ANTIFÚNGICA E BIOPESTICIDA

Campo da invenção

[001] A presente invenção se relaciona a formulações compreendendo carreadores lipidicos nanoestruturados . Especificamente, a formulação ora pleiteada compreende nanoparticulas carreadoras lipidicas (NLC) naturais cuja composição permite o encapsulamento de óleos essenciais com notável perfil de estabilidade, mantendo tamanho e distribuição de diâmetro médio homogéneos mesmo após 1 ano de monitoramento . Em outras palavras, a presente formulação permite a obtenção de uma pluralidade de efeitos terapêuticos intrínsecos, obtidos por meio do encapsulamento de óleos essenciais e ação sinérgica dos demais componentes promotores de ação anestésica, bactericida, antifúngica e biopesticida, sem exigir o encapsulamento de princípios ativos sintéticos.

Fundamentos da invenção

[002] Sistemas nanoestruturados, enquanto adjuvantes na entrega de compostos ativos, vêm emergindo como uma estratégia interessante no desenvolvimento de novos medicamentos, composições cosméticas ou nutracêuticas . Exemplos não-exaustivos incluem lipossomos, Quantum dots, dendrímeros, matrizes poliméricas, nanoestruturas de carbono e matrizes lipidicas.

[003] Dentro deste contexto, as matrizes lipidicas se destacam em termos de P&D devido à compatibilidade destas com uma ampla gama de compostos, possibilidade de modulação de entrega de um dado composto, direcionamento do ativo, além de integrar diferentes funcionalidades .

[004] Dentre as matrizes lipidicas, destacam-se os sistemas de nanoparticulas lipidicas sólidas (Solid Lipid Nanopartícles ou SLNs) e carreadores lipidicos nanoestruturados (nanostructured lipid carriers ou NLCs) .

[005] Sistemas de nanoparticulas lipidicas sólidas consistem em lipídeos sólidos estabilizados por emulsionantes apresentando um diâmetro médio inferior a 1000 nm. Algumas de suas principais vantagens residem na escalabilidade industrial e biodegradabilidade, características desejáveis para o desenvolvimento de fármacos, tal como a proposta descrita na patente CN102106821, por exemplo.

[006] Por outro lado, SLNs apresentam diversas restrições em relação à taxa de encapsulação de fármaco ou princípios ativos e a possibilidade de expulsão do princípio ativo no processo de cristalização durante as condições de armazenamento - as alterações polimórficas nas estruturas lipidicas sólidas tendem a remover os compostos previamente encapsulados nos SLNs.

[007] Os sistemas carreadores lipidicos nanoestruturados ( nanostructured lipid carriers ou NLCs), compreendem um núcleo oleoso formado por lipídeos em fase líquida e em fase sólida em temperatura ambiente, estabilizados por tensoativos. Os lipídios utilizados comumente como base para preparação dos NLC incluem triglicerideos , glicerideos parciais, ácidos graxos, esteroides e ceras. De modo geral, NLCs têm maior capacidade de encapsulação de drogas devido à estrutura cristalina imperfeita, e, por consequência, melhorando a estabilidade do encapsulado solubilizado na matriz.

[008] Outras caracteristicas compreendem a possibilidade de gerar sistemas de liberação prolongada, além de apresentar um menor perfil de toxicidade quando comparado a sistemas poliméricos (ver, por exemplo, CA2840215, WO2011116963 e W02012038061 ) , devido à ausência de solventes orgânicos.

[009] Por outro lado, o desenvolvimento de formulações à base de NLCs exigem uma caracterização rigorosa de alguns parâmetros, como tamanho de partícula, distribuição de tamanho, polimorfismo e encapsulação de fármaco, todos críticos em relação a estabilidade da formulação final. A complexidade dos ensaios realizados para tal fim constitui um desafio para o lançamento de novos medicamentos ou produtos no mercado que empreguem tais sistemas.

[0010] Neste contexto, observa-se um interesse crescente por fármacos que empreguem técnicas que permitam o encapsulamento de óleos essenciais. Estes consistem em metábolitos vegetais formados maj oritariamente por compostos mono e sesquiterpênicos e usualmente obtidos por destilação a vapor. Diversos estudos correlacionam tais substâncias a propriedades antimicrobianas , anti- inflamatórias, antioxidantes , anti-neoplásicas , bem como propriedades antivirais, antifúngicas e antiparasitárias . A natureza hidrofóbica de tais compostos os torna extremamente compatíveis para a encapsulação em NLCs, e, consequentemente, excelentes candidatos para o desenvolvimento de novas possibilidades terapêuticas, considerando também seu baixo preço e grande diversidade.

Descrição do E stado da técnica

[0011] Neste intuito, algumas linhas de pesquisa vêm direcionando esforços para a obtenção de encapsulamento de óleos essenciais como óleo de cravo (Marques, E. Nanoencapsulação de óleo essencial de cravo em matrizes lipidicas . Tese de conclusão de Curso. Universidade Federal de Santa Catarina, Engenharia de Alimentos, 2017), canela (Wen et ai. Nanostructured lípíd carríers: a promísíng topical system for delivering cinnamon oíl ín wound care treatment Fífth Euro-Mediterranean conference of Natural Products, Limassol , Cyprus, 2018), óleo de amêndoas (De Paula, B.O. et ai. Desenvolvimento e caracterização de filmes lípídíco-bíopolímérícos funcionais para liberação transdérmica de lidocaina. XXIV CONGRESSO DE INICIAÇÃO CIENTIFICA DA UNICAMP, 2016) .

[0012] Algumas metodologias comuns no Estado da Técnica compreendem o emprego de homogeneização sob pressão a quente, tal como a descrita em WO2017185147 ou por Sena (SENA, L. Obtenção e Caracterização de Carreadores Lipídicos Nanoestruturados a partir de gordura vegetal de Murumuru, Dissertação Mestrado. Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências da Saúde Belém, 2016) .

