CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a uma composição voltada à hidrólise de polissacarideos do malte e ao método de mosturação do mesmo para a fabricação de bebidas. Mais especificamente, a presente invenção compreende uma composição enzimática definida e um método de mosturação de malte que envolve a incubação do mesmo com a referida composição. A presente invenção possui aplicação na indústria de alimentos, em especial, nas cervejarias.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] O processo industrial atual para a produção de cerveja baseia-se, essencialmente, nos mesmos princípios entre cervejarias. Os ingredientes básicos empregados na sua produção são água tratada, com pH e composição iônica corrigidos, malte, lúpulo, levedura do gênero Saccharomyces, além de, eventualmente, outras fontes de carboidratos chamadas de "adjuntos", que são empregadas em proporções diferentes e podem ser selecionadas dentre grítz de milho, arroz ou xarope de alta maltose, por exemplo.

[003] No processo, o malte de cevada é, inicialmente, moído. Após adição de água e correção de pH e força iônica, tem-se o início da etapa de maceração, na qual o malte moído hidratado é submetido à agitação com aumento gradual de temperatura, em rampas com período de tempo definidos, permitindo a ação das diversas enzimas do próprio malte (endógenas) : b-glucanases (por volta de 45°C) ; proteases (por volta de 52°C); b-amilases (por volta de 60°C) , e - amilases (por volta de 70°C) . Em 77°C, estas enzimas endógenas são inativadas. [004] Em função da grande variedade na qualidade do malte comercial, bem como de seu preço, são adicionadas preparações enzimáticas podendo conter a-amilases, b-glucanases , celulases e hemicelulases para favorecer a extração de carboidratos independentemente do conteúdo enzimático presente no grão germinado. Após a maceração, o produto obtido, chamado mosto, é filtrado. A adição de preparações enzimáticas também tem a finalidade de reduzir sua viscosidade e facilitar a filtragem. Na utilização de grítz de milho como adjunto, este é liquefeito, ou seja, submetido a um tratamento enzimático especifico com a-amilases termoestáveis comercialmente adquiridas para a degradação do amido, seu principal componente, em glicose. O adjunto liquefeito é, então, misturado ao mosto ainda na etapa de maceração .

[005] Após a filtragem, o material insolúvel contendo malte não hidrolisado é descartado. Em seguida o mosto sofre a adição de lúpulo de amargor (mais rico em a-ácidos) e é submetido à fervura por 50 minutos. Mais lúpulo é adicionado, agora de aroma, e a fervura prossegue por mais 10 minutos. A fervura tem por objetivo a esterilização do liquido, a extração dos componentes do lúpulo, a eliminação de componentes voláteis indesejados e a redução de volume de água, quando necessário. Em seguida, o mosto repousa por 20- 30 minutos, para promover a separação do trub, mistura de proteínas precipitadas e outros componentes insolúveis que serão removidos em um decantador arrefecedor hidrodinâmico, também conhecido como Whirlpool ou rotapool. O mosto é, então, resfriado e oxigenado para, finalmente, receber as leveduras e iniciar-se o processo de fermentação. Nesta etapa, podem ser adicionadas preparações contendo endopeptidase prolina-especifica e a-acetolactato descarboxilase, com o objetivo de controle de turbidez e de diacetil, respectivamente . A fermentação ocorre por 5-7 dias, em temperaturas baixas ( 12-14 °C, com Saccharomyces sp . ) , seguida por um período de maturação a 0°C por 3-7 dias, variável em função da concentração de diacetil encontrada após a fermentação. Em seguida à maturação, a cerveja é filtrada, carbonatada, diluída, sofre a adição de estabilizante de espuma, de antioxidante e, então, é envazada .

