【발명의 명칭】

골관절염 치료를 위한 친수화된 설파살라진 및 히알루론산을 포함하는 조성물 및 이의 제조방법

【기술분야】

본 발명은 골관절염의 치료를 위한 조성물 및 이와제조방법에 관한 것으로， 보다 상세하게는 관절강 주입 및 국소 투여를 통해 통증 완화와 더불어 관절 마모를 방지하여, 퇴행성 골관절염과 같은 골관절염의 효과적인 치료가 가능하도록, 유효성분으로서 친수화된 설파살라진 및 히알루론산을 포함하는 조성물， 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

【배경기술】

골관절염은 관절 부위의 물리적 자극을 통하여

콘드로사이트 (chondrocyte)와 관절막 (synovial fluid)에서 발현되는 사이토카인과 연골분해 효소에 의해 관절 내 연골이 지속적으로 분해, 손상되어 관절면의 운동기능이 소실되고 불안정성이 유발되는 상태를 칭한다.

현재 골관절염의 치료에는 외과적 수술 외에 약물 치료와 히알루론산의 관절강 투여 등이 활용되고 있으나, 이들은 통증 완화가 주목적이며, 연골손상 감소 기능은 미약하여, 실질적으로 골관절염을 치료할 수 있는 의약품이 요구되고 있다.

한편, 설파살라진은 현재 류마티스 관절염 및 염증성 장질환의

경구치료제로 활용되고 있으며, 최근 골관절염의 발병원인인 콘드로사이트의 변화를 보호하고， 관절막에서 연골 파괴에 관련된 인자들의 발현을 억제하여 골관절염의 치료에 활용 가능성이 있다는 결과가 발표된 바 있다 (Nose M et al. J Rheumatol 1997;24:550-4, Lakey et al. Rheumatology 2009;48:1208-1212, Endo W. et al Mod Rheumatol 2014;24(5):844-50).

설파살라진을 경구 복용하는 경우, 일일 최대투여량인 4g을 섭취해도 혈중 농도가 12ug/ml로 그 흡수율이 매우 낮고， 물질의 난용성으로 인해 소화기 장애를 일으키는 것으로 알려져 있으며， 설파살라진의 분해 산물인 설파피리딘의 혈중 농도가 높을 경우, 다양한 부작용을 일으키는 것으로 보고되고 있다 (HoulURS. Drugs 1986;32:18-26). 이에 따라 설파살라진을 경구로 투여하는 것이 아닌 관절강 내로 직접 투여할 경우, 경구투여에서 발생하는 부작용들을 피할 수 있을 것으로 예상된다. 그러나, 설파살라진은 그 난용성으로 인해 효과를 보기위한 고농도의 액상 의약품을 만들기 어렵다. 또한, 관절액 (synovial fluid)의 turn-over시간은 2시간으로 알려져 있어 (Levick JR et al. Ann Rheuma 1995;54:417-423) 관절강 내에 직접 투여된다 하더라도 층분한 약효를 보이기 어려울 것으로 예상된다.

한편 히알루론산은 체내 관절액의 주요 구성 성분으로 관절 내 연골 사이에 존재하여 윤활제 역할을 하고 있다. 골관절염 환자들의 경우, 관절 내 히알루론산의 농도가 감소하는 것으로 알려져, 이를 체외에서 합성된

