel von Material-Oberflächenflächen.

Hier und Allgemein versteht man unter„Desinfektionsmittel" eine Zusammensetzung, die zur Keimreduzierung von vermehrungsfähigen Keimen genutzt werden kann. Ferner werden unter Desinfektionsmittel auch solche Zusammensetzungen verstanden, die sporozide Wirkungen aufweisen, also auch gegenüber Sporen (nicht vermehrungsfähige Keime) wirksam sind. Diese Art von Desinfektionsmittel wird auch Sporozid genannt. Hierdurch kann vor allem ein Rezidiv, ausgelöst durch keimende Sporen verhindert werden.

Desinfektionsmittel von Material-Oberflächenflächen sind vorliegend als

Flächendesinfektionsmittel zu verstehen, also Mittel, die für die Desinfektion von

Oberflächen von Gegenständen und größeren Flächen wie bspw. Böden o.ä., bevorzugt geeignet ist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Zusammensetzung zur

Desinfektion bei Säugetieren, insbesondere dem Menschen, eingesetzt, insbesondere bevorzugt auf der menschlichen Haut, vorzugsweise auf Händen, Schleimhaut oder einer Wunde.

Hierbei kann die Zusammensetzung im Sinne einer Händedesinfektion, eines Wund- und Schleimhautdesinfektionsmittel oder eines Hautantiseptikum zum Einsatz kommen. Das Desinfektionsmittel kann sowohl therapeutisch als auch im täglichen Gebrauch seine Anwendung finden. Dies bietet den Vorteil eines umfassenden Schutzes gegenüber Bakterien, welche durch Auskeimung pathogen wirken können. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Zusammensetzung als Arzneimittel zur Verhinderung eines Rezidivs bei Infektionen, die durch bakterielle Sporen ausgelöst werden, eingesetzt.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Zusammensetzung in der Therapie oder Prophylaxe einer Infektion, insbesondere eines Rezidivs, die durch bakterielle Sporen ausgelöst wird eingesetzt.

Neben dem Einsatz als Desinfektionsmittel kann die Zusammensetzung auch als

Arzneimittel verwendet werden. Hierbei kann die Zusammensetzung wirkungsvoll während bakterieller Erkrankungen eingesetzt werden, bzw. bei abgeklungenen

Erkrankungen zur Verhinderung eines Rezidivs. Ferner kann die Zusammensetzung auch als Prophylaxe eingesetzt werden.

Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutisch unbedenkliche

Zusammensetzungen bereit, die eine therapeutisch wirksame Menge an einer oder mehreren der hierin beschriebenen Verbindungen und/oder Zusammensetzungen in gemeinsamer Formulierung mit einem oder mehreren pharmazeutisch unbedenklichen Trägern (Zusatzstoffen) und/oder Verdünnungsmitteln umfassen. Zu Beispielen für die Verabreichung zählt die parenterale, z. B. intravenöse, intradermale, subkutane, transdermale, transmukosale Verabreichung. Die Bestimmung der Mengen und der

Dosierungsformen sowie der Verabreichungswege, die sich in jedem Fall eignen, zählt zur Fähigkeit und zum Wissen des Fachmanns. Sie können in Bezug auf den Patienten, die jeweilige Erkrankung und unter Berücksichtigung anderer Faktoren schwanken. Die Wirkstoff menge, die mit einem Trägermaterial vereinigt werden kann, um eine

Einzeldosisform zu erzeugen, wird im Allgemeinen diejenige Menge der Verbindung und/oder der Zusammensetzung sein, die zu einer therapeutischen Wirkung führt. Im Allgemeinen wird diese Menge im Bereich von ungefähr 1 % bis ungefähr 99% Wirkstoff, vorzugsweise von ungefähr 5% bis ungefähr 70%, am stärksten bevorzugt von ungefähr 10% bis ungefähr 30%, liegen. Die tatsächlichen Dosierungsniveaus der Wirkstoffe in pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung können variieren, so dass man zu derjenigen Wirkstoff menge gelangt, die wirksam ist, um die gewünschte therapeutische Reaktion bei einem bestimmten Patienten, einer bestimmten Zusammensetzung und einem bestimmten Verabreichungsweg zu erzielen, ohne für den Patienten toxisch zu sein. Das ausgewählte Dosierungsniveau wird von verschiedenen Faktoren abhängen, darunter der Aktivität der eingesetzten jeweiligen pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung oder des Esters, Salzes oder Amids davon, dem