[006] Um ponto que pode ser aprimorado no processo atual é o de aproveitamento do malte, reduzindo a quantidade de malte não hidrolisado por meio de composições enzimáticas exógenas mais eficientes. Neste sentido, WO09805788 descreve um processo para a produção de bebidas alcoólicas ao qual é adicionada uma mistura de enzimas, cuja composição compreende pelo menos o uso de uma endoxilanase, uma arabinofuranosidase, uma -amilase, uma endopeptidase, uma 1-3 ( 4 ) -b-glucanase e podendo conter ainda uma amilase sacarificante e/ou uma exopeptidase . W02015032850 comenta sobre a criação de um método para a redução da viscosidade do mosto pela adição de uma arabinofuranosidase da família GH43. WO2005118769 apresenta uma composição enzimática contendo uma endoglucanase de T. reesei e uma xilanase GH10 derivada de Aspergillus, que é útil na etapa de trituração e filtração do processo de fabricação da cervej a . EP3017706 descreve métodos e composições enzimáticas para a preparação de cereais maltados e sua utilização na fabricação de alimentos e bebidas, mencionando o uso de xilanases combinadas com glucanases para a hidrólise do malte.

[007] Embora existam várias composições propostas para a realização da mosturação do malte, a manutenção da atividade durante o maior período possível do processo é característica fundamental. Mesmo dentro de um grupo de enzimas que possuem a mesma atividade, existem diferenças de velocidade, de eficiência catalítica e de resistência às condições do processo de hidrólise. Ainda, nem todas as enzimas que possuem a mesma atividade catalítica apresentarão sinergia com as demais enzimas que constituem uma composição enzimática: em boa parte das associações, o efeito é nulo ou, até mesmo negativo, reduzindo a eficácia da composição como um todo. Levando-se em consideração a questão da rampa de temperatura convencionalmente empregada para a execução da etapa de mosturação do malte, é importante que a composição enzimática possa apresentar atividade dentro da faixa estipulada para garantir o máximo de eficiência do processo.

[008] Portanto, carece-se de composições que possuam um conjunto enzimático capaz de fechar o ciclo da mosturação do malte com eficácia ampliada, mantendo sua atividade na temperatura do processo durante o maior período e com o mínimo de carga enzimática possíveis sem intervir no processo posterior de fermentação do mosto, dado que, conforme o conjunto de enzimas empregado na mosturação, compostos inibitórios podem ser liberados no meio de forma a reduzir a eficiência global da produção de cerveja ou de outras bebidas à base de fermentados de cereais.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[009] A presente invenção trata-se de uma composição enzimática para a mosturação do malte e de um método de mosturação de malte com a referida composição. Mais especificamente, a presente invenção trata-se de uma composição enzimática que compreende a arabinofuranosidase de sequência definida como SEQ ID NO: 1, a xilanase de sequência definida como SEQ ID NO: 2 e beta-glucanases , além do método de mosturação de malte com a composição da presente invenção .

[010] A presente invenção apresenta a vantagem de ser ativa nas condições processuais mais drásticas, permitindo um incremento de °Brix do mosto e, portanto, de rendimento de hidrólise, além de promover uma redução de sua viscosidade. Ainda, a presente invenção apresenta a vantagem de poder afetar positivamente a fermentação do mosto, proporcionando uma redução na quantidade de células mortas e, consequentemente, possibilitando um maior reuso do fermento empregado.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[011] A Figura 1 mostra um gráfico comparativo de atuação das enzimas em sinergia buscando a melhor combinação com menor número de enzimas possível. Mixed E contém 9 enzimas: SEQ ID NO: 1, Gluc_GH16, b-GlucjGHl, oí-Xyl_GH31, b-Cg1_OH39, Exo_Xeg_GH5, AraXyl_GH5, Man_GH5 e SEQ ID NO: 2. Mixed O contém 6 enzimas: as anteriores menos -Xyl_GH31, Exo_Xeg_GH5 e Man_GH5. Mixed U contém 5 enzimas: as anteriores menos Gluc_GH16. Mixed Y contém 4 enzimas: as anteriores menos SEQ ID NO: 1. Mixed T contém 5 enzimas: SEQ ID NO: 1, Gluc_GHl 6 , b-Cg1_OH39, AraXyl_GH5 e SEQ ID NO: 2. Mixed Z contém 4 enzimas: as anteriores menos Gluc_GH16. Mixed AB contém 3 enzimas: as anteriores menos b-Cg!_OH39. Mixed AE contém 4 enzimas: SEQ ID NO: 1, Gluc_GH16, b- Xyl_GH39 e SEQ ID NO: 2. Mixed AF contém 3 enzimas: as anteriores menos b-Cg1_OH39. Mixed AA contém SEQ ID NO: 1, b-Cg1_OH39 e SEQ ID NO: 2. Mixed AC contém apenas 2 enzimas: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Ao lado de cada combinação foi plotado o seu respectivo controle indicando a contribuição, em atividade, que cada enzima apresentaria caso estivesse atuando isoladamente. Os valores das reações sinérgicas apresentados são a média e o desvio padrão.