[0013] A partir dos documentos citados no Estado da Técnica, é possível observar que nenhum destes permite a obtenção de formulações nanoencapsuladas composta por excipientes estritamente naturais e com atividade terapêutica intrínseca, tampouco composições que mantenham a estrutura do encapsulado devidamente estabilizada. Tal fato constitui uma severa restrição na viabilização de formulações farmacêuticas naturais que explorem efeitos potencialmente sinérgicos entre óleos essenciais.

Breve descrição da invenção

[0014] Neste sentido, visando contornar as desvantagens relatadas no Estado da Técnica, o presente pedido de patente revela formulações biofuncionais estáveis baseadas em carreadores lipídicos nanoestruturados naturais (NLC) e dotados de ação terapêutica intrínseca e composição estritamente natural.

[0015] As presentes composições são compostas de diferentes matrizes lipídicas estruturais e bioativas, especificamente cera de abelha, palma, manteiga de karité e/ou cacau estabilizadas por biossurfactantes naturais, tais como:

- lauril glicosídeo, por exemplo Plantaren 1200®;

- decilpoliglicosídeo, por exemplo Plantaren 2000®;

- derivado de óleo de coco, tais como: Dietanolamida do Ácido Graxo de coco com 90% mínimo de concentração (por exemplo, Amida 90®) ; monoetanolamina cocamida (por exemplo, Cocamide®) ; - emulsionante olivato de sorbitano, derivado de oliva (por exemplo, Oliva Mil®) .

[0016] Mais especificamente, a referida composição compreende de 5 a 20% (m/v) de carreadores lipidicos nanoestruturados estritamente naturais selecionados do grupo que compreende cera de abelha; manteigas de karité; cacau e palma; ou combinação das mesmas; de 1 a 3% (m/v) de óleos essenciais e de 1 a 10 % (m/v) de biossurfactantes .

[0017] A cera de abelha está presente em uma quantidade de 5 a 9% (m/v), as manteigas de karité em uma quantidade de 10 a 20% (m/v, o cacau estar em uma quantidade de 10 a 20% (m/v), o óleo de palma estar em uma quantidade de 10 a 20% (m/v) e os óleos essenciais serem selecionados do grupo compreendendo cravo; canela; cravo- canela; pimenta preta; hortelã ou combinações das mesmas.

[0018] Os biossurfactantes são naturais e selecionados do grupo compreendido por lauril glicosídeo; decilpoliglicosídeo ; derivado de óleo de coco; emulsionantes derivados de oliva ou combinações das mesmas. Onde o lauril glicosídeo está presente em uma quantidade de 1 a 10% (m/v), o decilpoliglicosídeo está presente em quantidade de 1 a 10% (m/v) , o óleo de coco compreende Dietanolamida do Ácido Graxo de coco (por exemplo, Amida 90 ^® ) com 90% mínimo de concentração em uma quantidade de 1 a 5% (m/v) , monoetanolamina cocamida está presente em uma quantidade de 1 a 8% (m/v) e o emulsionante derivado de oliva, Olivato de sorbitano, estar presente em uma quantidade de 3% a 10% (m/v) . [0019] Adicionalmente, é objeto da presente invenção uma composição de carreadores lipidicos nanoestruturado compreendendo 10% m/v de manteiga de palma, 3% m/v de óleo essencial de cravo e 2% m/v de lauril glicosideo na amostra (Fl) .

[0020] Outro objeto adicional refere-se a uma composição de carreadores lipidicos nanoestruturado compreendendo 10% m/v de manteiga de palma, 3% m/v de óleo essencial de canela e 2% m/v de lauril glicosideo na amostra ( F2 ) .

[0021] Outro objeto adicional refere-se a uma composição de carreadores lipidicos nanoestruturado compreendendo 10% m/v de manteiga de palma, 1,5% m/v de óleo essencial de canela, 1,5% m/v de óleo essencial de cravo, 2% m/v de lauril glicosideo na amostra (F3) .

[0022] Outro objeto de invenção ora proposta refere-se ao uso das composições, conforme definidas acima, por serem empregadas na preparação de formulações medicamentosas; formulações químicas e formulações biopesticidas . Sendo que para formulação medicamentosa ter uso para tratar dor; inflamação; infecções bacterianas; infecções fúngicas. Para formulação biopesticida ter uso para controlar lagartas, carunchos e ácaros.

[0023] Notou-se surpreendentemente que as formulações ora pleiteadas apresentaram notável estabilidade em período de 1 ano (25°C) , fato este comprovado por meio de ensaios de tamanho e distribuição de partículas, potencial Zeta e concentração de nanopartícuias .

Breve Descrição das Figuras

[0024] Para obter uma total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, como se segue.

[0025] A Figura 1 ilustra o perfil cromatográfico de eugenol, empregando a técnica de UHPSFC.

[0026] A Figura 2 ilustra o perfil cromatográfico do óleo de cravo empregando a técnica de UHPSFC.

[0027] A Figura 3 ilustra o perfil cromatográfico de canela empregando a técnica de UHPSFC.

[0028] A Figura 4 ilustra o perfil cromatográfico da formulação F1 empregando a técnica de UHPSFC.

[0029] A Figura 5 ilustra o perfil cromatográfico da formulação F2 empregando a técnica de UHPSFC.

[0030] A Figura 6 ilustra o perfil cromatográfico da formulação F3 empregando a técnica de UHPSFC.

[0031] A Figura 7 ilustra o perfil cromatográfico de eugenol empregando a técnica de UHPLC .

[0032] A Figura 8 ilustra o perfil cromatográfico de óleo de cravo empregando a técnica de UHPLC.

