발명의명칭:핵산및키토산을포함하는회전근� �파열수복용 조성물

기술분야

[1] 본발명은핵산및키토산을포함하는회전근개파 열수복용조성물에관한 것이다.

배경기술

[2] 어깨속에는어깨를움직이는데꼭필요한 4개의근육 (극상근,극하근,

견갑하근,소원근)이있으며,이를회전근개라고 한다.회전근개는강력한 삼각근의수직전단력을원활한외전전단력으로 전환시키며，상완골두가 견봉하부와접촉하지않도록하는보호막의역할 을한다 (Kang J.D., et al., 2007).

[3] 회전근개의손상은급성외상으로발생하는경우 도있으나대부분이환자에서 특별한외상력없이발생되어서서히진행되는것 으로알려져있다.즉， 회전근개질환은기본적으로는노화현상에따른 퇴행성질환이지만외적인 요인으로견관절의불안정성，견봉쇄골관절의 관절염,견봉골 (osacromiale), 오구견봉인대충돌,오구돌기충돌，후상방관� �과층돌등이원인이되어 발생될수있다.또한회전근:개손상은단지견봉� ��부에서의충돌 (층돌 증후군)에의한외부압박에의해발생하는것뿐� �아니라회전근개자체의내부 변성 (intrinsic degeneration)이나염증반웅의영향등여러요인이� �합적으로 작용하는것으로알려져있다.이러한병적변화� �팔을무리하게쓰거나가벼운 외상이동반될경우회전근개의파열로진행되어 일상생활및작업활동에 심각한장애를유발할수있다 (Cho N.S., et al., 2012).

[4] 회전근개손상의증상으로는통증，근육위축， 관절운동의제한，견관절근력 약화,견관절전외측부의압통등이있다ᅳ파열� �정도가심하면파열된부분이 외부에서촉진된다.또한건측팔로아픈팔을올� �려고시도하면올라가지나 파열로인해힘이약해져올린팔을유지하지못하 고아픈팔이툭떨어지거나 어깨통증을호소하게된다.

[5] 견관절의회전근개손상은초기 1단계에서말기 3단계까지각단계에파라그 임상적특징과치료에차이가았다. 1단계는회전근개의부종및출혈이 나타나고, 25세이하의연령층에많으며보존적치료로완치� ��가능하다.

2단계는회전근개의섬유화및건염이나타나는� �계로 25세에서 40세사이의 연령층에많으며활동량에따라증상이재발한다 .보존적치료로호전될수 있으나증상이심할경우에는수술을필요로한다 . 3단계는퇴행성골극형성및 회전근개가파열된단계로 , 40세이상의연령층에많으며증상이계속적으로 악화되어수술을필요로한다ᅳ

[6] 회전근개파열의치료는보존적치료와수술적치 료가있으며，국내에서는 수술적치료가많이시행되고있는데,수술방법� �로는내시경관절봉합술과 개방적봉합술이있다.수술치료는기법과관계� �이수술실패및감염등 후유증가능성이항시있으며，삼각근에수슬반 흔이남는문제가있다.또한 수술이후에도수개월간의재활훈련이필요하며 ,수술로통증이완전히 없어지지않고남아있거나관절의강직으로움직 임이완전히회복되지않는 경우도있다 (Lee J.H., et al., 2011).

[7] 보존적치료의방법은크게염증과통증의완화를 위한방법으로서휴식,진통 소염제복용，국소스테로이드주사제의사용， 물리요법등을사용할수있으며， 연부조직의유연성회복을위한스트레칭운동과 기능의회복을위한근력강화 운동을시행할수있다 (Jung H.J., et al., 2012).약물치료의경우비스테로이드성 소염진통제를경구투여하가나국소적용하는방 법，또는스테로이드

주사용법이사용되어왔으나，이러한약물치료 법은단기적인효과는크나 재발률이높고부작용을수반하는문제가있었다 .이외에도，초음파온열치료， 전기치료와같은물리적인치료방법과같은비수 술적치료방법들의경우에는 통증을감소시키는등의증상완화에국한되어， 원인을적극적으로해결하기 위한치료법이되지못하는한계가있었다.