[012] A Figura 2 mostra um gráfico com as curvas de concentração das enzimas arabinofuranosidase SEQ ID NO: 1 e xilanase SEQ ID NO: 2 atuando em sinergia sobre bagaço de malte com gritz proveniente de um processo com adição da enzima Laminex® Super 3G e sobre o bagaço de malte com xarope de alta maltose proveniente de um processo com adição da enzima comercial Bioglucanase® GB. Os experimentos foram realizados em rampas de temperatura otimizadas. Os valores representam a média e o desvio padrão.

[013] Na Figura 3 são apresentados os resultados dos parâmetros avaliados no "Mosto Congress" para teste das enzimas SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 com malte e adição da enzima comercial Bioglucanase® GB. No primeiro gráfico estão plotados os valores de densidade em graus Plato (°P) . No segundo gráfico estão os valores de rendimento, em %. No terceiro gráfico estão os valores de concentração de b- glucanos remanescentes no mosto, em mg/L. No quarto gráfico estão plotados os valores de viscosidade em mPa.s. Branco : malte com adição de Bioglucanase® GB; SEQ ID NO: 2: reação com adição de 0,6 mg/mL de SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 1 : reação com adição de 0,6 mg/mL de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 1 + 2 : reação com adição de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou 3 a 0, 6 mg/mL cada. A enzima comercial Bioglucanase® GB foi adicionada em todas as condições na dosagem padrão de 150 g/tonelada de malte. Os valores representam a média e o desvio padrão.

[014] A Figura 4 mostra os resultados obtidos para os parâmetros avaliados no "Mosto Congress" para teste das enzimas SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 com malte e adição da enzima comercial Rohalase® Barley L. No primeiro gráfico estão plotados os valores de densidade em graus Plato (°P) . No segundo gráfico estão os valores de rendimento, em %. No terceiro gráfico estão os valores de concentração de b- glucanos remanescentes no mosto, em mg/L. No quarto gráfico estão plotados os valores de viscosidade em mPa.s. Malte puro : malte apenas, sem adição de qualquer enzima; SEQ ID NO: 2: reação com adição de 0,6 mg/mL de SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 1 : reação com adição de 0,6 mg/mL de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 1 + 2 : reação com adição de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 a 0, 6 mg/mL cada. A enzima comercial Rohalase® Barley L foi adicionada em todas as condições, exceto no malte puro, na dosagem padrão de 75 g/tonelada de malte. Os valores representam a média e o desvio padrão.

[015] A Figura 5 ilustra os resultados dos parâmetros avaliados no "Mosto Congress" no teste das enzimas SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 com malte e adição da enzima comercial Laminex® MaxFlow 4G. No primeiro gráfico estão plotados os valores de densidade em graus Plato (°P) . No segundo gráfico estão os valores de rendimento, em %. No terceiro gráfico estão os valores de concentração de b-glucanos remanescentes no mosto, em mg/L. No quarto gráfico estão plotados os valores de viscosidade em mPa.s. Malte puro : malte apenas, sem adição de qualquer enzima; SEQ ID NO: 2: reação com adição de 0,6 mg/mL de SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 1 : reação com adição de 0,6 mg/mL de SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 1 + 2: reação com adição de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 a 0, 6 mg/mL cada. A enzima comercial Laminex® MaxFlow 4G foi adicionada em todas as condições, exceto no malte puro, na dosagem padrão de 75 g/tonelada de malte. Os valores apresentados representam a média e o desvio padrão.