[0033] A Figura 9 ilustra o perfil cromatográfico de óleo de canela empregando a técnica de UHPLC.

[0034] A Figura 10 ilustra o perfil cromatográfico da formulação F1 empregando a técnica de UHPLC.

[0035] A Figura 11 ilustra o perfil cromatográfico da formulação F2 empregando a técnica de UHPLC.

[0036] A Figura 12 ilustra o perfil cromatográfico da formulação F3 empregando a técnica de UHPLC .

[0037] A Figura 13 ilustra a caracterização estrutural das formulações mediante a técnica de DSC.

[0038] A Figura 14 ilustra a caracterização estrutural das formulações mediante a técnica de FTIR-ATR.

[0039] A Figura 15 ilustra imagens de microscopia eletrónica de transmissão das diferentes formulações de NLC (Fl, F2 e F3) em um aumento de lOO.OOOx (acima) e 60.000x (abaixo) .

[0040] A Figura 16 ilustra o efeito analgésico máximo possível em camundongos submetidos ao teste de Taíl Flick após a administração de 100 pL das formulações Fl, F2, F3 e do controle de solução salina de lidocaina 0,5%, n=5.

[0041] As Figuras 17 e 18 ilustram os esquemas utilizados nos ensaios ín vitro para determinação da atividade antifúngica.

[0042] A Figura 19 ilustra a avaliação do crescimento fúngico após 24 e 48 h de cultivo estático, suplementado com extratos complexos.

[0043] A Figura 20 ilustra a avaliação do crescimento fúngico após 24 e 48 h de cultivo estático, suplementado com os insumos puros.

[0044] A Figura 21 ilustra a mortalidade de carunchos de feijão após a exposição de diferentes concentrações das formulações Fl, F2 e F3.

[0045] A Figura 22 exibe a porcentagem de mortalidade de ácaro rajado Tetranychus urtícae com formulações nanoestruturadas Fl, F2 e F3, nas concentrações de 0,003, 0,03, 0,3 e 3,0% e do controle positivo

(Propargite) e controle negativo (água desionizada) aos 4 dias após a transferência (4 DAA) .

[0046] A Figura 23 exibe a porcentagem de repelência de ácaro rajado Tetranychus urtícae com formulações nanoestruturadas Fl, F2 e F3, nas concentrações de 0,003, 0,03, 0,3 e 3,0% e do controle positivo

(Propargite) e controle negativo (água desionizada) aos 4 dias após a transferência (4 DAA) .

Descrição detalhada da invenção

[0047] A presente invenção se refere a formulações compreendendo carreadores lipidicos nanoestruturados .

[0048] Mais particularmente, ditas formulações abrangem diferentes lipídios naturais, tais como cera de abelha de 5 a 9% (m/v), preferivelmente 5%; manteigas de karité, cacau e palma de 10 a 20% (m/v), preferivelmente

10%, e óleos essenciais de cravo, canela, cravo-canela, pimenta preta e hortelã de 1 a 3% (m/v), preferivelmente

3%.

[0049] Já os biossurfactantes , podem ser escolhidos dentre o grupo compreendendo lauril glicosideo

(Plantaren 1200®) de 1 a 10% (m/v), preferivelmente

2%; decilpoliglicosideo (Plantaren 2000®) de 1 a 10% (m/v), preferivelmente 2%, Dietanolamida do Ácido Graxo de coco (Amida 90®) de 1 a 5% (m/v), preferivelmente 1%; Monoetanolamina do Ácido Graxo de coco (Cocamide®) , de 1 a 8% (m/v), preferivelmente 1% e Olivato de Sorbitano da oliva (Oliva Mil®) de 3 a 10% (m/v), preferivelmente 3%.

[0050] A combinação de excipientes preferenciais para a presente invenção é selecionada do grupo que compreende :

i) manteiga de palma (10% m/v) + óleo essencial de cravo (3% m/v) e lauril glicosideo (Plantaren 1200®) (2% m/v) - (Fl) ;

ii) manteiga de palma (10% m/v) + óleo essencial de canela (3% m/v) e lauril glicosideo (Plantaren 1200®) (2% m/v) - ( F2 ) ;

iii) manteiga de palma (10%) + óleo essencial de cravo

(1,5%) + óleo essencial de canela (1,5% m/v) e lauril glicosideo (Plantaren 1200®) (2% m/v) - F3.

Preparação dos carreadores lipídicos nanoestruturados

(NLC)

[0051] 0 preparo das diferentes formulações pode ser realizado pelo método da emulsificação-ultrasonicação ou homogeneização sob alta pressão. Em uma concretização preferencial, emprega-se a técnica de emulsificação- ultrasonicação nas condições a seguir.

[0052] Separam-se os componentes lipídicos e ambas as fases lipidicas são aquecidas em banho-maria, 10°C acima da temperatura de fusão do lipídio sólido (manteiga de palma, TF 40°C) . Simultaneamente, a fase aquosa foi composta pela solução do biossurfactante Plantaren 1200®, aquecida na mesma temperatura da fase lipídica. Para a formação da pré-emulsão, a fase aquosa foi gotejada à fase lipidica, sob agitação de 10000 rpm, por 2 min, em agitador Ultra-Turrax (Ultra-turrax® T18) . A pré-emulsão formada foi imediatamente submetida à sonicação por 15 minutos. Ao término desta etapa, a nanoemulsão gerada foi arrefecida em banho de gelo, até alcançar 25°C, a fim de solidificar as nanoparticulas formadas. As formulações preparadas apresentaram coloração amarelo pálida, de aspecto liquido e homogéneo .

