Konservierung von biologischen Molekülen sowie Vorrichtungen, welche entsprechend stabilisierte Biomoleküle aufweisen.

Die Verwendung von Proteinen und Polypeptiden in industriellen Produkten und Verfahren erfordert große Mengen dieser Biomoleküle, insbesondere für klinisch-diagnostische und pharmazeutische Zwecke. Während die hierfür erforderlichen Basistechniken wie Isolierung und Aufreinigung von Proteinen im industriellen Maßstab zumeist etabliert sind, liegt der schwierigste Aspekt der Verwendung derartiger Biomoleküle in der Aufrechterhaltung der für die beabsichtigte Verwendung gewünschten nativen bzw. aktiven Moleküleigenschaften.

Insbesondere bei der Lagerung und dem Transport von Biomolekülen müssen häufig Verluste der Aktivität hingenommen werden, wodurch der Erfolg späterer Anwendungen gefährdet sein kann. Kommerziell erhältliche Proteinpräparationen enthalten daher zumeist Verbindungen, durch deren Anwesenheit der Aktivitätsverlust während der Lagerung oder des Transports vermindert werden kann. Weiterhin erfolgen die Lagerung sowie der Transport zumeist unter niedrigen Temperaturen, obgleich ein Einfrieren von z. B. bestimmten Proteinen aufgrund molekularer Veränderungen unerwünscht sein kann.

Aus der Literatur ist bekannt, dass bestimmte Pflanzen und Tiere Mechanismen entwickelt haben, um den Zustand einer annähernd vollständigen Dehydratation zu überleben. Dieser Stresszustand wird als Anhydrobiose bezeichnet und wird bei Organismen beobachtet, die Trockenbedingungen ausgesetzt werden. Während der Anhydrobiose befindet sich der Organismus in einer Art Ruhezustand, bis eine Rehydratation es erlaubt, den normalen Stoffwechsel fortzusetzen. Gemeinsame, charakteristische Eigenschaft dieser Organismen ist die Synthese von hohen Konzentrationen an nicht-reduzierenden Zuckern, die durch anhydrobiotische Bedingungen induziert wird.

Die als Antwort auf Dehydratisierung bei verschiedenen Organismen beobachtete Akkumulation großer Mengen an Trehalose führt zu einem Schutz von Membranen und Proteinen vor Schädigungen der molekularen Integrität und korreliert mit einer gewissen Toleranz gegenüber Wasserentzug. Man nimmt an, dass der Zucker die entzogenen Wassermoleküle ersetzt bzw. funktional substituiert und an der Bildung eines intrazellu- lären organischen Glases beteiligt ist, von dem man vermutet, dass es die Zellinhalte stabilisiert.

Im Stand der Technik wird die Verwendung von Trehalose bei der Herstellung von mit Antikörpern beschichteten Mikrotiterplatten beschrieben, um diese normalerweise sehr schnell denaturieren- den Proteinspecies zu stabilisieren (V. K. Nguyen et al., Protection of immunoreactivity of dry immobilized proteins on microtitration plates in ELISA : application for detection of autoantibodies in Myasthenia gravis, J. of Biotechnology, 72, S. 115 bis 125 (1999) ). Hierzu wurden Mikrotiterplatten mit darauf immobilisierten Antikörpern mit einem Rinderserumalbumin (BSA) und Trehalose enthaltenden Film beaufschlagt und anschließend getrocknet. Die auf den in dieser Weise erzeugten ELISA-Platten immobilisierten, getrockneten Antikörper zeigten auch bei erhöhten Temperaturen (bis zu 50 °C) eine Lagerungsfähigkeit von bis zu 30 Tagen.

Eine insbesondere aus wirtschaftlicher Sicht anzustrebende Verlängerung der Lagerungsfähigkeit unter Raumtemperatur-oder sogar Tropenbedingungen kann mit dieser Technologie jedoch nicht erreicht werden. Insbesondere im Zusammenhang mit der Bereitstellung großer Mengen an immobilisierten Proteinen ist eine Lagerungsfähigkeit für eine Zeitdauer von über einem Jahr bei im wesentlichen gleichbleibender biologischer Aktivität bzw. Funktionalität der Biomoleküle wünschenswert.