[8] 이에,최근비수술적치료방법의일환으로서，� �소판풍부혈장 (platelet-rich plasma)주사치료와같은조직재생효과에기반을� �새로운치료법이소개되어 있으며실제로회전근개파열에서치료.효과가� �는것으로보고되고있다.

[9] 이에,본발명자는회전근개파열수복용조성물� �연구하는과정에서，핵산및 키토산을포함하는조성물이회전근개파열에의 한통증완화및파열된 회전근개의수복효과가우수한것을확인함으로 써본발명을완성할수있었다.

[10] 종래선행기술로서한국둥록특허제 2015-0131864호에는디엔에이단편

흔합물을함유하는희전근개파열의예방또는치 료용약학조성물이개시되어 있고，한국등록특허제 1536134호에는회전근개를포함하는연부조직수� �용 매트튀스를기재하고있으나，핵산및키토산을 포함하는회전근개파열수복용 조성물에대해기재된바가없어그구성에있어서 본발명과차아가있다.

발명의상세한설명

기술적과제

[11] 본발명의목적은핵산및키토산을포함하는회전 근개파열수복용조성물을 제공하는데있다.

[12] 또다른본발명의목적은핵산및키토산을포함하 는회전근개파열수복용 조성물의제조방법을제공하는데있다.

과제해결수단

[13] 본발명은핵산및키토산을포함하는회전근개파 열수복용조성물에관한 것이다.

[14] 상기핵산은함량이조성물총중량을기준으로 0.1중량 %내지 3중량 %>일수 있다.

[15] 상기키토산은함량이조성물총중량을기준으로 0.001중량 %내지

0.1중량 %일수있다.

[16] 상기핵산및키토산은 1:1내지 3000:1중량비율일수있다.

[17] 상기핵산은디옥시리보핵산 (deoxyribonucleic acid, DNA),리보핵산 (ribonucleic acid, RNA)또는이들의흔합물일수있다.바람직하게는

디옥시리보핵산 (deoxyribonucleic acid, DNA)이다.

[18] 상기디옥시리보핵산은올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide),

폴리뉴클레오타이드 (polynucleotide)및

폴리디옥시리보뉴클레오타이드 (polydeoxyribonucleotide)에서선택될수있다.

[19] 상기핵산은분자량이 lkDa내지 100,000kDa일수있다.바람직하게는 10kDa 내지 10,000kDa이고,더욱바람직하게는 50kDa내지 3,500kDa이다.

[20] 상기키토산은분자량이 3kDa내지 l,000kDa일수있다.

[21] 상기조성물은수용성고분자를추가성분으로함 유할수있다.

[22] 상기수용성고분자는히알루론산 (hyaluronic acid),콘드로이틴황산 (chondroitin sulfate),글리코겐 (glycogen)，덱스트린 (dextrin),덱스트란 (dextran),덱스트란 황산 (dextran sulfate),히드록시프로필메틸셀를로스 (hydroxypropyl

methylcellulose),알긴산 (alginic acid),키틴 (chitin),풀루란 (pullulan),

콜라겐 (collagen),젤라틴 (gelatin)및이들의가수분해물，

폴리비닐알코을 (polyvinyl alcohol),폴리비닐피롤리돈 (poly vinyl pyrrolidone), 폴리아크릴산 (polyacrylic acid)및카르복시비닐중합체 (carboxylvinylpolymer)로 이루어진군중에서선택되는 1종이상일수있다.바람직하게는

히알루론산 (hyaluronic acid)이다…

[23] 상기조성물은주사기를통해주입할수있다.

[24] 상기조성물은온도에따라졸-겔전이가일어나� �하이드로겔일수있다.

[25] 이하본발명을상세하게설명한다.

[26] 상기핵산및키토산을포함하는회전근개파열수 복용조성물은 i)핵산을 완충용액 (buffer)에넣고 40°C내지 70°C에서교반하면서 30분내지 1시간동안 용해시켜핵산저장용액올제조하는단계; ii)키토산을산성완충용액에 용해시켜키토산저장용액을제조하는단계 ; iii)상기 i)단계의핵산저장용액및 상기 ii)단계의키토산저장용액을핵산및키토산의중 량비율이 1:1내지 3000:1이되도록흔합하여 40°C내지 70°C에서 30분내자 1시간동안교반하는 단계 ;및 iv)상기 iii)단계의핵산-키토산흔합액을교반하면서상� ��으로낮추는 단계;를포함할수있다.