Ensaios de medidas de tamanho, dispersão das partículas, potencial Zeta e concentração de nanoparticulas

[0053] As medidas de tamanho de partícula, PDI e potencial Zeta foram realizadas pela diluição das formulações (1:1000 v/v) em água desionizada. O equipamento de espalhamento dinâmico de luz usado foi o ZetaSizer Nano ZS 90 (Malvern Instruments, Malvern, Worcester-shire, UK) .

[0054] Os experimentos de rastreamento de nanoparticulas (NTA) foram realizados no equipamento NanoSight NS300 (NanoSight - Malvern®, Reino Unido) , que utiliza um vídeo-microscópio para analisar as propriedades de espalhamento de luz e o movimento browniano de partículas em suspensão, afim de obter medidas de tamanho, concentração e agregação das mesmas, em amostras em suspensão líquida.

[0055] As medidas foram realizadas após diluição das amostras em água desionizada (1:50000 v/v) e injeção no interior do porta-amostra por meio de uma seringa esterilizada, até seu total preenchimento (~ 0,5 mL) . A análise foi realizada com um feixe de laser verde (À=532 nm) , a 25°C, em triplicata.

[0056] Os resultados obtidos estão sumarizados de acordo com a Tabela 1 a seguir:

Tabela 1. Caracterização estrutural das formulações de NLC naturais (Fl, F2 e F3) no dia do preparo e após 1 ano.

FORMULAÇÃO Tamanho (nm) PDI Zeta (mV) [Np/mL]

_ Inicial 1 ano_ Inicial 1 ano_ Inicial 1 ano_ Inicial 1 ano

F1 200 260 0 090 0.096 -44.9 -44.1 4 4E+13 4 1E+13

F2 202 232 0.058 0.047 -40.7 -42.3 4.7E+13 4.3E+13

F3_ 206 260_ 0.118 0.131 -49.5 -42.2 3.8E+Í3 3.3E+13

[0057] Os ensaios a seguir demonstram que os valores de tamanho de partícula, PDI, potencial Zeta e concentração de nanoparticulas mantiveram-se estáveis após 1 ano de acompanhamento em temperatura ambiente, exibindo excelentes propriedades estruturais.

Obtenção do perfil cromatográfico dos óleos essenciais por Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência (UHPLC) e Cromatografia com Fluido Supercrítico de Ultra Alta Eficiência (UHPSFC)

[0058] Considerando as Figuras 1 a 12, a extração dos princípios ativos dos óleos essenciais de cravo e canela foi realizada com metanol. O eugenol foi utilizado como padrão por ser o composto majoritário presente em ambos os óleos essenciais de cravo e canela (folha), de acordo com o laudo do fabricante.

[0059] O perfil cromatográfico do eugenol (Figura

1), óleos essenciais de cravo (Figura 2) e canela (Figura 3) e das formulações Fl a F3 (Figuras 4 a 6, respectivamente ) foram obtidos a partir das seguintes condições cromatográficas para a técnica de UHPSFC: coluna cromatográfica Acquity HSS C18 1,7 mpi 2,1 x 50 mm, vazão da fase móvel: 1,50 mL min -1, temperatura do forno: 40°C, pressão de retorno: 1500 psi, volume de injeção: 0,5 pL, solvente de injeção: metanol, modo de eluição: 0,00-1,50 min: 100% C02, 1,50-2,50 min: gradiente 5%/min de metanol, 2,50 - 4, 00 min: 95% CO2 : 5% metanol e detecção (PDA) : 281,6 nm .

[0060] Para a técnica UHPLC as condições cromatográficas adotadas foram: coluna cromatográfica Acquity BEH C18 1,7 pm 2,1 x 50 mm, vazão da fase móvel: 0,3 mL min-1, temperatura do forno: 30°C, temperatura amostrador: 30°C, volume de injeção: 2,0 pL, solvente de injeção: MeOH, Fase Móvel do solvente A 10 mM ácido fórmico em água e do solvente B 10 mM ácido fórmico em Acetonitrila, modo de eluição: 0,00-1,00 min: 5% de solvente B, 1,00- 7,00 min: gradiente 15%/min de solvente B, 7,00-8,00 min: 95% de solvente B e 8,00-10,00 min: 5% de solvente B e detecção (PDA) : 281,6 nm.

[0061] O perfil cromatográfico obtido a partir de ensaios com UHPLC do eugenol, óleos essenciais de cravo, canela e formulações F1 a F3 estão representados nas Figuras 7, 8, 9, 10, 11 e 12 respectivamente .

[0062] Tais resultados confirmam que o principio ativo (eugenol) presente nos óleos essenciais foi mantido após sua encapsulação pelas nanoparticulas lipidicas. Isso demonstra que o método empregado, apesar de utilizar calor em seu procedimento, não foi responsável pela evaporação ou degradação do ativo na fórmula. Tais perfis cromatográficos obtidos mediante distintas técnicas estão aptos a caracterizar analiticamente os novos compostos desenvolvidos .

Caracterização estrutural das formulações de NLC preparadas (FTIR-ATR, DSC e TEM)

[0063] Os espectros de absorção na região do infravermelho (FTIR-ATR) foram obtidos mediante a técnica de transformada de Fourier. Os espectros foram registrados na região compreendida entre 4000 e 500 cnT ¹ . Esta técnica foi utilizada por permitir o estudo das possíveis interações entre os excipientes utilizados, proporcionando valiosas informações acerca da nova estrutura preparada.

[0064] As amostras foram analisadas por um Calorímetro Diferencial de Varredura (DSC) , em um porta- amostra padrão de alumínio selado. As análises foram feitas em atmosfera de nitrogénio, a um fluxo de 50 mL.min-1, na faixa de temperatura de + 0 a + 100 °C. As curvas de análise térmica são úteis para comprovar mudanças termodinâmicas das formulações em relação aos excipientes empregados .