히알루론산을 보충하는 골관절염 치료 물질로 널리 활용되고 있다. 히알루론산은 다른 관절액의 성분들과는 달리 그 반감기가 13시간 이상으로 알려져

있어 (Browon TJ et aL ExpPhysiol 1991 :76;125-134)， 설파살라진과 히알루론산을 흔합할 경우， 관절강 내 유지시간도 24시간 이상 유지시킬 수 있을 것으로 예상되었다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 난용성인 설파살라진을 이용하여 효과적인 골관절염의 치료방법을 개발하고자 예의 연구한 결과, 특정 농도의 염기성 첨가제를 사용하여 설파살라진을 용해하는 방법에 의해 설파살라진과 히알루론산의 조성물을 제조하는 경우, 기존과는 달리 고농도의 설파살라진이 유효성분으로 포함된 치료용 조성물을 제조할 수 있음을 확인하였다. 나아가, 이러한 고농도의 설파살라진과 히알루론산을 포함하는 조성물을 동물 모델에 적용한 결과, 상기 조성물이 특정한 고농도의 설파살라진 수준을 유지하는 것에 의해 골관절염의 진행을 억제할 뿐만 아니라, 진통효과를 동시에 나타낸다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 유효성분으로서 친수화된 설파살라진 및 추가적으로 히알루론산， 이의 염 또는 유도체를 포함하는, 관절강 및 국소투여가능한 골관절염 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 나아가, 본 발명은 상기 관절강 및 국소투여 가능한 골관절염 치료용 조성물의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

【발명의 효과】 본 발명에 따른 제조방법에 의해 친수화된설파살라진 및 추가적으로 히알루론산을 포함하는 골관절염 치료용 조성물을 제조하는 경우, 용해 후 중화 단계를 거쳐도 용해상태가 유지되어, 중화 이후 발생하는 설파살라진의염석현상에 의한 침전을 방지하기 때문에, 고농도로 설파살라진을 포함하는 조성물을 제조할 수 있고, 이에 따라 제조된 조성물은 종래 난용성에 의해 저농도로만 포함되던 설파살라진을 고농도로 포함함으로 인해 관절강주입이나 국소투여를 통한 골관절염， 특히 퇴행성 골관절염의 치료에 매우 유용하다.

【도면의 간단한 설명】

. 도 1은 본 발명에 따른 l, 2, 4, 8mM의 친수화된설파살라진 및

히알루론산을 포함하는 골관절용 조성물의 사진이다.

도 2는 IL-lb로 염증이 유도된 인간 지방세포 유래 줄기세포를 이용하여 본 발명에 따른 조성물의 염증 및 연골파괴 인자 발현억제에 대한 in vitro 시험결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 친수화된 설파살라진과 히알루론산의 흔합물이 생리식염수에 담겨있을 때, 생리식염수로 용출되는 설파살라진 양의 누적용출량을 측정한 그래프이다. .

도 4은 lmg MIA를 관절강에 처리하여 유도한 골관절염 동물모델 (rat)에 0 내지 8mM의본 발명에 따른 친수화된설파살라진 및 히알루론산을 포함하는 골관절염조성물을 투여하고 8주 후 X-ray 촬영한사진이다.

도 5는 lmg MIA를 관절강에 처리하여 유도한 골관절염 동물모델 (rat)에 0 내지 8mM의 본 발명에 따른 친수화된 설파살라진 및 히알루론산을 포함하는 골관절염조성물을 투여하고 동물모델의 통증을 측정할 수 있는 장비를 이용하여 6주간 통증의 감소 여부를 관찰한 결과이다.

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

이러한 목적올 달성하기 위한 하나의 양태로서， 본 발명은 유효성분으로서 2 내지 10mM의 친수화된 설파살라진 및 1 내지 2(\^ %의 히알루론산, 이의 염 또는 유도체를 포함하는, 관절강 및 국소투여가능한 골관절염 치료용 조성물 및 이를 투여하여 골관절염을 개선 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

상기 설파살라진 (Sulfasalazine, 이하 "SSZ"라고도 지칭함)은, 설파피리딘 (Sulfapyridine)과 5-아미노살리실산 (5-aminosalicylic acid, 5-ASA)이 아조 결합 (azo bond)하여 형성된 화합물로, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 말한다. 1]

본 발명에서, 상기 조성물에는 골관절염 치료를 위한 유효성분으로서 친수화된 설파살라진을 2 내지 10mM 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 명세서에서 용어 "친수화된 설파살라진"은 수난용성인 설파살라진의 수성 매질내에서 용해도 또는 분산 균일성을 증가시킨 것을 의미하며, 이러한 친수화된 설파살라진은 i) 설파살라진의 수용성 염, 또는 ii) 수성매질중에서 친수화 용매와 설파살라진을 흔합하여 균일하게 분산된 흔합물을 포함하며, 상기 친수화 용매는 폴리에틸렌글라이콜일 수 있다.