Ein weiterer Nachteil der zuvor beschriebenen Technologie liegt in der Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA), einem Proteingemisch, von dem bekannt ist, dass es im Rahmen Antikörper-gestützter Anwendungen unspezifische Bindungen mit den Antikörpern eingeht und damit unerwünschte Kreuzreaktionen verursacht, durch die das gesamte Untersuchungsergebnis negativ beeinträchtigt wird.

Insbesondere von pflanzlichen Samen und Pollen ist bekannt, dass in ihnen als Reaktion auf Wasserentzug Proteine der LEA- Klasse gebildet werden (LEA ='late embryogenesis abundant') (J.

Ingram und D. Bartels, Annu. Rev. Plant Physio. Plant Mol.

Biol., 47, S. 377 bis 403 (1996) ). Die mittlerweile auch in Nematoden identifizierten LEA-Proteine enthalten ein spezielles, 11 Aminosäuren umfassendes Motiv, welches vermutlich eine amphipatische a-Helix ausbildet, durch das die Oligomerisierung des Proteins gesteuert wird. Die LEA-Proteine sind extrem hydrophil und gegenüber einer Denaturierung durch Hitze resistent. Erste Versuche mit einem aus Pollen von Typha latifolia gereinigten Protein dieser Klasse haben gezeigt, dass sich Sucrosegläser in vitro durch Inkubation mit diesem Protein stabilisieren lassen. Es wird daher vermutet, dass nicht- reduzierende Zucker und Vertreter der LEA-Proteinklasse in synergistischer Weise zusammenwirken bei der Bildung eines stabilen Bioglases im Cytoplasma von anhydrobiotischen Pflanzen und in gegenüber Austrocknung resistenten Samen und Pollen (J.

Brown et al., Plant desiccation gene found in a nematode, Nature, 416, S. 38 (2002)).

Aufgabe der Erfindung ist daher die Bereitstellung von Zusammensetzungen und Verfahren zur Stabilisierung bzw.

Konservierung von Biomolekülen, mit denen die Nachteile des Standes der Technik überwunden werden und mit denen die gewünschte biologische Aktivität der Moleküle über einen längeren Zeitraum auch ohne Kühlung gewährleistet wird.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Zusammensetzung gemäß Hauptanspruch gelöst.

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst mindestens ein nicht-reduzierendes Disaccharid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trehalose (D-Glucopyranosyl-D-glucopyranose), Sucrose (ß-D-Fructofuranosyl-a-D-glycopyranosid), sowie Derivaten davon, und mindestens ein Protein oder Polypeptid der LEA-Klasse.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Zusammensetzung Trehalose sowie mindestens ein Protein oder Polypeptid. der LEA-Klasse mit einem 11 Aminosäuren umfassenden Motiv, welches durch die folgende allgemeine Formel (SEQ ID NO. 1) charakterisiert ist : (l)- (2)- (3)- (4)- (5)- (6)- (7)- (8)- (9)- (10)-E, wobei (1) K oder T, (2) A, G, K, M oder T, (3) R, D, A, E, Q oder K, (4) E, K oder S, (5) T, F, Y oder A, (6) K, R, T oder A, (7) D, E oder Q, (8) S, R, Y oder K, (9) A oder T, und (10) G, A oder R, bedeuten.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung mindestens ein Protein oder Polypeptid der LEA- Unterklasse 3 mit einer Aminosäuresequenz, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, wie sie in der GenBank unter der Zugriffsnummer AF423069 oder S39475 hinterlegt ist.