[0065] As amostras foram visualizadas em microscópio eletrónico de transmissão Zeiss - LEO 906, pertencente ao Laboratório de Microscopia Eletrónica do Instituto de Biologia/Unicamp . Para o preparo da amostra, uma gota da formulação será adicionada a uma grade de carbono. Após 10 s, o excesso da amostra foi retirado com papel de filtro e, em seguida, uma gota de solução aquosa de uranila a 2% (p/p) foi adicionada sobre a mesma, no intuito de melhorar o contraste das imagens. Após cerca de 8 s, o liquido em excesso foi novamente retirado com papel de filtro e, na sequência, uma gota de água Milli-Q foi adicionada à grade, seguindo-se o mesmo procedimento para a retirada do excesso, após 5 s. Em seguida, a grade permaneceu em repouso, em temperatura ambiente, até a secagem das amostras.

[0066] Conforme observado na Figura 13 e Figura 14, as técnicas estruturais de caracterização confirmaram que as formulações desenvolvidas têm perfil compatível com sistemas de carreador lipidico nanoestruturado, mesmo sendo compostas somente por excipientes naturais, sem a indicação de decomposição ou degradação de qualquer um dos excipientes nas condições analisadas. Além disso, a Figura 15 referente à microscopia eletrónica de transmissão, ilustra a morfologia das diferentes formulações de NLC (Fl, F2 e F3) em um aumento de lOO.OOOx (acima) e 60.000x (abaixo) , que confirmou o formato esférico de contornos bem delimitados, de dimensões semelhantes às quantificadas por DLS, de acordo com o esperado para este tipo de formulação. Assim, os lipídios estruturais escolhidos como matriz para a nanopartícuia, os biossurfactantes empregados em sua estabilização e os óleos essenciais encapsulados como moléculas-ativas mostraram-se compatíveis entre si, sendo excelentes excipientes destas novas formulações com diversas atividades terapêuticas.

[0067] A seguir, serão descritos as metodologias e testes relacionados à capacidade antimicrobiana, analgésica, antifúngica e biopesticida das composições ora pleiteadas .

Teste de suscetibilidade antimicrobiana

[0068] As formulações foram avaliadas quanto à atividade antimicrobiana dos compostos, determinada pelo método de difusão em ágar, utilizando-se diferentes cepas bacterianas Gram-positivas (BEC 9393- Staphylococcus aureus, RIB1- Stapylococcus aureus MRSA, S. EP.- Staphylococcus epidermidis, e SAATCC- Staphylococcus aureus ATTC 25922) e Gram-negativas (31 NM- Pseudomonas aeuroginosa cepa clinica e KP 230- Klebsíella pneumoníae ATCC 25619) .

[0069] As placas contendo ágar Mueller Hinton preparadas antecipadamente foram retiradas da geladeira e armazenadas até atingir a temperatura ambiente. Foram feitos poços de 12 mm de diâmetro. Com um swab estéril, o inoculo bacteriano com turvação 0,5 da escala de MacFarland foi distribuído uniformemente sobre a superfície do ágar, deixados em repouso em temperatura ambiente, por aproximadamente 5 minutos. As placas foram incubadas em estufa a 35 ± 1°C por 24 horas. O halo de inibição do crescimento foi medido por meio de régua milimetrada. Os testes foram realizados em duplicata e em dias diferentes. O álcool etílico hidratado 96° foi empregado como controle negativo e a solução do antibiótico ciprofloxacino (CPR) foi utilizado como controle positivo.

[0070] De acordo com a Tabela 2, fica evidente a atividade bactericida de cada formulação (Fl, F2 e F3) em relação aos distintos tipos de cepas bacterianas testadas, em comparação com o controle positivo do antibiótico. As formulações compostas por lipídios naturais apresentaram um efeito antimicrobiano semelhante ou maior que o antibiótico empregado como controle positivo, como é o caso da cepa bacteriana BEC. E ainda, as formulações foram eficazes contra a cepa KP230 (Gram -), onde o antibiótico CPR não teve efeito terapêutico sobre a mesma. Cabe ressaltar, que formulações de NLC com maiores concentrações de óleos essenciais poderão ser preparadas com sucesso e seu efeito bactericida poderá ser igualmente avaliado.

Tabela 2. Susceptibilidade bacteriana de diferentes cepas tratadas com as formulações naturais Fl, F2 e F3, e com o controle positivo do antibiótico ciprofloxacino (CPR) .

Cepa _ Gram Fl _ F2 _ F3 _ CPR

BEC + 1 ,6 cm 1 ,6 cm 1 ,6 cm 1 ,0 cm

RiB l + 1 ,4 cm 1 ,3 cm 1 ,2 cm 3,8 cm

S. EP + 1 ,4 cm 1 ,3 cm 1 ,5 cm 4,7 cm

31 MN - - 1 ,3 cm - 5,4 cm

SAATCC + 2,0 cm 2,2 cm 2,1 cm 2,6 cm

KP230 _ 1 ,1 cm 1 ,1 cm 1 ,1 cm _ -

Estudo in vivo da eficiência anestésica por Tail-flick

[0071] A avaliação da atividade analgésica (bloqueio sensorial) das formulações de NLC natural Fl, F2 e F3 foi realizada em camundongos Siviss machos (30-35 g) . Os animais foram alojados nas seguintes condições: 25°C ± 2°C, 30% -70% de umidade e 12/12 h de ciclo claro/escuro, com comida e água disponíveis ad libitum e separados em grupos de 5 animais.

