ОПИСАНИЕ

Изобретение относится к фармакологии и касается композиции для приготовления про- тивоопухолевого средства, которое представляет собой комплекс солей двухвалентной платины и пептида аллоферон и к фармацевтическим композициям, содержащим ука- занные комплексы. Может найти применение для изготовления препаратов, исполь- зующихся в онкологии.

Поиск новых препаратов противоопухолевого действия занимает одно из центральных мест современной биофизики, молекулярной биологии, химии и медицины. Среди из- вестных препаратов противоопухолевого действия особое место занимают препараты на основе металлических комплексов, наиболее известными из которых являются ком- плексы на основе платины.

Использование комплексов платины в противораковой химиотерапии хорошо известно специалистам. При этом в данном качестве используются, прежде всего, препараты двухвалентной платины - платины (II). Для лечения рака обычно применяются такие платиносодержащие препараты, как цисплатин (cisplatin), карбоплатин (carboplatin), ок- саплатин (oxaliplatin) и другие. Однако эти соединения оказываются полезными для ле- чения не всех типов опухолей, к тому же, некоторые типы раковых клеток могут прояв- лять резистентность к этим лекарствам. Одним из самых больших недостатков упомяну- тых платиносодержащих препаратов является то, что они отличаются высокой нейро- токсичностью, ототоксичностью, нефротоксичностью, миелосупрессией и вызывают большое количество нежелательных побочных эффектов.

Платиновые препараты обладают широким спектром противоопухолевого действия. Наиболее изученный препарат этого класса противоопухолевых средств - цис- дихлордиаминоплатинид (ДДП) активен против опухолей различного генезиса: спон- танных, перевивных, индуцированных вирусами и химическими канцерогенами. Ос- новной недостаток ДДП - его высокая токсичность, в результате которой нарушается работа почек, костного мозга и желудочно-кишечного тракта (Биологические аспекты координационной химии, ред. К. Б. Яцимирского. Киев. "Наукова думка". 1979 г. стр. 149-180).

Противоопухолевая активность комплексных соединений платины (II) связана с образо- ванием прочных связей с азотистыми основаниями ДНК (в основном с гуанином), что приводит к апоптозу опухолевых клеток. Известно, что в клетки попадает далеко не весь введенный препарат. Большая его часть выводится из кровяного русла почками, главным образом в неизменном виде или в виде тетрамминных комплексов. Именно поэтому главным "пострадавшим" от побочных эффектов платиновых лекарств оказы- вается система выделения.

Препарат ДДП (торговое название «Цисплатин») применяется в достаточно высоких до- зах, что повышает вероятность возникновения осложнений, связанных с токсичностью препаратов платины.

Исследования различных комплексов платины на животных и клинические испытания ДДП и некоторых его аналогов обнаружили разнообразие в биологических свойствах комплексов платины: противоопухолевой активности и побочного действия. Было пока- зано, что незначительные изменения в молекулярной структуре комплекса могут вызы- вать радикальные их изменения в биологической активности. Существование связи ме- жду структурой комплексного соединения и его противоопухолевой активностью сти- мулирует поиск новых содержащих платину препаратов - высокоактивных и вместе с тем низкотоксичных.

Сразу после обнаружения противоопухолевого эффекта (ДДП), многие лаборатории по всему миру предприняли исследования его структурных аналогов. Несмотря на то, что молекулярные механизмы их воздействия на клеточные структуры остаются далекими от понимания, достигнуты определенные успехи - увеличена растворимость, снижена токсичность, увеличена клеточная проницаемости и др. К сожалению, очень немногие из найденных лекарств по терапевтическому индексу (отношение актив- ность/токсичность) превзошли ДДП.

При создании новых противоопухолевых препаратов на основе ДДП используют в ос- новном два метода: 1. химическую модификацию молекулы путем введения в неё раз- личных заместителей (как правило, заместители вводятся на место одного или двух ато ов хлора), 2. образование комплекса ДДП с другим соединением, в том числе об- ладающим собственной биологической активностью.