Verabreichungsweg, dem Zeitpunkt der Verabreichung, der Ausscheidungsrate oder dem Metabolismus der jeweiligen eingesetzten pharmazeutischen Zusammensetzungen, der Behandlungsdauer, anderen Arzneistoffen, Verbindungen und/oder Zusammensetzungen und/oder Materialien, die in Kombination mit den jeweiligen eingesetzten

pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht, dem Zustand, der allgemeinen Gesundheit und der Anamnese des behandelten Patienten, sowie ähnlichen Faktoren, die auf dem Gebiet der Medizin gut bekannt sind. Es kann eine tägliche, wöchentliche oder monatliche Dosierung (oder ein anderes Zeitintervall) verwendet werden.

Der im vorliegenden Text verwendete Ausdruck„pharmazeutisch unbedenklich" bezieht sich auf diejenigen Verbindungen, Materialien, Zusammensetzungen und/oder

Dosisformen, die im Rahmen einer soliden medizinischen Beurteilung zur Verwendung im

Kontakt mit den Geweben von Menschen und Tieren ohne schwere Toxizität,

Reizwirkung, allergische Reaktion oder andere Probleme oder Komplikationen

entsprechend einem angemessenen Nutzen-Risiko-Verhältnis geeignet sind. Der Ausdruck„pharmazeutisch unbedenklicher Träger" bedeutet im vorliegenden

Zusammenhang ein pharmazeutisch unbedenkliches Material, eine pharmazeutisch unbedenkliche Zusammensetzung oder einen pharmazeutisch unbedenklichen

Grundstoff, wie einen flüssigen oder festen Füllstoff, ein Verdünnungsmittel/Streckmittel, ein Exzipiens oder ein lösungsmittelverkapselndes Material, das am Übertragen oder Transportieren der vorliegenden Verbindung und/oder Zusammensetzung von einem

Organ oder Körperteil zu einem anderen Organ oder Körperteil beteiligt ist. Jeder Träger muss in dem Sinn„unbedenklich" sein, dass er mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel ist und für den Patienten nicht schädlich ist.

Pharmazeutisch unbedenkliche Träger und Exzipienten mit gegebenenfalls weiteren Zusatzstoffen sind allgemein im Stand der Technik bekannt und werden zum Beispiel in der Arbeit von Kibbe A., Handbook of Pharmaceutical Excipients, dritte Ausgabe, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press 2000 beschrieben. Gemäß der Erfindung umfassen Zusatzstoffe eine beliebige Verbindung oder

Zusammensetzung, die für die therapeutische Verwendung der Zusammensetzung vorteilhaft ist, was Salze, Bindemittel, Lösungsmittel, Dispergiermittel und andere

Substanzen, die üblicherweise im Zusammenhang mit der Formulierung von

medizinischen Produkten eingesetzt werden, beinhaltet.

Der Ausdruck„therapeutisch wirksame Menge" bedeutet im vorliegenden Zusammenhang diejenige Menge einer Verbindung und/oder einer Zusammensetzung, eines Materials oder einer Zusammensetzung umfassend eine pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die wirksam ist, um in zumindest einer Unterpopulation von Zellen in einem Tier eine gewisse gewünschte therapeutische Wirkung hervorzurufen, und zwar entsprechend einem Nutzen-Risiko-Verhältnis, das für jegliche medizinische Behandlung angemessen ist.