[0072] Primeiramente, os animais foram anestesiados com volume máximo de 100 pL da formulação ou de solução de cloridrato de lidocaina 0,5% como controle. As amostras foram aplicadas por via intradérmica na base da cauda do animal. As medidas foram realizadas no equipamento de tail- flick (Onda Cientifica Ltda) . A base da cauda foi colocada sob estimulo térmico (~55°C) por um tempo de latência de 10 segundos {cutoff) , até a reação de movimentação da cauda. O animal foi submetido a esse procedimento em tempos de 30 min e 1 hora, e a partir disso, a cada hora até que o tempo de latência atinja o valor da linha basal. Todos os experimentos foram realizados pelo mesmo observador.

[0073] A Figura 14 ilustra os resultados obtidos e expressos em percentagem de efeito máximo possível (%EMP) e os resultados tratados com o software GraphPad Prism® 6.0. Todas as análises foram realizadas no Instituto de Biologia da Unicamp, de acordo com as normas do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na área de Ciência em Animais de Laboratório (CEMIB-Unicamp) aprovado pelo comité de ética (4833-1/2018) .

[0074] Tais resultados demonstraram que o efeito das formulações testadas (Fl, F2 e F3) não apresentaram diferença estatística (AUC) em relação ao fármaco controle - lidocaina 0,5% em salina - após administração via intra dérmica na base da cauda de camundongos. As formulações testadas também se comportaram de maneira similar ao controle mesmo em relação ao tempo de recuperação do bloqueio sensorial, reforçando assim a similaridade de ação dessas formulações de NLC naturais com o fármaco de ação anestésica reconhecida (lidocaina) .

Tabela 3. Dados de área sobre a curva (AUC) e tempo de recuperação dos camundongos submetidos ao teste de Taíl Flick em relação a cada grupo testado.

Avaliação in vitro da atividade fungicida

[0075] A atividade antifúngica dos extratos foi avaliada frente aos seguintes microrganismos: Aspergillus fumigatus, Cândida albicans e Trichophyton rubrum. Os fungos foram mantidos e repicados em meio potato dextrose agar (PDA; Sigma-Aldrich) . Após o repique em meio sólido, as culturas foram incubadas em estufa a 35 °C, por 24 h, 96 h e até esporulação, respectivamente em C. albicans, T. rubrum e A. fumigatus . Devido a não produção de esporos, os ensaios de T. rubrum foram padronizados discos 4 mm de diâmetro nos inóculos em meio sólido.

[0076] Para os testes de atividade antifúngica, foram utilizadas 3 diferentes formulações classificadas como EI (Fl) , E2 (F2) e E3 (F3) . Essas três formulações, são extratos solúveis em água e foram utilizados diretamente no ensaio, e também foram analisadas com seus insumos separadamente que foram classificados de II a 15.

[0077] A avaliação da atividade antifúngica dos insumos puros foi desenvolvida de acordo com os parâmetros determinados pelo CLSI ( Clinicai and Laboratory Standards Institute) em microplaca estéril de 96 poços. Dessa forma utilizou-se o meio de cultivo sintético RPMI-1640 tamponado em pH 7,0 com 0,165 mol/L de MOPS (ácido 3- [N-morfolino ] propanosulfônico) a fim de não antagonizar com os agentes antifúngicos .

[0078] Os extratos foram analisados em 12 concentrações diferentes, diluídas em série de 1:1 em solução salina (NaCl 0,85%), iniciando 0,3% de EI a E3 de acordo com a Figura 17. Os insumos foram analisados em duplicata em 6 concentrações diferentes, diluídas em série de 1:1 em solução salina (NaCl 0,85%), iniciando em 1% do insumo II; 0,5% do insumo 12; e 0,3% dos insumos 13 a 15 de acordo com a Figura 18.

[0079] Os microrganismos foram contados utilizando câmara de Neubauer e inoculados na concentração final de 103 e 104 unidades por/ml de C. albicans e A. fumigatus, respectivamente . Todas as placas de microdiluição foram incubadas a 35°C sem agitação.

[0080] Na última linha da segunda placa foram adicionados 3 diferentes controles em duplicatas. O controle negativo, somente com o meio RPMI-1640; controle positivo, contendo o meio RPMI e o inoculo; e o controle positivo contendo 1% de DMSO.

[0081] Na penúltima linha da placa foram adicionadas 4 réplicas de controles positivos, contendo o meio RPMI e o inoculo. Todas as análises foram realizadas em duplicata (1-6 e 7-12) .

[0082] No teste convencional de microdiluição, o crescimento em cada poço recebeu um escore numérico, da seguinte maneira: 4 = nenhuma redução do crescimento; 3 = ligeira redução do crescimento ou aproximadamente 75% do crescimento do controle (meio isento de droga) ; 2 = redução proeminente de crescimento ou aproximadamente 50% do crescimento do controle; 1 = ligeiro crescimento ou aproximadamente 25% do crescimento do controle; e 0 = opticamente claro ou ausência de crescimento.

[0083] Nas presentes análises classificaram-se alguns poços com o valor 5, pois nessa determinada condição o microrganismo apresentou crescimento maior do que o controle positivo. A menor concentração de um agente antifúngico que inibe substancialmente o crescimento do organismo visualmente detectado é denominado CIM (concentração inibitória mínima) . Assim, para a determinação do CIM avaliou-se o crescimento dos cultivos após 24 e 48 horas, conforme representado a seguir nas Figuras 19 e 20.

[0084] A atividade antifúngica dos extratos em C. albicans foi verificada para os extratos EI a E3. Em relação a atividade antifúngica em A. fumigatus, o crescimento foi completamente inibido utilizando os extratos EI a E3. Dessa forma, os valores de CIM foram obtidos para os três extratos complexos (Tabela 3) . Por convenção os valores de análise da inibição variam de 0 a 4, no entanto classificamos algumas condições com o escore numérico de 5.