Первый путь привел к созданию таких, вошедших в клиническую практику, противоопу- холевых препаратов как: карбоплатин ( цикл обута н- 1,1- дикарбоксилато)диаминплатина), оксалиплатин ([(1К,21*)-1,2-циклогександиамин- М,1\ ][оксалато(2)-0,0'] платина).

Введением пиридинового кольца в молекулу ДДП был создан препарат пириплатин. Введением в ДДП больших по размеру колец Стивен Дж. Липпард ( Stephen J Lippard) с коллегами получили препарат фенантриплатин, показавший в исследованиях на ряде клеток эффективность более высокую, чем цисплатин.

Конденсацией цисплатина с желчными кислотами Энцо Бартоли, Бениамино Палмиери, Алессандро Медичи (патент WO/2003/095470 «Platinum complexes having antitumor ac- tivity») создали препарат, имеющий пониженную токсичность и эффективный при опу- холях семенников и яичников.

Группой авторов разработан препарат S-малатоаммин (цикло-пентиламин)платина (П) (патент RU 2128042 «Противопухолевое средство», Чельцов-Бебутов П.А. и другие), по- казавший эффективность по отношению к ряду опухолей резистентных к цисплатину. Платина известна склонностью к образованию координационных комплексных соеди- нений. Поэтому ещё одним способом создания платиносодержащих противоопухоле- вых препаратов является связывание платины в них в комплексы с различными лиган- дами. Лиганды могут быть различной природы: как низко - так и высокомолекулярны- ми соединениями, как инертными, так и биологически активными.

Описаны комплексы платины с гуминовыми кислотами - патенты РФ 2182482 «Способ получения антиракового средства» и РФ 2178702 «Антираковое средство» авторов Тро- фимов В.А.; Шипов В.П.; Пигарев Е.С., Попов А.И.; Иванов В.Н. и патент РФ N° 2368379 «Противоопухолевое средство» Шипов В. П., Пигарев Е. С, Федорос Е.. И., Трофимова Н. П.

Авторы патентов в качестве соединения платины используют как цисплатин, так тетра- хлороплатинат калия и другие соединения платины, а в качестве гуминовых веществ аммониевые соли лигногуминовых кислот. Изобретение обеспечивает уменьшение токсичности препарата при одновременном повышении эффективности лечения рако- вых заболеваний.

При этом необходимо отметить, что используемые в качестве лиганда гуминовые ки- слоты обладают собственной биологической активностью - антиоксидантной, противо- воспалительной, противовирусной и иммуномодулирующей.

Известен патент SU 1813089 A3 Волченковой И. И., Майданевич Н.Н., Бударина Л. И., Ша- лимова С.А., Трохименко Е.П., Кейсевич Л. В. «Способ получения комплексного соеди- нения платины (II) с ДНК, обладающего противоопухолевой активностью», в котором водный, содержащий ДНК и хлорид натрия, раствор смешивают с водным раствором ДДП. Способ позволяет получить средство, сочетающее высокую противоопухолевую активность с выраженным иммуномодулирующим действием. Развитием этой работы является патент WO 2010074662 А1 O.S.Sokyrko с соавторами «Противоопухолевое средство, способ его получения и способ его стабилизации»

В работе Екимова А.А., Алексеевой Г.М., Караваевой А.В.. «Комплексные соединения платины с дипептидами: биологическая активность», Фармация, 2014, N2 6, с. 52-54 по- лучены и описаны биядерные комплексы цис-дихлородиамминплатины с дипептидами - ОД-аланил- Р,1.-аланином (Ala-Ala). D.L-аланил-глицином (Ala-Gly) О -аланил--.- лейцином (Ala-Leu), 0,Ь-аланил-Ь-норлейцином (Ala-nLeu). Введение в координацион- ную сферу платины дипептидов способствует изменению спектра противоопухолевого действия из-за целенаправленной доставки соединения к опухолевой клетке, а также снижению влияния токсичности на организм.