상기 i) 설파살라진의 수용성 염형태는, 설파살라진에 염산， 염화나트륨, 염화칼슴 또는 염화칼륨 등을 첨가하여 산 부가염 또는 알칼리 부가염의 형태로 얻어 질 수 있고, 설파살라진을 폴리에틸렌글라이콜과 흔합하여 얻어질 수 있다. 보다 바람직하게, 본 발명의 설파살라진은 ii) 폴리에틸렌글라이콜과 흔합된 상태를 포함할 수 있다. 상기 폴리에틸렌글라이콜과 흔합된 설파살라진은 염을 이용하여 pH를 조절한 수용성 매질에， 폴리에틸렌글라이콜을 부가하고, 설파살라진을 상기와 같은 폴리에틸렌글라이콜을 포함하는 수용성 매질에 첨가하여 얻어질 수 있다.

이러한 균형염용액은 다양한 분자량 및 농도의 폴리에틸렌글라이콜을 포함할 수 있는데， 예를 들어， 200 내지 500， 바람직하게는 380 내지 420의 중량평균분자량을 갖는 폴리에틸렌글라이콜올 1% 내지 40 % (w/v)의 농도로 포함할 수 있다.

이와 관련하여， 본 발명자는 설파살라진의 골관절염 치료 효과는 상기 범위 미만의 농도, 예를 들어 lmM 에서는 전혀 나타나지 않고, 본 발명과 같이 더욱 고농도가 되어야 골관절염 치료 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

설파살라진이 2mM(0.08 w/v%) 미만으로 포함되는 경우, 골관절염의 치료를 위한 유효한 효과를 나타낼 수 없고, 10mM(0.4 w/v%)를 초과하는 경우, 설파살라진 자체의 난용성으로 인해 액상제제 또는 주사제제에 적합하지 않게 된다. 한편, 친수화된 설파살라진과 함께 본 발명에 따른 조성물에는히알루론산, 이의 염 또는 이의 유도체가 추가적으로 포함된다.

본 발명에서 히알루론산 (hyaluronic acid)은 결합조직 내의 세포 간질에 널리 분포되어 생리 조건 하에서 점착성 및 탄력성 용액을 형성함으로써, 홍채， 망막 등의 조직, 혈관 내피세포, 상피세포 등을 기계적으로 보호하며 완층역할을 제공하는 것으로 알려진, 세포외 매트릭스의 주요 성분이다. 본 발명에서 상기 히알루론산은 물성, 형태， 크기 등에 제한이 없으며, 무균 처리된 것이 바람직하나, 보다 바람직하게는 , l .O x 10 ⁶ 내지 6.0 x l0 ⁶ g/몰의 중량평균분자량을 갖는

히알루론산을 사용할 수 있다. 또한, 상기 히알루론산은 약제학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있는데, 상기 약제학적으로 허용가능한 염은 나트륨염， 칼륨염, 칼슘염 등을 포함하며, 바람직하게는 나트륨염을 포함한다. 또한, 히알루론산의 유도체 또한 사용될 수 있는데 이러한 유도체는 구체적으로 교차결합， 황화, 에스터화또는 아미노산 결합에 의해 화학적으로 변형된

히알루론산일 수 있다. 상기와 같이, 본 발명에서는， 상기 히알루론산의 농도는 전체 조성물에 대해 1 내지 2 %(wt/vol)인 것이 바람직하다 _; 상기 범위 미만으로 사용될 경우 점탄성이 너무 낮아 골관절염의 환부에 적절한 시간 동안 유지되지 않는 문제가 발생할 수 있고, 상기 범위를 초과하는 경우 과다한 고점탄성으로 인해 액상제제로서 적합한 유동성을 확보하기 어려운 문제가 있다.