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst am meisten bevorzugt mindestens ein Protein oder Polypeptid der LEA- Unterklasse 3 mit einem 11 Aminosäuren umfassenden Motiv, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus : (a) K-T-A-E-F-R-D-S-A-G-E (SEQ ID NO. 2), (b) K-G-Q-E-F-K-E-R-A-G-E (SEQ ID NO. 3), (c) K-A-E-E-T-K-Q-R-A-G-E (SEQ ID NO. 4), (d) K-M-D-E-T-K-Q-R-A-G-E (SEQ ID NO. 5), (e) K-A-R-K-T-K-D-S-A-A-E (SEQ ID NO. 6), (f) K-A-K-E-Y-K-D-Y-T-A-E (SEQ ID NO. 7), (g) K-A-R-E-T-T-E-K-A-R-E (SEQ ID NO. 8), und (h) T-K-D-S-A-A-E-K-A-R-E (SEQ ID NO. 9).

Nach einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung die Komponenten des nicht-reduzierenden Disaccharids und des Proteins oder Polypeptids der LEA-Klasse in jeweiligen Mengen von 0,01 bis 15 beziehungsweise 0,00001 bis 1 Gewichtsprozent, jeweils bezogen auf eine gebrauchs- fertige Lösung. Beispielsweise wird die Zusammensetzung hergestellt, indem einer Lösung aus 50 mM Phosphat und 100 mM NaCl mit einem pH- Wert von 6,8 0,1 Gew. % gereinigtes LEA-Protein und 5 Gew. % Trehalose zugegeben werden. Gewünschtenfalls können auch weitere Komponenten wie z. B. Natriumazid (0, 02 Gew. %) zugesetzt werden.

Für den Fachmann ist klar, dass er anhand der erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenz-und Motivinformationen homologe Vertreter der Proteinklasse LEA aus anderen Quellen auffinden und erfindungsgemäß einsetzen kann. Folglich sind alle Homologa umfasst, sofern sie in der Lage sind, ein aus nicht- reduzierenden Zuckern wie insbesondere Trehalose und/oder Sucrose gebildetes biologisches Glas zu stabilisieren.

Beispielhafte Vertreter der Proteinklasse LEA sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt, stellen aber keine Beschränkung der vorliegenden Erfindung dar. Die jeweiligen Sequenzinformationen können vom Fachmann anhand der bereitgestellten Daten leicht erhalten werden. Datenbank Organismus Bezeichnung (Zugriffsnummer) SWISS-PROT Gossypium hirsutum P09422 SWISS-PROT Raphanus sativus P21208 SWISS-PROT Zea mays P46517 SWISS-PROT Hordeum vulgare Q02400 SWISS-PROT Hordeum vulgare Q05191 SWISS-PROT Hordeum vulgare Q5190 SWISS-PROT Hordeum vulgare P46532 SWISS-PROT Helianthus annuus P46515 SWISS-PROT Helianthus annuus P46515 SWISS-PROT Gossypium hirsutum P09411 SWISS-PROT Gossypium hirsutum P46518 SWISS-PROT Gossypium hirsutum P09443 SWISS-PROT Gossypium hirsutum P13940 SWISS-PROT Gossypium hirsutum P09444 SWISS-PROT Gossypium hirsutum P46521 SWISS-PROT Gossypium hirsutum P4522 SWISS-PROT Brassica napus P13934 SWISS-PROT Gossypium hirsutum P13939 SWISS-PROT Zea mays Q42376 SWISS-PROT Tricitum aestivum Q03968 TrEMBL Phaseolus vulgaris 024442 TrEMBL Arabidopsis thaliana 064820 TrEMBL Arabidopsis thaliana 065148 TrEMBL Arabidopsis thaliana 080576 TrEMBL Arabidopsis thaliana 081483 TrEMBL Oryza sativa P83196 TrEMBL Oryza sativa P83197 TrEMBL Glycine max P93165 TrEMBL Glycine max Q01527 TrEMBL Tricitum aestivum Q03967 TrEMBL Arabidopsis thaliana Q39138 TrEMBL Citrus sinensis Q39466 TrEMBL Chlorella vulgaris Q39660 TrEMBL Gossypium hirsutum Q39793 TrEMBL Gossypium hirsutum Q39797 TrEMBL Glycine soja Q39919 TrEMBL Onoclea sensibilis Q40697 TrEMBL Picea glauca Q40842 TrEMBL Picea glauca Q40843 TrEMBL Picea glauca Q40848 TrEMBL Picea glauca Q40858 TrEMBL Picea glauca Q40869 TrEMBL Zea mays Q41804 TrEMBL Oryza sativa Q8S4X7 TrEMBL Brassica campestris Q8S8Z2 TrEMBL Brassica napus Q8S8Z2 TrEMBL Arabidopsis thaliana Q96273 TrEMBL Oryza sativa Q9AWZ5 TrEMBL Arabidopsis thaliana Q9FG31 TrEMBL Arabidopsis thaliana Q9FK14 TrEMBL Arabidopsis thaliana Q9FK15 TrEMBL Arabidopsis thaliana Q9FKV7 TrEMBL Oryza sativa Q9FPB2 TrEMBL Arabidopsis thaliana Q9LF88 TrEMBL Oryza sativa Q9LGL8 TrEMBL Arabidopsis thaliana Q9LT74 TrEMBL Euphorbia esula Q9M556 TrEMBL Arabidopsis thaliana Q9S7S3 TrEMBL Oncolea sensibilis Q9S2B2 TrEMBL Arabidopsis thaliana Q9SKP0 TrEMBL Chlorella vulgaris Q9SLP7 TrEMBL Arabidopsis thaliana Q9XID7 TrEMBL Arabidopsis thaliana Q9ZPW6 TrEMBL Glycine max Q9ZTZ2 Die erfindungsgemäß vorgeschlagenen LEA-Proteine oder Polypeptide können aus natürlichen Quellen isoliert, rekombi- nant hergestellt oder synthetisiert werden. Die hierfür anzuwendenden Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung eines Verfahrens zur Stabilisierung bzw.