Наряду с цитостатиками, к которым относятся вышеописанные препараты платины, в лечении рака нашли применение рекомбинантные белки из группы интерферонов в качестве активаторов противоопухолевого иммунитета и ингибиторов пролиферации опухолевых клеток. Интерфероны применяются для лечения множественной миеломы (Zee et al., J. Clin. Oncol., 1998, 16, 8, p. 2834-2839), болезни Ходжкина (Aviles et al. Leuk. Lymphoma, 1998, 30, 5-6, p. 651-656), миелоидной лейкемии (Gilbert, Cancer, 1998, 83, 6, p.1205-13).

С этой же целью в лечении онкологических заболеваний используют вещества - индук- торы интерферонов, такие как: неовир, циклоферон и другие.

К категории индукторов интерферонов относится и олигопептид аллоферон, обладаю- щий высокой противовирусной активностью. На основе аллоферона создан противовирусный лекарственный препарат «Аллокин- альфа, лиофилизат для приготовления раствора для подкожного введения, 1мг» (Р N002829/01). Аллокин-альфа эффективен при терапии пациентов страдающих хрониче- ской папилломавирусной инфекцией, вызванной онкогенными вирусами папилломы человека; в комплексной терапии хронического рецидивирующего герпеса 1 и 2 типов; в составе комплексной терапии среднетяжелой (желтушной) формы острого гепатита В. Как известно, папиломовирусы и вирусы герпеса являются онкогенными.

Имеются сведения о противоопухолевых свойствах аллоферонов, основанных на акти- вации механизмов противоопухолевого иммунитета - интерферонов и естественных киллеров (Chernysh et al., Proceedings of National Academy of Science, 2002, 99, p. 12628- 12632).

Отличительным свойством пептидов семейства аллоферонов является их высокая ком- плексообразующая активность. Изучены комплексы аллоферона-1 и его аналогов с большим количеством переходных металлов, в том числе с медью (M.Kuczer and other. J. Inorganic Biochemistry,lll, 2012, 40-49), никелем и другими. Известно также (M.Kuczer and other, Inorganic Chemistry, 2013, 52, 5951-5961), что такие комплексы могут обладать биологической активностью. В патенте RU 2470031, Киселев О. И., Ершов Ф.И. «Биологи- чески активные пептидные комплексы» показано, что уровень индукции интерферона- альфа вызываемый цинковым комплексом аллоферона существенно выше, чем это ус- тановлено для аллоферона и циклоферона.

Наиболее близким решением является АЛЛОФЕРОНЫ-ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ ПЕП- ТИДЫ (патент RU 2172322, опубликовано: 20.08.2001), в котором описываются новые соединения общей формулы I: Xl-His-Gly-X2 -His-Gly-Val-ХЗ или их фармацевтически приемлемые соли, или эфиры, или амиды, где XI отсутствует либо содержит не менее 1 аминокислоты, Х2 содержит не менее 1 аминокислоты либо представляет собой пеп- тидную связь; ХЗ отсутствует либо содержит не менее 1 аминокислоты, причем указан- ные аминокислоты выбраны из групп: алифатической, ароматической или гетероцикли- ческой. Соединения стимулируют антивирусную, антимикробную и противоопухолевую активность иммунной системы человека.

Задачей настоящего изобретения является создание композиции для приготовления противоопухолевого препарата, который бы объединял противоопухолевую эффектив- ность соединений платины и веществ, обладающих интерфероногенной активностью. Объединение может позволить снизить концентрацию платины и, тем самым, обеспе- чить уменьшение токсичности препарата.

Техническим результатом изобретения является возможность на основе композиции изготавливать различные виды препаратов для инъекций или лиофилизата, которые имеют одновременно противоопухолевую эффективность и пониженную токсичность.