[27] 상기핵산저장용액제조시아용할수있는완충용 액으로는소듐포스페이트 디베이직도데 7]·하이드레이트 (sodium, phosphate dibasic dodecahydrate), 염화나트륨 (sodium chloride),염화마그네슘 (magnesium chloride),

염화칼륨 (potassium chloride),인산완층식염수 (phosphate buffer saline)또는 HEPES(N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N'-2-ethanesulfonic acid)완층용액이 있으며,바람직하게는소듐포스페이트디베이� �도데카하이드레이트 (sodium phosphate dibasic dodecahydrate)이며，가장바람직하게는 5~300mM의소듐 포스페이트디베이직도데카하이드레이트를이 용할수있으나,이에한정하는 것은아니다.

[28] ： 상기키토산저장용액제조시이용할수있는산성 완층용액으로는

아세트산 (acetic acid),염산 (hydrochloric acid),'아스코르브산 (ascorbic acid), 젖산 (lactic acid),질산 (nitric acid),글루탐산 (glutamic acid)또는포름산 (formic acid)이있으며,바람직하게는아세트산 (acetic acid)이며,가장바람직하게는 10~300mM의아세트산을이용할수있으나,이에한정 하는것은아니다.

[29] 상기핵산및키토산을포함하는회전근개파열수 복용조성물은온도에따라 졸 -겔전이가일어나는온도감웅성하이드로겔일� �있다.

[30] 상기온도감웅성하이드로겔은온도에따라졸 (sol)이겔 (gel)로또는겔이졸로 상전이 (phase transition)가일어나는것으로,졸이겔로변하는현 상을

겔화 (gelation)라고하며，본발명에서의：겔화는점� �성을가지며온도가 증가함에따라고분자가 3차원그물구조를형성하여용매에녹지않고 잔류하는상태가되는것으로정의한다.

[31] 상기온도감웅성하이드로겔성질을가지고있는 회전근개파열수복용

조성물을파열부위에주입하여체온에와해점탄 성이회복되어겔화됨으로써 파열부위에상기조성물의잔류시간이증가되어 조직수복효과를증진시킬 수있다.또한，조성물의겔화로인해조성물의� �해속도를늦춤으로써 장기간의치료효과를얻을수있다.

[32] 상기핵산및키토산을포함하는회전근개파열수 복용조성물은

균일한 (homogeneous)상태를유지하면서층분리가일어나� �않는

안정성 (stability)이높은것으로,핵산및키토산은 1:1내지 3000:1중량비율일수 있다.바람직하게는 10:1내지 300:1이다.더욱바람직하게는 10: 1내지 100: 1 이다ᅳ

[33] 상기핵산은함량이조성물총증량을기준으로 0.1중량 ^« ¾내지 3중량%일수 있다.바람직하게는 1중량%내지 2중량 ^< ¾이다.

[34] 상기핵산은분자량이 lOkDa내지 100,000kDa일수있고，바람직하게는 lOkDa 내지 10,000kDa일수있고,가장바람직하게는 50kD내지 3,500kDa일수있다. 핵산의분자량이 lOkDa미만인경우에는겔의분해속도를조절하기� ��어려우며，

100,000kDa초과인경우에는겔의점성조절이어� �워사용에문제가있다.

[35] 상기핵산은디옥시리보핵산 (deoxyribonucleic acid, DNA),리보핵산 (ribonucleic acid, RNA)또는이들의흔합물일수있다.바람직하게는� ��옥시리보핵산이다.

[36] 또한，상기디옥시리보핵산은올리고뉴클레오 타이드 (oligonucleotide),

폴리뉴클레오타이드 (polynucleotide)및

폴리디옥시리보뉴클레오타이드 (polydeoxyribonucleotide)일수있다. [37] 또한，상기키토산의함량은조성물의총중량을 기준으로 0.001증량 %내지 0.1중량 %일수있고，바람직하게는 0.이중량 %내지 0.1중량 %이다.

[38] 상기키토산은분자량이 3kDa내지 l,000kDa인것이바람직하나,이에

한정되지않는다.