Konservierung von Biomolekülen, bei dem die zu schützenden Moleküle in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung inkubiert werden. Nach ausreichender Inkubationsdauer kann der Ansatz nachfolgend z. B. bei Raumtemperatur trocknen und bis zur Verwendung ohne Kühlung gelagert werden. Sofern das Verfahren zur Stabilisierung von auf bestimmten Oberflächen immobilisierten Biomolekülen angewendet werden soll, werden diese beladenen Oberflächen mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung beaufschlagt. Dies kann beispielsweise durch Aufsprühen der Zusammensetzung auf die Oberfläche oder durch Eintauchen der Oberfläche in die Zusammensetzung erfolgen. Im Falle des Tauchverfahrens sollte die Oberfläche vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit von etwa 2 mm pro Sekunde herausgezogen werden, damit eine gleichmäßige Benetzung mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung erfolgen kann.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung von Oberflächen, die mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung beaufschlagt sind. Auf bevorzugten Oberflächen sind Biomoleküle direkt oder indirekt immobilisiert und werden von der erfindungsgemäßen Zusammensetzung stabilisiert bzw. konserviert. Besonders bevorzugte Oberflächen sind Bestandteile von analytischen und/oder diagnostischen Vorrichtungen, wie z. B. Biochips, Sensorchips, Mikrotiterplatten, Reaktions- röhrchen und dergleichen. Das Material der Oberfläche unterliegt hierbei keiner Beschränkung und kann beispielsweise aus Glas, Quarzglas, Quarz, Silizium, Polymeren (PMMA, Polystyrol, Polyethylen, Polypropylen, PVC etc. ), und Membranen wie z. B. Nitrozellulose-, Nylon-und Mikrofasermembranen sowie Papier ausgewählt werden.

Die vorliegend verwendeten Begriffe"biologische Moleküle"und Biomoleküle"umfassen jedwede Substanzen und Verbindungen im wesentlichen biologischen Ursprungs, die über Eigenschaften verfügen, welche im Rahmen wissenschaftlicher, diagnostischer und/oder pharmazeutischer Anwendungen relevant sind. Umfasst sind nicht nur native Moleküle, wie sie aus natürlichen Quellen isoliert werden können, sondern auch davon abgeleitete Formen, Fragmente und Derivate, sowie rekombinante Formen und artifizielle Moleküle, sofern sie mindestens eine Eigenschaft der nativen Moleküle aufweisen. Bevorzugte Biomoleküle sind solche, die für analytische, diagnostische und/oder pharmazeu- tische Zwecke eingesetzt werden können, wie Nukleinsäuren und deren Derivate (DNA, RNA, PNA, LNA, Ribozyme, Oligonukleotide, Plasmide, Chromosomen), Peptide und Proteine (Enzyme, Rezeptorproteine, Proteinkomplexe, Peptidhormone, Antikörper) sowie biologisch aktive Fragmente derselben, Kohlenhydrate und deren Derivate wie insbesondere glykosylierte Proteine und Glykoside, und Fette, Fettsäuren und Lipide.