Указанный технический результат достигается тем, что заявлена композиция для приго- товления противоопухолевого средства в виде раствора для инъекций или лиофилиза- та, содержащая аллоферон, отличающаяся тем, что в качестве активного компонента используется комплексное соединение двухвалентной платины с олигопептидом алло- ферон.

Предпочтительно, в качестве соли платины используют цис-дихлордиамминплатину. Способ приготовления противоопухолевого средства на основе вышеописанной компо- зиции характеризующийся тем, что аллоферон постепенно вводят в раствор цисплатина с концентрацией 0,05% , полученный раствор перемешивают в течение 15 мин, после чего стерилизуют фильтрацией через фильтр с размером пор 0,2 мкм, затем разливают в ампулы.

Предпочтительно, формируют раствор, который имеет концентрацию ДДП от 0,01 до 0,05% и аллоферона от 0,05 до 0,1%.

Осуществление изобретения

Известно семейство цитокиноподобных пептидов - аллофероны, обладающих высокой противовирусной активностью (RU 2172322 Черныш СИ., Ким Су Ин, Беккер Г.П., Ма- халдиани Н.Б., Хоффманн Ж., Бюле Ф. «Аллофероны - иммуномодулирующие пепти- ды»). Механизм действия аллоферонов состоит в индукции синтеза эндогенных интер- феронов и активации системы естественных киллеров.

Как известно из курса общей химии, платина обладает большой склонностью к образо- ванию комплексных соединений. Поставленная задача решается созданием противоопухолевого лекарственного средст- ва, активным началом которого является комплексное соединение двухвалентной пла- тины с пептидом аллоферон. Оно обладает пониженной токсичностью и большей эф- фективностью, связанной с сочетанием противоопухолевых свойств как солей платины (II), так и аллоферонов.

Предлагаемый препарат может являться как раствором для инъекций, так и лиофилиза- том.

Возможность достижения цели изобретения подтверждается следующими примерами приготовления различных препаратов на основе заявленной композиции.

Пример 1.

Мольное соотношение АЛФ : ДДП равно 1 : 1.

В химический стакан, содержащий 10 мл 0,9% раствора натрия хлорида, вводят 5 мг сухой цис-дихлордиамминплатины. Раствор перемешивают до полного растворения соли. Затем в раствор добавляют 10 мг аллоферона. Раствор перемешивают в течение 15 мин, после чего стерилизуют фильтрацией через фильтр с размером пор 0,2 мкм, разливают по 2 мл в ампулы, которые запаивают. Полученный раствор имеет концен- трацию ДДП 0,5 мг/мл (0,05%) и аллоферона 1,0 мг/мл (0,10%).

Пример 2.

Мольное соотношение АЛФ : ДДП равно 1 : 2.

В химический стакан, содержащий 10 мл 0,9% раствора натрия хлорида, вводят 5 мг сухой цис-дихлордиамминплатины. Раствор перемешивают до полного растворения соли. Затем в раствор добавляют 5 мг аллоферона. Раствор перемешивают в течение 15 мин, после чего стерилизуют фильтрацией через фильтр с размером пор 0,2 мкм, разливают по 2 мл в ампулы, которые запаивают. Полученный раствор имеет концен- трацию ДДП 0,5 мг/мл (0,05%) и аллоферона 0,5 мг/мл (0,05%).

Пример 3.

Мольное соотношение АЛФ : ДДП равно 1 : 1.

В химический стакан, содержащий 10 мл 0,9% раствора натрия хлорида, вводят 5 мг сухой цис-дихлордиамминплатины. Раствор перемешивают до полного растворения соли. Затем в раствор последовательно добавляют 40 мг маннитола и 10 мг аллоферо- на. Раствор перемешивают в течение 15 мин, после чего стерилизуют фильтрацией че- рез фильтр с размером пор 0,2 мкм, разливают по 2 мл во флаконы типа ФИ-5 или 4D. Флаконы помещают в камеру сублимационной сушилки и высушивают в стандартном режиме. После окончания процесса флаконы закрывают пробками и укупоривают кол- пачками алюминиевыми.