[39] 상기핵산및키토산의혼합은핵산및키토산의중 량비율이 1: 1내지 3000:1이 되도록흔합하며，이때，핵산의함량이조성물 의총중량을기준으로 0.1중량 % 내지 3중량 %가되고，키토산의함량이조성물의총중량을� �준으로 0.001중량 % 내지 0.1증량%이되도록하는것이바람직하다. .

[40] 상기핵산및키토산을포함하는회전근개파열수 복용조성물은수용성

고분자를추가성분으로함유할수있다.

[41] 상기수용성고분자는핵산및키토산을포함하는 회전근개파열수복용

조성물의분해속도조절및치료효과를공고히하 기위해추가할수있다

[42] 상기수용성고분자는생체내에서용해또는분해 가능한것으로,

히알루론산 (hyaluronic acid)，콘드로이틴황산 (chondroitin sulfate),

글리코겐 (glycogen),덱스트린 (dextrin),덱스트란 (dextran),덱스트란황산 (dextran sulfate),히드록시프로필메틸샐를로스 (hydroxypropyl methylcellulose), 알긴산 (alginic acid),키틴 (chitin),풀루란 (pullulan)등의다당류나

콜라겐 (collagen),젤라틴 (gelatin)및이들의가수분해물등의단백질,

폴리비닐알코올 (poly vinyl alcohol),폴리비닐피롤리돈 (poly vinyl pyrrolidone), 폴리아크릴산 (polyacrylic acid),카르복시비닐중합체 (carboxylvinylpolymer)등의 합성고분자화합물을사용할수있으며,바람직� �것은히알루론산이다.

[43] 상기수용성고분자를추가성분으로포함하는핵 산및키토산을포함하는 회전근개파열수복용조성물은핵산，키토산및 수용성고분자가 1 3000： 1： 1-3000중량비율로흔합된것일수있다.바람직하� �는 10-1,000： 1： 10-1,000 중량비율이고，더바람직하게는 :25~100： 1 : 25~100중량비율이다.

[44] 상기히알루론산은선형또는가교된형태를포함 하며 ,분자량이 20kDa내지 10,000kDa일수있으며, 500kDa내지 3,000kDa이바람직하나,이에한정되지 않는다.

[45] 상기핵산및키토산을포함하는회전근개파열수 복용조성물은회전근개 파열에따른지방변성과염증반웅을억제시킬수 있고，회전근개조직의 콜라겐섬유의연속성및평행성을향상시켜회전 근개조직수복효과를나타낼 수있다. ^:

발명의효과

[46] 본발명은핵산및키토산을포함하는회전근개파 열수복용조성물에관한 것으로，보다자세하게는핵산및키토산의흔합 을통해제조된회전근개파열 수복용조성물은온도에따라졸-겔전이가일어� �는것을확인하였고,기존의 단일조성물보다조직수복효과가높고，조성물 의분해속도를늦추어조직 수복효과가지속되는것을확인하였다.

[47] 따라서，본발명의회전근개파열수복용조성물 은치료가필요한파열부위에 직접적인주입이가능하고，주입된부위에서겔 화를통해조성물의분해속도를 늦추고,파열부위에대한약물의체류시간이증� �함에따라조직수복효과가 층분히발휘될수있어뛰어난치료효과를얻을수 있을것으로기대된다. 도면의간단한설명

[48] 도 1은본발명의회전근개파열수복용조성물의물� �상태를확인한

결과이다.각각의회전근개파열수복용조성물� �제조하고 3일동안방치한후， 조성물의투명도와침전물생성및층분리여부를 확인하였다.

[49] 도 2는본발명의실시예 1 의회전근개파열수복용조성물의온도에따른 졸-겔전이가일어.나는하이드로겔형성을확인� ��결과를보여주고있다.

[50] 도 3은본발명의회전근개파열수복용조성물이처� �된회전근개가파열될 때의최대인장강도를측정하는방법을보여주고 있다.

발명의실시를위한최선의 형태

[51] 이하본발명의바람직한실시예를상세히설명하 기로한다.그러나본발명은 여기서설명되는실시예에한정되지않고다른형 태로구체화될수도있다. 오히려，여기서소개되는내용이철저하고완전 해지고,당업자에게본발명의 사상을충분히전달하기위해제공하는것이다.