Vorteile der Erfindung

Die Verwendung der Zusammensetzung im Sinne der Erfindung bietet den Vorteil, eine Zusammensetzung bereitzustellen, die zur Inaktivierung von bakteriellen Sporen geeignet ist. Ferner bietet die Erfindung den Vorteil, dass die Zusammensetzung wirksam ist gegenüber einer Vielzahl an bakteriellen Spornen, insbesondere Sporen von pathogenen Bakterien, sodass eine Hemmung der Auskeimung gegebenenfalls zu einer Verhinderung eines Rezidivs führen kann.

Ferner kann die pharmazeutische Zusammensetzung sowohl als Arzneimittel als auch als Desinfektionsmittel zum Einsatz kommen. Dies bietet den Vorteil einer ganzheitlichen Therapie innerhalb einer bakteriellen Erkrankung aber auch vorbeugend innerhalb einer Prophylaxe oder im Anschluss einer bakterieller Erkrankung als zusätzliche Therapie. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann beispielsweise unterstützend während einer Antibiotikatherapie eingesetzt werden. Die vorliegende Erfindung ist in ihrer Anwendung nicht auf die Details der Erstellung und Anordnung der Komponenten, die in der Beschreibung dargestellt oder in den

Zeichnungen veranschaulicht sind, beschränkt. Die Erfindung ermöglicht andere

Ausbildungsformen und kann auf verschiedene Art und Weise durchgeführt werden. Auch dient die hier verwendete Ausdrucksweise und Terminologie Beschreibungszwecken und ist nicht als einschränkend zu betrachten. Die Verwendung von„einschließlich", „umfassend" oder„aufweisend",„enthaltend",„beinhaltend" und Variationen davon soll im vorliegenden Text das danach Aufgezählte sowie Äquivalente davon und Zusätzliches mit umfassen.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele, die keinesfalls als weiter einschränkend aufzufassen sind, weiter veranschaulicht. Der gesamte Inhalt aller in der vorliegenden Anmeldung zitierten Angaben (einschließlich Literaturstellen, ausgegebener Patente, veröffentlichter Patentanmeldungen und mitanhängiger Patentanmeldungen) wird hiermit ausdrücklich durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen. Im Falle eines Konfliktes ist die vorliegende Beschreibung, einschließlich beliebiger

Definitionen hierin, vorrangig. Es folgt die Beschreibung der Figuren.

Fig. 1 zeigt die Ergebnisse einer Behandlung einer Suspension aus vegetativen Zellen und Sporen nach einer Hitzebehandlung zur Abtötung der vegetativen Zellen mit den beispielhaften antimikrobiellen Peptiden LL37 und hBD3 in Abhängigkeit der Konzentration des antimikrobiellen Peptids; und

Fig. 2 zeigt eine Elektronenmikroskopie von C.d/ff/c/ ' /e-Sporen, die mit Gold markierten HBD3-Peptiden inkubiert worden waren. HBD3 konnte in die Sporen eindringen

(schwarze Partikel); und

Fig. 3 zeigt eine Elektronenmikroskopie von C. d/ ' /f/ ' c/ ' /e-Sporen. Bei diesem C. difficile- Stamm wurden die Sporen strukturell durch HBD3 zerstört.

BEISPIELE

Ausführungsformen der Erfindung

Auswirkung antimikobieller Peptide auf C. d/ ' /f/c/ ' /e-Sporen Um die Auswirkungen antimikobieller Peptide auf C. d/Tf/ ' c/ ' /e-Sporen zu untersuchen, wurden zunächst ein Bakteriensuspension mit Sporen angereichert, so dass mindestens 70% Sporen vorlagen. Die Sporensuspension wurde mit verschiedenen Defensinen (HBD1 , HBD2, HBD3) und dem Cathelicidin LL37 (rekombinante Defensine: Fa.

Peptanova Sandhausen, HBD1 Best. Nr. 4337; HBD2; 4338, HBD3 4382 / rekombinantes LL37: Innovagen Lund Schweden, Best. Nr. SP-LL-37-1 ) für 60 Minuten inkubiert. Danach wurden Aliquots der Proben auf Columbia-Blutagar ausplattiert und mindestens 4 Tage anaerob inkubiert. Die ausgekeimten Sporen in einer unbehandelten Kontrolle und den Ansätzen mit antimikrobiellen Peptiden wurden ausgezählt.