Полученный раствор имеет концентрацию ДДП 0,5 мг/мл (0,05%) и аллоферона 1,0 мг/мл (0,10%).

Пример 4.

Мольное соотношение АЛФ : ДДП равно 1 : 2.

В химический стакан, содержащий 10 мл 0,9% раствора натрия хлорида, вводят 5 мг сухой цис-дихлордиамминплатины. Раствор перемешивают до полного растворения соли. Затем в раствор последовательно добавляют 40 мг маннитола и 5 мг аллоферона. Далее соответственно примеру 3. Полученный раствор имеет концентрацию ДДП 0,5 мг/мл (0,05%) и аллоферона 0,5 мг/мл (0,05%).

Пример 5. Определение противоопухолевой активности

Эффективность предложенного изобретения продемонстрирована на примере препа- рата, полученного на основе товарного лекарственного средства Цисплатин-Тева со- держащий 0,5 мг/мл платины.

Сравнительному исследованию подвергнуто три материала:

• Плацебо (раствор натрия хлорида 0,9%)

• Препарат сравнения Цисплатин-Тева (препарат 1)

• Препарат, описанный в примере 1 (препарат 2).

Испытание противоопухолевой активности проводилось на модели перевивной солид- ной опухоли Эрлиха. Штамм перевиваемого солидного рака Эрлиха мышей был полу- чен из банка опухолевых штаммов ФГУ НИИ онкологии им. Петрова.

В работе использовались беспородные мыши обоего пола массой 18 - 20 г. Животных содержали в естественном режиме освещения со свободным доступом к стандартному корму и воде. Опухоль перевивали подкожно в количестве 10 ⁷ клеток в объеме 0,2 мл. Животные были распределены по группам случайным образом. Для проведения экспе- римента было сформировано три группы:

- Группа 1 (п=10). Животные получали физиологический раствор (плацебо), - Группа 2 (n=9). Животные получали препарат NQl.

- Группа 3 (п=9). Животные получали препарат N°2.

На 13, 16, 22 и 25 дни эксперимента измеряли длину и ширину опухолевых узлов. Объ- ем опухоли рассчитывали по формуле:

где а - больший, b - меньший линейный размер узла.

Препараты и плацебо вводили подкожно в районе инъекции клеток опухоли на 3, 6, 9, 13, 16 и 20 сутки после перевивки в объеме 0,2 мл каждой мыши.

Оценку противоопухолевой активности исследуемых агентов проводили сравнивая ди- намику роста опухолей в соответствии с принятыми в экспериментальной онкологии методами (Методические рекомендации по доклиническому изучению средств, обла- дающих способностью ингибировать процесс метастазирования и повышать эффектив- ность цитостатической терапии злокачественных опухолей /Под ред. Е.Д.Гольдберга, А.Б.Сыркина. М., 1992).

Полученные данные изучения размеров опухоли у белых мышей показаны ниже в в таблицах 1, 2 и 3, а также на Фиг.

Таблица 1. Динамика роста опухоли (карцинома Эрлиха) у белых мышей (группа плаце- бо)

Таблица 2. Динамика роста опухоли (карцинома Эрлиха) у белых мышей (препарат 1)

Таблица 3. Динамика роста опухоли (карцинома Эрлиха) у белых мышей (препарат 2)

На Фиг. показана динамика роста перевивной карциномы Эрлиха у белых мышей в ус- ловиях применения химиопрепаратов. При этом Препараты N21 (Цис-платин) и N22 проявляют противоопухолевые свойства. Препарат на основе композиции N22, где в ка- честве активного компонента используется комплексное соединение двухвалентной платины с олигопептидом аллоферон, оказался значительно (втрое) эффективнее по сравнению с Цис-платином.