[52] <실시예 1.핵산및키토산을포함하는희전근개파열수복� ��조성물제조 >

[53] 핵산저장용액 (stock solution)의경우핵산올 190mM소듐포스페이트디베이직 도데카하이드레이트 (sodium phosphate dibasic dodecahydrate)완충용액에넣고 70 ^o C의열교반기를이용하여 30분이상용해하여제조하였다.

[54] 키토산저장용액은 lOOmM아세트산 (acetic acid)을이용하여제조하였다.

[55] 제조한핵산및키토산저장용액을흔합하여 70 ^o C의열교반기에서 30분동안 교반하였다.그후,온도를상온으로낮추며 1시간동안교반하여핵산및 키토산을포함하는회전근개파열수복용조성물 을제조하였다.이때,핵산및 키토산의농도가하기표 1의농도가되도록흔합하였다.

[56] [표 1]

구성 최종농도 (중량 %) 흔합비율 (중량비율)

핵산 키토산 핵산 키토산 실시예 1-1 1.5 0.015 100 1

실시예 1-2 0.1 0.001 100 1

실시예 1-3 0.1 0.1 1 1

실시예 1-4 3 0.001 3000 1

실시예 1-5 3 0.1 30 1 [57] <실시예 2.핵산，키토산및히알루론산을포함하는회전� ��개파열수복용 조성물제조〉

[58] 핵산저장용액의경우핵산을 190mM소듐포스페이트디베이직

도데카하이드레:이트 (sodium phosphate dibasic dodecahydrate)완충용액에넣고 70°C의열교반기를이용하여 30분이상용해하여제조하였다.

[59] 키토산저장용액은 lOOmM아세트산 (acetic acid)을이용하여제조하였다.

[60] 제조한핵산및키토산저장용액을홈합하여 70°C의열교반기에서 30분간 교반하였다.핵산및키토산흔합용액에히알루� �산원료를추가흔합하여 60°C의열교반기에서 _. 1시간교반후， 3시간동안상온에서교반하여핵산,키토산 및히알루론산을포함하는희전근개파열수복용 조성물을제조하였다.이때， 핵산,키토산및히알루론산의농도가하기표 2의농도가되도록흔합하였다.

[61] [표 2]

[62] 상기히알루론산은분자량이 l,000kDa인것을사용하였으나，분자량이 20kDa 내지 10,00()kDa인것을사용해도；무방하다.

[63] <비교예 1.비교대상의희전근개파열수복용조성물제조 >

[64] 하기표 3에해당되는성분과이의함량및흔합비율에따� �비교대상의

회전근개파열수복용조성물을제조하였다.제� �방법은상기실시예 1및 실시예 2와동일한방법올이용하였다. [65] [표 3]

[66] <실험예 1.회전근개파열수복용조성물의물성확인 >

[67] 상기실시예 1(실시예 1-1내지실시예 1-5)，실시예 2(실시예 2-1내지실시예

2-9)및비교예 1(비교예 1-1내지비교예 1-13)의회전근개파열수복용조성물을 . 이용하여겔화,겔의안정성및용해성여부를확� �하였다.

[68] 각각의조성물을흔합하고, 3일동안방치한후조성물의투명도와겔화상태� � 육안으로관찰하였고，겔화정도는레오미터 (rheometer)를이용하여 24 ⁰ C부터 40°C까지 1 ⁰ C씩을려주면서 1분간유지시켜점탄성측정값의증가변화를 확인하였으며，겔의안정성은침전물생성및층 분리여부로확인하였다.겔의 용해성여부는 3그 5°C의수용액에실시예 1,실시예 2및비교예 1의회전근개 파열수복용조성물을점적하여겔화시킨후온도 를 37.5 로유지하면서 , 400rpm으로 5분동안교반하면서 겔와용해여부를확인하였고，그결과를표 4 및도 1에나타내었다ᅳ [69] [표 4]