[016] A Figura 6 apresenta um comparativo de arabinofuranosidase SEQ ID NO: 1 (indicada como Abf) e xilanase SEQ ID NO: 2 (indicada como Xyl) adicionadas de b- glucanases comerciais. Todos os parâmetros avaliados foram plotados em porcentagem, sendo que os valores das enzimas comerciais foram considerados como 100%. Bioglucanase, Rohalase, laminex : adição apenas de cada uma dessas enzimas comerciais em sua dosagem padrão. B+Xyl+Abf: adição da enzima comercial Bioglucanase, de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, ambas as SEQ a 0,6 mg/mL; R+Xyl+Abf: adição da enzima comercial Rohalase® Barley L e das enzimas SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2; I+Xyl+Abf: adição da enzima comercial Laminex® MaxFlow 4G e das enzimas SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Os valores representam a média e o desvio padrão.

[017] A Figura 7 mostra os resultados do teste no "Mosto Congress" para verificar o efeito da concentração das enzimas comerciais, de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 sobre o malte. As enzimas comerciais Bioglucanase® GB, Rohalase® Barley L e Laminex® MaxFlow 4G foram testadas na concentração de 1,2 mg/mL e comparadas com teste anterior na dosagem padrão. Malte puro : malte apenas, sem adição de qualquer enzima; Bioglucanase + SEQ ID NO: 1 + 2: enzima comercial Bioglucanase® GB na dosagem padrão (150 g/tonelada de malte) mais adição de SEQ ID NO: 1 + SEQ ID NO: 2, ambas a 0,6 mg/mL. Os valores representam a média e o desvio padrão.

[018] A Figura 9 mostra os resultados do teste de avaliação no "Mosto Congress" das enzimas SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 como substituintes das b-glucanases comerciais. Malte puro : malte apenas, sem adição de qualquer enzima; Bioglucanase (150 g/ton) : reação com adição apenas da enzima comercial Bioglucanase® GB na dosagem padrão de 150 g/tonelada de malte; SEQ ID NO: 1 + 2 : reação com adição apenas de SEQ ID NOs : 1 e 2 (ambas as enzimas a 0, 6 mg/mL) ; Bioglucanase (150 g/ton) + SEQ ID NO: 1 + 2 : reação com adição da enzima comercial Bioglucanase® GB na dosagem padrão de 150 g/tonelada de malte mais SEQ ID Nos 1 e 2 (a 0, 6 mg/mL) . Os valores são médias ± o desvio padrão.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[019] A presente invenção trata-se de uma composição enzimática que compreende a arabinofuranosidase de sequência definida como SEQ ID NO: 1, a xilanase de sequência definida como SEQ ID NO: 2 e beta-glucanases .

[020] Entende-se por arabinofuranosidase como sendo uma enzima que atua sobre extremidades não redutoras de arabinooligossacarideos e cadeias laterais de polissacarideos que contenham resíduos de arabinose unidos por ligações dos tipos CÍ-1,2, -1,3 e/ou -1,5.

[021] Entende-se por xilanase como sendo a enzima responsável pela clivagem das ligações do tipo b-1,4 entre os resíduos de xilose na cadeia principal de xilanos e heteroxilanos . [022] Entende-se por beta-glucanases como sendo as enzimas responsáveis pela clivagem das ligações dos tipos b- 1,3 e b-1,4 entre os resíduos de glicose em glucanos. As beta-glucanases da composição do presente invento podem ser selecionadas dentre o grupo que compreende as famílias das hidrolases glicosídicas GH5, GH6, GH7, GH12, GH16, GH17, GH74 ou combinações entre estas. As beta-glucanases da composição da presente invenção podem ser provenientes de bactérias ou fungos, porém não se restringindo a estes, sendo estas beta-glucanases de origem natural ou heteróloga, com ou sem mutações, provenientes ou não de mutação dirigida.

[023] Comparativamente a três composições base compostas por beta-glucanases, a composição da presente invenção permite, nas condições mais drásticas de processo, uma redução média da concentração de beta-glucanos superior a 50%.

[024] A composição pode ser apresentada sob a forma de solução ou como um sólido. Neste último caso, a composição pode se apresentar tanto sob a forma de pó liofilizado ou como grânulos. É opcional a adição de um estabilizante e/ou um conservante à composição.

[025] A presente invenção refere-se, ainda a um método de mosturação de malte caracterizado pelo fato de incubar a solução compreendendo malte com uma composição enzimática que compreende a arabinofuranosidase de sequência definida como SEQ ID NO: 1, a xilanase de sequência definida como SEQ ID NO: 2 e beta-glucanases.