구체적인 하나의 양태로서， 본 발명에 따른 골관절염 치료용 조성물은 관절강내 투여하거나 국소투여를 하는 것을 특징으로 한다. 본 발명자들의 실험에 따르면, 설파살라진은 예를 들어 ImM 과 같은 저농도에서는 유효한 수준의 골관절염 치료효과를 나타내지 못하므로 2mM 이상의 높은 농도로 사용될 것이 요구되나, 이와 같은 고농도의 설파살라진 혈중농도를 유지하기 위해 경구 투여를 하는 경우 심각한 부작용이 발생할 우려가 높다. 따라서, 본 발명에 따른 골관절염 치료용 조성물은 바람직하게는 관절강내 및 환부에 국소투여하기 위해 설파살라진을 친수화시켜 액상제제， 더욱 바람직하게는 주사제제로 제형화될 수 있다. 상기 제형화를 위해서， 본 발명에 따른 골관절염 치료용 조성물은 상기 특정 농도의 설파살라진과 히알루론산 외에 약학적으로 허용가능한 첨가제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 첨가제란, 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 유효성분의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 상기 약학적으로 허용가능한 첨가제의 예로는 등장화제， 완충제, 안정제 , ρΗ 조절제 등이 있다. 나아가， 본 발명에 따른 조성물은 액상의 제형인 것이 바람직하므로, 이를 위해 수용액을 포함하는 담체를 더욱 포함할 수 있다. 상기 수용액을 포함하는 담체는 증류수, 인산완층액 (Phosphate Buffered Saline), 균형염용액 (Balanced Salt Solution) 및 생리식염수 (Saline)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이 때 사용되는 담체의 함량은 제조하고자 하는 액상제제 또는 주사제제의 총 용량에 필요한 양에 맞추어 사용량을 조절할 수 있다. 상기 균형 염용액은 생리적 pH 및 염농도 (삼투압)를 제공하는 염용액을 의미하는 것으로서 또는 평형 염용액이라고 하며, 통상의 균형 염용액은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슴 및 이들의 염화물로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상을 포함한다. 본 발명에서 용어, "투여 "는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 성분을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 투여 경로는 관절강에 국소적으로 투여하는 것이다. 본 명세서에서

"치료 "란 발병 증상을 보이는 객체에 사용될 때 질병의 진행을 중단， 지연 또는 개선시키는 것을 의미한다. 본 발명의 치료방법은 상기 친수화된설파살라진 및 히알루론산을 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료학적 유효량은, 달성하고자 하는 반웅의 종류와 정도, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 치료 기간, 함께 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 친수화된 설파살라진과 히알루론산을 포함하는 관절강 및 국소투여 가능한 골관절염 치료용 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태로서， 본 발명에 따른 골관절염 치료용 조성물의 제조방법은 a) 염기성 첨가물 및 PEG를 물에 용해시켜 pH l l 이상 14 이하의 PEG 수용액을 제조하여 이에 설파살라진을 용해시키는 단계; b) 단계 a)의 반웅물에 히알루론산, 이의 염 또는 유도체를 용해시키는 단계; 및 C) 단계 b)에서 제조된 반응물을 산성 첨가물로 중화시키는 단계를 포함한다.

상기 (a) 단계는 난용성인 설파살라진을 친수화시키는 단계로서， 염기성 첨가물과 폴리에틸렌글리콜 (PEG)와 설파살라진을 반웅시키는 단계이다.

구체적으로, 상기 염기성 첨가물은으 01 내지 l(w/v)%의 NaOH, KOH 또는 암모니아를 사용할 수 있고, 이에 의해 PEG 수용액의 pH가 11 이상 14이하가 되어 유용하게 설파살라진을 용해시킬 수 있다. 염기성 첨가물의 농도가 상기 . 범위를 벗어나는 경우에는 이후 중화 단계에서 중화 시 설파살라진이 염석 (salting out)에 의해 침전되어 액상제제로서의 사용이 불가능하게 된다. 상기

설파살라진의 함량 등은 상기 본 발명에 따른 조성물에 관한사항을 그대로 적용할 수 있다. 한편, 상기 폴리에틸렌글리콜은 친수성 혹은 소수성 성분을 모두 용해하는 성질에 의해 설파살라진을 가용화를 안정시키며, 바람직하게 400 내지 20000의 중량평균분자량을 갖는 폴리에틸렌글리콜， 더욱 바람직하게는

PEG400, 1500, 4000, 6000, 20000을 사용할 수 있고, 전체 조성물에 대해 1 내지 40(\¥/\ %을 사용할 수 있다.