구성 3일경과후결과 37.5 C에서 5분 동안교반결과 점탄성 침전물생성 층분리 겔의용해 실시예 1-1 O X X X

실시예 1-2 o X X X

실시예 1-3 0- X X X

실시예 1-4 - o X X X

실^ᅵ예 1-5 o X X X

실시예 2-1 0 X X X

실시예 2-2 0 X X

실시예 2-3 o X X X

실시예 2-4 o X X X

실시예 2-5 0 X X X

실시예 2-6 o X X X

실시예 2-7 0 X X X

실시예 2-8 o X X X

실시예 2-9 o X X X

비교예 1-1 o X X o

비교예 1-2 X X X 0

비교예 1-3 o X X O

비교예 1-4 o X X O

비교예 1-5 X o X O

비교예 1-6 X X X O

비교예 1-7 X X X O

비교예 1-8 o o X O

비교예 1-9 o X X O

비교예 1-10 X O X X

비교예 1-11 X 0 X X

비교예 1-12 o O o O

비교예 1-13 o O 0 O [70] 상기표 4및도 1을살펴보면，실시예 1및실시예 2의회전근개파열수복용 조성물의경우에는 3일이경과하여도침전물생성및층분리현상이� �타나지 않으면서도점탄성을유지하고있는것을알수있 으며,겔의용해성의경우， . 3그 5°C에서겔을형성하고，형성된겔이지속적으� �유지되는것을관찰하였다.

[71] 그러나비교예 1의비교대상의회전근개파열수복용조성물의� �우에는

침전물이생성되거나，층분리가일어나거나부 분적으로덩어리가생성되어 점탄성의측정이불가능하였으며，겔의용해성 의경우 37.5 ⁰ C에서겔화되지 않거나겔화가되더라도 5분이내에모두용해되는것으로확인되었다.특� ��나, 비교예 1-12및비교예 1-13의비교대상의회전근개파열수복용조성물� �같이 핵산이포함되지않은경우에는조성물이점탄성 을가지지만침전물생성및층 분리현상이나타나며 37.5 ⁰ C에서겔이형성된후 5분이내에모두용해되어 안정성이떨어지는것을확인하였다 (표 4참조).

[72] 이를통해，본발명의회전근개수복용조성물은 온도변화에따라

온도감웅성을나타내고,겔화된후에도겔의형� �를지속적으로유지한다는 것을알수있었으며，이에따라,주입된본발명� �조성물이파열된회전근개 부위에서겔화되어조성물의분해속도가늦어지 고，약물체류성이증가되어 손상된회전근개부위의치료효과를증대시킴으 로써우수한회전근개파열 치료효과를나타낼수있음을예상할수있다.

[73] <실험예 2.온도에따른졸-겔잔이 (sol-gel transition)확인 >

[74] 상기실시예 1，실시예 2및비교예 1의회전근개파열수복용조성물의온도 변화에따른졸-겔전이가일어나는하이드로겔� �성을확인하였다.

[75] 졸-겔전이를확인하기위해서레오미터 (rheometer)를이용하였다.이때사용한 측정조건은 PU20,간격 (Gap) 0.5mm, 0.1Hz, 1%웅력-변형률 (stress strain)로

24°C부터 40°C까지 1°C씩을려주면서 1분간유지시켜 G' (탄성)및 G" (점성)의 변화를측정하였다.또한,각각의조성물에온도� ��가하여 36°C전.후의졸-겔 상변화를육안으로관찰하여도 2에나타내었다.

[76] 실시예 1-1의회전근개파열수복용조성물의온도에따른 탄성및점성변화를 측정한결과，온도감웅성하이드로겔이갖는： 특징인온도가증가함에따라 _. G' (탄성)의감소폭이완만하고， G" (점성)이상승하는것을관찰하였다.또한，도 2에서보여주듯이,실시예 1-1의회전근개파열수복용조성물이 36°C미만와 온도에서는졸의형태를띠는반면에 36°C가넘으면겔화되는것을관찰하였다.

[77] 이러한결과는실시예 1및실시예 2의회전근개파열수복용조성물모두에서 동일하게나타나는것을확인하였다.

[78] 이를통해,본발명의회전근개파열수복용조성� �이온도에따라졸-겔

전아가일어나는온도감옹성성질을갖고있어， 회전근개파열부위에주입된 후，체온에의해겔화되어약물의체류시간이증 가됨으로써조직수복효과를 극대화시킬수있올것으로예상할수있다.

[79] <실험예 3.회전근개파열동물모델의제조 > [80] Sprague-Dawley계수컷쥐 (rat)를실험군별로무작위적으로배정하였다.