[026] Novamente, as beta-glucanases da composição da etapa (c) podem ser selecionadas dentre o grupo que compreende as famílias das hidrolases glicosídicas GH5, GH6, GH7, GH12, GH16, GH17, GH74 ou combinações entre estas. Ainda, as beta-glucanases da composição da etapa (c) podem ser provenientes de bactérias ou fungos, porém não se restringindo a estes, sendo estas beta-glucanases de origem natural ou heteróloga, com ou sem mutações, provenientes ou não de mutação dirigida.

[027] A incubação a que se refere o método da presente invenção pode incluir a submissão da solução de malte, solução esta que compreende água, malte e, eventualmente, agentes de correção do pH e da força iônica, à agitação com aumento gradual de temperatura, em faixas e rampas com período de tempo definidos conforme as práticas já conhecidas no estado da técnica.

[028] Exemplo : O bagaço de malte é o nome dado ao material remanescente não hidrolisado da mostura do malte. Este é rico em celulose (17%) e, principalmente, hemiceluloses (39%), especialmente arabinoxilanos (Valverde, 1994; Bartolomé et ai, 2002; Mandalari et ai., 2005; Mussato et ai., 2006; Robertson et ai., 2010) .

[029] A partir desta informação foram selecionadas 22 enzimas recombinantes , dentre celulases e hemicelulases , com potencial aplicação no processo de mostura do malte para compor um coquetel enzimático personalizado que permitisse um maior fracionamento de arabinoxilanos e glucanos e, consequentemente, um aumento na produtividade e na redução de custos das cervejarias.

[030] Na Tabela 1 estão descritas as enzimas recombinantes que foram testadas e a família das hidrolases glicosídicas a qual pertencem.

[031] Estas 22 enzimas recombinantes foram expressas de forma heteróloga em E. coli, purificadas por cromatografia de afinidade em resina de níquel (Ni-NTA Agarose - Qiagen) e avaliadas em reações de hidrólise contra o bagaço de malte com grítz ou xarope de alta maltose sob as condições de mostura normalmente empregadas pelas indústrias cervej eiras.

[032] Tabela 1: enzimas recombinantes testadas

[033] Estes experimentos de hidrólise enzimática foram realizados em microtubos de 1,5 mL contendo 55 mg de bagaço de malte, 125 pL de água destilada, 225 pL de tampão acetato de sódio 250 mM pH 5,5 e 150 pL de enzima a ser testada. As reações de hidrólise foram incubadas em agitador com controle de temperatura, sendo a agitação de 700 rpm e o aumento da temperatura realizado de forma gradual de acordo com as rampas de mostura utilizadas nas cervejarias. Nestes testes foram utilizadas duas rampas de temperatura, uma chamada de padrão que iniciava a 45°C e a outra denominada de otimizada, que começava a 60°C. Ambas as rampas de temperatura se encerravam a 77°C. Ao final do processo, as amostras foram centrifugadas por 2 minutos a 14.000 x g para a sedimentação do material particulado. Os sobrenadantes obtidos foram utilizados para a quantificação de açúcar redutor liberado nas reações de hidrólise através do método colorimétrico com o reagente ácido 3 , 5-dinitrosalicílico - DNS (Miller, 1959) .

[034] Das 22 enzimas testadas sob os bagaços de malte nas duas rampas de temperatura, foi selecionada pelo menos uma enzima representante de cada tipo de atividade para serem avaliadas em experimentos de sinergia. Esses testes tiveram por objetivo encontrar a melhor combinação com o menor número possível de enzimas para compor um coquetel enzimático. [035] Nos experimentos de sinergia as reações de hidrólise foram preparadas como descrito anteriormente, com a única diferença de que as enzimas utilizadas foram diluídas 2,5 vezes quando comparadas com os testes de atividade realizados para cada uma delas isoladamente. Também foram preparadas reações controle negativo, ou seja, sem a adição de nenhuma enzima. Em cada combinação enzimática realizada foi sendo excluída uma atividade enzimática por vez, com intuito de se obter uma mistura com uma quantidade mínima de enzimas que apresentasse um ganho considerável na hidrólise de bagaço. A quantificação de açúcar redutor produzido nas reações foi determinada pelo método do reagente DNS (Miller, 1959) .