Es zeigte sich, dass bei den Proben, die mit HBD3 oder LL37 inkubiert wurden, im Vergleich zu den Kontrollen signifikant weniger ausgekeimte Sporen vorlagen. Um sicher feststellen zu können, ob die Anwesenheit antimikrobieller Peptide im Medium entweder auskeimende Bakterien rasch abtöten oder die Sporen tatsächlich am

Auskeimen gehindert werden wurde das Experiment wiederholt, wobei am Ende der Inkubationszeit die Peptide ausgewaschen wurden und das Medium frei von Peptiden war.

Trotz des Auswaschens blieb überraschenderweise der hemmende Effekt von HBD3 und LL37 dennoch erhalten, so dass auch in diesen Experimenten gezeigt werden konnte, dass sowohl Defensine als auch Cathelicidine gegenüber Sporen wirkungsvoll sind. In weiteren Experimenten wollten die Erfinder eindeutig zurückführen, dass entstehenden Bakterienkolonien sicher auf die ausgekeimten Sporen und nicht auf das Anwachsen restlicher vegetativer Zellen zurückzuführen sind. Hierzu wurden nach Inkubation und Auswaschung die restlichen vegetativen Zellen durch Hitze (61 °C, 30 Min) abgetötet. Dieses Erhitzen tötet lediglich die vegetativen Zellen ab, nicht jedoch die Sporen.

Innerhalb dieser Versuche ergab sich eine konzentrationsabhängige Abnahme auskeimender Sporen bei beiden wirksamen antimikrobieller Peptide, wobei HBD3 schon in geringeren Konzentrationen eine etwas höhere Wirksamkeit zeigte. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Figur 1 zusammengefasst. Dort werden die unterschiedlichen Wirkungen von LL37 im Vergleich mit HBD3 auf auskeimende Sporen in einem Graphen wiedergegeben. Deutlich wird, dass bereits eine geringe Konzentration (2,5 g/mL) an HBD3 ausreicht um die Anzahl der auskeimenden Sporen massiv zu senken. Während bei geringen

Konzentrationen noch ein deutlicher Unterschied zwischen der Wirkung von LL37 und HBD3 besteht ist dieser kaum noch erkennbar bei größeren Konzentrationen an antimikrobiellen Peptiden (10 μg mL).

In weiteren Versuchen mit Gold-markierten HBD3 Peptiden konnte nachgewiesen werden, dass HBD3 in das Exosporium, die äußere Wand der Sporen eindringt und teils die Sporenstruktur zerstört. Diese Ergebnisse sind eindrucksvoll in den Figuren 2 und 3 dargestellt.

Bisher war lediglich bekannt, dass antimikrobielle Peptide, insbesondere das Defensin HBD3 und das Cathelicidin LL37 vegetative Zellen gut abtöten und in Verbindung mit Antibiotika die Wirkung zudem verstärkt werden kann. Völlig neu dagegen ist die

Erkenntnis, dass auch Sporen durch die Behandlung mit antimikrobiellen Peptiden zerstört werden können.

Darüberhinaus bestätigen elektronenmikroskopische Aufnahmen das Eindringen von HBD3 direkt in die Sporen. Nach dem jetzigen Stand der Technik, ist kein Antibiotikum oder Peptid bekannt, dass dies erreichen könnte.

Der bekannteste Wirkmechanismus antimikrobieller Peptide ist die Porenbildung in der bakteriellen Membran. Völlig neu und überraschend ist, dass sich dieser

Wirkmechanismus auch auf die Sporenwand übertragen lässt.Da sich die

Zellwandstruktur von Bakterien gegenüber der Zellwandstruktur von bakteriellen Sporen stark unterscheidet, beispielsweise sind Antibiotika die eine Wirkungsweise innerhalb der Zellmembran aufweisen völlig wirkungslos gegenüber Sporen, war nicht davon auszugehen, dass menschliche antimikrobielle Peptide zwingenderweise gegenüber bakteriellen Spornen aktiv sind.