Für den Fachmann ist klar, dass sich die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren auch auf zelluläre Gewebe und vollständige Zellen sowie Teile derselben (Organellen, <BR> <BR> Membranen und Membranfragmente etc. ) anwenden lassen, sofern sie Träger der obigen Biomoleküle sind. Deshalb sind Gewebe, Zellen und Teile derselben grundsätzlich vom Begriff "Biomoleküle"umfasst.

Die verwendeten Begriffe"Stabilisierung"und"Konservierung" beziehen sich auf die strukturelle bzw. funktionelle Integrität von Biomolekülen und den hierauf basierenden biologischen Eigenschaften. Die für einen bestimmten Anwendungszweck erforderliche Aktivität eines Biomoleküls erfordert z. B. die weitgehende Beibehaltung seiner Primär-, Sekundär-und/oder Tertiärstruktur. Die biologische Aktivität einer Nukleinsäure- sonde umfasst beispielsweise ihre Eigenschaft zur Ausbildung eines Hybridisierungskomplexes mit einem Nukleinsäuretarget, welches zur Sonde komplementär ist. Die biologische Aktivität eines Antikörpers umfasst beispielsweise die spezifische Bindung seines Antigens.

Die Erfindung wird anhand des nachfolgenden Beispiels näher erläutert.

Beschichtung von Oberflächen Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung erfolgt durch Auflösen von 0,1 % (Gew. /Vol. ) rekombinantem LEA-Protein<BR> und 5 % (Gew. /Vol. ) Trehalose in 100 ml Phosphatpuffer (50 mM Phosphat, 100 mM NaCl, pH 6,8). Anschließend werden 0, 02 % (Gew. /Vol. ) Natriumazid als cytotoxisches Agenz gegen mikrobielle Verunreinigungen zugegeben. Nach Sterilfiltration der erhaltenen Lösung unter Verwendung eines 0, 2 um Filters erfolgt die Aufbewahrung in einer autoklavierten sterilen Flasche.

Zum Beschichten erfindungsgemäß geeigneter Oberflächen werden Biochips (z. B. Objektträger) mit immobilisierten Biomolekülen im Reinraum (bzw. Sterilwerkbank) in die Lösung eingetaucht und mit einer Geschwindigkeit von 2mm/sec wieder aus der Lösung herausgezogen. Dabei trocknet eine dünne Schicht der Trehalose/LEA-Lösung auf dem Chip an und führt zu einer Stabilisierung der Biomoleküle.

Zur Lagerung können die auf diese Weise behandelten Chips mit den stabilisierten Biomolekülen in Kunststofftaschen verpackt und unter Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur gelagert werden. Die Taschen können vorteilhafterweise in einer lichtdichten Kartonage verpackt werden, um einer möglichen Photodegradation der Proteine vorzubeugen.

Zur Verwendung die Chips werden der Verpackung entnommen und mit Assay-Buffer (z. B. PBS-Puffer) rehydriert (5 min, RT).

Anschließend wird die Probenflüssigkeit direkt auf den Chips inkubiert und der Assay durchgeführt. Es können alle Arten der im Stand der Technik bekannten Rezeptor-Liganden Interaktionen durchgeführt werden. Wahlweise kann auch auf das Entfernen des Stabilisators verzichtet werden. In diesem Fall wird die Probe direkt auf die Trehalose-beschichteten Oberflächen gegeben.

Dies ist vor allem dann praktikabel, wenn zuvor gezeigt wurde, dass weder Trehalose noch das LEA-Protein mit dem Nachweis interferieren.