[036] Na Figura 1 são apresentados os resultados obtidos nos experimentos de combinação das enzimas durante os testes de sinergia. O valor de absorbância obtido nas reações de hidrólise enzimática foi subtraído do valor de absorbância dos respectivos brancos (reações realizadas nas mesmas condições, porém sem adição de enzimas) .

[037] Verificou-se que com 9 enzimas atuando em sinergia {mixed E - SEQ ID NO: 1 (AbfD3), uma endo-glucanase, uma b- glucosidase, uma a-xilosidase , uma b-xilosidase, uma xiloglucanase, uma arabinoxilanase, uma mananase e SEQ ID NO: 2 (XyllOB) obtinha-se um valor médio de 11,3 unidades de absorbância (u.a.) . Reduzindo-se para 6 enzimas (mixed O - SEQ ID NO: 1, uma endo-glucanase, uma b-glucosidase, uma b- xilosidase, uma arabinoxilanase e SEQ ID NO: 2) a atividade total foi para 10,7 u.a. Com 5 enzimas (mixed T - SEQ ID NO: 1, uma endo-glucanase, uma b-xilosidase, uma arabinoxilanase e SEQ ID NO: 2) obteve-se um valor médio de 9,9 u.a. e, considerando o desvio padrão, esta redução na atividade de 9 para 5 enzimas não foi significativamente relevante. Com 3 enzimas {mixed AF - SEQ ID NO: 1, uma endo-glucanase e SEQ ID NO: 2) a atividade média foi de 8,5 u.a., enquanto que com apenas 2 enzimas (mixed AC - SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2) a atividade foi de 7,4 u.a. e, novamente, considerando o desvio padrão entre 5, 3 e 2 enzimas essa variação na atividade média não foi significativa. Desta forma, a melhor relação custo x beneficio, com relação ao nivel de material remanescente não hidrolisado no bagaço de e quantidade de enzimas necessárias para tal hidrólise, foi com apenas 2 enzimas, a arabinofuranosidase SEQ ID NO: 1 e a xilanase SEQ ID NO: 2.

[038] Foi ainda realizada uma avaliação em microescala de concentração das enzimas selecionadas, com o intuito de se obter a melhor concentração de uso da arabinofuranosidase e da xilanase no coquetel enzimático. Nesta avaliação foram preparadas reações de hidrólise enzimática usando a enzima arabinofuranosidase SEQ ID NO: 1 em uma concentração fixa de 0,6 mg/mL e variações da concentração da xilanase SEQ ID NO: 2, entre 0 a 1,2 mg/mL. Essas hidrólises foram preparadas como descrito anteriormente usando bagaço com grítz e bagaço com xarope de alta maltose sob as condições de rampa otimizada de temperatura.

[039] Na Figura 2 são apresentados os resultados desta avaliação. Foi verificado que em concentrações acima de 0,6 mg/mL da xilanase não são obtidos ganhos significativos de liberação de açúcares. Observou-se ainda que o comportamento das duas enzimas em sinergia foi bem semelhante contra os dois tipos de bagaços testados, sendo estes, inclusive, provenientes de processos de produção com adição de diferentes enzimas comerciais, indicando que a atuação dessas enzimas foi eficaz mesmo com variações no tipo de bagaço utilizado.

[040] Posteriormente, as enzimas arabinofuranosidase, de sequência definida como SEQ ID NO: 1, e xilanase, de sequência definida como SEQ ID NO: 2, foram expressas em larga escala e purificadas para serem utilizadas em testes de mostura com o malte no equipamento "Mosto Congress" (Banho de Brassagem - Fluxo Tecnologia) . Este equipamento permite a análise de processamento do mosto, possibilitando reproduzir desde a moagem do malte misturado com água aquecida até etapa de maceração e simula a rampa de temperatura .