정상군을제외한실험군의쥐에대하여우측어깨 부위를개복하고회전근개의 하나인극하근 (infraspinatus)을잘라펜로즈드레인 (penrose drain)으로감싼뒤 피부를봉합하고 4주동안사육하여만성회전근개파열 (chronic rotator cuff tear) 모델을만들었다.

[81] <실험예 4.회전근개파열수복용조성물의주입및조직검� ��>

[82] 상기실험예 3에서제조된만성회전근개파열동물모델의우� �어깨부위를 개복하여파열된회전근개를봉합수술한뒤,본� �명의회전근개파열수복용 조성물을 0.5m£씩주입하고 3주또는 6주동안사육하였다. 3주또는 6주후에각 군의동물모델의회전근개부위에대해조직검사 를수행하였다.조직검사는 10%중성완층포르말린 (neutral buffered formalin)에채취된조직을 24시간이상 고정화시킨후,탈수및파라핀침습을통해,근육 -힘줄경계부 (musculotendinous junction)의근위 0.3cm부위를확인하였다.

[83] <실험예 5.조직병리학적관찰 >

[84] 실험예 5-1.지방변성 (fatty degeneration)과염증반웅의조직검사를통한

회전근개파열수복용조성물의생체적합성과치 유정도확인

[85] 회전근개에파열과같은손상이일어나면회전근 개부위의내부변성및

염증반웅이나타나고,회전근개과열의봉합이� �패할경우에도회전근개의 지방변성과염증반웅이현저하게나타나고,회� �근개의재파열가능성이높다. 이에따라，본발명의회전근개파열수복용조성 물을처리한후，회전근개 파열의수복정도를확인하기위해지방변성과염 증반웅의변화를관찰하였다.

[86] 조직절편의지방변성을확인하기위해지방세포 의개수변화를 S100으로, 염증반웅을확인하기위해대식세포의개수변화 를 CD68으로염색하여，염색된 세포수를통계처리한결과를표 5에나타냈다.

[87] [표 5]

상기표 5에서보여주듯이，회전근개파열동물모델 (무처라군)에서시간 경과함에따라지방세포와대식세포의수가증가 하여병변이악화되고있음을 알수있다.반면,실시예 1-1,실시예 2-1，비교예 1-1및비교예 1-3의회전근개 파열수복용조성물을처리한군에서는시간이경 과함에따라지방세포와 대식세포의수가감소하였으나,비교예 1-2의회전근개파열수복용조성물을 처리한군에서는무처리군과유사하게지방세포 와대식세포의수가증가하면서 병변의조직수복효과가없었다.나아가,실시예 1-1및실시예 2-1의회전근개 파열수복용조성물을처라한군의경우에는비교 예 1-1및비교예 1-3의 회전근개파열수복용조성물을처리한군보다지 :방세포및대식세포의：수의 감소율어더큰것을알수있었다. ^■

[89] 이에따라，본발명의회전근개파열수복용조성 물은생체적합성이우수하고, 회전근개파열부위에서약물체류성이증가되어 조직수복효과가현저하게 향상됨을예상할수있었다.

[90] 실험예 5-2.콜라겐섬유의조직검사를통한파열된회전� �개치유정도확인

[91] 파열된회전근개치유정도는뼈 -힘줄결합부의콜라겐섬유 (collagen fiber)의 연속성및규칙적인평행성에대한조직검사를통 해확인하였다.

[92] 조직절편의콜라겐섬유연속성및규칙적인평행 성정도을확인하기위해 메이슨트리크롬 (Masson's trichrome)염색과 H&E(hematoxyline and eosin):염색을 이용하여확인하였다.염색된조직절편의콜라� �섬유연속성및뉴칙적인 평행성정도에따라 0내지 3단계 (0: 25%, 1: 25-50%, 2: 50-75%, 3: >75%)로나눈 후각단계에해당되는쥐의까리수를확인하여파 열된:회전근개치유정도를 평가하였고，그결과를표 6에나타내었다ᅳ

[93] [표 6]

[94] 상기표 6에서보여주듯이,회전근개파열이있는동물모� �� (무처리군)에서 뼈-힘줄경계부의콜라겐섬유의연속성및평행� �변화의정도가 6주까지 0과 1단계에있는것을알:수있었다.그러나실시예 1-1과실시예 2-1，및비교예 1-1과비교예 1-3의회전근개파열수복용조성물은뼈-힘줄경� �부의콜라겐 섬유의연속성및평행성변화의정도가 6주까지 1, 2, 3단계에있었다.특히， 실시예 1-1및실시예 2-1은비교예 1-1및비교예 1-3보다콜라겐섬유의연속성 및평행성변화의정도가높은단계로나타나는것 을알수있었다.