[0085] Esses valores foram observados no cultivo de

C. albicans no extrato E2. Esse aumento no crescimento se deve a uma possível suplementação do meio de cultivo favorecendo o crescimento do microrganismo, uma vez que os extratos são complexos e podem conferir uma vantagem nutricional nessas determinadas condições.

Tabela 3. Resumo das atividades antifúngicas após 48 h .

[0086] A atividade antifúngica em C. albicans foi verificada apenas para os insumos 12, em todas as concentrações avaliadas. Enquanto que 14, 15 e 13 apresentaram, respectivamente, uma inibição de aproximadamente 75%, 50% e 25% do crescimento. Em relação a atividade antifúngica em A. fumigatus, foi verificada a inibição de crescimento apenas para os insumos 12, em todas as concentrações testadas, e 14 na concentração de 0,30%.

[0087] A inibição do crescimento em 75% e 50%, respectivamente, foi observada em 15 e 13. Em ambos os fungos o insumo II não promoveu nenhuma alteração no crescimento dentre as concentrações testadas. Dessa forma, os valores de CIM foi determinado somente em 14 na concentração de 0,30% para A. fumigatus.

[0088] Apesar de observar a inibição de crescimento de ambos os fungos em todas as concentrações de 12 não se atingiu uma diluição que permitisse o crescimento fúngico.

Dessa forma podem-se dizer que o CIM do 12 é menor do que a menor concentração testada.

[0089] A Tabela 4 sumariza as atividades antifúngicas após 48 horas:

Tabela 4 . Resumo das atividades antifúngicas após 48 h .

[0090] Posteriormente aos cultivos de 48 h, 100 mΐ do volume dos poços que apresentaram CIM definido foram inoculados em PDA a 35 °C a fim de verificar se o extrato tem atividade fungicida ou fungistática . De acordo com os dados obtidos, pode-se inferir que os insumos 12 e 14 tem atividade fungistática, visto que foi detectado o crescimento de A. fumígatus e C. albicans após o inoculo em meio sólido.

[0091] Para os testes de atividade antifúngica em meio sólido em placa de Petri utilizou-se 10 ml de meio PDA suplementado com 0,30% de extrato complexo. Nesse teste os ensaios foram realizados em duplicata de cada extrato complexo adicionado de uma duplicata controle contendo somente PDA.

[0092] A avaliação do crescimento foi realizada diariamente por um período de 10 dias a partir do inoculo para os fungos A. fumígatus, C. albicans e T. rubrum.

[0093] A partir do primeiro dia já foi possível observar o crescimento de todos os fungos no cultivo controle. Após os 10 dias de acompanhamento não foi possível observar o crescimento de nenhum fungo em todos os extratos complexos. Dessa forma, infere-se que existe uma sinergia entre os insumos que permite a inibição do crescimento em períodos maiores em comparação aos insumos puros .

[0094] Dentre os extratos analisados foi possível determinar a CIM dos extratos El, E2 e E3 tanto em C. albicans quanto em A. fumígatus . Quanto aos insumos analisados foi observado a inibição de crescimento em 12 e 15, no entanto só possível determinar a CIM exata de 15 para A. fumígatus . Apesar de não inibir completamente o crescimento do A. fumígatus os insumos 13 e 15 inibiram em pelo menos 50% o crescimento esperado.

[0095] Dessa forma, de acordo com a viabilidade, pode-se atingir a inibição do crescimento em concentrações maiores às testas nesse ensaio. Quanto a inibição do crescimento de C. albicans, pode-se inferir que 13, 14 e 15 apresentam potencial inibição de crescimento, porém em concentrações maiores do que as testadas nesse ensaio. Além disso, foi observado que o insumo 12 tem atividade fungistática em A. fumígatus e C. albicans; e 14 tem atividade fungistática em A. fumígatus . Apesar dos resultados obtidos com os insumos purificados, o ensaio em meio sólido mostrou que os extratos complexos têm maior eficiência e são capazes de inibir o crescimento de A. fumígatus , C. albicans e T. rubrum em períodos de até 10 dias .

Avaliação da atividade lagarticida das formulações

[0096] Para cada espécie foram utilizadas 50 lagartas em cada tratamento, distribuídas em 10 potes plásticos (7,0 x 3 cm) . Em cada recipiente foi colocado 19,2 cm ³ de dieta artificial, sobre a qual foi aplicado 200 microlitros da suspensão contendo os tratamentos. Após a secagem do excesso de agua foram transferidas lagartas de segundo instar de cada espécie. A mortalidade foi anotada sete dias após os tratamentos. Na testemunha foi aplicada agua destilada. A lagarta foi considerada morta quando não apresentada movimentos quando tocada com pincel de cerdas finas .

[0097] A maior mortalidade obtida foi para o tratamento F2 para S. frugiperda (56%) e em seguida com o tratamento F3 (42%) para C. includens . Para os demais tratamentos a mortalidade foi inferior, com redução ou estabilidade da mortalidade em função da redução da concentração testada. Na testemunha a mortalidade foi zero para todos os tratamentos. A diferença de suscetibilidade entre as espécies era esperada, uma vez que ambas apresentam a mesma variação de resposta a inseticidas convencionais e bioinseticidas .