[041] As reações de hidrólise realizadas nos micro reatores do equipamento "Mosto Congress" foram preparadas usando um volume final de 100 mL . Estas reações continham 12,5 g do malte recém-moido em moinho de discos (Bílhler) , CaCÍ2 até se ter a concentração final de 0,3 mg/mL e a enzima comercial Bioglucanase® GB na dosagem padrão recomendada pelo fabricante (150 g/tonelada de malte), neste caso foi usado 1,8 pL da enzima. Foi ainda adicionado à mistura reacional as quantidades necessárias das enzimas SEQ ID NO:l e 2 até se obter a concentração de 1,2 mg/mL (0,6 mg/mL de xilanase + 0,6 mg/mL de arabinofuranosidase) e água destilada até completar o volume de reação de 100 mL . Também foram preparadas reações controle sem adição de nenhuma enzima, assim como reações contendo apenas a enzima Bioglucanase® GB, reações contendo a enzima Bioglucanase® GB com a adição da xilanase SEQ ID NO: 2 na concentração de 0,6 mg/mL e a enzima Bioglucanase® GB com a arabinofuranosidase SEQ ID NO: 1 também na concentração de 0,6 mg/mL. Estas reações de hidrólise foram realizadas sob agitação de 100 rpm e utilizando as condições de rampa otimizada de temperatura.

[042] Após finalizada a rampa de temperatura, as reações foram mantidas a temperatura ambiente, os volumes acertados de acordo com os respectivos valores iniciais (para correção do volume de água evaporado durante o aumento de temperatura) e o resultado avaliado imediatamente. Os parâmetros avaliados foram o tempo de filtração, concentração de b- glucanos, densitometria e viscosidade. O tempo de filtração consiste na contagem manual do tempo necessário para que o material particulado se separe do liquido, através de um filtro de papel, com observação visual do operador. A concentração de b-glucanos é medida em espectrofotômetro, no comprimento de onda de 550 nm, em cubetas plásticas de 3 mL . Para tal, o liquido filtrado proveniente da mosturação é incubado por 30 minutos com a solução A do kit Enzitec™ Color Gluca Test®. Como controle negativo, essa solução é incubada com igual volume de água. Os valores obtidos de concentração de b-glucanos são em mg/L, tendo como referencial uma curva padrão. Os dados de tempo de filtração e concentração de b- glucanos podem ser utilizados para calcular a eficiência de uma determinada enzima adicionada no processo.

[043] Os graus Brix ou graus Plato foram medidos em densímetro (Anton Paar DMA 4.500 Density Meter) . Essas medidas foram realizadas a 20°C com aproximadamente 50 mL de amostra (líquido filtrado proveniente da mosturação), sendo que as duas primeiras medidas são feitas com água e as leituras são sequenciais e automáticas. [044] O último parâmetro avaliado foi a viscosidade das amostras, medidas em um viscosimetro (Brooksfield Viscometer DV-I Prime) , sendo as leituras realizadas a 20 °C durante 10 minutos, gerando um valor médio em mPa.s.

[045] Este mesmo teste de hidrólise do malte no equipamento "Mosto Congress" foi realizado com outros coquetéis enzimáticos comerciais que também apresentam atividade declarada de b-glucanases . Ao invés da Bioglucanase® GB foram utilizados as enzimas Rohalase® Barley L (AB Enzymes) e Laminex® MaxFlow 4G (Danisco) . Estas duas enzimas foram utilizadas na dosagem padrão recomendada pelo fabricante de 75 g/tonelada de malte.

[046] Como pode ser observado nas Figuras 3, 4, 5 e 6, o uso das das enzimas SEQ ID NO : 1 e 2 em combinação com diferentes b-glucanases comerciais promoveu o aumento no valor Brix e no rendimento da hidrólise do malte, bem como reduziu a concentração de b-glucanos remanescentes no mosto e também diminuiu a sua viscosidade. O ganho médio com a composição do presente invento para o Brix foi de 3,9% e, para o rendimento, 4,43%. A redução média na concentração de b-glucanos foi de 55,92% e, na viscosidade, de 2,72%.

[047] Também foram realizados experimentos para avaliar se o aumento na dosagem utilizada das enzimas comerciais Bioglucanase® GB, Rohalase® Barley L e Laminex® MaxFlow 4G provocaria um resultado semelhante ao obtido com a adição do das duas enzimas na hidrólise enzimática do malte. Nestes testes, foram preparadas reações de hidrólise no equipamento "Mosto Congress" usando as enzimas comerciais na mesma concentração final das demais, ou seja, de 1,2 mg/mL nas reações ao invés das concentrações recomendadas pelos fornecedores. Para tal, a concentração das enzimas comerciais foi determinada através de leitura da absorbância em 280 nm no equipamento NanoDrop 2000c da Thermo Scientific™. O mesmo padrão dos testes anteriores com relação a rampa de temperatura, volume de reação e padrão de agitação foram adotados nesta avaliação.