[95] . 이에따라，본발명의회전근개파열수복용조성 물은회전근개파열부위의 약물체류성을증가시켜콜라겐섬유의연속성및 평행성이향상되어조직수복 효과가나타남을확인하였다.

[96] <실험예 6.회전근개의인장강도측정 >

[97] 본발명의실시예 1및실시예 2의회전근개파열수복용조성물이처리된 회전근개가파열될때의인장강도를도 3의 Instron 3343장비를사용하여 확인하였다.

[98] 공기식집게 (Pneumatic grip)를이용하여쥐의회전근개을고정하고

인장하중 (tensile load)을주어파열될때의최대장력을측정하였다. 이때파열의 패턴은뼈와힘줄 (tendon)의연결부에서발생하는삽입파열 (insertional tear)과 힘줄의중간부에서발생하는중간파열 (midsubstance tear)의두가지형태로 나타난다.파열의형태는결합의강약정도에의� �구분되는데,중간 파열 (Midsubstance Tear)은뼈-힘줄에서강한결합이있을때나타나며 ,삽입 파열 (Insertional Tear)은뼈-힘줄에서비교적약한결합이있을때나 타나는 것으로알려져있어,중간파열 (midsubstance tear)이나타났을때조직이강화된 것으로판단하였다.

[99] 장력시험을실시하기전 1N의전부하를주고 0.1腿 /s속도에서 5%의

strain으로 10 cycle의반복하증을가하여전처리를하였다.전처 리후

스트레스-이완반웅 (stress-relaxation response)이 2.5%/s변형속도 (strain rate)에서 5%의기울기로시험되었고 , 300초간을기다린뒤다시 1N의전부하로돌아간 뒤，준정적파괴하중시험 (quasi-static load-to-failure test)을 0.1匪 /s에서 시행하였다.하중 (Load)및변위 (displacement)는 100Hz로기록하였다.

[100] 검정력분석 (Power analysis)은파괴하중정도 (peak failure load)의

비율 (ratio)에서 20%의차이 (difference)를감지하는데필요한최소의샘플수를 4마리로하였으며， 0.8의파워 (power)와 0.05의알파 (alpha)값으로예상되는 표준편차 (SD)를 10%로하였다.두군사이의각각의매개변수 (parameter)의 차이를비교하거위해비모수분석을사용하였으 며,독립샘플 (independent samples)에대한 Mann— Whitney test를이용하였으며， SPSS version 13.0(SPSS, Chicago, IL)통계 .프로그램을사용하였다.그결과를표 7에나타내었다.

[101] [표 7]

[102] 상기표 7에서，실시예 1-1,실시예 1-3，실시예 1-4,실시예 2-1및실시예 2-7의 회전근개파열수복용조성물이처리된군의경우 ，회전근개파열이있는우측 어깨의회전근개파괴하중과파열패턴은 6주경과한후에정상어깨의파괴하중 및파열패턴과유사한측정값이나타나는것으로 확인되었고，비교예 1-1및 비교예 1-3의회전근개-파열수복용조성물을 _. 처리한군보다그수치가현저히 증가되는것으로나타났다.

[103] 또한，실시예 1-1,실시예 1-3,실시예 1-4,실시예 2-1및실시예 2-7의회전근개 파열수복용조성물이처리된군에서의회전근개 파열패턴은약한결합을 나타내는삽입파열패턴보다강한결합을나타내 는중간파열패턴의비율이 높다는것을통해회전근개의인장강도가강화되 어회전근개파열이

수복되었다는것을알수있었다. ― .

[104] 이를통해，본발명의회전근개파열수복용조성 물을처리한경우，처리시간 ⁰ 경과함에따라회전근개의인장강도가증가하고 ，파열된희전근개의조직이 수복됨으로써우수한회전근개파열수복효과를 나타냄을알수있었다.