[0098] Os ensaios a seguir ilustram a mortalidade de diferentes espécies frente as formulações F1-F3 sob diferentes diluições.

a) Mortalidade de Chrysodeixis includens ( Lepídoptera :

Noctuidae) frente ao tratamento F3

1 Diluição (0,3%)

POTES 1 a 10

2 Diluição (0,03%)

3 Diluição (0,003%) b) Mortalidade de Chrysodeixis includens ( Lepídoptera : Noctuidae) com Tratamento F2.

1 Diluição (0,3%)

TOTAL

2 Diluição (0,03%)

3 Diluição (0,003%) c) Mortalidade de Chrysodeixis includens ( Lepidoptera : Noctuídae) : Tratamento F1

1 Diluição (0,3%)

2 Diluição (0,03%)

3 Diluição (0,003%) d) Mortalidade de Spodoptera frugiperda ( Lepidoptera : Noctuídae) : Tratamento F3

POTES 1 a 10

1 Diluição ( 0 , 3% ) 2 Diluição (0,03%)

3 Diluição (0,003%)

e) Mortalidade de Spodoptera frugiperda ( Lepidoptera : Noctuídae) : Tratamento F2

1 Diluição (0,3%)

2 Diluição (0,03%)

3 Diluição (0,003%)

f) Mortalidade de Spodoptera frugiperda ( Lepidoptera : Noctuídae) : Tratamento F1

1 Diluição (0,3%)

2 Diluição (0,03%)

3 Diluição (0,003%)

Avaliação da mortalidade de carunchos de feijão

[0099] A cultura de Acanthoscelides obtectus utilizada foi obtida e estabilizada no Laboratório de Biologia do Instituto de Ciência e Tecnologia de Sorocaba, Universidade Estadual Paulista "Julio de Mesquita Filho" - Campus Sorocaba, São Paulo, Brasil. Os insetos foram mantidos em bandejas, com aeração, em incubadora e condições de ausência de luz, temperatura de 27 ± 2 °C, com umidade máxima de 73% e mínima de 52%.

[00100] O feijão carioca (Qualitá®) , adquirido em supermercado comum local utilizado para manutenção da cultura e realização dos experimentos foi previamente mantido em freezer durante 14 dias e seco visando evitar possível infestação vinda do campo e reduzir qualquer efeito potencial por resíduo de inseticida.

[00101] Em frascos plásticos de 145 mL com pequenos furos na tampa para aeração, foi adicionado 25 g de feijão carioca, aplicado os tratamentos de Fl, F2, F3, F1C, F2C e F3C e os frascos foram agitados manualmente por 60 segundos visando garantir distribuição completa do material nos grãos de feijão. Dez A. obtectus de 1 a 5 dias de idade não sexados foram colocados em cada um deles, e os frascos foram mantidos sob condições laboratoriais controladas (ausência de luz, temperatura de 27 ± 2 °C, umidade de 52% a 73%) durante 96 horas. O experimento foi realizado nas concentrações de 8.13, 16.25, 32.5, 65 e 130 uL do ativo/kg do feijão.

[00102] A mortalidade foi avaliada após o período de exposição, em estereoscópio Coleman® XTB-2B e os besouros foram considerados mortos quando não apresentavam movimentos mesmo estimulados por toque de pincel com cerdas finas durante 30 segundos. Duas repetições foram realizadas para cada dose e para o tratamento controle e o experimento repetido por três vezes.

[00103] De acordo com o demonstrado na Figura 21, pode-se evidenciar que todas as formulações foram responsáveis pela mortalidade dos carunchos em porcentagens igual ou superior a 50%, nas 5 concentrações testadas.

Avaliação in vivo da Atividade acaricida

[00104] Os ácaros Tetranychus urtícae utilizados no experimento foram procedentes de uma criação mantida sobre plantas de feij ão-de-porco Canavalia ensiformes (L.) DC cultivadas em vasos de 2 L de capacidade, contendo solo, areia e esterco bovino (1:1:1) como substrato. A criação estava mantida em câmara climatizada (temperatura 25 ± 1°C, umidade de 70 ± 10% e fotoperíodo de 12 horas) .

[00105] No experimento foram utilizadas arenas confeccionadas de folhas da planta hospedeira (C. ensíformís) de 2,5 cm de diâmetro. As arenas foram colocadas em placas de Petri de 9 x 2 cm contendo espuma umedecida e as arenas foram circundadas com algodão hidrófilo .

[00106] Foram avaliados 14 tratamentos estabelecidos na Tabela 5. Cada tratamento foi repetido 8 vezes e cada repetição foi composta por uma arena. As aplicações dos produtos foram realizadas sob torre de Potter calibrada a 4 lbf.pol-2. Foram aplicados 2 mL de calda por disco, correspondendo a 1,56 mg cnT ² de resíduo seco. Após a secagem dos produtos sobre as folhas ( aproximadamente 2 horas) foram transferidos com pincel de um pelo, cerca de 10 ácaros fêmeas adultas de T. urtícae para cada arena, totalizando 80 ácaros por tratamento. Após as transferências as arenas foliares foram levados para câmara climatizada com temperatura de 25 ± 1°C, umidade relativa de 70±10% e fotofase de 12 horas. As avaliações para quantificação dos ácaros mortos, vivos e retidos na barreira de algodão foram realizadas aos 1, 2, 3 e 4 dias após a transferência (DAA) dos ácaros.

Forma de análise dos dados:

[00107] Foi calculada a porcentagem de mortalidade de ácaros e a porcentagem de repelência de ácaros.

[00108] Com base nas Figuras 22 e 23, evidenciou-se que as formulações testadas apresentaram atividade acaricida semelhante ao controle positivo, em todos os casos. Além disso, elas mostraram-se excelentes repelentes contra os ácaros, sendo superior ao controle positivo mesmo quando diluídas, em todos os casos.

Tabela 5 . Descrição dos tratamentos a serem utilizados no experimento .

Concentração

Tratamentos Produtos

% de ativo

1 F1 0,003 2 F1 0,03

3 F1 0,3

F1 3,0

F2 0,003

F2 0,03

F2 0,3

F2 3,0

F3 0,003

F3 0,03

F3 0,3

12 F3 3,0

13 Propargite controle positivo 1 mL / L ^_1

14 Água desionizada controle negativo

[00109] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.