나아가, 상기 (b) 단계는 상기 용해된 설파살라진에 히알루론산을 첨가 및 흔합하는 단계로, 상기 히알루론산의 물성， 형태， 크기， 함량은 상기 본 발명에 따른 조성물에서 정의한 바와 동일하며, 무균 처리된 것이 바람직하다. 상기 첨가되는 히알루론산은 분말형태 또는 액상용액일 수 있으며, 예를 들면 분말일 수 있다. 또한， 설파살라진에 히알루론산을 흔합하는 단계는, 상기 친수화된 설파살라진 및 히알루론산을 10 내지 40에서 3시간 내지 6시간 흔합하는 것이 바람직하다. 상기 흔합시의 온도 범위 미만인 경우에는, 조성물의 성분들이 균질하게 흔합되지 않을 수 있고， 상기 온도 범위 초과인 경우는 제제의 안정적인 조제가 쉽지 않기 때문에 바람직하지 않다. 또한, 상기 흔합 시간 범위 미만인 경우에는, 조성물의 구성성분들이 균질하게 흔합되지 않을 수 있고, 상기 시간을 초과하는 경우에는 히알루론산의 점도에 변화가 생길 수 있다.

또한, 상기 단계 c)에서는 단계 b)에서 제조된 반웅물이 인체 내 투여가 가능한 수준의 pH를 갖추도록 산성 첨가물로 증화 반웅을 시키는 단계이다.

상기 산성 첨가물로는 적정 수준의 pH로 조절할 수 있는 것으로 인체 내에 무해한 것이면 제한없이 사용가능하나， 예를 들어, 초산, 염산, 인산, 황산, 구연산, 니트르산, 주석산이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

한편, 상기 골관절염 치료용 조성물의 제조방법에서는, 약학적으로 허용되는 첨가제, 담체 또는 염을 첨가하는 단계, 또는 무균제제의 제조를 위해 멸균하는 단계를 더 포함할수 있다ᅳ

상기와 같은 방법에 의해, 종래 골관절염 치료를 위해 고농도의 설파살라진을 포함하는 제제가 요구되었음에도 불구하고 그 설파살라진 특유의 난용성의 문제 때문에 고농로로 설파살라진 제제를 제조할 수 없었던 문제를 해소할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 제조방법에서는, 염기성 첨가제를 특정 농도 범위로 사용함으로써, 용해 후 증화 단계를 거쳐도 용해상태가 유지되어, 중화 이후 발생하는 설파살라진의 염석 현상에 의한 침전을 방지하기 때문에, 고농도로 설파살라진을 포함하는 제제를 제조할 수 있다.

【발명의 실시를 위한 형태】

이하， 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

이하， 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 실시예 1: 1 내지 8mM 친수화된 설파살라진과 1 내지 2(w/v)%

히알루론산흔합 조성물의 제조

하기와 같은 방법에 의해 1, 2, 4 및 8mM의 친수화된 설파살라진 및 1 내지 2(w/v)% 히알루론산을 포함하는 조성물을 제조하였다.