[048] Como pode ser verificado na Figura 7, o aumento na concentração das três enzimas comerciais não foi eficaz. Este resultado indica que as duas enzimas SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 têm um papel complementar na hidrólise do malte, atuando sobre alvos diferentes daqueles das enzimas comerciais, de tal forma que uma hidrólise mais eficiente independe do aumento na concentração das b-glucanases comerciais testadas.

[049] Outra análise feita foi com relação ao papel desempenhado pela adição das enzimas da composição do presente invento sobre o malte no processo de mosturação, ou seja, se as duas enzimas da referida composição estariam atuando com funções complementares ou substituintes às enzimas comerciais. Para este teste, foram realizadas hidrólises usando SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 a 0, 6 mg/mL na presença ou não de Bioglucanase® GB, na dosagem padrão de 150 g/tonelada de malte, seguindo o mesmo padrão dos testes anteriores realizados no equipamento "Mosto Congress".

[050] Os resultados obtidos neste teste, apresentados na Figura 8, demonstram que SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 têm um efeito de complementação de atividade da preparação enzimática comercial contendo b-glucanases mais pronunciado do que como substituinte da mesma no processo de mosturação. [051] Testes de microfermentação do mosto obtido a partir da mostura do malte com as enzimas arabinofuranosidase SEQ ID NO: 1, xilanase SEQ ID NO: 2 e beta-glucanases foram realizados. Para este teste, a mostura foi realizada como descrito anteriormente no equipamento "Mosto Congress", porém utilizando um volume de 400 mL em cada copo. As reações controle continham apenas malte, sem adição de qualquer enzima; nas reações branco BG foi adicionada apenas a enzima comercial Bioglucanase® GB na dosagem padrão de 150 g/tonelada de malte, enquanto nas reações de interesse houve adição, além da enzima comercial Bioglucanase® GB, de 0, 6 mg/mL de cada enzima purificada, mantendo a estequiometria de 1:1 entre SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. A mosturação foi realizada na rampa de temperatura otimizada. Após finalizada a rampa de temperatura, as reações foram mantidas a temperatura ambiente, os volumes acertados de acordo com os respectivos valores iniciais e o primeiro parâmetro avaliado foi o tempo de filtração, seguido pela determinação da concentração de b-glucanos, densitometria e viscosidade.

[052] Após avaliação da etapa de mosturação, uma parte do mosto filtrado (200 mL) foi incubada com 15 gramas de fermento, sob agitação de 148 rpm a temperatura ambiente por 24 horas. O material resultante foi filtrado, em filtro de papel, para separação do fermento e analisado no sistema Alcolyzer Beer (Anton Paar) . Este sistema de análise fornece os valores de extrato original (em °P) e extrato aparente (em %), densidade em g/cm3, teor alcoólico em %, quantidade de células mortas, vitalidade e um valor do grau de fermentação ocorrido (ADF Apparent Degree of Fermentation) . [053] A Tabela 2 apresenta os resultados obtidos no teste de microfermentação . Os valores representam a médias e o desvio padrão. Malte refere-se ao mosto proveniente de uma mosturação contendo apenas malte, sem adição de qualquer enzima; Branco BG refere-se ao mosto proveniente de mosturação com adição da preparação enzimática comercial Bioglucanase® GB na dosagem padrão (150 g/tonelada de malte) ; BG + SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 (1:1) = adição da

Bioglucanase® GB na dosagem padrão e das enzimas SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 1, ambas a 0, 6 mg/mL.

[054] Tabela 2: resultados de microfermentação

[055] A adição das enzimas SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 levou a um considerável aumento nos valores de extrato aparente e original e, além disso, resultou em uma redução de 55,25% na quantidade de células mortas em relação à mosturação sem adição de enzimas (apenas malte), permitindo assim mais ciclos de reutilização do fermento adicionado.