우선, 1% ΚΟΗ를 아용하여 pH IO 이상의 용액을 제조하였다. 이후, 상기 제조된 용액에 1의 용액에 PEG6000를 4 (w/v)%으로 첨가하고 최종농도

l,2,4,8mM의 설파살라진을 첨가하여 3시간 동안 교반하였다. 이후, 교반하여 제조된 용액을 ().22um filter (Millipore사 Millex-GP)로제균여과하고， 최종농도 1% w/ _VO l(10 mg/ml)의 히알루론산 (일동히알루론산 일동원료)을 첨가하여 교반하여 흔합하였다. 4시간 흔합후 1% 염산 용액을 첨가하여 pH를 7.5로 조정하여 친수화된 설파살라진과 히알루론산의 흔합조성물을 제조하였다 (도 1 참조). 실시예 2: 1 내지 6mM 친수화된 설파살라진과 1 내지 2(w/v)%

히알루론산의 서방용출 확인 시험

실시예 1에서 제조한 복합제를 생리식염수에 담그고, 설파살라진- 히알루론산 복합제로부터 생리식염수로 용출되는 설파살라진에 대한

누적용출량 (cumulative release profile)을 확인하였다. 그 결과 히알루론산과 흔합된 설파살라진의 용출이 최소 60일 이상 지속되어 설파살라진이 서방 용출되는 것을 확인하였다 (도 2 참조). 실시예 3: 1 내지 8mM 친수화된 설파살라진，히알루론산복합제의 골관절염억제에 대한 in vitro 효력시험

인간 지방세포 유래 줄기세포 (Human Adipose Derived stem cell; ATCC PCS- 500-011)에 IL-lb를 처리하여 염증을 유도한 후 실시예 1에서 제조한 복합제를 처리하여 염증 및 연골파괴인자 (MMP-3, MMP-13, ADMT-5, COX-2)의 발현에 미치는 영향을 RealTime-PCR로 확인하였다. 그 결과 친수화된 설파살라진의 농도에 따라 염증 및 연골파괴인자의 발현이 농도의존적으로 억제 되는 것을 확인하였다. 실시예 4: 1 내지 8mM 친수화된 설파살라진 -히알루론산 복합제의 골관절염 연골파괴 억제에 대한 동물모델 효력시험

8주령 쥐 (rat, Sprague Dawley)의 관절강에 lmg MIA(Monosodium

IodoAcetate)를 처리하여 골관절염 동물모델을 유도한 후, 1주일 후에 실시예 1에서 제조한 복합제를 관절강에 투여하였다. 투여 후 8주 차에 실험 동물의 관절부위를 x-my로 관찰하였다. 관찰 결과 히알루론산 단독제제는 연골의 보호 효과가 없는 반면， 1 내지 4mM 설파살라진-히알루론산복합제는 관절염의 진행아 대조군에 비해 늦춰졌으며, 6 내지 8mM 친수화된 설파살라진-히알루론산복합제에 의해 골관절염의 진행이 완전히 억제되었음을 확인하였다. 실시예 5: 2 내지 8mM 친수화된 설파살라진 -히알루론산복합제의 골관절염 통증 억제에 대한동물모델 효력시험

실시예 3에서와 같은 방법으로 동물모델을 유도한후， 1주일 후에 생리식염수 (saline), 히알루론산 단독제제 (HA only), 8mM 친수화된 설파살라진 용액 (8mM SSZ only)또는 실시예 1에서 제조한 8mM 친수화된 설파살라진- 히알루론산 (8mM SSZ-HA) 복합제를 관절강에 투여하였다. 투여 후 4주까지 매주 Incapacitance tester(Linton instrument Co., UK, Ser No. 01/45/25) 또는 이와동등한 측정장치를 이용하여 오른쪽， 왼쪽 발무게를 각각 측정한다. MIA에 의해 골관절염이 유발되면 Rat은 MIA를 투여하지 않은 발에 의지하여 tester의 holder안에 서게된다. Rat의 배가 기기의 센서에 닿지 않은 상태에서 왼쪽, 오른쪽 각각의 발무게 (g)를 측정하여 나타낸다. 실험결과는 양쪽 발의 무게에 대한 오른쪽 발의 무게 비율을 계산하여 평균 (%) ± 표준오차로 표시한다.

시험 결과 설파살라진 단독은 초기 통증억제 효과가 없었고, 히알루론산 단독제제는 초기에만 효과를 보인 반면, 8mM 설파살라진-히알루론산복합제는 초기에서 후반부까지 고른 통증억제 효과를 보였다.